水煎煮提取的枳实或枳壳总黄酮提取物及其用途 【技术领域】
本发明涉及一种水煎煮提取的枳实或枳壳总黄酮提取物及其用途。背景技术 功能性消化不良 (FD) 是一种常见、 多发病。 又称为胃动力不足， 或胃动力障碍。 是 一种常见的临床综合症， 国外统计资料表明， 1/3 人群患过 FD， 占门诊人数的 20％～ 30％。 国内占消化系门诊患者 50％左右， 发生于 20％～ 40％的正常人群。另外， 80％以上的肿瘤 患者化疗后会引起呕吐， 止呕主要以灭吐灵、 枢复宁等药物为主， 但化药止呕伴有倦怠、 头 晕、 头痛， 甚至有可能出现颈背肌肉痉挛症状。
目前西医治疗主要以吗叮啉、 西沙必利、 莫沙必利等为主 ； 但随其大量使用， 发现 有明显心脏毒副作用， 不少患者在应用西沙必利后出现 Q-T 间期延长及心律失常， 特别是 尖端扭转型室速等严重不良反应， 甚至导致死亡。 为此， 美国食品与药品管理局决定于 2000 年 7 月 23 日起停止使用该药， 我国药品监督管理局也对西沙必利的使用做出了限定， 但仍 可在医师指导下应用。
中医治疗以破气消积， 化痰散痞类中药 ； 治疗积滞内停， 痞满胀痛等， 枳实为代表 药之一。枳实、 枳壳为芸香科植物酸橙 Citrus aurantium L. 及其栽培变种或甜橙 Citrus sinensis Osbeckr 的干燥幼果或未成熟果实。枳实、 枳壳从 《神农本草经》 、 《名医别录》 记 载： “除胸胁痰癖， 逐停水， 破结实， 消胀满” 、 从金代医学家李东垣 《内外伤辨惑论》 中首创枳 实导滞丸以手工制作， 到目前临床配方应用及现代中药规模化生产并用于消化道疾病， 前 后有近二千年的历史 ； 枳实、 枳壳主要成分为黄酮等， 其水煎液及橙皮苷等能显著增强正常 小鼠和阿托品产生小鼠抑制模型的小肠的推进运动， 具有促胃肠动力的作用。 但枳实、 枳壳 仅少量用于临床配方及中成药制剂， 大量资源没有得到广泛应用， 其天然的破气消积作用 可能与现代促进胃动力药的作用类同性没有得到充分挖掘。发明内容 本发明的目的是提供一种水煎煮提取的枳实或枳壳总黄酮提取物， 用于胃肠运动 障碍型功能性消化不良 ； 上腹疼痛、 腹胀、 厌食、 嗳气、 恶心、 呕吐及化疗药物或其他原因引 起的呕吐。
本发明提供的枳实或枳壳总黄酮提取物， 通过将枳实或枳壳用水煎煮提取得到， 其中水煎煮提取方法是 ： 取枳实或枳壳， 切成饮片或粉碎， 加 4 ～ 15 倍量水， 煎煮 1 ～ 3 次， 每次煎煮提取 1 ～ 3 小时， 合并煎煮液， 滤过， 滤液通过已处理好的非极性大孔树脂， 依次用 水、 20％以下的乙醇洗脱除去杂质， 再用 25 ～ 90％乙醇、 0.5 ～ 2％氢氧化钠洗脱， 收集乙醇 洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.20 ～ 1.40(50℃～ 70℃ ) 的流浸膏， 减压干燥， 干燥的温 度为 60 ～ 80℃， 粉碎， 即得。
优选的， 具体的水煎煮提取方法如下 ： 取枳实或枳壳， 切成饮片或粉碎， 加 4 ～ 13 倍量水， 煎煮 2 ～ 3 次， 每次煎煮提取 1 ～ 2.5 小时， 合并煎煮液， 滤过， 滤液通过已处理好的
非极性大孔树脂， 依次用水、 20％以下的乙醇洗脱除去杂质， 再用 30％～ 85％乙醇、 0.5 ～ 1.8％氢氧化钠洗脱， 收集乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.25 ～ 1.40(55℃～ 70℃ ) 的流浸膏， 减压干燥， 干燥的温度为 65 ～ 80℃， 粉碎， 即得。
优选的， 具体的水煎煮提取方法如下 ： 取枳实或枳壳， 切成饮片或粉碎， 加 4 ～ 11 倍量水， 煎煮 2 ～ 3 次， 每次煎煮提取 1.5 ～ 2.5 小时， 合并煎煮液， 滤过， 滤液通过已处理 好的非极性大孔树脂， 依次用水、 20 ％以下的乙醇洗脱除去杂质， 再用 35 ％～ 75 ％乙醇、 0.5 ～ 1.6％氢氧化钠洗脱， 收集乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.25 ～ 1.35(55℃～ 65℃ ) 的流浸膏， 减压干燥， 干燥的温度为 70 ～ 80℃， 粉碎， 即得。
优选的， 具体的水煎煮提取方法如下 ： 取枳实或枳壳， 切成饮片或粉碎， 加4～9倍 量水， 煎煮 3 次， 每次煎煮提取 1.5 ～ 2 小时， 合并煎煮液， 滤过， 滤液通过已处理好的非极 性大孔树脂， 依次用水、 20％以下的乙醇洗脱除去杂质， 再用 40％～ 65％乙醇、 0.5 ～ 1.3％ 氢氧化钠洗脱， 收集乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.30 ～ 1.35(60℃～ 65℃ ) 的流 浸膏， 减压干燥， 干燥的温度为 70 ～ 75℃， 粉碎， 即得。
优选的， 具体的水煎煮提取方法如下 ： 取枳实或枳壳， 切成饮片或粉碎， 加4～7倍 量水， 煎煮 3 次， 每次煎煮提取 2 小时， 合并煎煮液， 滤过， 滤液通过已处理好的非极性大孔 树脂， 依次用水、 20％以下的乙醇洗脱除去杂质， 再用 45％～ 55％乙醇、 0.8 ～ 1.2％氢氧化 钠洗脱， 收集乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.30(60℃ ) 的流浸膏， 减压干燥， 干燥的 温度为 75℃， 粉碎， 即得。
优选的， 具体的水煎煮提取方法如下 ： 取枳实或枳壳， 切成饮片或粉碎， 加4～8倍 量水， 煎煮 2 次， 每次煎煮提取 1.5 小时， 合并煎煮液， 滤过， 滤液通过已处理好的非极性大 孔树脂， 依次用水、 20％以下的乙醇洗脱除去杂质， 再用 40％～ 55％乙醇、 0.7 ～ 1.3％氢氧 化钠洗脱， 收集乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.30(60℃ ) 的流浸膏， 减压干燥， ， 干 燥的温度为 75℃， 粉碎， 即得。
优选的， 具体的水煎煮提取方法如下 ： 取枳实或枳壳， 切成饮片或粉碎， 加4～6倍 量水， 煎煮 2 次， 每次煎煮提取 1.5 小时， 合并煎煮液， 滤过， 滤液通过已处理好的非极性大 孔树脂， 依次用水、 20％以下的乙醇洗脱除去杂质， 再用 45％～ 50％乙醇、 0.9 ～ 1.1％氢氧 化钠洗脱， 收集乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.30(60℃ ) 的流浸膏， 减压干燥， ， 干 燥的温度为 75℃， 粉碎， 即得。
优选的， 具体的水煎煮提取方法如下 ： 取枳实或枳壳， 粉碎， 加水煎煮 3 次， 第一 次加 8 倍量水煮 2 小时， 第二、 三次分别加 6、 4 倍量煎煮 1 小时， 滤过， 合并滤液， 依次用 水、 15％乙醇、 45％乙醇、 1％氢氧化钠洗脱， 收集 45％乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.30(60℃ ) 的流浸膏， 减压干燥， 干燥的温度为 75℃， 粉碎， 即得。
优选的， 其中 15％乙醇部分洗脱体积为每 1ml 树脂用 3ml 洗脱， 45％乙醇洗脱时选 择每 1ml 树脂用 4ml 洗脱。
优选的， 其中枳实或枳壳通过 8 目筛粉碎。
优选的， 其中总黄酮含量 50％以上。
优选的， 其中总黄酮含量 80％以上。
优选的， 其中还包含黄酮类化学成分及其医学上可以接受的酚酸类成分， 黄酮类 化学成分含柚皮苷、 新橙皮苷、 橙皮苷、 新柚皮苷、 野漆树苷及其苷元中的一种或多种。优选的， 其中柚皮苷含量、 新橙皮苷含量分别达 25％以上。
优选的， 其中大孔树脂上样量按树脂体积 (ml) ∶生药质量 (g) 为 5 ∶ 1。
优选的， 其中每 1ml 树脂的上样流速在 1.25 ～ 1.55ml/h 之间。
优选的， 其中每 1ml 树脂的洗脱流速为 1.25 ～ 1.45ml/h 之间， 所述非极性大孔树 脂径高比为 1 ∶ 10， 上样后药液的静态吸附时间为 1 小时。
优选的， 其中所述非极性大孔树脂重复 8 次后用 10 倍量的 5％氢氧化钠溶液浸泡 2 小时， 用水洗至中性 ； 再用 10 倍量的 3％盐酸溶液浸泡 2 小时， 用水洗至中性以再生后使 用。
一方面， 本发明提供了枳实或枳壳总黄酮提取物用于制备治疗胃肠运动障碍型功 能性消化不良疾病药物的用途。
在一方面， 本发明提供了枳实或枳壳总黄酮提取物用于制备治疗化疗药物或其他 原因引起的呕吐疾病药物的用途。
在一方面， 本发明提供了枳实或枳壳总黄酮提取物用于制备治疗上腹疼痛疾病药 物的用途。
在一方面， 本发明提供了枳实或枳壳总黄酮提取物用于制备治疗腹胀、 厌食、 嗳气 疾病药物的用途。
在一方面， 本发明提供了枳实或枳壳总黄酮提取物用于制备治疗恶心疾病药物的用途。 另一方面， 本发明还提供了一种枳实或枳壳总黄酮提取物制剂， 该制剂以所述的 枳实或枳壳总黄酮提取物为主要活性成分。
实验数据证明， 本发明水煎煮提取获得的枳实或枳壳总黄酮提取物， 可用于治疗 胃肠运动障碍型功能性消化不良 ； 上腹疼痛、 腹胀、 厌食、 嗳气、 恶心、 呕吐及化疗药物或其 他原因引起的呕吐。
更重要地是， 发明水煎煮提取获得的枳实或枳壳总黄酮提取物除具有显著的促进 胃动力作用外， 还对顺铂等药物所致的呕吐极其有效， 具有吗叮啉所没有的效果。 同时又没 有西沙必利、 莫沙必利的心脏毒副作用， 能彻底避免西沙必利、 莫沙必利导致的心脏安全性 风险。
而医学和药学研究人员无法预先在不做实验的前提下， 预先得知发明水煎煮提取 获得的枳实或枳壳总黄酮提取物具有上述良好的效果。
综上所述， 本发明水煎煮提取获得的枳实或枳壳总黄酮提取物及其用途带来显著 的技术效果。
具体实施方式
实施例 1
制备方法 ： 取枳实或枳壳， 切成饮片， 加 7 倍量水， 煎煮 3 次， 每次煎煮提取 1 小 时， 合并煎煮液， 滤过， 滤液通过已处理好的 D101 大孔树脂， 依次用水、 18％乙醇洗脱除去 杂质， 再用 35％乙醇、 0.5％氢氧化钠洗脱， 收集 35％乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.25(55℃ ) 的流浸膏， 减压干燥 (60℃ )， 粉碎， 即得。
实施例 2制备方法 ： 取枳实或枳壳， 粉碎， 通过 8 目筛， 加水煎煮 3 次， 第一次加 8 倍量水 煮 2.5 小时， 第二、 三次分别加 6、 5 倍量煎煮 1 小时， 滤过， 合并滤液， 滤液通过已处理好 的 AB-8 大孔树脂柱， 依次用水、 15％乙醇、 45％乙醇、 1％氢氧化钠洗脱， 收集 45％乙醇洗脱 液， 减压浓缩至相对密度约 1.31(65℃ ) 的流浸膏， 减压干燥 (70℃ )， 粉碎， 即得。
实施例 3
制备方法 ： 取枳实或枳壳， 切成饮片， 加 8 倍量水， 煎煮 3 次， 每次煎煮提取 1.5 小 时， 合并煎煮液， 滤过， 滤液通过已处理好的 D101 大孔树脂， 依次用水、 16％乙醇洗脱除去 杂质， 再用 40％乙醇、 0.6％氢氧化钠洗脱， 收集 40％乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.20(50℃ ) 的流浸膏， 减压干燥 (65℃ )， 粉碎， 即得。
实施例 4
制备方法 ： 取枳实或枳壳， 切成饮片， 加 9 倍量水， 煎煮 2 次， 每次煎煮提取 2 小 时， 合并煎煮液， 滤过， 滤液通过已处理好的 D101 大孔树脂， 依次用水、 15％乙醇洗脱除去 杂质， 再用 45％乙醇、 0.7％氢氧化钠洗脱， 收集 45％乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.25(55℃ ) 的流浸膏， 减压干燥 (65℃ )， 粉碎， 即得。
实施例 5 制备方法 ： 取枳实或枳壳， 粉碎， 通过 8 目筛， 加水煎煮 2 次， 第一次加 8 倍量水煮 2 小时， 第二、 三次分别加 7 倍量煎煮 1 小时， 滤过， 合并滤液， 滤液通过已处理好的 D101 大 孔树脂柱， 依次用水、 14％乙醇、 40％乙醇、 0.9％氢氧化钠洗脱， 收集 40％乙醇洗脱液， 减压 浓缩至相对密度约 1.32(70℃ ) 的流浸膏， 减压干燥 (70℃ )， 粉碎， 即得。
实施例 6
制备方法 ： 取枳实或枳壳， 粉碎， 通过 8 目筛， 加水煎煮 3 次， 第一次加 8 倍量水煮 2 小时， 第二、 三次分别加 7、 6 倍量煎煮 1.0 小时， 滤过， 合并滤液， 滤液通过已处理好的 AB-8 大孔树脂柱， 依次用水、 16％乙醇、 45％乙醇、 1.1％氢氧化钠洗脱， 收集 45％乙醇洗脱液， 减 压浓缩至相对密度约 1.29(60℃ ) 的流浸膏， 减压干燥 (75℃ )， 粉碎， 即得。
实施例 7
制备方法 ： 取枳实或枳壳， 粉碎， 加 10 倍量水， 煎煮 3 次， 每次煎煮提取 1 小时， 合并煎煮液， 滤过， 滤液通过已处理好的 AB-8 大孔树脂， 依次用水、 14 ％乙醇洗脱除去杂 质， 再用 50 ％乙醇、 0.8 ％氢氧化钠洗脱， 收集 50 ％乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.30(55℃ ) 的流浸膏， 减压干燥 (65℃ )， 粉碎， 即得。
实施例 8
制备方法 ： 取枳实或枳壳， 粉碎， 通过 8 目筛， 加水煎煮 3 次， 第一次加 8 倍量水煮 1.5 小时， 第二、 三次分别加 6 倍量煎煮 1 小时， 滤过， 合并滤液， 滤液通过已处理好的 D101 大孔树脂柱， 依次用水、 12％乙醇、 45％乙醇、 0.8％氢氧化钠洗脱， 收集 45％乙醇洗脱液， 减 压浓缩至相对密度约 1.30(60℃ ) 的流浸膏， 减压干燥 (75℃ )， 粉碎， 即得。
实施例 9
制备方法 ： 取枳实或枳壳， 粉碎， 加 11 倍量水， 煎煮 2 次， 每次煎煮提取 1.5 小 时， 合并煎煮液， 滤过， 滤液通过已处理好的 AB-8 大孔树脂， 依次用水、 13％乙醇洗脱除去 杂质， 再用 55％乙醇、 0.9％氢氧化钠洗脱， 收集 55％乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.30(60℃ ) 的流浸膏， 减压干燥 (70℃ )， 粉碎， 即得。
实施例 10
制备方法 ： 取枳实或枳壳， 粉碎， 通过 8 目筛， 加水煎煮 2 次， 第一次加 8 倍量水煮 2 小时， 第二、 三次分别加 6、 5 倍量煎煮 1.5 小时， 滤过， 合并滤液， 滤液通过已处理好的 D101 大孔树脂柱， 依次用水、 15％乙醇、 45％乙醇、 1％氢氧化钠洗脱， 收集 45％乙醇洗脱液， 减压 浓缩至相对密度约 1.30(60℃ ) 的流浸膏， 减压干燥 (75℃ )， 粉碎， 即得。实施例 11
实施例 11
制备方法 ： 取枳实或枳壳， 粉碎， 通过 8 目筛， 加水煎煮 3 次， 第一次加 8 倍量水煮 2 小时， 第二、 三次分别加 6、 4 倍量煎煮 1 小时， 滤过， 合并滤液， 滤液通过已处理好的 D101 大孔树脂柱， 依次用水、 15％乙醇、 45％乙醇、 1％氢氧化钠洗脱， 收集 45％乙醇洗脱液， 减压 浓缩至相对密度约 1.30(60℃ ) 的流浸膏， 减压干燥 (75℃ )， 粉碎， 即得。
实验数据 1 ： 提取工艺优化研究
黄酮苷类化合物一般易溶于热水、 甲醇、 乙醇、 吡啶及稀碱溶液中， 而难溶或不溶 于苯、 乙醚、 氯仿、 石油醚等有机溶剂中。枳实中的主要活性成分是以柚皮苷和新橙皮苷为 代表的二氢黄酮类成分， 这些二氢黄酮的极性比一般的黄酮类成分都大， 可溶于水及低浓 度乙醇中， 易溶于热水或热的稀乙醇溶液。 根据药材中所含主要化学成分的理化性质， 参考有关文献， 同时结合预试验结果， 采用水煎煮， 煎煮液上大孔树脂纯化的方法。
考察指标分别为得膏率、 总黄酮含量和总黄酮的转移率
1. 提取工艺条件的优选
1.1 提取溶剂的选择
将枳实药材粉碎过 8 目筛， 取 12 份， 分为 4 组， 每组平均三份， 各自用水、 65 ％乙 醇、 95％乙醇和饱和石灰水煎煮。结果见表 1。
表 1 提取溶剂的选择
结论 ： 由表 1 可知， 乙醇提取总黄酮转移率较低， 水提取总黄酮转移率达 90 ％以 上， 但水低于 65％乙醇提取效果， 综合生产成本， 结合工业化生产实际情况， 选择水为提取 溶剂。
1.2 药材粒度的选择
将粉碎好的枳实过筛， 各取饮片、 8 目、 20 目、 40 目、 60 目、 120 目三份， 共 18 份， 分 别加水煎煮。结果见表 2。
表 2 药材粒度的选择
结论 ： 由表 2 中有关数据可知， 用水煎煮时， 药材的粒度有很大的差别， 并不是药 材颗粒越细越好， 其中以过 8 目筛的得膏率和总黄酮苷的转移率最高， 故选择 8 目作为药材 最终的粉碎粒度。
1.3 正交试验法优选提取工艺
根据以上的实验结果， 现以煎煮过程中煎煮时间 (A)、 煎煮次数 (B)、 加水量 (C)、 4 煎煮前浸泡时间 (D) 四项作为考察因素， 每一因素设三个水平， 按 L9(3 ) 正交表进行正交 实验设计 ( 表 3、 表 4)， 考察指标为得膏率和总黄酮苷转移率。
表 3 因素水平表
取枳实药材 (8 目 )27 份， 每组平均三份， 共九组， 按表 4 L9(34) 正交试验表设计 试验。结果见表 4。
表 4 L9(34) 正交试验表
(1) 直观分析 ： 从得膏率 Ra 最佳工艺 ： B3C3A1D1(B、 C 为主要因素 ) 总黄酮苷转移率最佳工艺 ： B3C3A1D1(B、 C 为主要因素 ) (2) 方差分析 结果见表 5。 表 5 以总黄酮苷转移率为指标的方差分析
** F1-0.05(2， F1-0.01(2， 2) ＝ 99.0 2) ＝ 19.0
(3) 结论 ： 直观分析可知， 煎煮次数 (B) 及所用溶剂体积 (C) 对煎煮效果影响较 大， 煎煮时间 (A) 及浸泡时间 (D) 对煎煮效果影响较小。以转移率为指标进行方差分析， 表 5 分析结果进一步验证了直观分析结论， 即所设因素 C、 B 依次对煎煮效果有较大影响。由 于因素 A 对煎煮效果影响较小， 而第一煎药液还没有完全渗入药材组织内部， 根据生产实 际情况， 第一煎增加一小时， 由此初步确定煎煮条件为 ： 加 18 倍量水 ( 与药材重量比 ) 提 3 次 (8 倍、 6 倍、 4 倍 )， 煎煮时间分别为 2h、 1h、 1h， 药材不浸泡。
*2. 验证试验
取枳实药材 ( 过 8 目筛 )3 份， 按正交试验选取的最佳提取工艺条件进行验证试 验， 即： 18 倍量水 (8 倍 /2h、 6 倍 /1h、 4 倍 /1h) 分别煎煮 3 次， 药材不浸泡。结果见表 6。
表 6 验证试验测定结果
结论 ： 由表 6 可知， 按优选工艺水煎煮 3 次， 总黄酮苷已有 92％以上被煎出， 且三 个样品总黄酮苷转移率较为一致 (RSD 为 1.73％ )， 结果显示最后确定的最佳提取工艺是合 理、 稳定的。
实验数据 2 ： 枳实总黄酮提取物的纯化研究
2.1 分离纯化工艺考察
枳实药材用水提取后提出大量水溶性杂质， 必须对水提液进行进一步纯化处理， 以提高黄酮类有效成分的含量， 水溶性杂质多为无机盐、 糖类、 果胶及蛋白质类， 而枳实中 的活性成分为黄酮类化合物， 根据黄酮类化物特性及目前我国常用的分离纯化方法， 因此 选择用大孔树脂来富集纯化该黄酮类成分。
首先通过初步上样量考察实验， 初步确定每 1000ml 大孔树脂上样 5000ml 提取液， 即树脂体积∶生药质量为 4 ∶ 1。
再进一步地， 通过上样量考察， 最终确定 1000ml 的大孔树脂吸附 200g 生药作为最 终的上样量 ( 即 0.2g 生药 /ml 树脂 )。
之后， 通过洗脱体积的考察， 确定 15％乙醇部分洗脱体积确定为 3000ml( 即每 1ml 树脂用 3ml 15％乙醇洗脱 )， 45％乙醇洗脱时选择用 4000ml( 即 1ml 树脂用 4ml 45％乙醇 洗脱 )。
再进一步地， 通过上样流速的考察， 确定上样流速应选择在 1250ml/h ～ 1550ml/h 之间较好 ( 即每 1ml 树脂的上样流速在 1.25 ～ 1.55ml/h 之间 )。2.2 正交优选大孔树脂 优化工艺
根据以上的实验结果， 现以洗脱流速、 大孔树脂的径高比和上样后药液的静态吸 附时间三项作为考察因素， 每一因素设三个水平， 按 L9(34) 正交表进行正交实验设计 ( 表 7、 表 8)， 考察指标为得膏率、 总黄酮苷的含量和总黄酮苷转移率。
表 7 因素水平表
取枳实药材 ( 过 8 目筛 ) 提取， 提取液均分为 9 份， 每份 4000ml( 相当于 200g 生 4 药 ) 药液共九份， 按表 8 L9(3 ) 上预先处理好的大孔树脂 ( 每根树脂装 1000ml 大孔树脂 )， 分别用 4000ml 的水、 3000ml 15％的乙醇、 4000ml 45％乙醇和 3000ml 95％乙醇洗脱。 结果 见表 8。
表 8 L9(34) 正交试验表
(1) 直观分析 根据 R 值分析， 得膏率最佳工艺 ： A1B3C1(A 为主要因素 ) 根据 R 值分析， 总黄酮苷转移率最佳工艺 ： A1B1C2(A 为主要因素 ) (2) 方差分析 结果见表 9、 表 10。 表 9 以得膏率为指标的方差分析
表 10 以总黄酮苷转移率为指标的方差分析* F1-0.19(2， F1-0.05(2， 2) ＝ 9.00 2) ＝ 19.0
(3) 结论 ： 直观分析可知， 树脂的洗脱流速 (A) 为主要因素， 大孔树脂的径高比 (C) 和上样后药液的静态吸附时间 (B) 影响较小。再以得膏率和总黄酮苷的转移率为指标进行 方差分析， 表 9、 10 中分析结果进一步验证了直观分析结论， 即所设因素 A 对洗脱效果有较 大影响。由于总黄酮含量为本项目的主要指标， 因此， 初步确定最佳条件为 A1B1C2 即 ： 洗脱 流速为 1250 ～ 1450ml/h( 即每 1ml 树脂的洗脱流速为 1.25 ～ 1.45ml/h 之间 )， 径高比为 1 ∶ 10， 上样后药液的静态吸附时间为 1 小时。
2.3 验证试验及树脂使用次数试验
取枳实药材 ( 过 8 目筛 ) 提取， 提取液取为 13 份， 每份 4000ml( 相当于 200g 生 药 )， 冷藏， 备用。
a. 取 1 份上样于 1000ml 大孔树脂 ( 树脂柱径高比为 1 ∶ 10)， 上样流速为 1400ml/ h， 静态吸附 1 小时。依次用 4000ml 的水、 3000ml 15％的乙醇、 4000ml 45％乙醇和 3000ml 95％乙醇洗脱以 1400ml/h 的流速洗脱。 收集 45％乙醇洗脱液进行含量测定。 结果见表 11。
b. 将 a 用后的树脂以水洗至无醇味， 另取一份冰箱冷藏的样品上此树脂， 按 a 的步 骤重复处理。树脂依次进行下次吸附 ( 以下步骤同 a.b)。
表 11 验证试验测定结果
△
结论 ： 从表 11 中可以看出按最佳工艺所进行的验证试验， 重复 8 次所得的样品总 黄酮苷含量和总黄酮苷转移率均有所提高。且样品的各项指标均一， 稳定， 说明此工艺最 佳、 稳定的。同时在使用 8 次以后需要对树脂进行再生处理。
2.4 树脂再生后使用试验
将树脂用 10 倍量的 5％氢氧化钠溶液浸泡 2 小时， 用水洗至中性 ； 再用 10 倍量的 3％盐酸溶液浸泡 2 小时， 用水洗至中性。再生好的树脂， 按验证试验及树脂使用次数试验 项下方法依次吸附洗脱 3 次， 计算得膏率， 液相检测总黄酮苷含量和转移率。结果见表 12。
表 12 树脂再生后使用试验
结果显示树脂再生后使用情况良好。
根据上述分离、 纯化研究， 药材提取后合并提取液， 滤过， 滤液通过已处理好的 D101 大孔树脂柱， 依次用水、 15％乙醇、 45％乙醇、 1％氢氧化钠洗脱， 收集 45％乙醇洗脱液。
实验数据 3 ： 枳实总黄酮提取物干燥方法及干燥温度的研究
取枳实药材 1kg， 共 10 份， 照上述确定的提取、 纯化工艺， 经提取、 纯化后， 收集 45 ％乙醇洗脱液， 减压回收乙醇并浓缩至相对密度约 1.30(60 ℃ ) 的浸膏， 对上述浸膏分 别采用烘干法、 真空干燥法进行比较研究。烘干法和真空干燥法分别进行 5 种不同温度 (50℃、 65℃、 75℃、 85℃、 95℃ ) 的比较。考察总黄酮苷的含量。结果见表 13 和表 14。
表 13 烘干法不同温度的测定结果
表 14 真空干燥法不同温度的测定结果
从表 13、 14 可知， 烘干法在同一温度水平上较真空干燥所需时间长， 效果不如真 空干燥。烘干法烘干的样品色泽较差， 不易粉碎， 且随着温度的上升， 烘干法易因局部过热 而引起碳化， 从而造成样品颜色发黑， 有效成分丢失。真空干燥时易拉干成蜂窝状， 有利于 粉碎， 且色泽较好， 同时真空干燥的温度控制在 75℃左右为宜， 省时又不会造成有效成分的 丢失。
以下全部选用实施例 11 枳实总黄酮苷提取物作为实验组
实验数据 4 ： 枳实总黄酮苷提取物镇吐作用
4.1 枳实总黄酮苷提取物对硫酸铜致家鸽呕吐的影响
家鸽 60 只， 体重 280 ～ 350g， 雌雄各半。随机分为 6 组 ： 对照组、 实施例 11 枳实总 -1 黄酮苷提取物 (20、 40、 80、 160mg· kg )4 个剂量组以及阳性药组 ( 吗丁琳 40mg· kg-1)， 每组 10 只， ♀♂各半。各组家鸽禁食不禁水 16 小时， 次日一次给药， 对照组给予蒸馏水灌胃， 其 -1 -1 他组灌胃相应药物， 10ml·kg 。1 小时后各组家鸽给予 3.5％的硫酸铜溶液 10mg·kg 灌 胃造模。记录各组家鸽呕吐潜伏时间和 2 小时内呕吐次数， 试验结果显示， 枳实总黄酮苷提 -1 取物 (20、 40、 80、 160mg·kg ) 一次给药均不能延长硫酸铜所致家鸽的呕吐潜伏时间， 但枳 -1 实总黄酮苷提取物 (40、 80mg·kg ) 一次给药能减少硫酸铜所致家鸽的呕吐次数， 见表 15。
表 15 枳实总黄酮苷提取物对硫酸铜致家鸽呕吐的影响
* ** 注： 与对照组比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01
4.2 枳实总黄酮苷提取物对顺铂致家鸽呕吐的影响
家鸽 80 只， 体重 280 ～ 350g， 雌雄各半。随机分为 8 组 ： 对照组、 实施例 11 枳实总 -1 黄酮苷提取物 (20、 40、 80、 160mg· kg )4 个剂量组以及阳性药 3 组 ( 吗丁琳 80、 160mg· kg-1 和盐酸昂丹司琼注射液 5ug· kg-1) 每组 10 只， ♀♂各半。 各组家鸽禁食不禁水 16 小时， 次日 一次给药， 对照组给予蒸馏水灌胃， 其他组给予相应药物， 1 小时后腹腔注射给予 13mg· kg-1 的注射用顺铂。记录各组家鸽呕吐潜伏时间和 4 小时内呕吐次数， 试验结果显示， 枳实总黄 -1 酮苷提取物 80mg·kg 一次给药能延长顺铂所致家鸽的呕吐时间， 但 20、 40 和 160mg·kg-1 时均不能延长顺铂所致家鸽的呕吐时间 ； 枳实总黄酮苷提取物 (80、 160mg·kg-1) 一次给药 能减少顺铂所致家鸽的呕吐次数， 见表 16
表 16 枳实总黄酮苷提取物对顺铂致家鸽呕吐的影响
* ** 注： 与对照组比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01
4.3 枳实总黄酮苷提取物对阿朴吗啡致杂种犬呕吐的影响
杂种犬 56 只， 体重 8.0 ～ 10.0kg， 雌雄各半。随机分为 7 组 ： 对照组、 实施例 11 枳 -1 实总黄酮苷提取物 (15、 30、 60、 120mg· kg )4 个剂量组以及阳性药 2 组 ( 吗丁啉 30mg· kg-1 和盐酸甲氧氯普胺注射液 1mg·kg-1)， 每组 8 只， ♀♂各半。各组杂种犬禁食不禁水 16 小 时， 次日一次给药， 对照组给予蒸馏水灌胃， 其他组给予相应药物灌胃， 5ml·kg-1。1 小时后 给予 500ug·kg-1 的阿朴吗啡皮下注射。记录各组杂种犬呕吐潜伏时间和 1 小时内呕吐次 数。试验结果显示， 枳实总黄酮苷提取物 (15、 30、 60、 120mg·kg-1) 一次给药均不能减少阿 朴吗啡致杂种犬呕吐次数 ； 枳实总黄酮苷提取物 (15、 30、 120mg· kg-1) 亦不能延长阿朴吗啡 致杂种犬的呕吐潜伏时间， 但枳实总黄酮苷提取物 60mg·kg-1 时能延长杂种犬的呕吐潜伏
时间， 见表 17。
表 17 枳实总黄酮苷提取物对阿朴吗啡致杂种犬呕吐的影响
* 注： 与对照组比较， P ＜ 0.05 实验数据 5 ： 枳实总黄酮苷提取物对肠推进作用 5.1 枳实总黄酮苷提取物对多巴胺致肠功能低下小鼠的影响小鼠 70 只， 体重 19 ～ 22g， 随机分为 7 组 ： 对照组、 模型组、 实施例 11 枳实总黄酮 苷提取物 (25、 50、 100、 200mg·kg-1)4 个剂量组以及阳性药组 ( 吗丁啉 50mg·kg-1)， 每组 10 只， ♀♂各半。各组小鼠禁食不禁水 16 小时， 次日一次给药， 对照组灌胃蒸馏水， 其他组 给予相应药物灌胃。各小鼠灌胃 30 分钟后除对照组外， 其余小鼠给予 1.7mg·kg-1 盐酸多 巴胺注射液皮下注射造模， 20 分钟后 70 只小鼠分别灌服 2％的羧甲基纤维素钠碳末混悬液 0.2ml·10g-1， 20 分钟后小鼠脱颈处死， 立即取出胃肠， 平铺， 测定碳末前端至幽门的距离和 小肠全长， 以两者之比计算推进百分率。试验结果显示， 皮下注射 1.7mg·kg-1 的多巴胺可 明显抑制小鼠的肠推进， 枳实总黄酮苷提取物 (25、 50、 100mg· kg-1) 能提高由多巴胺抑制的 小鼠肠推进活动， 见表 18。
表 18 枳实总黄酮苷提取物对多巴胺致小鼠肠推进的影响
小鼠 70 只， 体重 19 ～ 22g， 随机分为 7 组 ： 对照组、 模型组、 实施例 11 枳实总黄酮 -1 苷提取物 (25、 50、 100、 200mg·kg )4 个剂量组以及阳性药组 ( 吗丁啉 50mg·kg-1)， 每组 10
只， ♀♂各半。各组小鼠禁食不禁水 16 小时， 次日一次给药， 对照组灌胃蒸馏水， 其他组给 -1 予相应药物灌胃。 各小鼠灌胃 30 分钟后除对照组外， 其余小鼠给予 2.5mg· kg 的阿托品皮 下注射造模， 20 分钟后 70 只小鼠分别灌服 2％的羧甲基纤维素钠碳末混悬液 0.2ml· 10g-1， 20 分钟后小鼠脱颈处死， 立即取出胃肠， 平铺， 测定碳末前端至幽门的距离和小肠全长， 以 -1 两者之比计算推进百分率。试验结果显示， 皮下注射 2.5mg· kg 的阿托品可明显抑制小鼠 的肠推进， 枳实总黄酮苷提取物 50mg·kg-1 能提高由阿托品抑制的小鼠肠推进活动， 见表 19。
表 19 枳实总黄酮苷提取物对阿托品致小鼠肠推进的影响
△ * 注： 与对照组比较， P ＜ 0.05 ； 与模型组比较， P ＜ 0.05
5.3 枳实总黄酮苷提取物对肾上腺素致肠功能低下小鼠的影响
小鼠 70 只， 体重 19 ～ 22g， 随机分为 7 组 ： 对照组、 模型组、 实施例 11 枳实总黄酮 苷提取物 (25、 50、 100、 200mg·kg-1)4 个剂量组以及阳性药组 ( 吗丁啉 50mg·kg-1)， 每组 10 只， ♀♂各半。各组小鼠禁食不禁水 16 小时， 次日一次给药， 对照组灌胃蒸馏水， 其他组 -1 给予相应药物灌胃。各小鼠灌胃 30 分钟后除对照组外， 其余小鼠给予 0.5mg·kg 的盐酸 肾上腺素注射液皮下注射造模， 20 分钟后 70 只小鼠分别灌服 2％的羧甲基纤维素钠碳末混 悬液 0.2ml·10g-1， 20 分钟后小鼠脱颈处死， 立即取出胃肠， 平铺， 测定碳末前端至幽门的 距离和小肠全长， 以两者之比计算推进百分率。试验结果显示， 皮下注射 0.5mg·kg-1 的肾 上腺素可明显抑制小鼠的肠推进， 枳实总黄酮苷提取物 (25、 50、 100、 200mg· kg-1) 均不能改 善由肾上腺素抑制的小鼠肠推进活动， 见表 20。
表 20 枳实总黄酮苷提取物对肾上腺素致小鼠肠推进的影响
△△ 注： 与对照组比较， P ＜ 0.01
实验数据 6 ： 枳实总黄酮苷提取物对胃液分泌量、 胃酸和胃蛋白酶的影响
6.1 对胃液分泌量、 胃酸的影响
大鼠 48 只， 体重 230 ～ 270g， 随机分为 6 组 ： 对照组、 实施例 11 枳实总黄酮苷提 -1 取物 (20、 40、 80、 160mg·kg )4 个剂量组以及阳性药组 ( 吗丁啉 40mg·kg-1)， 每组 8 只， ♀♂各半。试验前大鼠禁食不禁水 36 小时， 大鼠一次灌胃给药， 对照组给予蒸馏水， 其他组 给予相应药物。给药同时， 各大鼠在乙醚浅麻醉下， 打开腹腔， 结扎幽门， 收集幽门结扎后 5 小时的大鼠胃液， 以 3000r/min 离心 5min， 去处食物残渣等胃内容物， 用量筒准确称量胃液 量。量取胃液 1ml， 置于三角烧瓶中加入等量蒸馏水， 混合均匀， 加入游离酸指示剂 0.5％对 二甲基偶氮苯胺乙醇溶液和总酸指示剂 0.5％酚酞乙醇溶液各 2 滴， 混合胃液中若含有盐 ， 边加边摇动烧瓶， 至红色消失， 开始出 酸， 即呈樱红色。用滴定管滴加 0.01mol/L 的 NaOH， 现桔黄色为止。即为游离盐酸的终点。记下用去 NaOH 至红色不再变深为止的量， 即为总酸 度的终点。记下两次滴定用去 NaOH 溶液总量。计算游离盐酸和总酸的浓度以及总分泌量。 试验结果显示， 枳实总黄酮苷提取物 (20、 40、 80mg·kg-1) 对幽门结扎大鼠的胃液分泌量无
明显影响， 但枳实总黄酮苷提取物 160mg·kg-1 可减少大鼠的胃液分泌量 ； 枳实总黄酮苷提 -1 取物 (80、 160mg·kg ) 可升高幽门结扎大鼠游离盐酸和总酸的浓度， 但枳实总黄酮苷提取 -1 物各剂量 (20、 40、 80、 160mg·kg ) 对游离盐酸和总酸的分泌量无影响， 见表 21。
表 21 枳实总黄酮苷提取物对大鼠胃液分泌量、 游离盐酸和总酸浓度的影响
注： 与对照组比较， *P ＜ 0.05， **P ＜ 0.01将内径 1 ～ 2mm 粗细匀称的毛细玻管洗净烤干， 取适量蛋清充分打匀后用纱布过 滤， 将上述毛细玻璃管利用虹吸作用， 灌满蛋清 ( 管内应无气泡混入 )。然后放置于 85℃热 蒸气中使蛋白质凝固。待冷却后， 取出石蜡将蛋白管两端封固， 贮冰箱中备用。实验时取胃 液 1ml 放入 50ml 的三角烧瓶中， 加 0.05N 盐酸溶液 15ml， 摇匀， 放进约长 2.5cm 蛋白管二 根。塞好瓶口， 放于 37℃恒温箱中温孵 24h。用尺测量蛋白管两端透明部分的长度 (mm) 以 四端之值求其平均值， 用下列公式计算胃蛋白酶的单位＝平均值 2×16。试验结果显示， 实 -1 施例 11 枳实总黄酮苷提取物各剂量 (20、 40、 80、 160mg·kg ) 对幽门结扎大鼠的胃蛋白酶 活性无明显影响， 见表 22。
表 22 枳实总黄酮苷提取物对大鼠游离盐酸、 总酸分泌量和胃蛋白酶活性的影响
实验数据 7 ： 枳实总黄酮苷提取物对平滑肌的影响
7.1 对离体胃肠平滑肌的影响
选用健康成年大鼠， 猛击头部致昏， 迅速取出全胃及十二指肠中段 1-2cm， 沿胃 大弯处剪开， 用含 95％ O2 和 5％ CO2 的混合气体充分饱和的 pH 7.35 ～ 7.45 的 Krebs 液 ( 成 份： NaCl 117mmol/L、 KCl 4.8mmol/L、 CaCl2 2.5mmol/L、 MgCl2 1.2mmol/L、 NaH2PO4 1.2mmol/L、 NaHCO3 25mmol/L、 Glucose 11mmol/L) 反 复 冲 洗 去 除 内 容 物， 分别取胃窦 和胃底纵、 横肌条以及十二指肠中段长约 1cm， 宽约 0.5cm， 底端固定于通气钩， 上端与 换能器 (JH-2 型肌张力传感器 ) 相连， 并将其置入盛有氧饱和的 Krebs 液 (pH 7.35 ～ 7.45)20ml 的浴管中， 调整前负荷为 1g， 每隔 20min 换液一次， 通过通气钩向浴液内注入氧 气， 应用 BL-420E 生物机能实验系统记录其张力及频率。外管经恒流输液泵 [ 持续、 恒温 (37±0.5℃ )、 恒速 (3 ～ 4ml/min)] 灌流以保持浴槽内温度。 待标本稳定后， 加入待测药品 最终浓度分别为 0.25mg/L、 0.4mg/L、 0.55mg/L、 0.7mg/L、 0.85mg/L 和 1.00mg/L， 记录并观 察用药前后频率及张力改变。 离体试验结果显示， 实施例 11 枳实总黄酮苷提取物 (0.25mg. -1 -1 ml ～ 1.0mg.ml ) 可降低胃窦和胃底纵、 横形肌以及十二指肠平滑肌张力， 抑制胃肠运动， 见表 23 ～ 27。
表 23 枳实总黄酮苷提取物对离体胃窦横行肌张力和频率的影响
* ** 注： 与给药前比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01表 24 枳实总黄酮苷提取物对离体胃窦纵行肌张力和频率的影响
* ** 注： 与给药前比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01表 25 枳实总黄酮苷提取物对离体胃底横行肌张力和频率的影响
* ** 注： 与给药前比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01表 26 枳实总黄酮苷提取物对离体胃底纵行肌张力和频率的影响
* ** 注： 与给药前比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01表 27 枳实总黄酮苷提取物对离体十二指肠中段张力和频率的影响* ** 注： 与给药前比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.01
7.2 对在体十二指肠平滑肌的影响
大鼠 56 只， 体重 180 ～ 230g， 随机分为 7 组 ： 对照组、 模型组、 实施例 11 枳实总黄 -1 酮苷提取物 (20、 40、 80、 160mg·kg )4 个剂量组以及阳性药组 ( 吗丁琳 40mg·kg-1)， 每组 8 只， ♀♂各半。大鼠灌胃给药， 对照组和模型组给予蒸馏水， 其他组给予相应药物。各组 大鼠禁食不禁水 16 小时， 次日一次给药， 各大鼠灌胃 30 分钟后除对照组外， 其余大鼠给予 -1 1.5mg·kg 的盐酸多巴胺注射液皮下注射造模， 水合氯醛麻醉， 沿腹正中线打开腹腔， 选择 十二指肠中段约 2-3cm， 将肠段两端用缝合线固定在肠管固定管两侧的小孔上， 再用一根缝 合线将一端缝在肠段中间的肠壁上， 另一端由肠管固定管中央穿出连在 JH-2 型肌张力传 感器上， 并通过 BL-420E 生物机能实验系统记录各大鼠十二指肠的张力及频率。试验结果
显示， 皮下注射 1.5mg·kg-1 的多巴胺可明显抑制在体大鼠十二指肠的张力和频率， 枳实总 -1 黄酮苷提取物 (20、 40、 80、 160mg·kg ) 能提高由多巴胺抑制的大鼠十二指肠的张力和频 率， 见表 28。
表 28 枳实总黄酮苷提取物对在体十二指肠中段张力和频率的影响
△ * ** 注： 与对照组比较， P ＜ 0.05， ； 与模型组比较， P ＜ 0.05， P ＜ 0.0122