用于活化干细胞的药剂 本发明涉及医药， 特别涉及设计用于活化它们自身的干细胞的药物。
人类干细胞被用于现代医药， 以治疗许多疾病， 包括癌症、 心脏疾病和其他疾病。 干细胞可来源于骨髓和胚胎组织的脐带血以及外周血。
干细胞分裂为间充质细胞 ( 它们能够分化为中胚层源的组织细胞 )、 造血细胞 ( 血 细胞的前体 )、 神经元细胞 ( 神经系统的祖细胞 ) 和其他细胞。间充质干细胞 (MSC) 经常被 用作移植物， 因为它们将增强它们自身的身体储备， 促进细胞因子和生长因子的形成， MSC 是成骨细胞的前体， 并促进重建单元的形成。
在细胞治疗的实践中， 基于引入新干细胞生物体而非其自身的活化的活化干细胞 的工具被广泛销售和使用。
特别是， 一种工具是通过糖蛋白活化干细胞 (Rd.IASC S07K16/28 上 RF 专利号 2,272,810， 公开于 2006 年 3 月 27 日 )， 其包括作为糖蛋白的 IgG 类的多克隆免疫球蛋白， 平均分子量为 150kDa， 获自对复合抗原 CD34+ 干细胞的体液免疫应答。这一工具在干细胞 表面和内部的抗原决定簇的最大范围内操作， 这引起它们的活化。
然而， 该工具用它们自身的干细胞活化。 获得药物的过程是持久的， 需要很大的努 力。
已知活化干细胞的一种工具 ( 药物非格司亭 (Neupogen)F.Hoffman-laRoshe 公 司 ) 是由 175 个氨基酸组成并具有 187-189 千道尔顿 (kDa) 分子量的， 由人类基因 5gdl-g31 在大肠杆菌 (E.coli) 的基因组中表达获得的糖蛋白。该产品含有额外的氨基酸 - 甲硫氨 酸。 非格司亭将祖细胞成熟为嗜中性粒细胞缩短了 5 至 1 天， 加速了成熟嗜中性粒细胞从骨 髓输出到血液 (B.Lord 等人 Proc.Of the National Academy of Sci.Of USA， 1992， 1986， 第 9499-9503 页 )， 增强了嗜中性粒细胞的趋化性 (SPColgan 等人， Experim.Hematology， 1992， 1920， 第 1229-1234 页 )。其用于标准细胞毒性化学治疗、 骨髓移植、 动员慢性嗜中性 粒细胞减少症中的天然集落刺激因子、 促进伤口愈合等等。
然而， 非格司亭的应用引起并发症 ： 骨痛、 脾肿大、 皮肤反应等等。此外， 非格司亭 的治疗成本非常高， 为 U.S.$1500-3000。
最接近要求保护的药物 《硼 替 佐 米》 ( 参 见 www.rlsnet.ru/mnn_bortezomib. html) 存在于所有真核细胞的细胞核和胞质溶胶中， 并催化细胞生命周期涉及的主要蛋白 的分裂， 硼替佐米是修饰中心的硼酸， 是一种 26S 蛋白酶体活性的高度选择性可逆抑制剂。 化学名 -[(1R)-3- 甲基 -1[[(2S)-1- 氧代 -3- 苯基 -2-[( 吡嗪羧基 (pirasinilcarbonil)) 氨基 ] 丙基 ] 氨基 ] 丁基 ]， Brutto 式 ： C19H25BN4O4。
《硼替佐米》 在体内引起人类肿瘤， 包括多发性骨髓瘤的许多实验模型的延缓。该 药物用 0.9％ NaCl 稀释至 1mg/ml 的浓度， 静脉内施用。该药物的主要目标是多发性骨髓 瘤。
还 确 定 (sm.www.sciencedaily.com/releases/2008/01/080124 173， 809.Htm)， 《硼替佐米》 减少骨组织的破坏， 增加成骨细胞和骨形成的活性， 具有对间充质干细胞的直 接药理学效应。因此， 相对于基于引入干细胞的新生物体的细胞治疗的实践中普遍和广泛
使用的， 该药物在体内活化干细胞， 增强其修复能力。
这一药物的主要缺点是其高毒性， 和许多的副作用 ： 对血液部分 ( 血小板减少， 贫 血 )、 对消化系统 ( 恶心、 呕吐、 肠梗阻、 急性胰腺炎、 肝炎 )、 对神经系统 ( 头疼、 意识丧失、 自主神经系统功能障碍、 惊厥 )、 对 Parties、 对心血管系统 ( 血压下降、 充血性心力衰竭 ) 等等。
本发明的目的是解决产生活化身体自身干细胞而无毒且不具有副作用的工具的 任务。
为解决这一问题， 根据本发明的活化干细胞的工具含有化学来源的活性成分和注 射用氯化钠， 其含有以下比例 wt.％的活性甲醛 ：
甲醛 ....................................................0.00003-0.004
注射用氯化钠 0.85-0.95％浓度 ........................... 余量
专利和科技信息来源的已知作者没有描述用于未基于将干细胞输入体内而活化 干细胞的无毒且不具有副作用的工具， 和对身体自身细胞， 即对脾细胞和红骨髓的影响。
已知免疫调节剂含有甲醛和氯化钠 ( 参见对于细胞的俄罗斯专利号 2077882， A61K31/115IPC， 公开于 1997 年 4 月 27 日 )， 甲醛的浓度是 0.07-0.24wt.％。 然而， 这一药物没有活化干细胞， 而仅具有免疫调节效应。
作者首先确认了药物浓度数据 (0.00003-0.004wt.％ ) 的作用。 增加有氧氧化， 这 转而限制其对正常细胞的效应并引起癌细胞死亡。
这使得我们推断出要求保护的发明存在 “创造性步骤” 。
具有特殊刺激性气味的透明无色液体甲醛水溶液以所有比例与水和醇混合。
甲醛是醛类的代表 HCOH。 是具有刺激性气味的无色气体， 它们具有 30.03 的质量， 其在 20℃的密度是 0.815， 熔点 92℃， 沸点 19.2℃。其可溶于水、 醇。其易于聚合， 在水介 质中形成聚合 - 低聚甲醛， 在干燥环境 ( 丁烷、 己烷 ) 中形成聚合 -POM。
等渗注射用氯化钠溶液 - 一种成味无色透明液体。溶液是无菌、 无热原的。
氯化钠 - 立方晶体或白色结晶粉末， 成味， 无气味。可溶于水 (1 ∶ 3)。
要求保护的药剂是澄清无色无气味液体， 略带咸味。
该工具如下制备。
取 LIMITED Medicine 37-40％甲醛溶液， 将其加入无菌的 0.9-0.95％注射用氯化 钠溶液， 直至 0.00003-0.003％的甲醛溶液。储备液在 15-35℃的温度下保存在暗处。
实施例 1
取 0.01ml 健康级 37％甲醛水溶液， 将其加入到 99.99ml 0.9％ ( 或 0.95％浓度 ) 无菌等渗氯化钠水溶液。将混合物溶液充分混合。甲醛在获得的储备液中的最终浓度将是 0.0037wt.％。
实施例 2
取 0.0001ml 健康级 37％甲醛水溶液， 将其加入到 99.9999ml 0.9％ ( 或 0.95％浓 度 ) 无菌等渗氯化钠水溶液。将混合物溶液充分混合。甲醛在获得的储备液中的最终浓度 将等于 0.000037wt.％。
实施例 3
取 0.01ml 医用 40％甲醛水溶液。根据以上实施例 2 制备工具。甲醛的最终浓度
将等于 0.004wt.％。
实施例 4
取 0.0001ml 健 康 级 40 ％ 甲 醛 水 溶 液 ； 将 其 加 入 到 99.9999ml 0.95 ％ 无 菌 等 渗氯化钠水溶液。将混合物溶液充分混合。甲醛在获得的储备液中的最终浓度将等于 0.00003wt.％。
为了证明干细胞的活化， 进行了药物对增殖的作用和在脾细胞和骨髓中的毒性的 研究。
实验使用 3 个月鼠龄的 C57Bl/6 系小鼠 ( 雄性 )。小鼠在无菌条件下通过断头术 杀死， 提取脾和红骨髓。脾碎片在 199 培养液中在玻璃匀浆器中充分均化， 通过灭菌纱布过 滤， 并以 1500rpm 在 199 培养液中洗涤 3 次， 持续 5 分钟。
在环境 199 下用注射器提取股骨的骨髓细胞。然后， 小心地吸取它们， 并用以上方 法洗涤。
此 后， 将 脾 细 胞 和 骨 髓 骨 髓 细 胞 (cariotsites) 转 移 至 完 全 培 养 基 ( 培 养 基 RPMJ-1640+10％ FCS( 胎牛血清 )+2mM L- 谷氨酰胺 +25mM Hepes 缓冲液 +2+ 巯基乙醇 4g/ ml 庆大霉素 )， 并调节至每 1ml1×106 有核细胞浓度。以上提及的程序之后， 活细胞的数量 是 93-98％。
在具有 5％ CO2 的潮湿气氛中， 在无菌条件下进行细胞培养。 在将吖啶橙 (0.25mg/ ml) 和菲啶溴红 (0.25mg/ml) 的溶液加入细胞悬浮液混合物之后， 使用荧光显微镜评价活 细胞和死细胞的数量。将 1mkKYu 3H- 胸苷 ( 比活性 ) 在 4:00( 孵育之后 ) 加入细胞之后， 评价细胞的增殖活性。
用胸苷孵育之后， 将相同的细胞转移至玻璃纤维滤器中， 用过量的水洗涤， 经受 96°乙醇， 然后在空气中干燥。 之后， 将滤器浸在基于标准甲苯闪烁剂的 POP 和 POPOP( 每种 药物稀释液 3 份样品 )。使用 β- 计数器计算样品的放射活性 (1 分钟内 3H- 胸苷的 β- 衰 变的数量 )。
在细胞培养物中， 以不同浓度加入药物， 并考虑孵育 24 小时之后死亡细胞的百分 比。
确定不同浓度的药物毒性的结果在表 1 中提供。
根据表 1， 当加入到脾细胞和骨髓细胞 (cariotsytes) 时， 与对照相比， 不同浓度 的药物 (0.0035-0.0000273) 增加死亡细胞的数量 1.4-2.5 倍。
研究脾细胞和骨髓细胞 (cariotsytes) 的增殖能力的结果在表 2 中提供。
表 2 显示与对照相比， 脾细胞增殖增加了 1.5-4.2 倍， 骨髓细胞 (kariotsitov) 增 加了 2.1 至 12.7 倍。
我们在孵育 24 小时和 44 小时之后， 在可比方面研究脾细胞的增殖活性。在这种 情况下， 通过注射到细胞培养物 4 小时的 3H- 胸苷的每分钟脉冲数， 评价增殖活性。结果在 表 3 中列出。
表 3 显示， 与对照相比， 所有浓度的药物在孵育期增加细胞增殖 1.5-14 倍。
这些结果表明在体外药物增加了脾细胞和骨髓的增殖。在这种情况下， 部分细胞 死亡在再生过程中不是决定性的， 且不影响剩余正常细胞增殖的加强。
该药物在使用浓度下在有限数量的患者中交替试用 ： 未愈合营养不良性溃疡、 术后瘘。 该药物每周肌内注射 1 次， 持续 1-2 个月。
实施例 1
患者 N， 35 岁， 患有术后瘘
治疗疗程持续 2 个月后， 伤口完全愈合， 而没有再次手术介入。
实施例 2
患者 S， 1972- 难治性营养不良性溃疡
1 个月疗程后， 出现溃疡净化并完全愈合。
实施例 3
患者 K， 45 岁 - 踝关节骨折
1.5 个月治疗后， 骨组织康复， 且没有任何并发症。放射学证实加速了康复过程。
因此， 体外的且应用于有限数量的患者的要求保护的工具证实其用于增加患者自 身干细胞的可能性。
用不同浓度的药物孵育 24 小时后， 3 个月鼠龄小鼠 S57VL/6 的死亡细胞 ( 脾细胞 和骨髓细胞 ) 的百分比
用不同浓度的药物孵育 24 小时后， 脾细胞和骨髓细胞的增殖用不同浓度的药物孵育 24 小时和 44 小时之后， 100,0003 个月鼠龄小鼠 S57VL/6 的脾细胞的增殖活性7