两株乳酸菌为基础的益生菌软饮料及其制作工艺.pdf

本发明公开了一种两株乳酸菌为基础的益生菌软饮料配方及其制作工艺，其特征在于，它以三级静态深层液体发酵、每级发酵时间48小时，发酵温度40±2℃，最后一级发酵所得菌液经沉淀过滤即可包装成产品；发酵试用种子培养基为普通的MSR培养基，扩大发酵和生产液体发酵培养基为：大豆豆浆2％、1.2％蔗糖、Rumfor乳酸菌培养基增效剂3‰(含有乙酸钠、柠檬酸鞍、硫酸镁等)。该加工工艺操作简便，生产的产品为无色、清亮透明液体、略有发酵气味、pH为2.5-4.5，保质期不低于两个月，保质期内的两菌种活菌总数cf

1、  一种两株乳酸菌为基础的益生菌软饮料，其特征在于：它含有植物乳杆菌、发酵乳杆菌的两个活菌株，其饮料的成分配方按重量百分比算包括水98.5％～99％，乳酸0.8％～1.5％，乙酸钠0.3‰～0.6‰，柠檬酸铵0.6‰～0.9‰，磷酸氢二钠0.6‰～0.9‰，硫酸镁0.5‰～0.6‰和余量的蔗糖和大豆蛋白。

2、  根据权利要求1所述的两株乳酸菌为基础的益生菌软饮料，其特征在于：所述植物乳杆菌、发酵乳杆菌的含量为cfu≥9×10⁷个/ml。

3、  一种权利要求1或2所述的两株乳酸菌为基础的益生菌软饮料的制作工艺，其特征在于，它包括如下步骤：
a、准备培养基材料以及制备Runfor乳酸菌培养基增效剂，以每100克大豆，洗净，浸泡7～9小时，取出放入豆浆机中，制作成去渣豆浆1000ml，放在干净的容器中，加热至沸腾，冷却备用；
b、菌种活化培养：将两菌种分别接种到两个斜面MRS培养基，在培养箱40±2℃，培养48小时，得到扩大培养所需菌种；
c、扩大培养、生产发酵，以发酵槽内三级静态深层液体发酵为基础，每级发酵时间40～50小时，发酵温度40±2℃，最后一级发酵所得菌液经沉淀、过滤、检验后包装成产品。

4、  根据权利要求3所述的两株乳酸菌为基础的益生菌软饮料的制作工艺，其特征在于：在所述工艺步骤c的扩大培养过程中，在一升的三角瓶中，加入冷却的豆浆，占液体培养基1～3％(v/v)、0.4～0.6％蔗糖(w/v)、Runfor乳酸菌培养基增效剂2～4‰(w/v)，制作1000ml培养基，在无菌的条件下等量接种两个菌种，摇匀后放置于培养箱中40±2℃温度条件下，静止发酵45～50小时；生产发酵过程中，按所述扩大培养同样的方法，在200升的培养槽中，配制生产培养液，将扩大培养母液，按体积以2％的接种量，接种，搅拌均匀，控制发酵温度40±2℃，静止发酵45～50小时，PH降到3-3.5之间，即可终止发酵。

5、  根据权利要求3所述的两株乳酸菌为基础的益生菌软饮料的制作工艺，其特征在于：在所述工艺步骤c的扩大培养过程中，在一升的三角瓶中加入蔗糖1～3(w/v)、Runfor乳酸菌培养基增效剂5～7‰(w/v)，以冷却的豆浆加满至1000ml培养基，在无菌的条件下等量接种两个菌种，摇匀后放置于培养箱中40±2℃温度条件下，静止发酵48小时；生产发酵过程中，在200升的培养槽中，以纯净水和所述扩大培养过程得到的完全接种液配制生产培养液，将扩大培养母液，按体积以4％的接种量，接种，搅拌均匀，控制发酵温度40±2℃，静止发酵45～50小时，PH降到3-3.5之间，即终止发酵。

6、  根据权利要求3所述的两株乳酸菌为基础的益生菌软饮料的制作工艺，其特征在于：在所述工艺步骤c的扩大培养后，以豆浆结晶粉加入蔗糖2～4％(w/w)，Runfor培养基增效剂0.5‰(w/w)，搅拌菌匀，在110～120℃灭菌箱中，灭菌65～80分钟，取出冷却，倒入培养基重量的18～22％的母液和干培养基重量的18～22％的水，搅拌均匀，倒入消毒灭菌好的发酵桶中，密闭保温发酵，40±2℃温度条件下，静止发酵45～50小时，然后取出在40～50℃的真空干燥机中干燥到水分10％以下，粉碎、包装得到生产发酵用接种剂干粉；在发酵过程，以所述扩大培养同样的方法，在200升的培养槽中，配制生产培养液，将接种剂干粉，按重量比以1％的接种量，接种，搅拌均匀，控制发酵温度40±2℃，静止发酵45～50小时，PH降到3-3.5之间，即终止发酵。

7、  根据权利要求3所述的两株乳酸菌为基础的益生菌软饮料的制作工艺，其特征在于：在所述工艺步骤c的扩大培养后，以豆浆结晶粉加入蔗糖2～4％(w/w)，Runfor培养基增效剂0.5‰(w/w)，搅拌菌匀，在110～120℃灭菌箱中，灭菌65～80分钟，取出冷却，倒入培养基重量的18～22％的母液和干培养基重量的18～22％的水，搅拌均匀，倒入消毒灭菌好的发酵桶中，密闭保温发酵，40±2℃温度条件下，静止发酵45～50小时，然后取出在40～50℃的真空干燥机中干燥到水分10％以下，粉碎、包装得到生产发酵用接种剂干粉；生产发酵以固体培养接种剂作为完全培养物，发酵生产活菌饮料，其方法为在200升的培养槽中，以纯净水和固体培养完全接种剂配制生产培养液，将上步所得的接种剂干粉，按重量比以2～4％的接种量，接种，搅拌均匀，控制发酵温度40±2℃，静止发酵45～50小时，PH降到3-3.5之间，即终止发酵。

8、  根据权利要求3所述的两株乳酸菌为基础的益生菌软饮料的制作工艺，其特征在于：在所述工艺步骤c的沉淀、过滤、检验过程中，将经过发酵的发酵液，在静止沉淀的状态下，吸取上清液，弃置沉淀渣子，上清液用550目的过滤器，过滤，检验，得到乳酸菌饮料，装瓶保存。

两株乳酸菌为基础的益生菌软饮料及其制作工艺
技术领域
本发明涉及生物技术中的微生物学科领域，其产品开发属于益生菌健康食品、饮料专业。
背景技术
半个世纪以来，抗生素和疫苗作为对抗各种病原微生物的主要手段，但MRSA、VRE等各种较强耐药性菌的出现，人类已经已经意识到抗生素疗法的局限性和不良后果。Fuller1989年提出益生菌，2002年FAO和WHO确定益生菌的概念和效果。之后短短10年世界人类卫生健康领域发生了巨大变化，益生素、益生元的研究和产品开发成为了潮流。益生菌的使用表现在医药治疗用药、液态口服使用、冲剂、胶囊，以及添加到其它食品和药品中共同使用等多种形式。该领域的研发、生产目前在乳酸菌、双歧杆菌的研究和应用方面尤其突出。这方面的产品有传统的酸奶、以及新开发的各种酸奶，乳酸饮料、各种单和复合菌保健品、食品，还有用于治疗肠道疾病的益生菌制剂。1930年，日本京都帝国大学微生物教研室的代田稔博士，成功地分离出来自人体肠道的乳酸杆菌，并倡导和实践健肠长寿开始乳酸菌市场七十多年历久不衰，消费者对乳酸菌有着充分的认知。资料显示，近十年来，日本的乳酸菌饮料市场每年的销售量都在60亿美元以上。例如使用到中国的Fancl、Yakult产品。
目前液态益生菌饮料在市场上有酸奶、发酵植物奶(如酸豆奶、乳酸菌果汁)、灭活菌饮料、以及部分相关的乳酸饮料。但活菌饮料都是同时含有大量培养基或辅料的不透明液态，另外保质期一般不到一个月，要求低温保存，如酸奶、养乐多等。为此，如何制作一种含活菌、比较耐保存的液体乳酸菌软饮料，以改善人体消化、提高免疫力已成为人们急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的就是为了解决现有技术之不足而提供的一种菌种的培养条件要求不苛刻，发酵性能稳定，发酵过程设备投资小，而且培养基简单、便宜、容易获得，用量很少，没有几乎不产生废料的两株乳酸菌为基础的益生菌软饮料配方。
本发明的另一目的是提供一种两株乳酸菌为基础的益生菌软饮料的制作工艺。
本发明是采用如下技术解决方案来实现上述目的：一种两株乳酸菌为基础的益生菌软饮料，其特征在于：它含有植物乳杆菌、发酵乳杆菌的两个菌株Lactobaccillus plantrums SMB-2 CGMCC No 2566、Lactobacillusfermenti CMS-H002，其保藏号为CCTCC No.M206110；其饮料的成分配方按重量百分比算包括水98.5％～99％，乳酸0.8％～1.5％，乙酸钠0.3‰～0.6‰，柠檬酸铵0.6‰～0.9‰，磷酸氢二钠0.6‰～0.9‰，硫酸镁0.5‰～0.6‰和余量的蔗糖和大豆蛋白。
作为上述方案的进一步说明，所述植物乳杆菌、发酵乳杆菌的含量为cfu≥3×10⁷个/ml。
一种两株乳酸菌为基础的益生菌软饮料的制作工艺，其特征在于，它包括如下步骤：
a、准备培养基材料以及制备Runfor乳酸菌培养基增效剂，以每100克大豆，洗净，浸泡7～9小时，取出放入豆浆机中，制作成去渣豆浆1000ml，放在干净的容器中，加热至沸腾，冷却备用；
b、菌种活化培养：将两菌种分别接种到两个斜面MRS培养基，在培养箱40±2℃，培养48小时，得到扩大培养所需菌种；
c、扩大培养、生产发酵，以发酵槽内三级静态深层液体发酵为基础，每级发酵时间40～50小时，发酵温度40±2℃，最后一级发酵所得菌液经沉淀、过滤、检验后包装成产品。
在所述工艺步骤c的扩大培养过程中，在一升的三角瓶中，加入冷却的豆浆，占液体培养基1～3％(v/v)、0.4～0.6％蔗糖(w/v)、Runfor乳酸菌培养基增效剂2～4‰(w/v)，制作1000ml培养基，在无菌的条件下等量接种两个菌种，摇匀后放置于培养箱中40±2℃温度条件下，静止发酵45～50小时；生产发酵过程中，按所述扩大培养同样的方法，在200升的培养槽中，配制生产培养液，将扩大培养母液，按体积以2％的接种量，接种，搅拌均匀，控制发酵温度40±2℃，静止发酵45～50小时，PH降到3-3.5之间，即可终止发酵。
在所述工艺步骤c的扩大培养过程中，在一升的三角瓶中加入蔗糖1～3(w/v)、Runfor乳酸菌培养基增效剂5～7‰(w/v)，以冷却的豆浆加满至1000ml培养基，在无菌的条件下等量接种两个菌种，摇匀后放置于培养箱中40±2℃温度条件下，静止发酵48小时；生产发酵过程中，在200升的培养槽中，以纯净水和所述扩大培养过程得到的完全接种液配制生产培养液，将扩大培养母液，按体积以4％的接种量，接种，搅拌均匀，控制发酵温度40±2℃，静止发酵45～50小时，PH降到3-3.5之间，即终止发酵。
在所述工艺步骤c的扩大培养后，以豆浆结晶粉加入蔗糖2～4％(w/w)，Runfor培养基增效剂0.5‰(w/w)，搅拌菌匀，在110～120℃灭菌箱中，灭菌65～80分钟，取出冷却，倒入培养基重量的18～22％的母液和干培养基重量的18～22％的水，搅拌均匀，倒入消毒灭菌好的发酵桶中，密闭保温发酵，40±2℃温度条件下，静止发酵45～50小时，然后取出在40～50℃的真空干燥机中干燥到水分10％以下，粉碎、包装得到生产发酵用接种剂干粉；在发酵过程，以所述扩大培养同样的方法，在200升的培养槽中，配制生产培养液，将接种剂干粉，按重量比以1％的接种量，接种，搅拌均匀，控制发酵温度40±2℃，静止发酵45～50小时，PH降到3-3.5之间，即终止发酵。
在所述工艺步骤c的扩大培养后，以豆浆结晶粉加入蔗糖2～4％(w/w)，Runfor培养基增效剂0.5‰(w/w)，搅拌菌匀，在110～120℃灭菌箱中，灭菌65～80分钟，取出冷却，倒入培养基重量的18～22％的母液和干培养基重量的18～22％的水，搅拌均匀，倒入消毒灭菌好的发酵桶中，密闭保温发酵，40±2℃温度条件下，静止发酵45～50小时，然后取出在40～50℃的真空干燥机中干燥到水分10％以下，粉碎、包装得到生产发酵用接种剂干粉；生产发酵以固体培养接种剂作为完全培养物，发酵生产活菌饮料，其方法为在200升的培养槽中，以纯净水和固体培养完全接种剂配制生产培养液，将上步所得的接种剂干粉，按重量比以2～4％的接种量，接种，搅拌均匀，控制发酵温度40±2℃，静止发酵45～50小时，PH降到3-3.5之间，即终止发酵。
在所述工艺步骤c的沉淀、过滤、检验过程中，将经过发酵的发酵液，在静止沉淀的状态下，吸取上清液，弃置沉淀渣子，上清液用550目的过滤器，过滤，检验，得到乳酸菌饮料，装瓶保存。
本发明采用上述技术解决方案所能达到的有益效果是：
1、本发明设计了一个含植物乳杆菌、发酵乳杆菌两个菌株的保健饮料配方，并设计了一套制作工艺，四个实用不同条件的工艺方案，以三级静态深层液体发酵、每级发酵时间48小时，发酵温度40±2℃，最后一级发酵所得菌液经沉淀过滤即可包装成产品，该加工工艺操作简便。生产的产品为无色、清亮透明液体、略有发酵气味、PH为2.5-4.5，保质期不低于两个月，保质期内的两菌种活菌总数cfu不低于3×10⁷个/ml。
2、本发明选择的两个菌种，培养条件要求不苛刻，从温度10-45℃都能有效繁殖；发酵性能稳定，扩大培养液，连续8个月产酸、发酵，性能都没有明显衰减；
3、扩大和生产用培养基一样，简单、便宜、容易获得，用量很少，没有几乎不产生废料。
4、发酵过程采用发酵槽、深层、静止发酵，不需要搅拌，由于工艺过程的特点，过程设备投资小；其产品在常温下就能保存2个月以上，而同类产品却要求低温条件保质期仅为一周。
具体实施方式
如图1、图2所示，本发明的两株乳酸菌为基础的益生菌软饮料，使用的益生菌是植物乳杆菌、发酵乳杆菌的两个菌株Lactobaccillusplantrums SMB-2 CGMCC No 2566、Lactobacillus fermenti CMS-H002，其保藏号为CCTCC No.M206110，含量cfu≥3×10⁷个/ml，其饮料的成分配方按重量百分比算包括水98.5％～99％，乳酸0.8％～1.5％，乙酸钠0.3‰～0.6‰，柠檬酸铵0.6‰～0.9‰，磷酸氢二钠0.6‰～0.9‰，硫酸镁0.5‰～0.6‰和微量的蔗糖和大豆蛋白。种子培养基为普通的MRS培养基，扩大发酵和生产培养基为：大豆豆浆2％、0.5％蔗糖、Runfor乳酸菌培养基增效剂3‰(含有乙酸钠、柠檬酸鞍、硫酸镁等)。其中，Runfor乳酸菌培养基增效剂配方为：乙酸钠20％、柠檬酸铵30％，磷酸氢二钠30％，硫酸镁20％，以上成份均以无结晶水的纯品为基础。
本发明的工艺为发酵槽三级静态深层发酵为基础；40±2℃，48小时。发酵工艺以三步静态发酵为基础，依据不同的生产条件，提出了四个实施工艺方案：
实施例1
三步液体发酵：
1培养基材料准备：
大豆豆浆准备：以100克大豆，洗净，浸泡8小时，取出放入豆浆机中，制作去渣豆浆1000ml，放在干净的容器中，加热至沸腾，冷却备用。
Runfor乳酸菌培养基增效剂制备：
准备食品级、80目粉末状的无水乙酸钠、无水柠檬酸铵、无水磷酸氢二钠、无水硫酸镁。
称取乙酸钠200克、柠檬酸铵300克，磷酸氢二钠300克，硫酸镁200克混合即成为复合矿物盐，装瓶备用。
液体培养的用水：以自来水经直饮机超滤过滤，将水中的杂质、细菌过滤，经检验，过滤后的水已检测不到细菌微生物。
2菌种活化培养：将两菌种分别接种到两个斜面MRS培养基，在培养箱40±2℃，培养48小时，得到扩大培养所需菌种。
3扩大培养：在一升的三角瓶中，加入冷却的豆浆，占液体培养基2％(v/v)、0.5％蔗糖(w/v)、Runfor乳酸菌培养基增效剂3‰(w/v)，制作1000ml培养基。在无菌的条件下等量接种两个菌种，摇匀后放置于培养箱中40±2℃温度条件下，静止发酵48小时。
所得培养液经检测，两个菌都发酵生长良好，所得总菌浓度cfu为6×10⁸个/ml，PH为3-3.5之间；刚开始发酵培养液为混浊均匀的黄色，PH为6左右，3小时后，逐渐产生沉淀，上面变清；18个小时，PH降到4-5之间，表明目标菌正在繁殖、代谢产酸。
4生产发酵：按扩大培养同样的方法，在200升的培养槽中，配制生产培养液，将扩大培养母液，按体积以2％的接种量，接种，搅拌均匀，控制发酵温度40℃，48小时，PH降到3-3.5之间，即可终止发酵。
5沉淀、过滤：上一步所得的发酵液，在静止沉淀的状态下，吸取上清液，弃置沉淀渣子，上清液用550目的过滤器，过滤，得到透明、澄清的最后乳酸菌饮料。味酸、略有发酵味，PH2.5-4.5之间，装瓶保存。
6检验：在产品中取样，稀释处理，经革兰氏染色，镜检可以看到大量的两个目标菌，一个是植物乳杆菌为短杆菌，发酵乳杆菌为长线状杆菌。
取样培养测得cfu＞5×10⁸个/ml，即可认为合格，如未达到要求则要补充培养基，以碱液中和酸，到5.5以上，继续培养到合格含量。该产品在室温条件下保存2个月，不变质，没有明显异味，保存两个月时测得活菌数cfu＞5×10⁷个/ml。
实施例2
生产发酵以浓缩液接种剂，作为完全培养物，生产活菌饮料：
第1步、第2步与方案1相同；
第3步扩大培养：在一升的三角瓶中加入2％(w/v)蔗糖、Runfor乳酸菌培养基增效剂6‰(w/v)(含有乙酸钠、柠檬酸鞍、硫酸镁等)，以冷却的豆浆加满至1000ml培养基。在无菌的条件下等量接种两个菌种，摇匀后放置于培养箱中40±2℃温度条件下、静止发酵48小时；
所得培养液经检测，两个菌都发酵生长良好，所得总菌浓度cfu＞10⁸个/ml，PH为3-3.5之间；刚开始发酵培养液为混浊均匀的黄色，PH为6左右，略有沉淀产生；18个小时，PH降到4-5之间，表明目标菌正在繁殖、代谢产酸。摇匀，这样就得到生产发酵以浓缩液接种剂。
实施例3
第三步为固体发酵的四步发酵法：
1培养基材料准备：
大豆豆浆准备：以100克大豆，洗净，浸泡8小时，取出放入豆浆机中，制作去渣豆浆1000ml，放在干净的容器中，加热至沸腾，冷却备用；
Runfor乳酸菌培养基增效剂制备：
准备食品级、80目粉末状的无水乙酸钠、无水柠檬酸铵、无水磷酸氢二钠、无水硫酸镁。称取乙酸钠200克、柠檬酸铵300克，磷酸氢二钠300克，硫酸镁200克混合即成为复合矿物盐，装瓶备用。
液体培养的用水：以自来水经直饮机超滤过滤，将水中的杂质、细菌过滤，经检验，过滤后的水已检测不到细菌微生物。
2菌种活化培养：将两菌种分别接种到两个斜面MRS培养基，在培养箱40±2℃，培养48小时，得到扩大培养所需菌种；
3扩大培养：一升的三角瓶，按照：加入冷却的豆浆，占液体培养基2％(v/v)、0.5％(w/v)蔗糖、Runfor乳酸菌培养基增效剂3‰(w/v)，制作1000ml液体培养基。在无菌的条件下等量接种两个菌种，摇匀后放置于培养箱中40±2℃温度条件下、静止发酵48小时。
所得培养液经检测，两个菌都发酵生长良好，所得总菌浓度cfu为6×10⁸个/ml，PH为3-3.5之间；刚开始发酵培养液为混浊均匀的黄色，PH为6左右，3小时后，逐渐产生沉淀，上面变清；18个小时，PH降到4-5之间，表明目标菌正在繁殖、代谢产酸。
4以豆浆结晶粉加入3％(w/w)蔗糖，0.5‰(w/w)的Runfor培养基增效剂，搅拌菌匀，在115℃灭菌箱中，灭菌70分钟，取出冷却，倒入培养基重量的20％的母液和干培养基重量的20％的水，搅拌均匀，倒入消毒灭菌好的发酵桶中，密闭保温发酵，40±2℃温度条件下，48小时，然后取出在45℃的真空干燥机中干燥到水分10％以下，粉碎、包装得到生产发酵用接种剂干粉，颜色为黄色、有酸味的粉末；经检验，复合菌含量cfu大于3×10⁹个/克。
5生产发酵：按本方案中扩大培养同样的方法，在200升的培养槽中，配制生产培养液，将上步所得的接种剂干粉，按重量比以1％的接种量，接种，搅拌均匀，控制发酵温度40℃，48小时，PH降到3-3.5之间，即可终止发酵。
6沉淀、过滤：上一步所得的发酵液，在静止沉淀的状态下，吸取上清液，弃置沉淀渣子，上清液用550目的过滤器，过滤，得到透明、澄清的最后乳酸菌饮料。味酸、略有发酵味，PH2.5-4.5之间。装瓶保存。
7检验：在产品中取样，稀释处理，经革兰氏染色，镜检可以看到大量的两个目标菌，一个是植物乳杆菌为短杆菌，发酵乳杆菌为长线状杆菌。
取样培养测得cfu＞5×10⁸个/ml，即可认为合格，如未达到要求则要补充培养基，以碱液中和酸，到5.5以上，继续培养到合格含量。该产品在室温条件下保存2个月，不变质，没有明显异味，保存两个月时测得活菌数cfu＞5×10⁷个/ml。
此实例，由于中间产物是接种剂干粉，耐保存，便于运输、保存，有利于扩大培养和生产发酵不在一个地方或不在一个机构的生产方式。
实施例4
生产发酵以固体培养接种剂作为完全培养物，发酵生产活菌饮料：
此方案的第一、第二、第三、第四与方案3相同；
5生产发酵：在200升的培养槽中，以洁净水和固体培养完全接种剂配制生产培养液，将上步所得的接种剂干粉，按重量比以3％的接种量，接种，搅拌均匀，控制发酵温度40℃，48小时，PH降到3-3.5之间，即可终止发酵。
6沉淀、过滤：上一步所得的发酵液，在静止沉淀的状态下，吸取上清液，弃置沉淀渣子，上清液用550目的过滤器，过滤，得到透明、澄清的最后乳酸菌饮料。味酸、略有发酵味，PH3-4之间，装瓶保存。
7检验：在产品中取样，稀释处理，经革兰氏染色，镜检可以看到大量的两个目标菌，一个是植物乳杆菌为短杆菌，发酵乳杆菌为长线状杆菌。取样培养测得cfu＞5×10⁸个/ml，即可作为合格，如未达到要求则要补充培养基，以碱液总和酸，到5.5以上，继续培养到合格含量。该产品在室温条件下保存2个月，不变质，没有明显异味，保存两个月时测得活菌数cfu＞5×10⁷个/ml。
此实例，由于中间产物是接种剂干粉，耐保存，便于运输、保存，有利于扩大培养和生产发酵不在一个地方或不在一个机构的生产方式，这种固体高浓度完全营养接种剂的使用，大大简化了生产发酵企业的工艺，以及减少了设备的投入。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解。依然可以对发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。