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冻干制剂
    背景技术
     一些在水溶液中的活性药物组分在储存期间不稳定， 容易分解。因此需要能满足 保存限期要求的合适制剂。发明内容
     本发明是基于以下出人意料的发现， 即， 与嘧啶化合物本身相比， 在一些制剂中的 药物活性的嘧啶化合物的吸湿性更低， 稳定性更高。
     一个方面， 本发明涉及一种药盒， 该药盒包括密封的容器和设置在该容器中的药 物活性化合物的冻干制剂， 该化合物具有通式 (I) ：
     其中， Q 和 U 各自独立地是 CH 或 N， 前提是， Q 和 U 中至少一个是 N ； X、 Y 和 Z 各自独 立地是 ： C1-5 亚烷基或不存在 ； m 是 0、 1、 2、 3、 4或5； n 是 0、 1或2； R1 是 H、 C1-C10 烷基、 C3-C20 环烷基、 C3-C20 杂环烷基、 芳基、 杂芳基、 卤素、 CN、 ORa、 COORa、 OC(O)Ra、 C(O)Ra、 C(O)NRaRb 或 NRaRb ； R2 是 C1-C10 烷基、 C3-C20 环烷基、 C3-C20 杂环烷基、 芳基、 杂芳基或 C1-C10 烷基， 任选被 C1-C10 烷基、 C3-C20 环烷基、 C3-C20 杂环烷基或 N(RcRd) 取代 ； 各 R3 基团独立地是 C1-C10 烷基、 C3-C20 环烷基、 C3-C20 杂环烷基、 芳基、 杂芳基、 卤素、 CN、 ORe、 COORe、 OC(O)Re、 C(O)Re、 C(O) NReRf 或 NReRf ； 或者， (R3)m 是与它所结合的环上的两个碳原子相连的 C1-5 亚烷基或者是与 它所结合的环上的一个碳原子相连的 C2-8 亚烷基 ； R4 是 P( ＝ O)(ORg)(ORi)、 P( ＝ O)(NHRg) (ORi)、 P( ＝ O)(NRg)(NRi)、 S( ＝ O)2ORg 或 S( ＝ O)2Rg ； 其中， Ra、 Rb、 R c、 Rd、 Re、 R f、 Rg 和 Ri 各 自独立地是 H、 C1-C10 烷基、 C3-C20 环烷基、 C3-C20 杂环烷基、 芳基、 杂芳基或 -C(O)R， R 是 H、 C1-C10 烷基、 C3-C20 环烷基、 C3-C20 杂环烷基、 芳基或杂芳基 ； 或者， Ra 和 Rb 连接一起形成 C2-8 亚烷基， Rc 和 Rd 相连一起形成 C2-8 亚烷基， Re 和 Rf 相连一起形成 C2-8 亚烷基或者 Rg 和 Ri 相 连一起形成 C1-5 亚烷基。
     上述化合物的亚组的特征在于 ： U是N； X 是 -CH2-、 -CH2CH2- 或 -CH2CH2CH2- ； Y 是 -CH2 或 不 存 在 ； Z 是 -CH2- ； m 是 0、 1或2； n是1或2； R1 是 NH2 ； R2 是 C1-5 烷 基 取 代 的 N(RcRd)， 如 -CH2CH2-N(RcRd) 或 -CH2CH2CH2-N(RcRd)， 其中 Rc 是 H， Rd 是 C1-C10 烷基、 C3-C20 环烷 基、 C3-C20 杂环烷基、 芳基或杂芳基或者， Rc 和 Rd 相连一起形成 C4-6 亚烷基 ； R3 是 C1-C3 烷基、 C3-C8 环烷基、 C3-C8 杂环烷基、 芳基、 杂芳基、 卤素、 CN、 ORe 或 C(O)NReRf ； 或者 R3 是是与它所结 合的环上的两个碳原子相连的 C1-2 亚烷基或是与它所结合的环上的一个碳原子相连的 C2-5
     亚烷基 ； R4 是 P( ＝ O)(OH)2、 P( ＝ O)(OH)(OCH2CH3)、 P( ＝ O)(OCH2CH3)2、S( ＝ O)2OH、 S( ＝ O)2CH3 或 S( ＝ O)2Ph。
     术语 “烷 基”表 示 饱 和 或 不 饱 和 的 直 链 或 支 链 烃 部 分， 如 -CH3、 -CH2-CH ＝ CH2 或 支 链 -C3H7。 术 语 “亚 烷 基”表 示 饱 和 或 不 饱 和 的 直 链 或 支 链 的 二 价 烃 基， 如 CH2-、 -CH2CH2-、 -CH2CH2CH2- 或 -CH ＝ CH-。术语 “环烷基” 表示饱和或不饱和的非芳族的单 环、 二环、 三环或四环的烃部分， 如环己基、 环己烯 -3- 基或金刚烷基。术语 “杂环烷基” 表 示饱和或不饱和的非芳族的单环、 二环、 三环或四环部分， 该部分基于一个或多个环杂原子 ( 如， N、 O 或 S)， 如 4- 四氢吡喃基或 4- 吡喃基。术语 “芳基” 表示有一个或多个芳环的烃 部分。芳基部分的例子包括 ： 苯基 (Ph)、 亚苯基、 萘基、 亚萘基、 芘基、 蒽基和菲基。术语 “杂 芳基” 表示包含一个或多个具有至少一个杂原子 ( 例如 N、 O 或 S) 的芳环的部分。杂芳基部 分的例子包括 ： 呋喃基、 亚呋喃基、 芴基、 吡咯基、 噻吩基、 唑基、 咪唑基、 噻唑基、 吡啶基、 嘧啶基、 喹唑啉基、 喹啉基、 异喹啉基和吲哚基。
     除非另外说明， 本文所述的烷基、 亚烷基、 环烷基、 杂环烷基、 芳基和杂芳基同时包 括取代的和未取代的部分。环烷基、 杂环烷基、 芳基和杂芳基上可能的取代基包括， 但不限 于： C1-C10 烷基、 C2-C10 烯基、 C2-C10 炔基、 C3-C20 环烷基、 C3-C20 环烯基、 C3-C20 杂环烷基、 C3-C20 杂环烯基、 C1-C10 烷氧基、 芳基、 芳氧基、 杂芳基、 杂芳氧基、 氨基、 C1-C10 烷基氨基、 C1-C20 二烷 基氨基、 芳基氨基、 二芳基氨基、 羟基、 卤素、 硫代、 C1-C10 烷硫基、 芳硫基、 C1-C10 烷基磺酰基、 芳基磺酰基、 酰基氨基、 氨基酰基、 氨基硫代酰基、 脒基、 胍基、 脲基、 氰基、 硝基、 酰基、 硫代 酰基、 羧基和羧酸酯基。另一方面， 烷基和亚烷基上可能的取代基包括上述所有的取代基， 但是 C1-C10 烷基、 C2-C10 烯基和 C2-C10 炔基除外。环烷基、 杂环烷基、 芳基和杂芳基也可以相 互稠合。
     上述化合物包括这些化合物本身， 如果可能的话， 还可包括这些化合物的盐、 前药 和溶剂合物。 例如， 盐可以是阴离子与上述式之一的化合物上带正电荷的基团 ( 例如氨基 ) 形成的盐。合适的阴离子包括氯离子、 溴离子、 碘离子、 硫酸根、 硝酸根、 磷酸根、 柠檬酸根、 甲磺酸根、 三氟乙酸根、 乙酸根、 苹果酸根、 甲苯磺酸根、 酒石酸根、 富马酸根、 谷氨酸根、 葡 糖醛酸根、 乳酸根、 戊二酸根和马来酸根。类似地， 可以由阳离子与上述式之一的化合物上 的带负电荷的基团 ( 例如羧酸根 ) 形成盐。合适的阳离子包括钠离子、 钾离子、 镁离子、 钙 离子和铵离子， 例如四甲基铵离子。化合物还可包括含有季氮原子的盐。除非另外指出， 为 简化计算， 本文所述化合物的重量指化合物的游离碱形式的重量。前药的例子包括酯和其 它药学上可接受的衍生物， 它们在给予目标的时候， 能够得到活性化合物。 溶剂合物表示活 性化合物与药学上可接受的溶剂之间形成的络合物。药学上可接受的溶剂的例子包括水、 乙醇、 异丙醇、 乙酸乙酯、 乙酸和乙醇胺。
     下面列出用于本发明的组合物的示例性的嘧啶化合物 ：
     在上述药盒中的冻干制剂还包含填充剂、 张力调节剂 (tonicityadjuster)， 或者 两种都存在。作为例子， 组合物包含甘露醇或右旋糖苷作为填充剂， 氯化钠作为张力调节 剂。所述化合物， 填充剂和张力调节剂的重量比可以为 1 至 25 ∶ 10 至 50 ∶ 0.01 至 6， 或 者 1 至 50 ∶ 0.01 至 50 ∶ 0.01 至 0.9。在另一个方面， 本发明涉及制备上述冻干制剂的 方法。该方法包括提供含通式 (I) 的化合物的水溶液 ； 将该溶液冷却至 -80℃至 -10℃ ； 将 在 -80℃至 -10℃的溶液抽真空 15-100 小时， 然后在 -9℃至 35℃之间抽真空 10-200 小时。
     任选地， 该水溶液还包含填充剂、 张力调节剂或者同时包含填充剂和张力调节剂。 作为例子， 所述溶液包含通式 (I) 的化合物、 甘露醇或右旋糖苷 ( 作为填充剂 )， 和 / 或氯化 钠或甘油 ( 作为张力调节剂 )， 所述化合物、 甘露醇 / 右旋糖苷、 氯化钠 / 甘油的浓度分别为 1-25 毫克 / 毫升， 10-50 毫克 / 毫升和 0.01-6 毫克 / 毫升， 或者 1-50 毫克 / 毫升， 0.01-50 毫克 / 毫升和 0.01-0.9 毫克 / 毫升。
     通式 (I) 的化合物能有效抑制 SDF-1 和趋化因子受体 ( 如 CXCR4 受体 ) 之间的结 合。 参见美国专利申请序列号 12/263,671。 因此， 在另一个方面， 本发明涉及所述药盒在治 疗与 CXCR4/SDF-1 途径例如炎性疾病或免疫疾病， 发育疾病或退行性疾病， 组织损害或癌 症相关病症的用途， 所述药盒包含这些药物活性化合物之一的冻干制剂。
     所述冻干制剂在制造用于上述治疗的药物中的应用也在本发明范围之内。
     炎症疾病表现为局部或全身性、 急性或慢性炎症。例子包括 ： 视网膜病变 ( 例如， 糖尿病视网膜病和增殖性视网膜病 )， 炎性皮肤病 ( 例如， 皮炎、 湿疹、 特应性皮炎、 过敏性
     接触皮炎、 荨麻疹、 坏死性血管炎、 皮肤血管炎、 超敏感性血管炎、 嗜酸性肌炎、 多肌炎、 皮肌 炎和嗜酸性筋膜炎 )， 炎性肠病 ( 例如， 克罗恩氏病和溃疡性结肠炎 )， 超敏感性肺病 ( 例 如， 超敏感性肺炎、 嗜酸性肺炎、 迟发型超敏反应、 间质性肺病 (ILD)、 特发性肺纤维化和与 类风湿性关节炎相关的 ILD)、 黄斑水肿， 哮喘和过敏性鼻炎。
     免疫疾病表现为免疫系统的反应过度或反应低下。例子包括但不限于 ： 自身免疫 病 ( 例如， 类风湿性关节炎、 银屑病关节炎、 系统性红斑狼疮、 重症肌无力、 I 型糖尿病、 肾小 球肾炎、 自身免疫性甲状腺炎、 强直性脊柱炎、 全身性硬皮病和多发性硬化 )、 急性和慢性炎 性疾病 ( 例如， 全身过敏反应或超敏反应、 药物变态反应、 昆虫螫伤变态反应、 移植物排斥， 包括同种异体移植物排斥和移植物抗宿主病 )、 舍格伦 (Sjogren) 综合征和人体免疫缺陷 病毒感染。
     发育异常是可导致功能缺失或功能增益的生长或分化相关病症。 变性疾病通常是 指朝功能较低或较少形式的组织变化。发育异常或变性疾病的例子包括 ： 年龄相关的黄斑 变性、 角膜新血管形成、 虹膜新血管形成、 脊髓性肌萎缩、 迪谢内肌营养不良、 帕金森病和阿 耳茨海默病。组织损伤可以是以下原因引起的 ： 氧化应激 ( 例如， 中风或心肌梗塞中的缺 血 - 再灌注 )， 补体激活， 移植物排斥， 化学物质 ( 例如， 酒精诱导的肝损伤或癌症疗法中的 粘膜组织损伤 )， 病毒感染 ( 例如， 与丙型肝炎感染有关的肾小球损伤 ) 和机械力 ( 例如， 运动损伤 )。组织损伤的例子包括 ： 脑损伤、 神经损伤、 心脏损伤、 肝损害、 骨骼肌损伤、 肾损 害、 胰脏损伤、 肺损伤、 皮肤损伤、 四肢缺血、 无症状缺血、 心肌缺血和胃肠道损伤。 癌症是一类细胞群具有自发生长能力的疾病， 即表现为快速增殖的细胞生长、 有 时是肿瘤转移的异常状态或病症。 癌症的例子包括但不限于 ： 癌和肉瘤， 例如白血病、 肉瘤、 骨肉瘤、 淋巴瘤、 黑色素瘤、 卵巢癌、 皮肤癌、 睾丸癌、 胃癌、 胰腺癌、 肾癌、 乳腺癌、 前列腺癌、 结肠直肠癌、 头颈癌、 脑癌、 食道癌、 膀胱癌、 肾上腺皮质癌、 肺癌、 支气管癌症、 子宫内膜癌、 鼻咽癌、 宫颈癌或肝癌、 结肠癌、 肾癌、 甲状腺癌、 造血系统癌症以及原发部位未知的癌症。
     上述组合物在生产用于上述治疗的药剂的应用也在本发明范围之内。
     下面对本发明的一个或多个实施方式进行了详细描述。 由说明书和权利要求书可 以显而易见地看出本发明地其它特征、 目标和优点。
     具体实施方式
     用于本发明的通式 (I) 的化合物可以采用本领域已知的方法制备。以下方案 I 显 示合成特定示例化合物的合成路线。 含两个卤素基团的嘧啶化合物 (i)(R3 和 R6 是卤素 ) 与 氨基化合物 (ii) 选择性反应， 产生 2- 氨基嘧啶化合物 (iii)， 该化合物与哌嗪化合物 (iv) 偶合， 形成 6- 哌嗪基 -2- 氨基嘧啶化合物 (v)。对化合物 (v) 进一步修饰， 获得所需的膦酸 酯化合物 (vi) 或膦酸 (phophonic acid)(vii)。合成的该化合物可以通过如柱层析法、 高 压液相色谱或重结晶的方法进行纯化。
     方案 I
     方案 1 所示的合成路线可以用各种方式改进， 以制备通式 (I) 的其他化合物。例 如， 可以使用化合物 (ii) 之外的氨基化合物， 或者哌嗪化合物 (iv) 可以被咪唑烷或二氮杂 化合物替代。上述方法中使用的化学试剂或可以商购或者采用本领域已知的方法制备。上述 方法还包括在进行上面具体描述的步骤之前或者最后进行的步骤， 即添加或去除合适的 保护基， 以最终合成化合物。此外， 可以按照其他顺序进行各合成步骤， 以得到所需化合 物。用于合成可应用的化合物的合成化学转化和保护基方法 ( 保护和去保护 ) 为本领 域已知， 并包括例如在以下文献中所述的那些方法 ： R.Larock， Comprehensive Organic Transformations( 综合有机转化 )， VCH 出版社 (VCH Publishers)(1989) ； T.W.Greene 和 P.G.M.Wuts， Protective Groups in Organic Synthesis( 有机合成保护基 )， 第二版， 约翰 威利父子公司 (John Wiley and Sons)(1991) ； L.Fieser 和 M.Fieser， Fieserand Fieser’ s Reagents for Organic Synthesis( 有机合成试剂 )， 约翰威利父子公司 (1994) ； 以及 L.Paquette 等， Encyclopedia of Reagents for OrganicSynthesis( 有机合成百科全书和 试剂 )， 约翰威利父子公司 (1995) 以及它的后续版本。
     通式 (I) 的化合物可包含非芳族双键以及一个或多个不对称中心。因此， 所述化 合物可以是外消旋物和外消旋混合物、 单一对映体、 单独非对映体、 非对映体混合物、 以及 顺 - 或反 - 异构体形式。可预期所有的异构体形式。
     为实施本发明， 可以制备包含预定浓度的通式 (I) 的化合物的水溶液。填充剂提 供了最终固体产品体积， 并可产生具有良好机械性质的晶体结构。填充剂的例子包括 ： 甘 露醇、 蔗糖、 葡萄糖、 葡聚糖和右旋糖苷。化合物与填充剂的浓度分别为 1-25 毫克 / 毫升和 10-50 毫克 / 毫升， 或者 1-50 毫克 / 毫升和 0.01-50 毫克 / 毫升。还可以使用填充剂来控 制溶液的重量克分子渗透浓度， 以获得接近等渗的溶液。 需要时， 所述溶液还可以包含张力 调节剂， 以进一步改善溶液的重量克分子渗透浓度。 张力调节剂的例子包括 ： 蔗糖、 甘氨酸、 甘油、 氯化钠、 氯化钾、 溴化钠和溴化钾。优选的重量克分子渗透浓度为 250-300 毫摩尔 /
     千克。在一个实例中， 水溶液含 5 毫克 / 毫升所述化合物， 30 毫克 / 毫升甘露醇和 3 毫克 / 毫升氯化钠。
     该溶液还包含一种或多种组分， 如缓冲剂和稳定剂。缓冲剂用来稳定溶液的 pH。 缓冲剂的例子包括 ： 乙酸盐、 柠檬酸盐、 酒石酸盐、 乳酸盐、 琥珀酸盐、 苹果酸盐和磷酸盐。 稳 定剂可以是形成无定形糖玻璃因此能使溶液中化合物稳定的物质。稳定剂的例子包括 ： 蔗 糖、 海藻糖、 葡萄糖、 乳糖和麦芽糖。
     所有这些组分可以在制备溶液的任意阶段加入。 提供预期效应的组分的适当浓度 能方便地理解并可以通过常规方法确定。
     可以将溶液过滤以去除颗粒和微生物。因此可获得清澈和无菌的溶液。过滤用膜 的孔径在 0.1-10 微米范围， 例如 0.22 微米。
     可能需要改变溶液的 pH 至使化合物最稳定的值。用来改变 pH 的试剂可以是有机 或无机的酸或碱， 例如 HCl、 乙酸、 氢氧化钠或氨水。
     为制备药盒， 可以将溶液转移至容器， 例如小瓶中的预定体积， 然后对溶液进行冻 干处理。或者， 可以将大体积的溶液冻干， 然后将预定量的冻干制剂放置在一容器中。
     冻干处理包括三个步骤 ： 冷冻、 初级干燥和二次干燥。 在冷冻步骤中， 用 10 分钟至 5 小时将溶液的温度降低至低温 ( 如 -40℃至 -50℃ )。 由一部分溶液形成纯的冰晶体。 这会使剩余溶液的浓度和粘度增大， 使溶液不能进行结晶。 最后， 这种高度浓缩且粘稠的溶液固化产生晶体 - 无定形混合相。
     在初级干燥步骤中， 冷冻溶液中的冰通过升华去除。例如， 升华可以在 10-655 微 巴 (μbar) 和 -20℃至 -50℃的温度条件下进行 15-100 小时。应注意， 优选将产物保持在 固态， 以保留冷冻期间形成的结构。
     在二次干燥步骤中， 升高温度 ( 如， -9℃至 35℃之间 ) 或者降低压力， 以除去残留 的结合水。该阶段可持续 10-200 小时以提供具有所需残留水分的固态制剂。
     可将由此获得的冻干制剂储存以备以后使用。 优在包含冻干制剂的容器中充入惰 性气体 ( 如氮气 ) 并密封， 以进一步防止降解和被微生物污染。
     通过给药需要治疗的对象有效量的包含在药盒中的冻干制剂， 可以使用药盒治疗 病症。
     如本文所用， 术语 “治疗” 定义为给予对象有效量的冻干制剂， 所述对象患有与 CXCR4/SDF-1 途径相关的疾病， 具有这种疾病的症状， 或者具有易受这种疾病的倾向， 其目 的是治愈、 缓解、 减轻、 治疗或改善这种疾病， 这种疾病的症状、 或者易受这种疾病的倾向。 术语 “有效量” 表示使得被治疗的对象获得治疗效果所需的冻干制剂的量。
     为治疗与 CXCR4/SDF-1 途径相关的疾病， 本发明的组合物可以肠道外给药、 口服 给药、 鼻内给药、 直肠给药、 局部给药或向颊给药。术语 “肠道外” 表示皮下注射、 皮内注射、 静脉注射、 肌内注射、 关节内注射、 动脉内注射、 滑膜内注射、 胸骨内注射、 鞘内注射、 损伤区 注射或颅内注射， 以及任何合适的输注技术。
     无菌可注射组合物可以通过将本发明的药盒中的冻干制剂与可接受的无毒肠道 外给药的稀释剂或溶剂例如水或者 1， 3- 丁二醇混合形成溶液或悬浮液制备。此外， 通常使 用不挥发性油作为溶剂或悬浮介质 ( 例如合成的单甘油酯或二甘油酯 )。 脂肪酸， 例如油酸 及其甘油酯衍生物可用来制备可注射药品， 例如可使用药学上可接受的天然油类， 例如橄
     榄油或蓖麻油， 特别是它们的聚氧乙烯化形式。这些油溶液或悬浮液还可包含长链醇稀释 剂或分散剂、 羧甲基纤维素或类似的分散剂。其它常用的表面活性剂， 例如吐温 (Tween) 或 司盘 (Span) 或通常用于生产药学上可接受的固体、 液体或者其它剂型的其它类似的乳化 剂或生物利用度促进剂， 也可用于配制目的。
     包含在药盒中的冻干制剂也可以口服给予病人。此外， 冻干制剂可以进一步加工 形成任何可以接受的口服剂型， 包括胶囊、 片剂、 乳液和水性悬浮液、 分散体和溶液。 对于片 剂， 常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。 通常还可以在本发明的组合物中加入润滑剂， 例如硬 脂酸镁。对于胶囊形式的口服给药， 可用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当水悬浮 液或乳液口服给药时， 可以将活性成分悬浮或溶解在与乳化剂或悬浮剂合并的油相中。如 果需要， 可以加入某些甜味剂、 香料或着色剂。
     眼用滴剂或软膏也可以按照本发明的方法制备和使用。
     我们相信， 基于本文的描述， 无需另外的工作便可实施本发明。 因此以下实施例仅 仅是说明性的， 不会对说明书的其它部分构成限制。本文引用的所有出版物的全文都全部 以引用的方式纳入本文。
     化学合成
     (1) 制备化合物 1
     在反 -4- 氨基甲基 - 环己烷甲酸 ( 化合物 1-I， 2.0 千克， 12.7 摩尔 ) 和碳酸氢钠 (2.67 千克， 31.8 摩尔 ) 的溶液中加入水 (10.0 升 ) 和 (Boc)2O(3.33 千克， 15.3 摩尔 )。环 境温度下搅拌该反应混合物 18 小时。水层用浓盐酸 (2.95 升， pH ＝ 2) 酸化后过滤。收集 所得固体， 用水洗涤三次 (15 升 )， 在热箱体 (60℃ ) 中干燥， 获得反 -4-( 叔丁氧基羰基氨 基 - 甲基 )- 环己烷甲酸 ( 化合物 1-II， 3.17 千克， 97％ )， 为白色固体。 Rf ＝ 0.58(EtOAc)。 + 1 LC-MS m/e 280(M+Na )。 H NMR(300MHz， CDCl3)δ4.58(brs， 1H)， 2.98(t， J ＝ 6.3Hz， 2H)， 2.25(td， J ＝ 12、 3.3Hz， 1H)， 2.04(d， J ＝ 11.1Hz， 2H)， 1.83(d， J ＝ 11.1Hz， 2H)， 1.44(s， 13 9H)， 1.35-1.50(m， 3H)， 0.89-1.03(m， 2H)。 C NMR(75MHz， CDCl3)δ181.31、 156.08， 79.12、 46.41、 42.99， 37.57， 29.47， 28.29， 27.96。M.p.134.8-135.0℃。
     将化合物 1-II(1.0 千克， 3.89 摩尔 ) 在 THF(5 升 ) 的悬浮液于 10 ℃冷却， 在低 于 10 ℃下加入三乙胺 (1.076 升， 7.78 摩尔 ) 和氯甲酸乙酯 (0.441 升， 4.47 摩尔 )。环 境温度下搅拌该反应混合物 3 小时。然后于 10℃再次将反应混合物冷却， 并在低于 10℃ 温度加入 NH4OH(3.6 升， 23.34 摩尔 )。环境温度下搅拌该反应混合物 18 小时后过滤。收 集固体， 并用水洗涤三次 (10 升 ) 并且在热箱体 (60℃ ) 中干燥， 获得反 -4-( 叔丁氧基羰 基 - 氨基 - 甲基 )- 环己烷羧酸酰胺 ( 化合物 1-III， 0.8 千克， 80％ )， 为白色固体。Rf ＝ + 1 0.23(EtOAc)。LC-MS m/e 279， M+Na 。 H NMR(300MHz， CD3OD)δ6.63(brs， 1H)， 2.89(t， J＝ 6.3Hz， 2H)， 2.16(td， J ＝ 12.2、 3.3Hz， 1H)， 1.80-1.89(m， 4H)， 1.43(s， 9H)， 1.37-1.51(m， 13 3H)， 0.90-1.05(m， 2H)。 C NMR(75MHz， CD3OD)δ182.26， 158.85， 79.97， 47.65， 46.02、 39.28， 31.11、 30.41、 28.93。M.p.221.6-222.0℃。
     将化合物 1-III(1.2 千克， 4.68 摩尔 ) 在 CH2Cl2(8 升 ) 的悬浮液于 10℃冷却， 在 低于 10℃下加入三乙胺 (1.3 升， 9.36 摩尔 ) 和三氟乙酸酐 (0.717 升， 5.16 摩尔 )。环境 温度下搅拌该反应混合物 3 小时。然后加入水 (2.0 升 )， 分离有机层， 并用水 (3.0 升 ) 洗 涤两次。然后使有机层通过硅胶并浓缩。得到的油用二氯甲烷结晶。晶体用己烷洗涤， 获 得反 -(4- 氰基 - 环己基甲基 )- 氨基甲酸叔丁酯 ( 化合物 1-IV， 0.95 千克， 85 ％ )， 为白 + 1 色晶体。Rf ＝ 0.78(EtOAc)。LC-MS m/e261、 M+Na 。 H NMR(300MHz， CDCl3)δ4.58(brs， 1H)， 2.96(t， J ＝ 6.3Hz， 2H)， 2.36(td， J ＝ 12、 3.3Hz， 1H)， 2.12(dd， J ＝ 13.3、 3.3Hz， 2H)， 1.83(dd， J ＝ 13.8， 2.7Hz， 2H)， 1.42(s， 9H)， 1.47-1.63(m， 3H)， 0.88-1.02(m， 2H)。 13 C NMR(75MHz， CDCl3)δ155.96， 122.41、 79.09， 45.89， 36.92、 29.06， 28.80、 28.25， 28.00。 M.p.100.4-100.6℃。
     将化合物 1-IV(1.0 千克， 4.196 摩尔 ) 溶解于 1， 4- 二 烷 (8.0 升 ) 和水 (2.0 升 ) 的混合物中。在该反应混合物中加入一水合氢氧化锂 (0.314 千克， 4.191)、 拉尼镍 (0.4 千克， 2.334 摩尔 ) 和 10％钯碳 (0.46 千克， 0.216 摩尔 ) 作为 50％的水悬液。于 50℃ 氢气氛下搅拌反应混合物 20 小时。过滤去除催化剂和真空除去溶剂后， 加入水 (1.0 升 ) 和 CH2Cl2(0.3 升 ) 的混合物。相分离后， 有机相用水洗涤 (1.0 升 ) 并浓缩获得反 -(4- 氨 基甲基 - 环己基甲基 )- 氨基甲酸叔丁酯 ( 化合物 1-V， 0.97 千克， 95 ％ )， 为淡黄色粘稠 + 1 油状物。Rf ＝ 0.20(MeOH/EtOAc ＝ 9/1)。LC-MS m/e 243、 M+H 。 H NMR(300MHz， CDCl3) δ4.67(brs， 1H)， 2.93(t， J ＝ 6.3Hz， 2H)， 2.48(d， J ＝ 6.3Hz， 2H)， 1.73-1.78(m， 4H)， 13 1.40(s， 9H)， 1.35(brs， 3H)， 1.19-1.21(m， 1H)， 0.77-0.97(m， 4H)。 C NMR(75MHz， CDCl3) δ155.85， 78.33、 48.27， 46.38， 40.80、 38.19， 29.87， 29.76， 28.07。化合物 1-V(806 克 ) 和 Et3N(1010 克 3 当量 ) 的 1- 戊醇 (2.7 升 ) 溶液于 90℃和 化合物 1-VI(540 克， 1 当量 ) 反应 15 小时。TLC 显示反应完成。
     于 25 ℃， 将乙酸乙酯 (1.5 升 ) 加入反应混合物中。搅拌该溶液 1 小时。过滤 Et3NHCl 盐。然后， 于 50℃将滤液真空浓缩至 1.5 升 ( 原体积的 1/6)。然后， 在该浓缩溶液 中加入二乙醚 (2.5 升 )， 25℃过滤后获得所需产物 1-VII(841 克， 产率为 68％ )。
     将 4N HCl/ 二 烷 (2.7 升 ) 溶液加入中间体 1-VII(841 克 ) 的 MeOH(8.1 升 ) 溶 液中反应， 并于 25℃搅拌 15 小时。TLC 显示反应完成。在 50℃将该混合物真空浓缩至 1.5 升 ( 原体积的 1/7)。然后， 在该溶液中缓慢加入二乙醚 (5 升 )， 形成 1-VIII 的盐酸盐 (774 克 )， 过滤并真空 ( ＜ 10 托 ) 干燥。为进行中和， 于 25℃， 在 1-VIII 的盐酸盐的 MeOH(17 升 ) 溶液中加入 K2CO3(2.5 千克， 8 当量 )。在同样温度下搅拌混合物 3 小时 (pH ＞ 12)， 然 后过滤 ( 估计滤液中 1-VIII 的量为 504 克 )。
     于 0-10℃， 在 1-VIII 的滤液中加入醛 1-IX(581 克， 以 1-VII 的摩尔数为基准为 1.0 当量 )。 于 0-10℃搅拌反应 3 小时。 TLC 显示反应完成。 然后， 在低于 10℃加入 NaBH4(81 克， 以 1-VII 的摩尔数为基准为 1.0 当量 )， 于 10-15℃搅拌溶液 1 小时。将该溶液浓缩得 到残余物， 该残余物然后用 CH2Cl2(15 升 ) 处理。混合物用饱和 NH4Cl 水溶液 (300 毫升 ) 洗 涤， 用水 (1.2L) 稀释。将 CH2Cl2 层浓缩， 残余物通过硅胶层析纯化 ( 短柱， EtOAc 为用于除 去其他组分的流动相 ； MeOH/28％ NH4OH ＝ 97/3 为用于收集 1-X 的流动相 )， 获得粗 1-X(841 克 )。
     然后， 于 25℃， 将 Et3N(167 克， 1 当量 ) 和 Boc2O(360 克， 1 当量 ) 加入 1-X(841 克 ) 在 CH2Cl2(8.4 升 ) 的溶液中。25℃搅拌混合物 15 小时。由 TLC 显示反应完成后， 将溶液浓 缩， 并在形成的残余物中加入 EtOAc(5 升 )。 在 50℃和低压条件下将该溶液浓缩至 3 升 ( 原 体积的 1/2)。然后， 在浓缩溶液中加入正己烷 (3 升 )。于 50℃通过晶种形成固体产物， 过 滤和蒸发后获得粗产物 1-XI(600 克， 产率为 60％ )。
     25℃， 向化合物 1-XI(120.0 克 ) 和哌嗪 (1-XII， 50.0 克， 3 当量 ) 的 1- 戊醇 (360 毫升 ) 溶液中加入 Et3N(60.0 克， 3.0 当量 )。于 120℃搅拌混合物 8 小时。于 25℃， 在反 应混合物中加入乙酸乙酯 (480 毫升 )。搅拌该溶液 1 小时。过滤 Et3NHCl 盐， 将溶液浓缩， 并通过硅胶纯化 (EtOAc/MeOH ＝ 2 ∶ 8)， 获得 1-XIII(96 克 )， 产率为 74％。
     于 25 ℃， 在 1-XIII(120 克 ) 的 MeOH(2.4 升 ) 溶 液 中 加 入 乙 烯 基 膦 酸 二 乙 酯 (1-XIV， 45 克， 1.5 当量 )。于 65℃搅拌混合物 24 小时。TLC 和 HPLC 显示反应完成。将溶 液浓缩并通过硅胶进行纯化 (MeOH/CH2Cl2 ＝ 8/92)， 通过 HPLC 分析产物的纯度后， 获得 87 克 1-XV( 产率为 53％， 纯度＞ 98％， 每一种杂质＜ 1％ )。
     将 20％ TFA/CH2Cl2 溶液 (36 毫升 ) 加入到中间体 1-XV(1.8 克 ) 在 CH2Cl2(5 毫升 ) 的溶液中。室温下搅拌反应混合物 15 小时， 并通过除去溶剂使溶液浓缩， 获得化合物 1 的 三氟乙酸盐 (1.3 克 )。
     CI-MS(M++1) ： 623.1
     (2) 制备化合物 2
     按照实施例 1 中所述制备中间体 1-XV。
     于 10-15℃用 1 小时在 1-XV(300 克 ) 的 CH2Cl2 溶液 (1800 毫升 ) 中加入 TMSBr(450 克， 8 当量 )。25 ℃搅拌该混合物 15 小时。于 40 ℃下将该溶液真空浓缩以除去 TMSBr 和 溶剂。在该混合物中加入 CH2Cl2 以溶解残余物。真空条件下再次除去 TMSBr 和溶剂， 真空 ( ＜ 1 托 ) 干燥 3 小时后获得 360 克粗固体。然后， 将该粗固体用 7.5 升 IPA/MeOH(9/1) 洗 涤， 过滤并在 25℃下真空 ( ＜ 1 托 ) 干燥 3 小时后， 获得化合物 2(280 克 )。通过 EtOH 结 晶获得化合物 2 的氢溴化物盐 (190 克 )。
     CI-MS(M++1) ： 567.0。
     将化合物 2 的氢溴化物盐 (5.27 克 ) 溶于 20 毫升水中， 用浓氨水 (pH ＝ 9-10) 进 行处理， 混合物真空蒸发。将水 (30 毫升 ) 中残余物施加于 Dowex 50WX8(H+ 形式， 100-200 目 ) 的柱 (100 毫升， 4.5×8 厘米 )， 并洗脱 ( 洗脱速率 6 毫升 / 分钟 )。用水 (2000 毫升 ) 和 0.2M 氨水进行洗脱。 将有 UV 吸收的氨洗脱液蒸发至干， 获得化合物 2 的氨盐 (2.41 克 )。
     CI-MS(M++1) ： 567.3。
     将化合物 2 的氨盐 (1.5 克 ) 溶解于水 (8 毫升 ) 中， 用浓氨水 (pH ＝ 11) 进行碱 化， 将该混合物溶液应用于 Dowex 1X2( 乙酸盐形式， 100-200 目 ) 的柱 (75 毫升， 3×14 厘 米 )， 并洗脱 ( 洗脱速率 3 毫升 / 分钟 )。用水 (900 毫升 ) 然后用 0.1M 乙酸进行洗脱。将 有 UV 吸收的乙酸洗脱液蒸发， 残余物与水 (5×50 毫升 ) 共蒸馏， 获得化合物 2(1.44 克 )。 +
     CI-MS(M +1) ： 567.4。
     (3) 制备化合物 3
     在制备化合物 1 的过程中获得中间体 1-XIII。
     向乙烯基膦酸二乙酯 (3-I， 4 克 ) 的 CH2Cl2(120 毫升 ) 溶液中加入草酰氯 (15.5 克， 5 当量 )， 于 30 ℃搅拌混合物 36 小时。混合物在旋转蒸发器中在真空浓缩， 定量获得 相应的氯化膦 (phosphochloridate)， 将该化合物加入环己胺 (3-II， 5.3 克， 2.2 当量 )、 2.5 当量 ) 的混合物中。35℃搅拌混合物 36 小时， 然后用 CH2Cl2(40 毫升 ) 和 Et3N(6.2 克， 水洗涤。 将有机层干燥 (MgSO4)， 过滤和蒸发， 获得棕色油状物 3-III(4.7 克， 产率为 85％ )。
     将化合物 3-III(505 毫克 ) 加入中间体 1-XIII(500 毫克 ) 的 MeOH(4 毫升 ) 溶 液。于 45℃搅拌溶液 24 小时。将溶液浓缩， 残余物通过硅胶柱层析纯化 (EtOAc/MeOH ＝ 4 ∶ 1)， 获得中间体 3-IV(420 毫克 )， 产率为 63％。
     将 HCl 的醚 (5 毫升 ) 溶液加入中间体 3-IV(420 毫克 ) 在 CH2Cl2(1.0 毫升 ) 的溶 液中。室温搅拌反应混合物 12 小时， 通过除去溶剂进行浓缩。所得残余物用醚洗涤， 获得 化合物 3 的盐酸盐 (214 毫克 )。
     CI-MS(M++1) ： 595.1。
     (4) 制备化合物 4
     按照实施例 2 中所述的相同方式制备化合物 4， 除了在 45℃， 在 DMF 中的 Et3N 存 在下使用 2- 溴代乙磺酸钠代替乙烯基膦酸二乙酯。通过盐酸使氨基 - 保护基去保护， 获得 化合物 4 的盐酸盐。
     CI-MS(M++1) ： 567.3
     (5) 制备化合物 5
     按照实施例 2 中所述的相同方式制备化合物 5， 除了在 CH3CN 中的 K2CO3 存在下使 用 1- 溴丙基膦酸二乙酯代替乙烯基膦酸二乙酯。
     CI-MS(M++1) ： 581.4
     (6) 制备化合物 6
     按照实施例 5 中所述的相同方式制备化合物 6， 除了使用 1， 4- 二氮杂 - 螺 [5.5] 十一烷的二盐酸盐代替哌嗪。
     CI-MS(M++1) ： 649.5
     (7) 制备化合物 7
     按照实施例 1 所述制备中间体 1-II。
     于 25℃用 1 小时向中间体 1-II(31.9 克 ) 在甲苯 (150 毫升 ) 的悬浮液中加入叠 氮磷酸二苯酯 ((phosphorazidic acid diphenyl ester)(7-I， 32.4 克 ) 和 Et3N(11.9 克 )。 于 80℃下搅拌反应混合物 3 小时， 然后冷却至 25℃。加入苯甲醇 (7-II， 20 克 ) 后， 于 80℃ 下再搅拌反应混合物 3 小时， 并加热至 120℃后过夜。 然后浓缩并再次溶解于 EtOAc 和 H2O。 收集有机层。水层用 EtOAc 萃取。合并的有机层用 2.5N HCl、 饱和 NaHCO3 水溶液和盐水洗 涤， 用无水 MgSO4 干燥， 过滤， 并浓缩。获得的残余物通过硅胶柱层析纯化 (EtOAc/ 己烷＝ 1 ∶ 2) 获得中间体 7-III(35 克 )， 产率为 79％。
     将 4N HCl/ 二烷 (210 毫升 ) 溶液加入中间体 7-III(35 克 ) 的 MeOH(350 毫升 ) 溶液反应， 并于室温搅拌过夜。加入醚 (700 毫升 ) 后， 将溶液过滤。固体真空干燥。室温 用 10 分钟向该固体在 CH3CN 和异丙醇的悬浮液中加入 K2CO3。加入水后， 室温搅拌该反应混 合物 2 小时， 过滤， 在无水 MgSO4 上干燥， 并浓缩。形成的残余物通过硅胶柱层析纯化 ( 使 用 CH2Cl2 和 MeOH 作为洗脱液 )， 获得中间体 7-IV(19 克 )， 产率为 76％。
     将中间体 1-IX(21 克 ) 加入中间体 7-IV(19 克 ) 的 CH2Cl2(570 毫升 ) 溶液中。于 25℃下搅拌该混合物 2 小时。然后， 25℃加入 NaBH(OAc)3(23 克 ) 过夜。将该溶液浓缩后， 在形成的残余物中加入饱和 NaHCO3 水溶液。 然后， 该混合物用 CH2Cl2 萃取。 将溶液浓缩， 残 余物通过硅胶柱层析纯化 ( 使用 EtOAc 和 MeOH 作为洗脱液 )， 获得中间体 7-V(23.9 克 )，
     产率为 66％。
     Boc2O(11.4 克 ) 和中间体 7-V(23.9 克 ) 在 CH2Cl2(200 毫升 ) 溶液中于 25℃下加 入 Et3N(5.8 毫升 ) 反应过夜。然后将该溶液浓缩， 形成的残余物通过硅胶柱层析纯化 ( 使 用 EtOAc 和己烷作为洗脱液 )， 获得中间体 7-VI(22 克 )， 产率为 77％。将 10％ Pd/C(2.2 克 ) 加入中间体 7-VI(22 克 ) 在 MeOH(44 毫升 ) 的悬浮液中。在氢气氛环境温度下搅拌混 合物过夜， 将该混合物过滤和浓缩。通过硅胶柱层析纯化 ( 使用 EtOAc 和 MeOH 作为洗脱 液 )， 获得中间体 7-VII(16.5 克 )， 产率为 97％。
     中间体 7-VII(16.5 克 ) 和 Et3N(4.4 毫升 ) 的 1- 戊醇 (75 毫升 ) 溶液与 2， 4- 二 氯 -6- 氨基嘧啶 (1-VI， 21 克 ) 于 120℃下反应过夜。然后除去溶剂， 残余物通过硅胶柱层 析纯化 ( 使用 EtOAc 和己烷作为洗脱液 )， 获得中间体 7-VIII(16.2 克 )， 产率为 77％。
     中间体 7-VIII(16.2 克 ) 和哌嗪 (1-XII， 11.7 克 ) 的 1- 戊醇 (32 毫升 ) 溶液中 加入 Et3N(3.3 毫升 )， 于 120℃下反应过夜。将溶液浓缩后， 残余物用水处理， 用 CH2Cl2 萃 取。收集有机层并浓缩。将获得的残余物通过硅胶柱层析纯化 ( 使用 EtOAc/MeOH 至 28％ NH4OH/MeOH 作为洗脱液 )， 获得中间体 7-IX(13.2 克 )， 产率为 75％。
     按照实施例 3 所述， 用 7-IX 与乙烯基膦酸二乙酯 (2-I) 反应， 获得化合物 7 的氢 溴酸盐。
     CI-MS(M++1) ： 553.3
     (8) 制备化合物 8
     于 0℃在顺 -1， 4- 环己烷二羧酸 (8-I， 10 克 ) 的 THF(100 毫升 ) 溶液中加入草酰 氯 (8-II， 15.5 克 )， 然后加入 DMF( 几滴 )。室温搅拌混合物 15 小时。将溶液浓缩， 残余物 溶解于 THF(100 毫升 )。将该混合物溶液加入氢氧化铵 (80 毫升 ) 并搅拌 1 小时。将溶液
     浓缩并过滤， 获得粗产物 8-III(7.7 克 )。
     于 0℃， 将化合物 8-III(7.7 克 ) 的 THF(200 毫升 ) 溶液缓慢加入 LiAlH4(8.6 克 ) 的 THF(200 毫升 ) 溶液。与 65℃搅拌混合物溶液 15 小时。室温下加入 NaSO4· 10H2O， 并搅 拌 1 小时。将形成的混合物过滤， 获得滤液， 并浓缩。将残余物溶解于 CH2Cl2(100 毫升 )。 室温加入 Et3N(27 克 ) 和 (Boc)2O(10 克 )。搅拌该溶液 15 小时， 然后浓缩获得形成的残余 物。在形成的残余物中加入醚。过滤并真空干燥， 获得固体粗产物 8-IV(8.8 克 )。
     化合物 8-IV(1.1 克 ) 和 Et3N(1.7 克 ) 的 1- 戊醇 (10 毫升 ) 溶液与 2， 4- 二氯 -6- 氨 基嘧啶 (1-VI， 910 毫克 ) 于 90℃下反应 15 小时。TLC 显示反应完成。与 25℃在反应混合 物中加入乙酸乙酯 (10 毫升 )。搅拌该溶液 1 小时。除去 Et3NHCl 盐。将滤液浓缩， 通过硅 胶纯化 (EtOAc/ 己烷＝ 1 ∶ 2)， 获得所需产物 8-V(1.1 克， 产率为 65％ )。
     将 4N HCl/ 二烷 (10 毫升 ) 溶液加入中间体 8-V(1.1 克 ) 的 MeOH(10 毫升 ) 溶液 反应， 并于 25℃搅拌 15 小时。TLC 显示反应完成。将混合物浓缩， 过滤并真空 ( ＜ 10 托 ) 干燥。为了中和， 于 25℃在盐酸盐的 MeOH 溶液 (20 毫升 ) 中加入 K2CO3(3.2 克 )。同样温 度下搅拌混合物 3 小时 (pH ＞ 12) 后过滤。于 0-10℃， 在滤液中加入醛 1-IX(759 毫克 )。 于 0-10℃搅拌反应 3 小时。TLC 显示反应完成。然后， 在低于 10℃加入 NaBH4(112 毫克 )， 于 10-15 ℃搅拌溶液 1 小时。将该溶液浓缩得到残余物， 该残余物用 CH2Cl2(10 毫升 ) 处 理。混合物用饱和 NH4Cl( 水溶液 ) 溶液洗涤。将 CH2Cl2 层浓缩， 残余物通过硅胶层析纯化 (MeOH/28％ NH4OH ＝ 97/3)， 获得中间体 8-VI(1.0 克， 产率为 66％ )。
     于 25℃， 将 Et3N(600 毫克 ) 和 Boc2O(428 毫克 ) 加入 8-VI(1.0 克 ) 的 CH2Cl2(10 毫升 ) 溶液。25℃搅拌该混合物 15 小时。TLC 显示反应完成。将溶液浓缩， 并通过硅胶层 析纯化 (EtOAc/ 己烷＝ 1 ∶ 1)， 获得中间体 8-VII(720 毫克， 产率为 60％ )。
     于 25℃向化合物 8-VII(720 毫克 ) 和哌嗪 (1-XII， 1.22 克 ) 的 1- 戊醇 (10 毫升 ) 溶液中加入 Et3N(1.43 克 )。于 120℃搅拌混合物 24 小时。TLC 显示反应完成。25℃加入 乙酸乙酯 (20 毫升 )。搅拌该溶液 1 小时。除去 Et3NHCl 盐， 将溶液浓缩并通过硅胶进行纯 化 (EtOAc/MeOH ＝ 2 ∶ 8)， 获得 8-VIII(537 毫克 )， 产率为 69％。
     于 25 ℃向 8-VIII(537 毫克 ) 的 MeOH(11 毫升 ) 溶液中加入乙烯基膦酸二乙酯 (2-I， 201 毫克 )。于 65℃搅拌混合物 24 小时。TLC 和 HPLC 显示反应完成。将溶液浓缩并 通过硅胶进行纯化 (MeOH/CH2Cl2 ＝ 1 ∶ 9)， 得到 8-IX(380 毫克 )， 产率为 57％。
     于 10-15℃用 1 小时向 8-IX(210 毫克 ) 的 CH2Cl2(5 毫升 ) 溶液中加入 TMSBr(312 毫克 )。25℃搅拌该混合物 15 小时。40℃下将该溶液真空浓缩除去 TMSBr 和溶剂， 然后， 加 入 CH2Cl2 以溶解残余物。然后在真空条件下进一步除去 TMSBr 和溶剂， 分四次加入 CH2Cl2。 将该溶液浓缩， 得到化合物 8 的氢溴酸盐 (190 毫克 )。
     CI-MS(M++1) ： 566.9
     (9) 制备化合物 9
     按照实施例 1 所述制备中间体 1-XIII。
     于 0℃， 向乙烯基膦酸 (9-I， 550 毫克 ) 在无水 CH2Cl2(17 毫升 ) 的溶液中缓慢加 入草酰氯 (3.9 克 ) 和 DMF(0.4 毫升 )。将该混合物回流 3 小时， 浓缩后定量获得相应的 氯化膦。于 -70 ℃， 将该氯化膦加入到 2， 2- 二甲基 -1， 3- 丙二醇 (9-II， 530 毫克 )、 无水 CH2Cl2(17 毫升 ) 和 Et3N(3.1 克 ) 的混合物中。该混合物缓慢加热至室温并搅拌 15 小时。 然后用水洗涤。有机层用 (MgSO4) 干燥， 过滤和蒸发。残余物通过硅胶柱层析纯化 (EtOAc/ MeOH ＝ 9 ∶ 1)， 获得 9-III(65 毫克， 产率为 7％ )， 为棕色油状物。
     将化合物 9-III(65 毫克 ) 加入到中间体 1-XIII(202 毫克 ) 在 MeOH(4 毫升 ) 的溶 液中。于 65℃搅拌该溶液 24 小时。将溶液浓缩， 残余物通过硅胶柱层析纯化 (CH2Cl2/MeOH ＝ 9 ∶ 1)， 获得中间体 9-IV(147 毫克 )， 产率为 48％。
     将 20％ TFA/CH2Cl2(3 毫升 ) 溶液加入到中间体 9-IV(147 毫克 ) 在 CH2Cl2(2.0 毫 升 ) 的溶液中。室温下搅拌反应混合物 12 小时， 浓缩获得化合物 9 的三氟乙酸盐 (267 毫 克 )。
     CI-MS(M++1) ： 635.4
     (10) 制备化合物 10
     按照与实施例 9 所述相同的方式制备化合物 10， 除了使用 2- 氨基苯甲醇替代 2， 2- 二甲基 -1， 3- 丙二醇。
     CI-MS(M++1) ： 654.4
     (11) 制备化合物 11
     于 0 ℃， 搅 拌 11-I(1000 毫 克 ) 和 外 -2- 氨 基 降 冰 片 烷 (11-II， 257 毫 克 ) 的 MeOH(10 毫升 ) 溶液 3 小时。然后， 于 0℃用 1 小时加入 NaBH4(87.5 毫克 )。将溶液浓缩， 用 NH4Cl( 水溶液 ) 猝灭， 用 CH2Cl2 萃取。将有机层合并， 用 MgSO4 干燥， 浓缩后获得残余物， 该残余物通过硅胶层析纯化 (MeOH/28％ NH4OH ＝ 97/3)， 获得中间体 11-III(1000 毫克， 产 率为 82％ )。
     于 25℃， 搅拌中间体 11-III(1000 毫克 )、 Et3N(210 毫克 ) 和 Boc2O(455 毫克 ) 的 CH2Cl2(10 毫升 ) 溶液 15 小时。将溶液浓缩， 并通过硅胶层析纯化 (EtOAc/ 己烷＝ 1/1)， 获 得中间体 11-IV(907 毫克， 产率为 76％ )。
     于 25℃， 在 H2( 气球 ) 下搅拌中间体 11-IV(907 毫克 ) 和 Pd/C(20 毫克 ) 的 MeOH(10 毫升 ) 溶液 18 小时。溶液通过硅藻土 (celite) 柱过滤获得滤液， 除去 MeOH， 获得中间体 11-V(740 毫克 )。
     将 Et3N(454 毫克 ) 加入中间体 11-V(740 毫克 ) 和 2， 4- 二氯 -6- 氨基嘧啶 (1-VI， 246 毫克 ) 的 1- 戊醇 (10 毫升 ) 溶液中。于 120℃搅拌反应混合物 15 小时， 并真空浓缩。 形成的残余物通过硅胶层析纯化 (EtOAc/ 己烷＝ 1/2)， 获得中间体 11-VI(420 毫克， 产率为 45％ )。
     于 25℃， 向化合物 11-VI(1.7 克 ) 和哌嗪 (1-XII， 1.4 克， 6 当量 ) 的 1- 戊醇 (30 毫升 ) 溶液中加入 Et3N(1.66 克， 6.0 当量 )。于 120℃搅拌混合物 15 小时。将溶液浓缩并 通过硅胶进行纯化 (EtOAc/MeOH ＝ 8 ∶ 2)， 获得 11-VII(1.5 克 )， 产率为 82％。
     于 25 ℃， 在 11-VII(1.5 克 ) 的 MeOH(30 毫升 ) 溶液中加入乙烯基膦酸二乙酯 (1-XIV， 0.556 克， 1.5 当量 )。于 65℃搅拌混合物 24 小时。TLC 和 HPLC 显示反应完成。将 溶液浓缩并通过硅胶进行纯化 (MeOH/CH2Cl2 ＝ 8/92)， 得到 1.1 克 11-VIII， 产率为 59％。
     于 10-15℃用 1 小时向 11-VIII(1.0 克 ) 的 CH2Cl2(5 毫升 ) 溶液中加入 TMSBr(1.46 克， 8 当量 )。25℃搅拌该混合物 15 小时。将该溶液浓缩， 在 40℃下真空除去 TMSBr 和溶 剂。在该混合物中加入 CH2Cl2 以溶解残余物。再次于真空除去 TMSBr 和溶剂， 获得粗固体，
     该固体用 IPA/MeOH(9/1) 洗涤， 过滤并于 25℃下真空 ( ＜ 1 托 ) 干燥 3 小时后获得化合物 11。在 EtOH 中结晶， 得到化合物 11 的氢溴酸盐 (530 毫克 )。
     CI-MS(M++1) ： 579.4
     (12) 制备化合物 12
     按照于实施例 11 所述相同的方式制备化合物 12， 除了使用环己基六甲基四胺 (cyclohexylmethanamine) 代替外 -2- 氨基降冰片烷。
     CI-MS(M++1) ： 581.4
     冻干
     (1) 制备水溶液
     在一个玻璃烧杯中， 将 3.00 克甘露醇和 0.7622 克测试化合物 ( 为 HBr 盐形式 ) 溶解于少于 100 毫升的 0.2％ (w/v)NaCl 溶液中。将该溶液移至 100 毫升的容量瓶中。烧 杯用 0.2％ NaCl 溶液冲洗， 将该溶液转移到该容量瓶中。用 0.2％ NaCl 溶液将容量瓶中溶 液的体积调节至 100 毫升。因此， 制备的溶液含有 5 毫克 / 毫升测试化合物 ( 游离碱 )、 3％ (w/v) 甘露醇和 0.2％ (w/v)NaCl。制成的溶液首先预过滤， 然后通过已灭菌的 0.22 微米 TM Millipore Durapore 微滤器过滤。这种无菌 - 过滤的溶液用于冻干。
     按照类似的方式， 制备含 5 毫克 / 毫升测试化合物、 3％ (w/v) 甘露醇和 0.3％ (w/ v)NaCl 的溶液以及含 5 毫克 / 毫升测试化合物、 3％ (w/v) 甘露醇和 0.4％ (w/v)NaCl 的溶 液。
     (2) 溶液冻干
     将溶液转移至小瓶中。将这些小瓶冷却至 20℃并达到平衡。用 20 分钟进一步冷 却至 5℃， 并保持该温度 30 分钟。 然后用 180 分钟冷却至 -45℃， 并保持该温度保持 4 小时。 在小瓶上施加 133 微巴真空。真空下用 60 分钟使小瓶的温度升高至 -38℃， 并保持 6 小时。 然后， 于 -29℃保持真空 5 小时， -27℃保持真空 15 小时。
     保持 133 微巴真空条件的同时， 使小瓶的温度在 60 分钟内升高至 -3℃。 6 小时后， 在 60 分钟内使温度升高至 5℃。小瓶在 48 微巴真空条件下保持 99 小时， 然后在氮气下密 封。
     (3) 冻干组合物的按照比例增加制备
     制备 2 升含 5 毫克 / 毫升测试化合物、 3％ (w/v) 甘露醇和 0.2％ (w/v)NaCl 的溶 液。 将该溶液通过 Millipak 20、 0.22 微米 PVDF 滤器过滤。 将该溶液转移至 10 毫升 Schott 1 型透明玻璃小瓶中， 并按照下面表中列出的条件进行冻干 ：
     温度 冷却 冷却 冷却 20℃ 5℃ 5℃至 -45℃压力 常压 常压 常压时间 N/A 50 分钟 3 小时23102058547 A CN 102058549说-45℃ -45℃至 -38℃ -38℃ -38℃至 -29℃ -29℃ -29℃至 -27℃ -27℃ -27℃至 -3℃ -3℃ -3℃至 12℃ 12℃ 12℃至 5℃ 5℃明书6 小时 1 小时 3 小时 2 小时 5 小时 2 小时 20 小时 1 小时 3 小时 1 小时 12 小时 0.5 小时 99 小时18/18 页冷冻 干燥 干燥 干燥 干燥 干燥 干燥 干燥 干燥 干燥 干燥 干燥 干燥
     常压 133 微巴 133 微巴 133 微巴 133 微巴 133 微巴 133 微巴 133 微巴 133 微巴 133 微巴 133 微巴 133 微巴 48 微巴在氮气下， 用 Helvoet Omniflex Rubber Lyo- 塞子将小瓶密封。
     稳定性研究
     将小瓶在 5℃ / 环境相对湿度， 25℃ /60％相对湿度， 或 40℃ /75％相对湿度条件 下储存 1 个月、 2 个月、 3 个月或 6 个月。与冻干后立刻得到的结果相比， 储存了 1 个月、 2个 月、 3 个月和 6 个月的组合物在其化合物含量、 水分含量、 外观和 pH 方面的变化很小或者没 有变化。即使增加其重溶的时间但依然很短， 即约 30-40 秒。
     其他实施方式
     说明书中所揭示的所有特征可以以任意的组合方式结合。 说明书中所揭示的各种 特征可以被起到相同、 等价或类似目的的特征代替。因此， 除非另外说明， 所揭示的各种特 征仅仅是一系列等价或类似特征的一个例子。
     通过以上说明， 本领域技术人员可以很容易地确定本发明的主要特征， 同时可以 在不背离本发明的精神和范围的前提下， 对本发明进行各种改变和改良， 以使其适用于各 种应用和条件。因此， 其他的实施方式也在所附权利要求书的范围之内。
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