背景技术
近年来，随着细胞生物学、分子生物学及生物材料学研究的突飞猛进，组织工程作为一门新兴的交叉学科在其研究和应用方面也取得了很大的进展。组织工程学的基本原理和方法是将在体外培养、扩增的正常组织细胞种植到具有良好生物相容性且在体内可逐步降解吸收的组织工程多孔支架上，形成细胞-支架复合物，细胞在支架上增殖、分化，然后将此复合物植入机体组织病损部位，在体内继续增殖并分泌细胞外基质，伴随着材料的逐步降解，形成新的与自身功能和形态相适应的组织或器官，从而达到修复病损组织或器官的目的。这种方法将使组织器官缺损的治疗从器官移植进入器官制造的新时代。
组织工程的关键技术之一在于将生物材料制成具有特定形状和孔结构的支架。支架的作用是引导周围组织细胞的迁移及生长(组织传导性)，或为种植于支架多孔结构中细胞的生长提供一个适宜基质，保证细胞的黏附、增值、分化功能及迁移。为了满足细胞的这些要求，选择合适的材料制备支架非常重要，但同时也应注意支架加工过程可能对其适应性产生的影响。
在组织工程中应用更多的是与特定组织或器官先匹配的具有复杂形状的三维多孔支架，因而研究开发具有复杂形状的三维多孔支架的制备技术是组织工程研究中迫切需要解决的关键问题之一。组织工程支架中孔隙位置、孔径大小的控制及孔隙率的高低也是多孔支架研究中的关键问题。
在现有的支架制备方法中，纤维黏接法的纤维比表面积大，可制备成不同形状的相互黏连的纤维网络，用于组织再生如血管、肠的管状支架，但若支架的三维形状较复杂时，该技术并不能解决问题。利用溶剂灌制和粒子沥滤技术可制得孔隙率近93％，且孔隙相通的多孔支架。孔隙率可通过改变盐用量而调节，孔径大小也可以通过改变盐颗粒尺寸而实现与孔隙率无关的控制。但该方法只能用于薄的晶片与膜材(厚度＜2mm)支架，不能直接构筑三维支架，而且不能控制孔隙的位置。粒子致孔法简单、适用性广、孔隙率和孔尺寸易独立调节，是一个通用的方法，也得到了广泛应用，但该方法在致孔时往往需要用到有机溶剂，支架中残留的有机溶剂在体外会产生毒性效应，并在体内诱发炎症反应。气体发泡法可避免在制备支架时使用有机溶剂，该方法与粒子沥滤技术相结合，则可制得相连的开孔结构的多孔支架，但该方法的不足之处是支架中的孔隙不可控。
生物微胶囊，多以溶剂蒸发法、相分离法、界面沉积法和喷雾干燥法等物理化学法，以及聚合法、乳化法等化学方法制备。用上述方法制备的微胶囊，通常需要在高温条件下或使用反应剧烈的破坏性有机溶剂，所制备的微胶囊粒径分布宽，很难满足生物支架中保持生物物质活性的要求，需要筛分过滤。静电法是通过电场中离子型物质之间的反应制备微胶囊的，虽然制造过程比较温和，但生产规模小，且生产的微胶囊粒径往往在200μm以上，不能满足实际使用要求。国内外有关微米级尺寸的微胶囊制造技术鲜有报道，Bnenedetti等利用超临界物体技术制得粒径小于20μm的微胶囊，但超临界物体技术对实验仪器、实验环境及流体的性质要求苛刻，无法实现产业化。中国科学院大连化学物理研究所生物医学材料工程组制作的包细胞海藻酸钠微胶囊，其平均直径在240μm左右，粒径同样较大，不能满足实际使用要求。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明拟解决的技术问题是，提供一种组织工程用三维多孔支架的制备方法及设备，该制备方法及设备所制备的三维多孔支架具有与缺损组织或器官同样复杂的外形结构，并且支架的孔隙可控，没有污染，适于工业化实施；该设备适用于本发明制备方法，结构简单。便于工业化制造。
本发明解决所述制备方法技术问题的技术方案是，设计一种组织工程用三维多孔支架的制备方法，该制备方法基于三维喷墨打印方法与生物微胶囊点种方法，采用如下步骤：
(1)首先由三维CAD软件设计出支架的形貌，然后根据产品的工艺要求，将支架按一定厚度切片分层，得到支架每一层的二维截面信息；
(2)在CAD软件的控制下，三维喷墨打印喷头沿X轴和Y轴方向运行，完成支架第一层截面信息所设定的打印运动，并按照该截面信息喷射液态聚合物，使液态聚合物直接或在紫外灯的照射下粘结成支架的第一层片；在计算机的控制下，生物微胶囊制备喷嘴在支架的第一层片上点种微胶囊颗粒，使微胶囊颗粒堆积形成支架设计要求的孔隙，同时使堆积的微胶囊颗粒作为支架的下一层支撑；所述的液态聚合物包括粘结性的生物可降解型高分子聚合物或光固化生物可降解型高分子聚合物；
(3)在计算机的控制下，使三维喷墨打印喷头与生物微胶囊制备喷嘴沿Z轴方向运动，移动支架一个层片的高度，采用与第(2)步一样的方法完成支架第二层的成形制备，同时使支架的第二层与其第一层粘结成一个整体，并使生物微胶囊堆积形成设计要求的孔隙；
(4)重复第(2)和(3)步方法，依次按照所述支架每一层的二维截面信息逐层进行，直至制得所述的组织工程用三维多孔支架。
本发明解决所述制备设备技术问题的技术方案是，设计一种组织工程用三维多孔支架的制备设备，其特征在于该制备设备适用于本发明所述的制备方法，包括三维喷墨打印成形机、喷射装置、生物微胶囊点种装置和控制系统；所述的三维喷墨打印成形机包括底板、龙门支架、成形平台、X向传动机构、X向精密线性模组的滑块、Y向传动机构、Y向精密线性模组的滑块、Z向传动机构和Z向精密线性模组的滑块；所述龙门支架竖直安装在底板上，成形平台安装在Y向精密线性模组的滑块上，X向传动机构固定在龙门支架上，Z向传动机构固定在X向精密线性模组的滑块上，Y向传动机构直接固定在底板上；
所述喷射装置主要包括打印喷头、储料盒和送料管；打印喷头安装在Z向精密线性模组的滑块上，储料盒固定在所述的龙门支架上，打印喷头与储料盒之间通过送料管连接；
所述生物微胶囊点种装置主要包括生物微胶囊喷嘴、胶囊控制阀和胶囊储存盒；生物微胶囊喷嘴安装在Z向精密线性模组的滑块上，胶囊储存盒安装在胶囊点种装置的顶部，并与作为生物微胶囊存储设备的胶囊控制阀相连；所述的打印喷头和生物微胶囊喷嘴安装在Z向精密线性模组的滑块上；
所述的控制系统包括控制装置和计算机；控制装置通过通用扩展槽与计算机相连接。
与现有技术相比，本发明制备方法基于三维喷墨打印方法与生物微胶囊制备方法的巧妙结合，所制备的三维多孔支架具有与缺损组织或器官同样复杂的外形结构，并且支架的孔隙位置和孔径大小可控，没有污染，适于工业化实施；本发明制备设备依据本发明制备方法设计，所制备的组织工程用三维多孔支架具有与人体或动物的缺损组织或器官同样的复杂外形结构，支架的孔隙率不低于60％，一般可达到95％，并具有相连的孔结构，既可满足不同产品设计的要求，又便于工业化实施制造。
具体实施方式
下面结合实施例和其附图对本发明作进一步说明，但本发明申请权利要求不受限于这些实施例。
本发明设计的组织工程用三维多孔支架(简称支架)的制备方法(简称制备方法，参见图1)基于三维喷墨打印方法与生物微胶囊点种方法的有机结合。采用如下步骤：
(1)首先由三维CAD软件设计出支架的形貌，然后根据产品的工艺要求，将支架按一定厚度切片分层，得到支架每一层的二维截面信息；
(2)在CAD软件的控制下，三维喷墨打印喷头沿X轴和Y轴方向运行，完成支架第一层截面信息所设定的打印运动，并按照该截面信息喷射液态聚合物，使液态聚合物直接或在紫外灯的照射下粘结成支架的第一层片；在计算机的控制下，生物微胶囊制备喷嘴在支架的第一层片上点种微胶囊颗粒，使微胶囊颗粒堆积形成支架设计要求的孔隙，同时使堆积的微胶囊颗粒作为支架的下一层支撑；所述的液态聚合物包括粘结性的生物可降解型高分子聚合物或光固化生物可降解型高分子聚合物；
(3)在计算机的控制下，使三维喷墨打印喷头与生物微胶囊制备喷嘴沿Z轴方向运动，移动支架一个层片的高度，采用与第(2)步一样的方法完成支架第二层的成形制备，同时使支架的第二层与其第一层粘结成一个整体，并使生物微胶囊堆积形成设计要求的孔隙；
(4)重复第(2)和(3)步方法，依次按照所述支架每一层的二维截面信息逐层进行，直至制得所述的组织工程用三维多孔支架。
本发明所述的三维多孔支架，具有复杂外形结构和孔隙可控的相连孔结构，孔隙或孔径尺寸可以通过调整生物微胶囊的大小及点种的颗粒数目得到调整。所述生物微胶囊是将酶、蛋白质和激素乃至细胞等生物活性物质包封在选择性透过膜中，形成的球状微球。包封在生物微胶囊中的生物活性物质可以调控组织的生长及细胞功能。本发明的生物微胶囊既是生物活性物质的包封物，又是三维喷墨打印时所需的支撑材料，无需专门设计支撑结构，因而可使支架体积小，制备简单。体积小的微胶囊具有利于氧和营养物的供应、囊内死腔小和便于支架小孔径的投放等优点。本发明选用或制备的生物微胶囊颗粒的粒径为10～20μm，支架孔径尺寸可控为10～800μm，一般为200～400μm。
本发明设计的支架，其外形基本材料既可选用带有粘结性的生物可降解型高分子聚合物，如明胶、白蛋白、甲壳素、壳聚糖和聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)等；也可以选用光固化生物可降解型高分子聚合物，如不饱和聚磷酸酯(UPPE)等。本发明制备方法中，如果支架外形基本材料选用带有粘结性的生物可降解型高分子聚合物时，在所述的第(2)步制备过程中可直接粘结成形(成形为支架外形层片)；而如果支架外形基本材料采用光固化生物可降解型高分子聚合物时，则在所述的第(2)步制备过程中，需要使用光固化光源(实施例为1000W紫外灯)照射一定时间(实施例为1s)，以使支架外形基本材料固化成形为支架外形层片。
本发明同时设计了所述组织工程用三维多孔支架的制备设备(简称设备，参见图1、2)，其特征在于该制备设备适用于本发明所述的制备方法，包括三维喷墨打印成形机1、喷射装置2、生物微胶囊点种装置3和控制系统；所述的三维喷墨打印成形机包括底板11、龙门支架12、成形平台13、X向传动机构14、X向精密线性模组的滑块15、Y向传动机构16、Y向精密线性模组的滑块17、Z向传动机构18和Z向精密线性模组的滑块19；所述龙门支架12竖直安装在底板11上，成形平台13安装在Y向精密线性模组的滑块17上，可使成形平台13沿Y方向移动；X向传动机构14固定在龙门支架12上，Z向传动机构18固定在X向精密线性模组的滑块15上，Y向传动机构16直接固定在底板11上；所述的X向传动机构14、Y向传动机构16和Z向传动机构18均由伺服电机和精密线性模组构成；所述的X向精密线性模组、Y向精密线性模组和Z向精密线性模组是采用直线导轨和滚珠丝杠为执行元件的结构；
所述喷射装置2主要包括打印喷头21、储料盒22和送料管23；打印喷头21安装在Z向精密线性模组的滑块19上，可以沿X、Z方向移动，储料盒22固定在所述的龙门支架12上，打印喷头21与储料盒22之间通过送料管23连接；喷射装置2主要完成支架外形结构7的喷射打印；
所述生物微胶囊点种装置(简称点种装置)3主要包括生物微胶囊喷嘴31、胶囊控制阀32和胶囊储存盒33；生物微胶囊喷嘴31安装在Z向精密线性模组的滑块19上，胶囊储存盒33安装在胶囊点种装置3的顶部，并与作为生物微胶囊存储设备的胶囊控制阀32相连；胶囊点种装置3主要完成支架孔隙结构8的制备；
所述的控制系统包括控制装置4和计算机5；控制装置4通过计算机5的通用扩展槽与计算机5相连接；
所述控制装置4是设备的控制中心，实施例是由各个分立器件构成的控制柜；计算机5主要负责给出控制系统具体的控制算法，控制系统的管理、程序相关参数的设定、系统状态的显示、控制系统数据的采集、各种开关信号和反馈信号的处理等工作，并由控制装置4来完成控制信号的输出。
本发明的打印喷头21和生物微胶囊喷嘴31安装在Z向精密线性模组的滑块19上，可以沿X、Z方向移动；成形平台13安装在Y向精密线性模组的滑块17上，可以沿Y方向移动；通过打印喷头21、生物微胶囊喷嘴31与成形平台13的运动配合，可顺利完成X、Y、Z三维多孔支架的制备。
本发明制备设备的进一步特征是，在打印喷头21和生物微胶囊喷嘴31之间安装有光固化光源6，光固化光源6通过光源控制线与控制装置4相连接，控制装置4根据控制信息直接控制光固化光源6的开关。光固化光源6及其控制本身是现有技术。这种结构的设备适用于所述支架外形基本材料选用光固化生物可降解型高分子聚合物的情形。
本发明制备方法和制备设备中使用生物微胶囊点种装置，用以完成支架孔隙的成形制造。所述的生物微胶囊点种装置通过计算机控制胶囊控制阀的开关，以满足支架孔隙对微胶囊数目的需要。制造支架孔隙时，计算机根据信息指令，控制微胶囊控制阀的开合。开启时，微胶囊落入生物微胶囊点种设备的腔体内，并到达胶囊喷嘴处，再在计算机的控制下，点种装置的胶囊喷嘴结合三维喷墨打印喷头按产品设计要求逐层点种生物微胶囊于成形平台上，完成所述支架的制造。由于点种设备和三维喷墨打印喷头都是可控的，因而支架的复杂外形结构和孔隙、孔径都是可控的。本发明所述的方法或/和设备制备的生物微胶囊基于微喷和点种技术，所制得的微胶囊粒径可控制在10～20μm。该微胶囊尺寸完全可以满足组织工程用支架中保持生物物质活性的要求。
本发明未述及之处适用于现有技术。
下面给出本发明的具体实施例：
实施例1
用不饱和聚磷酸酯(UPPE)材料制备长度为50mm骨组织工程三维多孔支架。生物胶囊颗粒的粒径为20μm，支架切片数为2500片。
首先运用三维CAD软件设计出支架的三维实体模型(参见图1)，然后根据产品设计工艺要求，将其按一定厚度进行切片分层，形成一系列二维切片，每一层的切片厚度为20μm。计算机5根据每一层的二维成形信息分别控制各控制机构做协调运动。具体而言，制备开始时，计算机5把第一层的二维成形信息传递给控制装置4，生物微胶囊点种装置3中的胶囊控制阀32在控制装置4的控制下打开阀门，胶囊落到生物微胶囊喷嘴31，控制装置4驱动打印喷头21和生物微胶囊喷嘴31，打印喷头21按照该层成形信息将可降解聚合物溶液喷射到成形平台13上，随后控制装置4控制光固化光源6，将其迅速固化，形成支架外形结构区域7，在打印喷头21喷射可降解聚合物溶液的同时，生物胶囊喷嘴31逐个点种胶囊粒径为20μm的生物胶囊，形成支架孔隙结构区域8，同时生物微胶囊又作为所需的支撑结构；Z向传动机构18工作实现打印喷头21和生物胶囊喷嘴31的协调运动，Y向传动机构16控制成形平台13的位置移动。接着，计算机5把下一层的成形信息传递给控制装置4，控制装置4驱动打印喷头21和生物胶囊喷嘴31像打印第一层一样完成第二层的制备。如此反复，一层层的打印并粘结，从而快速制备出三维多孔支架。在一定的条件下，生物胶囊降解形成支架孔隙，即可得到孔隙可控的三维支架。所制备的三维多孔支架孔径200～800μm，孔隙率80％。
实施例2
与实施例1基本相同，所不同的是，生物胶囊颗粒的粒径为18μm，并且胶囊内加入了药物活性分子，制备的支架孔径200～400μm，孔隙率90％。
实施例3
与实施例1基本相同，所不同的是，生物胶囊颗粒的粒径为15μm，并且胶囊内加入了药物活性分子，制备的支架孔径100～300μm，孔隙率85％。
实施例4
与实施例1基本相同，所不同的是，生物胶囊颗粒的粒径为12μm，制备的支架孔径50～200μm，孔隙率90％。
实施例5
与实施例1基本相同，所不同的是，生物胶囊颗粒的粒径为10μm，并且胶囊内加入了药物活性分子，制备的支架孔径10～100μm，孔隙率93％。
实施例6
与实施例1基本相同，所不同的是，制造支架外形的基本材料选用带有粘结性的生物可降解型高分子聚合物，此时不需用光固化光源6及其控制系统，直接粘结成支架外形。支架孔隙的制造可与实施例1、2、3、4或5中的任一个相同。