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高糖基化人凝血因子 IX
    发明领域 本发明涉及高糖基化人凝血因子 IX 多肽、 用于制备所述多肽的方法、 包含所述多 肽的药物组合物以及所述化合物在治疗通过人凝血因子 IX 缓解的疾病中的用途， 特别是 但非唯一地在治疗血友病中的用途。
     发明背景
     凝血因子 IX(FIX) 是结构类似于凝血因子 VII、 凝血酶原、 凝血因子 X 和蛋白 C 的 维生素 K 依赖性凝血因子。循环中的人 FIX 酶原由被分成四个不同的结构域的 415 个氨基 酸组成， 这四个结构域包括一个 N 端富含 γ- 羧基谷氨酸 (Gla) 的结构域、 两个 EGF 结构域 145 146 和一个 C- 端胰岛素样丝氨酸蛋白酶结构域。 FIX 的活化通过在 Arg -Ala 和 Arg180-Val181 处的限制性蛋白水解释放 35 个氨基酸的活化肽而发生 (Schmidt AE 和 Bajaj SP(2003) Trends in Cardiovascular Medicine 13， 39-45)。野生型人凝血因子 IX(SEQ ID NO ： 1) 具有两个 N- 糖基化位点 (N157 和 N167)。
     一些蛋白的半寿期可通过在野生型蛋白中未被糖基化的氨基酸位置添加 N- 聚 糖来延长 (Sinclair AM 和 Elliott， S(2005)Journal ofPharmaceutical Sciences 94， 1626-1635 的综述 )。N- 聚糖通过产生蛋白的真核细胞连接在该蛋白上。随着新生蛋白从 核糖体转移至内质网， 细胞的 N- 糖基化机构 (machinery) 识别并糖基化氨基酸链的 N- 糖 基 化 信 号 (N-X-S/T 基 序 )(Kiely 等 (1976)Journal of Biological Chemistry 251， 5490-5495 ； Glabe 等 (1980)Journal of Biological Chemistry 255， 9236-9242)。 因此， 糖 基化改造 (glycoengineered) 的蛋白可通过引入添加 N- 糖基化位点至蛋白的氨基酸序列
     的突变来制备。该原理已应用于获得长效的第二代促红细胞生成素 (Amgen)。此类糖基化改造在生物药剂学的生产方面非常有吸引力， 这是由于最终延长的蛋白分泌至 生产细胞的培养基中。因此， 与 PEG 化不同， 糖基化改造不会使下游加工复杂化并增加下游 处理的成本。 此外， 高糖基化可屏蔽蛋白表位 (Cheng-Mayer 等 (1999)Journal of Virology 73， 5294-5300) 并通过增大蛋白的溶解度减少聚集 (Song 等 (2001)FEBS Letters 491， 63-66)。 实际上， 糖基化改造还可通过减少蛋白的免疫原性来改良重组蛋白， 从而减少患者 形成针对该蛋白的中和抗体的风险。 有趣的是， N- 聚糖对清除的影响会随蛋白的不同而变化。个别蛋白不受 N- 聚糖 的去除或添加的影响。相比之下， 某些蛋白在其 N- 聚糖缺失下清除得更快， 而如上所述， 某 些蛋白的清除可通过添加额外的 N- 聚糖延迟 (Elliott 等 (2003)Nature Biotechnology 21， 414-421 ； Perlman 等 (2003)Journal of Clinical Endocrinology 和 Metabolism 88， 3227-3235)。N- 聚糖影响某些蛋白的清除的机制是未知的并且可随蛋白而变化。对于促 卵泡激素， 已提出用大小增加和来自唾液酸的负电荷增加而造成肾清除率减小来解释由额 外的 N- 聚糖诱导的清除的延迟 (Perlman 等 (2003)， 见上文 )。已知添加额外的 N- 聚糖 而延长的蛋白主要是相对小的蛋白， 其符合对肾清除率的影响。但对于促红细胞生成素， 仍待出现确凿的证据证明肾或肝清除率的重要影响。在结合促红细胞生成素受体后， 被骨 髓中的细胞内化的促红细胞生成素的胞内降解， 已被认为是清除循环促红细胞生成素的主
     要机制 (Jelkman、 (2002)European Journal of Haematology 69， 265-274 的综述 )。与野 生型促红细胞生成素相比， 长效的高糖基化促红细胞生成素与促红细胞生成素受体的亲和 力降低 (Elliott 等 (2004)Experimental Hematology 32， 1146-1155)， 并且近来的证据显 示受体亲和力减小和受体介导的降解较慢之间有联系， 从而导致较长的循环半寿期 (Gross 和 Lodish， (2006)Journal of Biological Chemistry 281， 2024-2032)。 有 趣 的 是， 高 糖基化促红细胞生成素与受体结合减少似乎起因于唾液酸含量增加 (Elliott 等 (2004) Experimental Hematology 32， 1146-1155)。高糖基化促红细胞生成素的体外活性相对于 野生型促红细胞生成素显著减小， 并且本领域技术人员已知的是， 当 N- 聚糖在野生型蛋白 中不被糖基化的位点处引入蛋白时， 必然预料到比活性大量减小。
     US 2003/0036181(Maxygen， Inc.) 描 述 了 向 多 肽 添 加 糖 基 化 位 点。EP 0640619(Amgen Inc.) 描述了具有另外的糖基化位点的促红细胞生成素类似物。Mimuro 等 (2004)Journal of Thrombosis and Haemostasis， 2， 275-280 描述了具有在第 260 位氨基 酸处引入 N- 糖基化位点的突变 A262T 的人凝血因子 IX。
     因此对提供人因子 IX 的改良变体存在很大的需求， 与野生型人因子 IX 相比， 所述变体显示增加的体内循环半寿期但并不显著降低蛋白水解活性或凝血活性 (clot activity)。 发明简述
     本发明的第一个方面提供具有一个或多个突变的人因子 IX 多肽类似物， 其中所 述突变导致在所述多肽中引入一个或多个糖基化位点。
     本发明的第二个方面提供糖基化人因子 IX 多肽类似物， 其中所述多肽相对于野 生型人因子 IX 多肽在除 N157 或 N167 之外的一个或多个位置被糖基化。
     本发明的另一个方面提供治疗血友病的方法， 其包括给予患者治疗有效量的如上 文定义的多肽。
     附图简述
     图 1 描述了培养基中的因子 IX 蛋白的蛋白印迹， 该因子 IX 蛋白来自用编码野 生型人凝血因子 IX 的 pTS87 或用编码高糖基化人凝血因子 IX 变体的 pGB071、 pGB072、 pGB073、 pGB074 或 pGB075 瞬时转染的 HEK293F 细胞， 所述变体具有在野生型人凝血因子 IX 中不存在的一个 N- 糖基化位点 ( 实施例 2)。
     图 2 描述了与图 1 所示相同的培养基经 PNGase F 处理时的蛋白印迹 ( 实施例 2)。
     图 3 描述了培养基中的因子 IX 蛋白的蛋白印迹， 所述因子 IX 蛋白来自用编码高 糖基化 (H) 人凝血因子 IX(FIX-T172N-K228N-I251T-A262T) 的 pGB022 或用编码野生型 (W) 人凝血因子 IX 的 pTS87 瞬时转染的 HEK293F 细胞。该培养基在 SDS-PAGE 之前与或不与 PNGase F 温育 ( 实施例 4)。
     图 4 描 述 了 在 用 高 糖 基 化 重 组 人 凝 血 因 子 IX 变 体 FIX-T172N-K228N-I251T-A262T( 填充框 ) 或重组野生型人凝血因子 IX( 空心环 ) 注射的凝 血因子 IX 敲除小鼠的血浆中， 平均 FIX 抗原浓度与时间的关系曲线 ( 实施例 7)。
     发明详述
     本发明的第一个方面提供具有一个或多个突变的人因子 IX 多肽类似物， 其中所 述突变导致在所述多肽中引入一个或多个糖基化位点。
     本发明的第二个方面提供糖基化人因子 IX 多肽类似物， 其中所述多肽相对于野 生型人因子 IX 多肽在除 N157 或 N167 之外的一个或多个位置被糖基化。
     意想不到地发现， 本发明的高糖基化多肽类似物显示凝血因子 IX 延长的循环半 寿期， 从而减少治疗用肽的给药频率和 / 或增加与治疗用肽的接触。
     本文所用术语 “蛋白” 、 “多肽” 和 “肽” 意指由经肽键连接的至少五个组成型氨基 酸组成的化合物。所述组成型氨基酸可来自由遗传密码编码的氨基酸， 并且它们可为并非 由遗传密码编码的天然氨基酸以及合成的氨基酸。 并非由遗传密码编码的天然氨基酸为例 如： 羟脯氨酸、 γ- 羧基谷氨酸、 鸟氨酸、 磷酸丝氨酸、 D- 丙氨酸和 D- 谷氨酰胺。合成的氨基 酸包括通过化学合成制得的氨基酸， 即由遗传密码编码的氨基酸的 D- 异构体例如 D- 丙氨 酸和 D- 亮氨酸、 Aib(α- 氨基异丁酸 )、 Abu(α- 氨基丁酸 )、 Tle( 叔丁基甘氨酸 )、 β- 丙 氨酸、 3- 氨甲基苯甲酸和邻氨基苯甲酸。
     本文所用的提及多肽的术语 “类似物” 意指一种修饰的肽， 其中所述肽的一个或多 个氨基酸残基已被其它的氨基酸残基取代， 和 / 或其中已从所述肽中缺失一个或多个氨基 酸残基， 和或其中一个或多个氨基酸残基已被添加至所述肽中。氨基酸残基的此类添加或 缺失可发生在肽的 N 端和 / 或肽的 C 端。对于未说明旋光异构类型的所有氨基酸， 其都应 理解为意指 L- 异构体。
     在一个实施方案中， 所述一个或多个突变导致多肽中引入一个或多个 N- 糖基化位点。 在一个实施方案中， 所述一个或多个突变导致因子 IX 多肽类似物与野生型多肽 相比分子量增加。
     在一个实施方案中， 所述一个或多个突变导致因子 IX 多肽类似物与野生型多肽 相比等电点更偏酸性。
     在一个实施方案中， 与野生型多肽相比， 所述一个或多个突变导致因子 IX 多肽类 似物的蛋白水解活性和 / 或凝血活性发生不超过 0、 1、 2、 5、 10、 20、 50 或 100 倍的减少。在 另一个实施方案中， 所述一个或多个突变导致因子 IX 多肽类似物的蛋白水解活性和 / 或凝 血活性与野生型多肽相比发生不超过 0 倍的减少。
     细胞的 N- 糖基化机构糖基化 N-X-S/T 基序中的天冬酰胺残基， 并且潜在的 N- 糖 基化位点可通过建立此类基序的氨基酸变换而被引入蛋白中。因此， 在一个实施方案中， 多肽内的突变掺入了一个或多个 N-X-S/T 基序。在另一个实施方案中， 所述一个或多个 N-X-S/T 基序优选建立在其中作为 “N”的残基具有超过 25 ％的相对侧链表面可接近性 (relative side-chain surface accessibility) 的位置。
     应理解的是， 对于重链和 EGF2 结构域的表面可接近性可从已公开的晶体学数据 计算出来 (1RFN， Hopfner 等 (1999)Structure withFolding and Design 7， 989-96)， 而对 于 GLA 和 EGF1 结构域的计算可基于从猪 FIXa 的晶体 ( 及局部建模的 ) 结构建立的同源 模型 (1PFX， Brandstetter 等 (1995)Proceedings of the National Acedemy of Science ofthe USA 92， 9796-9800)。此外， 活化肽中没有可用的结构信息的残基被认为是重要的。 因此， 在另一个实施方案中， 具有超过 25％的相对侧链表面可接近性的残基可选自以下中 的一个或多个 ：
     Y1、 S3、 G4、 F9、 V10、 Q11、 G12、 R16、 K22、 R29、 T35、 R37、 T39、 F41、 W42、 Q44、 V46、
     D47、 G48、 D49、 Q50、 E52、 S53、 N54、 L57、 N58、 G59、 S61、 K63、 D65、 I66、 N67、 S68、 Y69、 E70、 W72、 P74、 F77、 G79、 K80、 N81、 E83、 L84、 D85、 V86、 T87、 N89、 I90、 K91、 N92、 R94、 K100、 N101、 S102、 A103、 D104、 N105、 K106、 V108、 S110、 E113、 G114、 R116、 E119、 N120、 Q121、 K122、 S123、 E125、 P126、 V128、 P129、 F130、 R134、 V135、 S136、 S138、 Q139、 T140、 S141、 K142、 A146、 E147、 A148、 V149、 F150、 P151、 D152、 V153、 D154、 Y155、 V156、 S158、 T159、 E160、 A161、 E162、 T163、 I164、 L165、 D166、 I168、 T169、 Q170、 S171、 T172、 Q173、 S174、 F175、 N176、 D177、 F178、 T179、 R180、 G183、 E185、 D186、 K188、 P189、 K201、 V202、 D203、 E213、 E224、 T225、 G226、 K228、 E239、 E240、 T241、 H243、 K247、 N249、 I251、 R252、 I253、 P255、 H257、 N258、 N260、 A261、 A262、 I263、 N264、 K265、 A266、 D276、 E277、 P278、 V280、 N282、 S283、 Y284、 D292、 K293、 E294、 N297、 I298、 K301、 F302、 G303、 S304、 Y306、 R312、 F314、 H315、 K316、 G317、 R318、 S319、 L321、 V322、 Y325、 R327、 P329、 L330、 D332、 R333、 A334、 T335、 L337、 R338、 K341、 F342、 T343、 Y345、 N346、 H354、 E355、 G357、 R358、 Q362、 E372、 E374、 G375、 E388、 M391、 K392、 G393、 K394、 R403、 N406、 K409、 F410、 K411 和 K413。
     因此野生型人因子 IX 内的上述氨基酸位置表示用于引入 N- 糖基化位点的潜在靶 点。 因此， 在一个实施方案中， 靶向具有超过 25 ％的相对侧链表面可接近性的 N 残 基 的 一 个 或 多 个 突 变， 可选自 ： Y1N、 S3N+K5S/T、 G4N+L6S/T、 F9N+Q11S/T、 V10N+G12S/ T、 G12N+L14S/T、 R16N+C18S/T、 K22N、 R29N+V31S/T、 T35N+R37S/T、 R37N、 T39N+F41S/T、 F41N+K43S/T、 W42N+Q44S/T、 Q44N+V46S/T、 V46N+G48S/T、 D47N+D49S/T、 G48N+Q50S/T、 D49N+C51S/T、 Q50N+E52S/T、 E52N+N54T、 S53N+P55S/T、 C56S/T、 L57N+G59S/T、 G60S/T、 S61N+K63S/T、 K63N+D65S/T、 D65N+N67S/T、 I66N+S68S/T、 Y69S/T、 Y69N+C71S/T、 S68N+E70S/ T、 E70N+W72S/T、 W72N+P74S/T、 P74N+G76S/T、 F77N+G79S/T、 G79N+N81S/T、 K80N+C82S/ T、 E83S/T、 E83N+D85S/T、 L84N+V86S/T、 D85N、 V86N+C88S/T、 T87N+N89S/T、 I90N+N92S/T、 K91S/T、 I90N+N92S/T、 K91N+G93S/T、 R94S/T、 R94N+E96S/T、 K100N、 A103S/T、 S102N+D104S/ T、 A103N+N105S/T、 D104N+K106S/T、 V107S/T、 K106N+V108S/T、 V108N+V110S/T、 S110N、 E113N+Y115S/T、 G114N+R116S/T、 R116N+A118S/T、 E119N+Q121S/T、 K122S/T、 Q121N+S123S/ T、 K122N+C124S/T S123N+E125S/T 、 E125N+A125S/T 、 P126N+V128S/T 、 V128N+F130S/ T、 P129N+P131S/T 、 F130N+C132S/T 、 R134N 、 V135N+V137S/T 、 S136N 、 S138N 、 Q139N 、 T140N+L142S/T、 S141N+L143S/T、 K142N、 A146N+A148S/T、 E147N+V149S/T、 A148N+F150S/ T、 V149N+P515S/T、 F150N+D152S/T、 P151N+V153S/T、 D152N+D154S/T、 V153N+Y155S/T、 D154N+V156S/T、 Y155N+N157S/T、 V156N、 S158N+E160S/T、 T159N+A161S/T、 E160N+E162S/ T、 A161N、 E162N+I164S/T、 T163N+L165S/T、 I164N+D166S/T、 L165N+N167S/T、 D166N+I168S/ T、 I168N+Q170S/T、 T169N、 Q170N、 S171N+Q173S/T、 T172N、 Q173N+F175S/T、 S174N+N176S/ T、 F175N+D177S/T 、 F178S/T 、 D177N 、 F178N+R180S/T 、 T179N+V181S/T 、 R180N+V182S/ T、 G183+E185S/T 、 E185N+A187S/T 、 D186N+K188S/T 、 K188N+G190S/T 、 P189N+Q181S/ T、 K201N+D203S/T 、 V202N+A204S/T 、 D203N+F205S/T 、 E213N+W215S/T 、 E224N+G226S/ T、 T225N+V227S/T 、 G226N+K228S/T 、 K228N 、 E239N 、 E240N+E242S/T 、 T241N+H243S/T 、 H243N+E245S/T、 K247N+N249S/T、 I251S/T、 I251N+I253S/T、 R252N+I254S/T、 I253N+P255S/ T、 P255N+H257S/T、 H257N+Y259S/T、 N260S/T、 A262S/T、 A261N+I263S/T、 A262N+N264S/
     T、 I263N+K265S/T 、 K265N+N267S/T 、 A266N+H268S/T 、 D276N+P278S/T 、 P278N+V280S/ T、 E277N+L279S/T、 V280N+N282S/T、 Y284S/T、 S283N+V285S/T、 Y284N、 D292N+K294S/T、 K293N+Y295S/T、 E294N、 F299S/T、 I298N+L300S/T、 K301N+G303S/T、 F302N、 G303N+G305S/ T、 S304N+Y306S/T、 Y306N+S308S/T、 R312N+F314S/T、 F314N+K316S/T、 H315N+G317S/T、 K316N+R138S/T、 G317N、 R318N+A320S/T、 S319N+L321S/T、 L321N+L323S/T、 V322N+Q324S/T、 Y325N+R327S/T、 R327N+P329S/T、 P329N+V331S/T、 L330N+D332S/T、 D332N+A334S/T、 R333N、 A334N+C336S/T、 T335N+L337S/T、 L337N、 R338N、 K341N、 F342N+I344S/T、 T343N+Y345S/ T、 Y345N+N347S/T、 M348S/T、 H354N+G356S/T、 E355N+G357S/T、 G357N+D359S/T、 R358N、 Q362N+D364S/T 、E372N+E374S/T 、E374N 、G375N 、E388N+A390S/T 、M391N+G393S/T 、 K392N+K394S/T、 G393N+Y395S/T、 K394N+G396S/T、 R403N+V405S/T、 I408S/T、 K409N+K411S/ T、 E410N、 K411N+K413S/T 和 K413N。
     在另一个实施方案中， 所述一个或多个 N-X-S/T 基序优选建立在其中作为 “N” 的 残基具有超过 50％的相对侧链表面可接近性的位置。因此， 在一个实施方案中， 具有超过 50％的相对侧链表面可接近性的残基可选自以下中的一个或多个 ：
     Y1、 S3、 G4、 F9、 V10、 Q11、 K22、 R37、 Q44、 V46、 D47、 G48、 Q50、 E52、 S53、 N54、 L57、 G59、 S61、 I66、 N67、 S68、 E70、 W72、 P74、 K80、 L84、 T87、 N89、 I90、 K91、 R94、 K100、 N101、 S102、 A103、 D104、 N105、 K106、 V108、 E113、 R116、 E119、 N120、 Q121、 S123、 E125、 P129、 S138、 T140、 S141、 K142、 A146、 E147、 A148、 V149、 F150、 P151、 D152、 V153、 D154、 Y155、 V156、 S158、 T159、 E160、 A161、 E162、 T163、 I164、 L165、 D166、 I168、 T169、 Q170、 S171、 T172、 Q173、 S174、 F175、 N176、 D177、 F178、 T179、 R180、 G183、 E185、 D186、 K188、 P189、 K201、 V202、 D203、 E224、 T225、 G226、 K228、 E239、 E240、 T241、 H243、 K247、 N249、 R252、 P255、 H257、 N260、 A261、 A262、 I263、 K265、 E277、 V280、 D292、 K293、 E294、 K301、 G303、 F314、 K316、 R318、 L321、 R327、 D332、 R333、 R338、 K341、 F342、 T343、 H354、 E355、 G357、 E372、 E374、 G375、 M391、 K392、 G393、 N406、 E410 和 K413。
     因此野生型人因子 IX 内的上述氨基酸位置表示用于引入 N- 糖基化位点的潜在靶 点。
     因此， 在一个实施方案中， 靶向具有超过 50％的相对侧链表面可接近性的 N 残基 的一个或多个突变可选自 ：
     Y1N、 S3N+K5S/T、 G4N+L6S/T、 F9N+Q11S/T、 V10N+G12S/T、 K22N、 R37N、 Q44N+V46S/ T、 V46N+G48S/T、 D47N+D49S/T、 G48N+Q50S/T、 Q50N+E52S/T、 E52N+N54T、 S53N+P55S/T、 C56S/T、 L57N+G59S/T、 S61N+K63S/T、 I66N+S68S/T、 Y69S/T、 S68N+E70S/T、 E70N+W72S/ T、 W72N+P74S/T 、 P74N+G76S/T 、 K80N+C82S/T 、 L84N+V86S/T 、 T87N+N89S/T 、 K91S/T 、 I90N+N92S/T、 K91N+G93S/T、 R94N+E96S/T、 K100N、 A103S/T、 S102N+D104S/T、 A103N+N105S/ T 、D104N+K106S/T 、V107S/T 、K106N+V108S/T 、V108N+V110S/T 、E113N+Y115S/T 、 R116N+A118S/T、 E119N+Q121S/T、 K122S/T、 Q121N+S123S/T、 S123N+E125S/T、 E125N+A125S/ T、 P129N+P131S/T 、 S138N 、 T140N+L142S/T 、 S141N+L143S/T 、 K142N 、 A146N+A148S/T 、 E147N+V149S/T 、 A148N+F150S/T 、 V149N+P515S/T 、 F150N+D152S/T 、 P151N+V153S/T 、 D152N+D154S/T、 V153N+Y155S/T、 D154N+V156S/T、 Y155N+N157S/T、 V156N、 S158N+E160S/ T、 T159N+A161S/T、 E160N+E162S/T、 A161N、 E162N+I164S/T、 T163N+L165S/T、 I164N+D166S/T、 L165N+N167S/T 、 D166N+I168S/T 、 I168N+Q170S/T 、 T169N 、 Q170N 、 S171N+Q173S/T 、 T172N、 Q173N+F175S/T、 S174N+N176S/T、 F175N+D177S/T、 F178S/T、 D177N、 F178N+R180S/ T、 T179N+V181S/T 、 R180N+V182S/T 、 G183+E185S/T 、 E185N+A187S/T 、 D186N+K188S/ T、 K188N+G190S/T 、 P189N+Q181S/T 、 K201N+D203S/T 、 V202N+A204S/T 、 D203N+F205S/ T、 E224N+G226S/T 、 T225N+V227S/T 、 G226N+K228S/T 、 K228N 、 E239N 、 E240N+E242S/T 、 T241N+H243S/T、 H243N+E245S/T、 K247N+N249S/T、 I251S/T、 R252N+I254S/T、 P255N+H257S/ T 、H257N+Y249S/T 、A262S/T 、A261N+I263S/T 、A262N+N264S/T 、I263N+K265S/T 、 K265N+N267S/T、 E277N+L279S/T、 V280N+N282S/T、 D292N+K294S/T、 K293N+Y295S/T、 E294N、 K301N+G303S/T 、 G303N+G305S/T 、 F314N+K316S/T 、 K316N+R138S/T 、 R318N+A320S/T 、 L321N+L323S/T、 R327N+P329S/T、 D332N+A334S/T、 R333N、 R338N、 K341N、 F342N+I344S/T、 T343N+Y345S/T、 H354N+G356S/T、 E355N+G357S/T、 G357N+D359S/T、 E372N+E374S/T、 E374N、 G375N、 M391N+G393S/T、 K392N+K394S/T、 G393N+Y395S/T、 I408S/T、 E410N 和 K413N。
     应理解的是， 更优选在第 1 位已含有 N 或第 3 位已含有 S/T 的位置引入 N- 糖基化 位点。因此， 在一个实施方案中， 所述一个或多个 N-X-S/T 基序将优选建立在其中作为 “N” 的残基选自以下中的一个或多个的位置 ： Y1、 K22、 R37、 N54、 N58、 N67、 N81、 D85、 N89、 N92、 K100、 N101、 N105、 S110、 N120、 R134、 S136、 S138、 Q139、 K142、 V156、 A161、 T169、 Q170、 T172、 N176、 D177、 K228、 E239、 N249、 N258、 N260、 N282、 Y284、 E294、 N297、 F302、 G317、 R333、 L337、 R338、 K341、 N346、 R358、 E374、 G375、 N406、 E410 和 K413。
     因此野生型人因子 IX 内的上述氨基酸位置表示用于引入 N- 糖基化位点的潜在靶 点。
     因此， 在一个实施方案中， 靶向在第 1 位已含有 N 或第 3 位已含有 S/T 的残基的一 个或多个突变可选自 ：
     Y1N、 K22N、 R37N、 C56S/T、 G60S/T、 Y69S/T、 E83S/T、 D85N、 K91S/T、 R94S/T、 K100N、 A103S/T、 V107S/T、 S110N、 K122S/T、 R134N、 S136N、 S138N、 Q139N、 K142N、 V156N、 A161N、 T169N、 Q170N、 T172N、 F178S/T、 D177N、 K228N、 E239N、 I251S/T、 N260S/T、 A262S/T、 Y284S/T、 Y284N、 E294N、 F299S/T、 F302N、 G317N、 R333N、 L337N、 R338N、 K341N、 M348S/T、 G358N、 E374N、 G375N、 I408S/T、 E410N 和 K413N。
     在又一个实施方案中， 所述一个或多个突变选自以下中的一个或多个 ：
     T172N、 K228N、 I251T 和 A262T。
     因此所述一个或多个糖基化位置可选自 ：
     T172、 K228、 N249 和 N260。
     在一个实施方案中， 所述一个或多个突变不包括作为因子 IX 多肽内的单突变的 A262T。
     在一个实施方案中， 所述高糖基化多肽含有至少一个聚糖。
     本发明的肽和药物组合物可用于治疗通过给予人凝血因子 IX 缓解的疾病或凝血 因子替代疗法， 所述疾病例如为 ： 出血障碍， 例如血友病、 血液病、 关节积血、 血肿、 皮肤粘膜 出血、 遗传性血液病、 家族性出血障碍或家族性血液病。在一个实施方案中， 通过给予人凝 血因子 IX 缓解的疾病为血友病， 例如血友病 B 或克里斯马氏病 (Christmas disease)。
     因此本发明的另一个方面提供一种治疗血友病的方法， 所述方法包括给予患者治 疗有效量的如上文定义的多肽。
     还提供用于治疗血友病的如上文定义的多肽。
     还提供如上文定义的多肽在生产用于治疗血友病的药物中的用途。
     还提供了用于治疗血友病的包含如上文定义的多肽的药物组合物。
     本文所用术语 “疗法” 和 “治疗” 意指以对抗诸如疾病或病症等的病状为目的处理 和护理患者。所述术语旨在包括对于患者正在遭受的既定病状的全方位的治疗， 例如给予 活性化合物， 以缓解症状或并发症、 以推迟疾病、 病症或病状的进展、 以缓解或减轻症状和 并发症、 和 / 或以治愈或消除疾病、 病症或病状以及以预防病状， 其中预防应理解为出于对 抗疾病、 病状或病症的目的处理和护理患者并且包括给予活性肽以预防症状或并发症的发 病。被治疗的患者优选为哺乳动物、 特别为人， 但其还可包括动物， 例如狗、 猫、 牛、 羊和猪。 应理解的是， 治疗性和预防性 ( 预防的 ) 方案表示本发明的单独的方面。
     本文所用 “治疗有效量” 的肽意指足以治愈、 缓解或部分阻止既定疾病及其并发症 的临床表现的量。足以实现以上目的的量定义为 “治疗有效量” 。对于各种目的的有效量将 取决于疾病或损伤的类型和严重性以及受试者的重量和一般状况。应理解的是， 确定合适 的剂量可利用常规试验， 通过构造值的矩阵并测试矩阵中不同点实现， 这全部在受过训练 的医师或兽医的普通技术范围内。 本发明的另一个方面提供用于制备如上文定义的多肽类似物的方法， 所述方法包 括以下步骤 ：
     (a) 位点定向诱变人因子 IX 以将一个或多个 N-X-S/T 基序掺入至编码人因子 IX 的 DNA 中 ；
     (b) 将所得核酸构建体 (nucleic construct) 转染至生产细胞中 ； 以及
     (c) 从转染的生产细胞的培养基中纯化所述多肽类似物。
     本发明的另一个方面提供编码如上文定义的人因子 IX 多肽类似物的核酸构建 体。
     本文所用术语 “核酸构建体” 旨在表示 cDNA、 基因组 DNA、 合成 DNA 或 RNA 来源的 任何核酸分子。术语 “构建体” 旨在表示可为单链或双链的核酸片段， 并且其可基于编码目 标肽的完整或部分的天然存在的核苷酸序列。所述构建体可任选含有其它的核酸片段。
     本发明的核酸构建体可适当地为基因组来源或 cDNA 来源的， 例如通过制备基因 组文库或 cDNA 文库， 并根据标准技术 (cf.J.Sambrook 等， 1989， Molecular Cloning， A Laboratory Manual， 第 2 版， Cold Spring Harbor， New York) 利用合成的寡核苷酸探针通 过杂交筛选编码全部或部分所述肽的 DNA 序列而获得， 并如本领域已知的通过引入相应突 变而获得的。
     本发明的核酸构建体还可由已建立的标准方法通过合成来制备， 例如 Beaucage 和 Caruthers， Tetrahedron Letters 22， 1859-1869(1981) 描 述 的 亚 磷 酰 胺 法 (phosphoamidite method) 或 Matthes 等 .， EMBO Journal3， 801-805(1984) 中描述的方法。 依据所述亚磷酰胺法， 将寡核苷酸合成 ( 例如在自动 DNA 合成仪中 )、 纯化、 退火、 连接并克 隆至合适的载体中。
     此外， 所述核酸构建体可为合成和基因组混合来源的、 合成和 cDNA 混合来源的
     或基因组和 cDNA 混合来源的构建体， 其依照标准技术， 通过连接合成来源、 基因组来源或 cDNA 来源 ( 根据合适的情况 ) 的片段即与完整核酸构建体的各部分对应的片段来制备。
     所 述 核 酸 构 建 体 还 可 利 用 例 如 如 US 4,683,202 或 Saiki 等， Science239， 487-491(1988) 中所述的特异引物， 通过聚合酶链式反应来制备。
     在一个实施方案中， 本发明的核酸构建体为 DNA 构建体， 该术语在以下为了便利 将专门使用。以下的陈述还可在适当的调整下理解为本发明的其它核酸构建体， 这对于本 领域的技术人员来说是清楚的。
     在一个实施方案中， 本发明涉及包含本发明的 DNA 构建体的重组载体。插入了本 发明的 DNA 构建体的重组载体可为适宜地经过重组 DNA 操作的任何载体， 并且载体的选择 将通常取决于其被引入的宿主细胞。 因此， 所述载体可为自主复制型载体， 即作为染色体外 的实体存在的载体， 其复制不依赖染色体的复制， 例如质粒。或者， 所述载体可在引入宿主 细胞时整合进该宿主细胞基因组， 并随其所整合进的染色体一同复制。
     载体可为其中编码本发明肽的 DNA 序列可操作地连接至 DNA 转录所需的另外的片 段的表达载体。 一般而言， 所述表达载体来源于质粒或病毒 DNA， 或可含有以上两者的元件。 术语 “可操作地连接” 表示排列这些片段以使它们的功能与其预期目的一致， 例如转录起始 于启动子并沿编码肽的 DNA 序列前进。 所述启动子可为在所选宿主细胞中显示出转录活性的任何 DNA 序列， 并且可来源 于编码与所述宿主细胞同源或异源的蛋白的基因。
     若有必要， 编码本发明肽的 DNA 序列还可以可操作地与合适的终止子连接， 例 如人生长激素终止子 (Palmiter 等， 在引文中列举 ) 或 ( 对于真菌宿主 )TPI1(Alber 和 Kawasaki， 在引文中列举 ) 或 ADH3(McKnight 等， 在引文中列举 ) 终止子。所述载体还可 包含以下元件， 例如多腺苷酸化信号 ( 例如来自 SV40 或腺病毒 5Elb 区 )、 转录增强子序列 ( 例如 SV40 增强子 ) 和翻译增强子序列 ( 例如编码腺病毒 VA RNA 的序列 )。
     本发明的重组载体还可包含能够使所述载体在所讨论的宿主细胞中复制的 DNA 序列。
     所述载体还可包含选择性标记， 例如其产物弥补宿主细胞的缺陷的基因， 例如编 码二氢叶酸还原酶 (DHFR) 的基因或粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)TPI 基因 ( 如 P.R.Russell， Gene 40， 125-130(1985) 所述 )， 或者赋予药物抗性的基因， 所述药物例 如氨苄青霉素、 卡那霉素、 四环素、 氯霉素、 新霉素、 潮霉素或氨甲蝶呤。 对于丝状真菌， 选择 性标记包括 amdS、 pyrG、 argB、 niaD 和 sC。
     本发明的另一个方面提供用如上文定义的载体转染的细胞。在一个实施方案中， 所述细胞为真核细胞 ( 例如真核生产细胞 )。 在另一个实施方案中， 所述细胞为哺乳动物细 胞， 例如中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞 ( 例如 CHO-K1) 或人胚肾 (HEK) 细胞 ( 例如 HEK293)。
     本发明的另一个方面提供包含如上文定义的多肽的药物制剂。
     所述制剂还可包含缓冲系统、 一种或多种防腐剂、 一种或多种张度剂、 一种或多种 螯合剂、 稳定剂和表面活性剂。在本发明的一个实施方案中， 所述药物制剂为水性制剂， 即 含水的制剂。这样的制剂通常为溶液剂或混悬剂。在本发明的一个实施方案中， 所述药物 制剂为水溶液剂。
     术语 “水性制剂” 定义为包含至少 50％重量 / 重量水的制剂。同样地， 术语 “水溶
     液剂” 定义为包含至少 50％重量 / 重量水的溶液剂， 而术语 “水混悬剂” 定义为包含至少 50％重量 / 重量水的混悬剂。
     在一个实施方案中， 所述药物制剂为冻干剂， 医师或患者在使用前向其加入溶剂 和 / 或稀释剂。
     在一个实施方案中， 所述药物制剂为无需任何预先溶解便可即时使用的干燥制剂 ( 例如冷冻干燥的或喷雾干燥的 )。
     在一个实施方案中， 本发明涉及包含本发明肽的水溶液及缓冲液的药物制剂， 其 中所述肽以 0.1-100mg/m1 的浓度存在， 并且其中所述制剂的 pH 为约 2.0- 约 10.0。
     在本发明的一个实施方案中， 所述制剂的 pH 选自 ： 2.0、 2.1、 2.2、 2.3、 2.4、 2.5、 2.6、 2.7、 2.8、 2.9、 3.0、 3.1、 3.2、 3.3、 3.4、 3.5、 3.6、 3.7、 3.8、 3.9、 4.0、 4.1、 4.2、 4.3、 4.4、 4.5、 4.6、 4.7、 4.8、 4.9、 5.0、 5.1、 5.2、 5.3、 5.4、 5.5、 5.6、 5.7、 5.8、 5.9、 6.0、 6.1、 6.2、 6.3、 6.4、 6.5、 6.6、 6.7、 6.8、 6.9、 7.0、 7.1、 7.2、 7.3、 7.4、 7.5、 7.6、 7.7、 7.8、 7.9、 8.0、 8.1、 8.2、 8.3、 8.4、 8.5、 8.6、 8.7、 8.8、 8.9、 9.0、 9.1、 9.2、 9.3、 9.4、 9.5、 9.6、 9.7、 9.8、 9.9 和 10.0。
     在本发明的一个实施方案中， 所述缓冲剂选自 ： 乙酸钠、 碳酸钠、 柠檬酸盐、 甘氨酰 甘氨酸、 组氨酸、 甘氨酸、 赖氨酸、 精氨酸、 磷酸二氢钠、 磷酸氢二钠、 磷酸钠和三 ( 羟甲基 ) 氨基甲烷、 N- 二 ( 羟乙基 ) 甘氨酸、 曲辛、 苹果酸、 琥珀酸盐、 马来酸、 延胡索酸、 酒石酸、 天 冬氨酸或其混合物。这些特定缓冲液中的每一种构成本发明的备选的实施方案。
     在本发明的一个实施方案中， 所述制剂还包含药学可接受的防腐剂。在本发明的 一个实施方案中， 所述防腐剂选自 ： 苯酚、 邻甲酚、 间甲酚、 对甲酚、 对羟基苯甲酸甲酯、 对 羟基苯甲酸丙酯、 2- 苯氧乙醇、 对羟基苯甲酸丁酯、 2- 苯基乙醇、 苯甲醇、 氯代丁醇和硫柳 汞 (thiomerosal)、 溴硝丙二醇、 苯甲酸、 咪脲、 氯己定 (chlorohexidine)、 脱氢醋酸钠、 氯 甲酚、 对羟基苯甲酸乙酯、 苄索氯铵、 氯苯甘醚 (chlorphenesine)(3 对 - 氯苯氧基丙烷 -1， 2- 二醇 ) 或其混合物。
     在本发明的一个实施方案中， 所述防腐剂以 0.1mg/ml-20mg/ml 的浓度存在。在本 发明的一个实施方案中， 所述防腐剂以 0.1mg/ml-5mg/ml 的浓度存在。在本发明的一个实 施方案中， 所述防腐剂以 5mg/ml-10mg/ml 的浓度存在。在本发明的一个实施方案中， 所述 防腐剂以 10mg/ml-20mg/ml 的浓度存在。这些特定防腐剂中的每一种构成本发明的备选的 实施方案。药物组合物中防腐剂的使用为技术人员所熟知。为了方便， 作出对 Remington ： The Science and Practice ofPharmacy， 第 20 版， 2000 的引用。
     在本发明的一个实施方案中， 所述制剂还包含等渗剂。在本发明的一个实施方案 中， 所述等渗剂选自 ： 盐 ( 例如氯化钠 )、 糖或糖醇、 氨基酸 ( 例如 L- 甘氨酸、 L- 组氨酸、 精氨 酸、 赖氨酸、 异亮氨酸、 天冬氨酸、 色氨酸、 苏氨酸 )、 糖醇 ( 例如丙三醇 ( 甘油 )、 1， 2- 丙二醇 ( 丙二醇 )、 1， 3- 丙二醇、 1， 3- 丁二醇 )、 聚乙二醇 ( 例如 PEG400) 或其混合物。可使用任何 糖， 例如单糖、 二糖或多糖， 或水溶性葡聚糖， 包括例如果糖、 葡萄糖、 甘露糖、 山梨糖、 木糖、 麦芽糖、 乳糖、 蔗糖、 海藻糖、 葡聚糖、 茁霉多糖、 糊精、 环糊精、 可溶性淀粉、 羟乙基淀粉和羧 甲基纤维素 -Na。在一个实施方案中， 糖添加剂为蔗糖。糖醇定义为具有至少一个 -OH 基的 C4-C8 烃， 并包括例如甘露醇、 山梨糖醇、 肌醇、 半乳糖醇、 卫矛醇、 木糖醇和阿拉伯糖醇。在 一个实施方案中， 所述糖醇添加物为甘露醇。上述糖或糖醇可单独或联合使用。所用量没 有固定的限制， 只要所述糖或糖醇可溶于液体制剂中并且没有不利地影响利用本发明的方法达到的稳定作用即可。在一个实施方案中， 所述糖或糖醇的溶度为约 1mg/ml- 约 150mg/ ml。在本发明的一个实施方案中， 所述等渗剂以 1mg/ml-50mg/ml 的浓度存在。在本发明的 一个实施方案中， 所述等渗剂以 1mg/ml-7mg/ml 的浓度存在。本发明的一个实施方案中， 所 述等渗剂以 8mg/ml-24mg/ml 的浓度存在。本发明的一个实施方案中， 所述等渗剂以 25mg/ ml-50mg/ml 的浓度存在。这些特定等渗剂中的每一种构成本发明的备选的实施方案。药 物组合物中等渗剂的使用为技术人员所熟知。为了方便， 作出对 Remington ： The Science and Practice of Pharmacy， 第 20 版， 2000 的引用。
     在本发明的一个实施方案中， 所述制剂还包含螯合剂。在本发明的一个实施方案 中， 所述螯合剂选自 ： 乙二胺四乙酸 (EDTA) 盐、 柠檬酸盐、 天冬氨酸盐或其混合物。在本发 明的一个实施方案中， 所述螯合剂以 0.1mg/ml-5mg/ml 的浓度存在。在本发明的一个实施 方案中， 所述螯合剂以 0.1mg/ml-2mg/ml 的浓度存在。在本发明的一个实施方案中， 所述螯 合剂以 2mg/ml-5mg/ml 的浓度存在。这些特定螯合剂中的每一种构成本发明的备选的实施 方案。药物组合物中螯合剂的使用为技术人员所熟知。为了方便， 作出对 Remington ： The Science andPractice of Pharmacy， 第 20 版， 2000 的引用。
     在本发明的一个实施方案中， 所述制剂还包含稳定剂。药物组合物中稳定剂的 使用为技术人员所熟知。为了方便， 作出对 Remington ： The Science and Practice of Pharmacy， 第 20 版， 2000 的引用。
     更具体地， 本发明的组合物为稳定的液态药物组合物， 其治疗活性组分包括在以 液态药物制剂储存期间可能表现出聚集体形成的多肽。 “聚集体形成” 意指多肽分子之间 的物理相互作用， 其导致寡聚体的形成， 该寡聚体可保持可溶的或从溶液中沉淀出来的可 见大聚集体。 “储存期间” 意指液体药物组合物或制剂制得后并不立即给予受试者。而 是在制备后， 以液态形式、 以冷冻状态或以干燥形式包装用于储存， 用于以后的重构成适 于给予受试者的液态形式或其它形式。 “干燥形式” 意指通过冷冻干燥 ( 即冻干 ； 参见例 如 Williams 和 Polli(1984)J.Parenteral Sci.Technol.38 ： 48-59)、 喷雾干燥(参见 Spray-DryingHandbook 中的 Masters(1991)( 第 5 版 ； Longman Scientific 和 Technical， Essez， U.K.)， 第 491-676 页 ； Broadhead 等 (1992)Drug Devel.Ind.Pharm.18 ： 1169-1206 和 Mumenthaler 等 (1994)Pharm.Res.11 ： 12-20) 或 风 干 (Carpenter 和 Crowe(1988) Cryobiology 25 ： 459-470 ； 和 Roser(1991)Biopharm.4 ： 47-53) 来干燥液体药物组合物或 制剂。 由多肽在液体药物组合物的储存期间形成的聚集体可对该多肽的生物活性产生不利 影响， 导致所述药物组合物疗效损失。此外， 聚集体形成可引起其它问题， 例如当使用输注 系统给予含多肽的药物组合物时管道、 膜或泵的阻塞。
     本发明的药物组合物还可包含足以减少在所述组合物储存期间多肽聚集体形成 的量的氨基酸碱。 “氨基酸碱” 意指氨基酸或氨基酸的组合， 其中任何给定的氨基酸以其游 离碱的形式或以其盐的形式存在。当使用氨基酸的组合时， 所有氨基酸可以其游离碱的形 式存在、 所有可以其盐的形式存在、 或者一些可以其游离碱的形式存在而其它可以其盐的 形式存在。在一个实施方案中， 用于制备本发明的组合物的氨基酸为携带荷电侧链的氨基 酸， 例如精氨酸、 赖氨酸、 天冬氨酸和谷氨酸。特定的氨基酸 ( 例如甘氨酸、 甲硫氨酸、 组氨 酸、 咪唑 (imidazole)、 精氨酸、 赖氨酸、 异亮氨酸、 天冬氨酸、 色氨酸、 苏氨酸及其混合物 ) 的任何立体异构体 ( 即 L、 D 或其混合物 ) 或这些立体异构体的组合可存在于本发明的药物组合物中， 只要所述特定氨基酸以其游离碱形式或其盐的形式存在即可。在一个实施方案 中， 使用 L- 立体异构体。本发明的组合物还可用这些氨基酸的类似物配制。 “氨基酸类似 物” 意指天然存在的氨基酸的衍生物， 其引起减少在本发明的液体药物组合物储存期间多 肽聚集体形成的所需作用。 合适的精氨酸类似物包括例如氨基胍、 鸟氨酸和 N- 单乙基 L- 精 氨酸， 合适的甲硫氨酸类似物包括乙硫氨酸和丁硫氨酸 (buthionine)， 合适的半胱氨酸类 似物包括 S- 甲基 -L 半胱氨酸。如同其它的氨基酸一样， 所述氨基酸类似物以其游离碱形 式或其盐的形式掺入至组合物中。在本发明的一个实施方案中， 所述氨基酸或氨基酸类似 物以足以防止或延迟蛋白聚集的浓度使用。
     在本发明的一个实施方案中， 当充当治疗药物的多肽为包含至少一个容易氧化成 甲硫氨酸亚砜的甲硫氨酸残基时， 可加入甲硫氨酸 ( 或其它的含硫氨基酸或氨基酸类似 物 ) 以抑制这种氧化。 “抑制” 意指甲硫氨酸的氧化形式随时间的最小累积。抑制甲硫氨酸 的氧化导致多肽更大程度地以其合适的分子形式保留。 可使用甲硫氨酸的任何立体异构体 (L、 D 或其混合物 ) 或其组合。加入量应为足以抑制甲硫氨酸残基氧化的量， 使得甲硫氨酸 亚砜的量可为管理机构所接受。典型地， 这意味着所述组合物含有不超过约 10％ - 约 30％ 的甲硫氨酸亚砜。 一般而言， 这可通过加入甲硫氨酸， 使得所加甲硫氨酸与甲硫氨酸残基的 比在约 1 ∶ 1- 约 1000 ∶ 1 的范围， 例如 10 ∶ 1- 约 100 ∶ 1 的范围来实现。 在本发明的一个实施方案中， 所述制剂还包含选自高分子量聚合物或低分子化合 物的稳定剂。 在本发明的一个实施方案中， 所述稳定剂选自 ： 聚乙二醇 ( 例如 PEG 3350)、 聚 乙烯醇 (PVA)、 聚乙烯吡咯烷酮、 羧基纤维素 / 羟基纤维素或其衍生物 ( 例如 HPC、 HPC-SL、 HPC-L 和 HPMC)、 环糊精、 含硫物质如单硫代甘油、 巯基乙酸和 2- 甲硫基乙醇以及不同的盐 ( 例如氯化钠 )。这些特定稳定剂中的每一种构成本发明的备选的实施方案。
     所述药物组合物还可包含另外的稳定剂， 其进一步提高其中的治疗性活性多肽的 稳定性。本发明特别感兴趣的稳定剂包括但不限于甲硫氨酸和 EDTA， 其使多肽免受甲硫氨 酸的氧化， 以及非离子型表面活性剂， 其使多肽免受冻融或机械剪切相关的聚集作用。
     在本发明的一个实施方案中， 所述制剂还包含表面活性剂。在本发明的一个实施 方案中， 所述表面活性剂选自洗涤剂、 乙氧基化蓖麻油、 聚乙二醇化 (polyglycolyzed) 甘 油酯、 乙酰化甘油一酯、 山梨糖醇酐脂肪酸酯、 聚氧丙烯 - 聚氧乙烯嵌段共聚物 ( 例如泊
     洛沙姆例如F68、 泊洛沙姆 188 和 407、 Triton X-100)、 聚氧乙烯化山梨糖醇酐脂肪酸酯、 聚氧乙烯和聚乙烯衍生物例如烷基化和烷氧基化衍生物 ( 吐温例如 Tween-20、 Tween-40、 Tween-80 和 Brij-35)、 甘油一酯或其乙氧基化衍生物、 甘油二酯或其聚氧乙 烯衍生物、 醇类、 甘油、 凝集素类和磷脂类 ( 例如磷脂酰丝氨酸、 磷脂酰胆碱、 磷脂酰乙醇 胺、 磷脂酰肌醇、 双磷脂酰甘油和鞘磷脂 )、 磷脂衍生物 ( 例如二棕榈酰磷脂酸 ) 和溶血磷 脂衍生物 ( 例如棕榈酰溶血磷脂酰 -L- 丝氨酸和乙醇胺、 胆碱、 丝氨酸或苏氨酸的 1- 酰 基 -sn- 甘油 -3- 磷酸酯 ) 及溶血磷脂酰胆碱和磷脂酰胆碱的烷基、 烷氧基 ( 烷基酯 )、 烷 氧基 ( 烷基醚 ) 衍生物， 例如溶血磷脂胆碱的月桂酰和肉豆蔻酰衍生物、 二棕榈酰磷脂酰胆 碱以及极性头基团 ( 即胆碱类、 乙醇胺类、 磷脂酸、 丝氨酸类、 苏氨酸类、 甘油、 肌醇 ) 的修饰 物， 和带正电的 DODAC、 DOTMA、 DCP、 BISHOP、 溶血磷脂酰丝氨酸和溶血磷脂酰苏氨酸以及甘 油磷酸脂类 ( 例如脑磷脂 )、 甘油糖脂类 ( 例如吡喃型半乳糖苷 (galactopyransoide))、 鞘糖脂类 ( 例如神经酰胺、 神经节苷脂 )、 十二烷基磷酸胆碱、 鸡蛋溶血卵磷脂、 梭链孢酸衍生物 ( 例如牛磺二氢梭链孢酸钠等 )、 长链脂肪链及其 C6-C12 盐 ( 例如油酸和辛酸 )、 酰 α 基肉毒碱类及衍生物， 赖氨酸、 精氨酸或组氨酸的 N - 酰化衍生物、 或者赖氨酸或精氨酸的 侧链酰化衍生物、 包括赖氨酸、 精氨酸或组氨酸与中性或酸性氨基酸的任何组合的二肽的 α N - 酰化衍生物、 包括一个中性氨基酸与两个带电氨基酸的任何组合的三肽的 Nα- 酰化衍 生物、 DSS( 多库酯钠， CAS 登记号 [577-11-7])、 多库酯钙， CAS 登记号 [128-49-4])、 多库酯 钾， CAS 登记号 [7491-09-0])、 SDS( 十二烷基硫酸钠或月桂基硫酸钠 )、 辛酸钠、 胆酸或其衍 生物、 胆汁酸及其盐、 甘氨酸或牛磺酸缀合物、 熊脱氧胆酸、 胆酸钠、 脱氧胆酸钠、 牛磺胆酸 钠、 甘氨胆酸钠、 N- 十六烷基 -N， N- 二甲基 -3- 铵基 -1- 丙磺酸盐、 阴离子 ( 烷基 - 芳基 - 磺 酸盐类 ) 一价表面活性剂、 两性离子表面活性剂 ( 例如 N- 烷基 -N， N- 二甲基铵基 -1- 丙磺 酸盐、 3- 氯酰氨基 -1- 丙基二甲基铵基 -1- 丙磺酸盐、 阳离子表面活性剂 ( 季铵碱 )( 例如 溴化十六烷基三甲铵、 氯化十六烷基吡啶 )、 非离子表面活性剂 ( 例如十二烷基 β-D- 吡 喃葡萄糖苷 )、 poloxamine( 例如 Tetronic’ s)， 其为衍生自依次将环氧丙烷和环氧乙烷加 成至乙二胺的四官能嵌段共聚物， 或者所述表面活性剂可选自咪唑啉衍生物或其混合物。 这些特定表面活性剂中的每一种构成本发明的备选的实施方案。
     药 物 组 合 物 中 表 面 活 性 剂 的 使 用 为 技 术 人 员 所 熟 知。 为 了 方 便， 作出对 Remington ： The Science and Practice of Pharmacy， 第 20 版， 2000 的引用。
     可能的是本发明的肽药物制剂中可存在其它成分。所述另外的成分可包括 ： 湿润 剂、 乳化剂、 抗氧化剂、 填充剂、 张度改性剂、 螯合剂、 金属离子、 油脂载体、 蛋白 ( 例如人血 清白蛋白、 明胶或蛋白类 ) 和两性离子 ( 例如氨基酸， 例如甜菜碱、 牛磺酸、 精氨酸、 甘氨酸、 赖氨酸和组氨酸 )。所述另外的成分无疑不应对本发明药物制剂的整体稳定性造成不利影 响。
     含有本发明的肽的药物组合物可在数个部位给予到需要这样的治疗的患者， 例如 在局部部位， 例如皮肤和粘膜部位 ； 在旁路吸收部位， 例如给予到动脉中、 静脉中、 心脏中 ； 和在涉及吸收的位点， 例如给予到皮内、 皮下、 肌内或腹内。
     本发明的药物组合物的给予可通过几种给药途径给予需要这种治疗的患者， 所述 给药途径为例如舌部给药、 舌下给药、 含服给药、 口腔内给药、 口服给药、 胃肠内给药、 鼻部 给药、 肺部给药例如通过细支气管和肺泡或其组合、 表皮给药、 皮肤给药、 透皮给药、 阴道给 药、 直肠给药、 眼部给药如通过结膜、 输尿管给药和肠胃外给药。
     本发明的组合物可以以若干剂型给予， 例如作为溶液剂、 混悬剂、 乳剂、 微乳剂、 复 合型乳剂、 泡沫剂、 药膏、 糊剂、 硬膏、 软膏、 片剂、 包衣片剂、 冲洗剂、 胶囊如硬胶囊和软胶 囊、 栓剂、 直肠用胶囊、 滴剂、 凝胶剂、 喷雾剂、 散剂、 气雾剂、 吸入剂、 滴眼剂、 眼用软膏、 眼用 冲洗剂、 阴道栓剂、 阴道环、 阴道软膏、 注射液、 原位转化溶液剂如原位胶凝剂、 原位沉降剂、 原位沉淀剂、 原位结晶剂、 输液剂和埋植剂。
     本发明的组合物可进一步例如通过共价、 疏水和静电相互作用复合或连接至药物 载体、 药物递送系统和改良药物递送系统， 以便进一步增强本发明肽的稳定性 ； 提高生物利 用度 ； 增大溶解度 ； 减少不良作用 ； 实现本领域技术人员所熟知的择时治疗和提高患者顺 应性或其任何组合。载体、 药物递送系统和改良药物递送系统的实例包括但不限于 ： 聚合 物， 例如纤维素及衍生物、 多糖例如葡聚糖及衍生物、 淀粉及衍生物、 聚 ( 乙烯醇 )、 丙烯酸 酯聚合物和甲基丙烯酸酯聚合物、 聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物、 聚乙二醇、 载体蛋白例如白蛋白、 凝胶例如热胶凝体系， 例如本领域技术人员熟知的嵌段共聚物体系、 胶束、 脂 质体、 微球、 纳米颗粒、 液晶及其分散体、 脂质 - 水体系中相特性领域的技术人员熟知的 L2 相及其分散体、 聚合胶束、 复合型乳剂、 自乳化、 自微乳化、 环糊精及其衍生物， 以及树枝状 大分子 (dendrimer)。
     本发明的组合物可用于配制用于肺部给予本发明肽的固体制剂、 半固体制剂、 散 剂和溶液剂， 肺病给予使用例如定量吸入器、 干粉吸入器和喷雾器， 所有这些装置都为本领 域技术人员所熟知。
     本发明的组合物尤其可用于配制控释、 持续释放、 延释、 阻释和缓释的药物递送系 统。更具体地但不限于， 组合物可用于配制本领域技术人员所熟知的肠胃外控释系统和缓 释系统 ( 两种系统均导致给药次数减少许多倍 )。 更优选的是， 控释系统和缓释系统经皮下 给予。 在不限制本发明范围下， 有用的控释系统和组合物的实例为水凝胶、 油凝胶、 液晶、 聚 合胶束、 微球和纳米粒。
     制备可用于本发明组合物的控释系统的方法包括但不限于 ： 结 晶、 冷 凝、 共 结晶、 沉淀、 共沉淀、 乳化、 分散、 高压匀浆化、 包囊化、 喷雾干燥、 微胶囊化、 凝聚、 相分 离、 溶剂蒸发以制备微球、 挤压和超临界流体法。对以下文献作出整体参考 ： Handbook ofPharmaceutical Controlled Release(Wise， D.L. 编 辑 Marcel Dekker， NewYork， 2000) 和 Drug and the Pharmaceutical Sciences 第 99 卷 ： ProteinFormulation and Delivery(MacNally， E.J.， ed.Marcel Dekker， New York， 2000)。
     肠胃外给药可通过注射器、 任选笔型 (pen-like) 注射器经皮下注射、 肌内注射、 腹膜内注射或静脉注射来进行。 或者， 肠胃外给药可以依靠输液泵进行。 另一个选择为以下 组合物 ： 其可为以鼻用喷雾或肺部喷雾形式给予本发明肽的溶液剂或混悬剂。作为又一个 选择， 含有本发明肽的药物组合物还可以适合于透皮给药， 例如通过无针注射或贴剂 ( 任 选离子电渗贴剂 ) 来进行 ； 或跨粘膜给药例如含服给药。
     本发明现将根据以下的非限制性实施例来描述。 实施例 实施例 1
     编码具有一个在野生型人因子 IX 中不存在的 N- 糖基化位点的高糖基化人凝血因 子 IX 的表达构建体的制备
     编码高糖基化人凝血因子 IX 的构建体通过由具有编码野生型人凝血因子 IX 的插 入物的 pTT5 组成的 pTS87 的位点定向诱变制备。 因此， pTS87 编码在氨基酸残基 157 和 167 具有 N- 糖基化位点的人凝血因子 IX。pTS87 用 QuikChange Site-Directed Mutagenesis 试剂盒 (Stratagene)， 如生产商所推荐利用表 1 所示的正向引物对和反向引物对来进行突 变。 将通过诱变操作得到的质粒转入感受态大肠杆菌中， 并将来自所选克隆的质粒通过 DNA 测序筛选突变。按照该方式建立了表 2 所述的构建体 pGB071、 pGB072、 pGB073、 pGB074 和 pGB075， 其各自编码具有一个在野生型人凝血因子 IX 中不存在的 N- 糖基化位点的人凝血 因子 IX。
     表1
     诱变引物 ( 变换的核苷酸加下划线 )
     以及由该突变引起的氨基酸变换表2
     相对于野生型人凝血因子 IX 的氨基酸变换以及由构建体编码的野生型人凝血因 子 IX 或高糖基化人凝血因子 IX 中可能的 N- 糖基化位点
     构建体 pTS87 pGB071 pGB072 pGB073 pGB073 pGB075
     氨基酸变换 T172N K228N I251T A262T T343N-Y345T 157 + + + + + + 167 + + + + + + 172 + 228 + 249 + 260 + 343 +实施例 2
     在哺乳动物 HEK293 细胞中瞬时表达具有一个在野生型人因子 IX 中不存在的 N- 糖基化位点的高糖基化人凝血因子 IX
     将适应悬浮液的人胚肾 (HEK293F) 细胞 (Freestyle， Invitrogen) 根据生产商的说明书， 用编码野生型人凝血因子 IX 的 pTS87 表达质粒或编码高糖基化人凝血因子 IX 的 pGB071、 pGB072、 pGB073、 pGB074 和 pGB075 构建体转染。简言之， 将 30μg 的各种质粒与 7 40μl 293fectin(Invitrogen) 保温 20 分钟， 随后加至含 3×10 个细胞的补充有维生素 K 的无血清 Freestyle 293 Expression Medium 的 125ml Erlenmeyer 锥形瓶中。将转染细 胞在振荡培养箱 (37℃， 8％ CO2 和 125rpm) 中孵育。转染四天后， 将细胞沉淀并收获无血清 的培养基。将细胞重悬于补充有胎牛血清和维生素 K 的 ulbecco 氏 MEM(Invitrogen) 中， 并在振荡培养箱中孵育。次日， 将细胞沉淀， 并收获含血清的培养基。
     将收获的无血清培养基的样品在 37℃下与或不与肽 ： N- 糖苷酶 F(PNGase F) 温育 1 小时， 随后加载至 SDS-PAGE 凝胶上并电泳。电泳后， 将凝胶上的蛋白通过电印迹转移至 PVDF 膜上。膜上的凝血因子 IX 通过将膜与兔抗 -FIX 抗体和 IRDye 680 缀合的羊抗 - 兔 IgI(LI-COR) 依次温育可视化。用 Odyssey 扫描仪 (LI-COR) 于 680nm 下进行读出。膜的 读出示于图 1( 与 PNGase F 温育的样品 ) 和图 2( 与 PNGaseF 温育的样品 ) 中。由转染了 pGB071、 pGB072、 pGB073、 pGB074 或 pGB075 的细胞分泌的凝血因子 IX 变体的电泳迁移率， 相对于转染了 pTS87 的细胞分泌的野生型凝血因子 IX 的迁移减少 ( 图 1)。PNGase F 去除 了 N- 连接的聚糖， 经 PNGase F 处理后突变型和野生型凝血因子 IX 蛋白的迁移率相等 ( 图 2)， 表明了野生型和变体 FIX 蛋白在 PNGaseF 处理前不同的电泳迁移率与 N- 聚糖有关。因 此， 高糖基化人凝血因子 IX 确实由转染了 pGB071、 pGB072、 pGB073、 pGB074 或 pGB075 的细 胞产生。这表明了分别在 5 种 FIX 变体中的第 172、 228、 249、 260 和 343 位氨基酸处引入的 N- 糖基化位点的应用。
     通 过 在 ACL 9000 血 凝 监 测 仪 (clotting instrument) (InstrumentationLaboratory) 中使用来自同一生产商的试剂进行活化部分促凝血酶原激 酶时间 (APTT) 测定， 分析收获的含血清培养基样品的凝血因子 IX 的活性。还通过酶联免 疫吸附测定分析同一培养基的凝血因子 IX 抗原含量， 随后培养基中的凝血因子 IX 蛋白的 比活通过结合表 3 所示的 ELISA 和凝血测定数据计算。与野生型人凝血因子 IX 的比活相 比， 在第 172、 228、 249 或 260 位具有额外的 N- 糖基化位点的凝血因子 IX 变体的比活相等 或适度下降。因此， 在这些位置的 N- 聚糖并不特别不利于人凝血因子 IX 的凝血活性。相 反， FIX-T343N-Y354T 变体的比活相对于野生型人凝血因子 IX 的比活显著减少。
     表3
     瞬时转染的 HEK293 细胞的培养基中的野生型和高糖基化人凝血因子 IX 的表征
     实施例 3
     编码具有多个在野生型人因子 IX 中不存在的 N- 糖基化位点的高糖基化人凝血因 子 IX 的表达构建体的制备
     编码高糖基化人凝血因子 IX 的构建体通过由具有编码野生型人凝血子 IX 的插入 物的 pTT5 组成的 pTS87 的位点定向诱变来制备。 因此， pTS87 编码在氨基酸残基 157 和 167 具有 N- 糖基化位点的人凝血因子 IX。用 QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis 试剂盒 (Stratagene)， 如生产商所推荐利用表 4 所示的引物突变 pTS87。将通过诱变操作 制备的质粒转入感受态大肠杆菌中， 随后来自所选克隆的质粒通过 DNA 测序筛选突变。按 照该方式建立表 5 所述的构建体 pGB019、 pGB020、 pGB021 和 pGB022， 其各自编码具有至少 两个在野生型人凝血因子 IX 中不存在的 N- 糖基化位点的人凝血因子 IX。
     通过插入到 pMPSVHE 的 Eco RI 位点中亚克隆 pGB022 中编码核苷酸序列的高糖基 化人凝血因子 IX， 以得到质粒 pGB024。
     表4
     诱变引物 ( 变换的核苷酸加下划线 )
     以及由突变引起的氨基酸变换
     表5
     相对于野生型人凝血因子 IX 的氨基酸变换以及由构建体编码的野生型或高糖基 化的人凝血因子 IX 中可能的 N- 糖基化位点
     构建体 pTS87 pGB019 pGB020 pGB021 氨基酸变换 T172N+K228N T172N+A262T T172N+K228N+A262T 157 + + + + 167 + + + + 172 + + + 228 + + 249 260 + +20102105582 A CN 102105585 pGB022 pGB024
     说T172N+K228N+I251T+A262T T172N+K228N+I251T+A262T明书+ + + + + + + + + +17/23 页 + +实施例 4
     在哺乳动物 HEK293 细胞中瞬时表达具有多个在野生型人因子 IX 中不存在的 N- 糖基化位点的高糖基化人凝血因子 IX
     将适应于悬浮液的人胚肾 (HEK293F) 细胞 (Freestyle， Invitrogen)， 根据生产 商的说明书用编码野生型人凝血因子 IX 的 pTS87 表达质粒或编码高糖基化人凝血因子的 pGB022 构建体转染。简言之， 将 30μg 的各质粒与 40μl 293fectin(Invitrogen) 保温 20 7 分钟， 随后加至含 3×10 个细胞的补充有维生素 K 的 Freestyle 293 Expression Medium 的 125ml Erlenmeyer 锥形瓶中。将转染的细胞在振荡培养箱 (37℃， 8％ CO2 以及 125rpm) 中孵育。将转染四天后收获的培养基在 37℃下与或不与肽 ： N- 糖苷酶 F(PNGase F) 保温 1 小时， 随后加载至 SDS-PAGE 凝胶上并电泳。电泳后， 将凝胶中的蛋白通过电印迹转移至 PVDF 膜上。通过将膜与兔抗 -FIX 抗体和 HRP 缀合的猪抗 - 兔 IgG 抗体 (DAKO) 依次保温， 接着通过与 ECL Western Blotting Detection Reagent(Amersham Biosciences) 保温使 膜上的凝血因子 IX 可视化。用 Las-1000Luminescent 图像分析仪 (Fujifilm) 进行读出， 示于图 3 中。由转染了 pGB022 的细胞分泌的凝血因子 IX 的电泳迁移率， 相对于由转染了 pTS87 的细胞分泌的野生型凝血因子 IX 减少。PNGase F 去除了 N- 连接的聚糖， 突变型和 野生型凝血因子 IX 蛋白经 PNGase F 处理后的迁移率， 表明两种蛋白在 PNGase F 处理前不 同的电泳迁移率与 N- 聚糖有关。因此， 高糖基化人凝血因子 IX 确实由转染了 pGB022 的细 胞产生。
     实施例 5
     瞬时表达于哺乳动物 HEK293 细胞中具有多个在野生型人因子 IX 中不存在的 N- 糖基化位点的高糖基化人凝血因子 IX 凝血活性的测定
     将适应于悬浮液的人胚肾 (HEK293F) 细胞 (Freestyle， Invitrogen)， 根据生产 商的说明书用编码野生型人凝血因子 IX 的 pTS87 表达质粒或编码高糖基化人凝血因子 IX 的 pGB022 构建体转染。简言之， 将 30μg 的各质粒与 40μl 293fectin(Invitrogen) 保 7 温 20 分钟， 随后加入含 3×10 个细胞的补充有维生素 K 的 Freestyle 293 Expression Medium(Invitrogen) 的 125ml Erlenmeyer 锥形瓶中。将转染的细胞在振荡培养箱 (37℃， 8 ％ CO2 和 125rpm) 中孵育。转染两天后， 用补充有胎牛血清和维生素 K 的杜尔贝科氏 (Dulbecco’ s)MEM(Invitrogen) 替换培养基。将培养物在振荡培养箱中孵育两天以上， 随 后收获培养基。通过在 ACL 9000 血凝监测仪 (Instrumentation Laboratory) 中使用来自 同一生产商的试剂进行活化部分促凝血酶原激酶时间 (APTT) 测定， 分析该培养基的凝血 因子 IX 活性。还通过酶联免疫吸附测定分析培养基的凝血因子 IX 抗原含量， 培养基中凝 血因子 IX 蛋白的比活通过结合表 6 所示的 ELISA 和凝血测定数据来计算。由 pGB022 编 码、 在第 172、 228、 249 或 260 位具有额外的 N- 糖基化位点的高糖基化凝血因子 IX 变体的 比活， 与野生型人凝血因子 IX 的比活相比适度下降。因此， 在所选氨基酸位置上存在多至 4 个额外的 N- 聚糖并不特别不利于人凝血因子 IX 的凝血活性。表6
     分别瞬时转染了 pTS87 和 pGB022 细胞的培养基中的野生型和高糖基化的人凝血 因子 IX 的表征
     实施例 6
     表达高糖基化人凝血因子 IX 的稳定哺乳动物细胞系的产生
     利用 FuGENE 6 Transfection Reagent(Roche)， 用含新霉素抗性基因的 pSV2-neo 和 编 码 高 糖 基 化 FIX-T172N-K228N-I251T-A262T 变 体 的 pGB024 共 同 转 染 中 国 仓 鼠 卵 巢 (CHO-K1) 细胞。将转染的细胞用 600μg/ml G418 选择并通过有限稀释克隆。通过 用 ELISA 检测细胞培养物上清液的凝血因子 IX 抗原来筛选抗性克隆， 并扩繁至 12 株产 凝血因子 IX 的细胞系。将来自含该 12 株克隆的组织培养锥形瓶的培养基用 ELISA 分析 凝 血 因 子 IX 抗 原， 并 通 过 在 ACL 9000 血 凝 监 测 仪 (Instrumentation Laboratory) 中 使用来自同一生产商的试剂进行活化部分促凝血酶原激酶时间 (APTT) 测定， 来分析凝血 因子 IX 活性。培养基中凝血因子 IX 蛋白的比活， 通过结合表 7 所示的 ELISA 和凝血测
     定数据来计算。将第 15 号克隆接种于滚瓶中， 并从滚瓶内收获的培养基中纯化高糖基化 FIX-T172N-K228N-I251T-A262T 变体。
     表7
     来自转染了 pGB024 的 CHO-K1 细胞系的培养基中的高糖基化人凝血因子 IX 的表 征
     实施例 7 高糖基化人凝血因子 IX 药代动力学性质与野生型人凝血因子 IX 药代动力学性质的比较
     将高糖基化人凝血因子 IX(FIX-T172N-K228N-I251T-A262T) 和野生型人凝血因 Wyeth) 在 10mM 组氨酸， 0.26M 甘氨酸， 1％蔗糖， 0.005 Tween80， pH 6.8子 IX(中稀释至浓度为 0.2mg/ml(FIX-T172N-K228N-I251T-A262T) 或 0.4mg/ml( 野生型凝血因子 IX)。将每种化合物按 1.0mg/kg(FIX-T172N-K228N-I251T-A262T) 或 1.5mg/kg( 野生型凝 血因子 IX) 的剂量经由尾静脉给予 15 只凝血因子 IX 敲除小鼠。在给药后不同的时间点， 将 3 只小鼠麻醉并从眼窝网状组织抽取血样。从各小鼠抽取三次血样， 在第三次抽取血样 后， 通过颈脱位法处死小鼠。将血样用柠檬酸钠稳定并在 50mM HEPES、 150nMNaCl、 0.5％牛 血清白蛋白、 pH 7.4 中稀释 5 倍。将稳定并稀释后的血液离心以沉淀血细胞。所得血浆样 品通过 ELISA， 利用化合物特异性标准曲线分析 FIX 抗原。 平均 FIX 抗原浓度与时间的关系 与野生型凝血因子 IX 曲线示于图 4 中。估计的药代动力学参数列于表 8 中。该数据表明， 相比高糖基化 FIX-T172N-K228N-I251T-A262T 变体的体内半寿期延长而清除率下降。
     表8
     ELISA 测定的凝血因子 IX 敲除小鼠中的药代动力学参数
     本文所引用的所有参考文献 ( 包括出版物、 专利申请和专利 ) 都通过引用以其整 体结合于本文中， 并且在某种程度上如同各参考文献被独立且具体地指出通过引用结合， 并且在本文中以其整体阐述 ( 在法律所允许的最大程度上 )， 与任何单独提供的在本文其 它地方对特定文献所作的结合无关。
     除非本文另外说明或与上下文明显矛盾， 否则在描述本发明的上下文中对不定冠 词和术语 “所述” 以及类似的指示物的使用应理解为涵盖了单数和复数。例如， 除非另外说 明， 短语 “所述化合物” 应理解为指本发明或特定描述方面的不同 “多种化合物” 。
     除非另外说明， 否则本文提供的所有准确值代表了相应的近似值 ( 例如关于特定 要素或测量值所提供的所有确切的例示值可理解为还提供了相应的近似测量值， 适当时通 过 “约” 来修饰 )。
     除非另外说明或与上下文明显矛盾， 使用关于一个或多个要素的术语 ( 例如 “包 含” 、 “具有” 、 “包括” 或 “含有” ) 的本发明任何方面的本文描述， 旨在为 “由” 或 “基本上由” 具体一个或多个要素 “组成” 或者 “基本包含” 所述要素的本发明类似方面或方面提供支持 ( 例如除非另外说明或与上下文明显矛盾， 否则在本文描述为包含特定要素的组合物应理 解为还描述了由该要素组成的组合物 )。
     本发明的优选特征 ：
     1. 一种具有一个或多个突变的人因子 IX 多肽类似物， 其中所述突变导致所述多 肽中引入一个或多个糖基化位点。
     2. 条款 1 限定的多肽， 其中所述糖基化包括 N- 糖基化。
     3. 条款 1 限定的多肽， 其中所述一个或多个突变导致因子 IX 多肽类似物与野生型 多肽相比分子量增加了。
     4. 条款 1 限定的多肽， 其中所述一个或多个突变导致因子 IX 多肽类似物与野生型 多肽相比等电点更偏酸性。
     5. 条款 1 限定的多肽， 其中与野生型多肽相比， 所述一个或多个突变导致所述因 子 IX 多肽类似物的蛋白水解活性和 / 或凝血活性发生不超过 0、 1、 2、 5、 10、 20、 50 或 100 倍 的减少。
     6. 条款 5 限定的多肽， 其中与野生型多肽相比， 所述一个或多个突变导致所述因 子 IX 多肽类似物的蛋白水解活性和 / 或凝血活性不超过 0 倍的减少。
     7. 条款 1 或条款 2 限定的多肽， 其中所述一个或多个突变包括一个或多个 N-X-S/ T 基序的掺入。
     8. 条款 7 限定的多肽， 其中所述一个或多个 N-X-S/T 基序建立在其中预期作为 “N” 残基的所述残基具有超过 25％的相对侧链表面可接近性的位置。
     9. 条款 8 限定的多肽， 其中所述一个或多个突变选自以下中的一个或多个 ：
     Y1N、 S3N+K5S/T、 G4N+L6S/T、 F9N+Q11S/T、 V10N+G12S/T、 G12N+L14S/T、 R16N+C18S/ T、 K22N、 R29N+V31S/T、 T35N+R37S/T、 R37N、 T39N+F41S/T、 F41N+K43S/T、 W42N+Q44S/ T、 Q44N+V46S/T、 V46N+G48S/T、 D47N+D49S/T、 G48N+Q50S/T、 D49N+C51S/T、 Q50N+E52S/ T、 E52N+N54T、 S53N+P55S/T、 C56S/T、 L57N+G59S/T、 G60S/T、 S61N+K63S/T、 K63N+D65S/ T、 D65N+N67S/T 、 I66N+S68S/T 、 Y69S/T 、 Y69N+C71S/T 、 S68N+E70S/T 、 E70N+W72S/T 、 W72N+P74S/T、 P74N+G76S/T 、 F77N+G79S/T、 G79N+N81S/T、 K80N+C82S/T、 E83S/T、 E83N+D85S/ T、 L84N+V86S/T、 D85N、 V86N+C88S/T、 T87N+N89S/T、 I90N+N92S/T、 K91S/T、 I90N+N92S/ T、 K91N+G93S/T、 R94S/T、 R94N+E96S/T、 K100N、 A103S/T、 S102N+D104S/T、 A103N+N105S/ T、 D104N+K106S/T、 V107S/T、 K106N+V108S/T、 V108N+V110S/T、 S110N、 E113N+Y115S/T、 G114N+R116S/T、 R116N+A118S/T、 E119N+Q121S/T、 K122S/T、 Q121N+S123S/T、 K122N+C124S/ T S123N+E125S/T 、 E125N+A125S/T 、 P126N+V128S/T 、 V128N+F130S/T 、 P129N+P131S/ T、 F130N+C132S/T 、 R134N 、 V135N+V137S/T 、 S136N 、 S138N 、 Q139N 、 T140N+L142S/T 、 S141N+L143S/T、 K142N、 A146N+A148S/T、 E147N+V149S/T、 A148N+F150S/T、 V149N+P515S/ T、 F150N+D152S/T 、 P151N+V153S/T 、 D152N+D154S/T 、 V153N+Y155S/T 、 D154N+V156S/ T、 Y155N+N157S/T 、 V156N 、 S158N+E160S/T 、 T159N+A161S/T 、 E160N+E162S/T 、 A161N 、 E162N+I164S/T 、 T163N+L165S/T 、 I164N+D166S/T 、 L165N+N167S/T 、 D166N+I168S/T 、 I168N+Q170S/T、 T169N、 Q170N、 S171N+Q173S/T、 T172N、 Q173N+F175S/T、 S174N+N176S/ T、 F175N+D177S/T 、 F178S/T 、 D177N 、 F178N+R180S/T 、 T179N+V181S/T 、 R180N+V182S/ T、 G183+E185S/T 、 E185N+A187S/T 、 D186N+K188S/T 、 K188N+G190S/T 、 P189N+Q181S/ T、 K201N+D203S/T 、 V202N+A204S/T 、 D203N+F205S/T 、 E213N+W215S/T 、 E224N+G226S/ T、 T225N+V227S/T 、 G226N+K228S/T 、 K228N 、 E239N 、 E240N+E242S/T 、 T241N+H243S/T 、 H243N+E245S/T、 K247N+N249S/T、 I251S/T、 I251N+I253S/T、 R252N+I254S/T、 I253N+P255S/ T、 P2 55N+H257S/T、 H257N+Y259S/T、 N260S/T、 A262S/T、 A261N+I263S/T、 A262N+N264S/ T、 I263N+K265S/T 、 K265N+N267S/T 、 A266N+H268S/T 、 D276N+P278S/T 、 P278N+V280S/ T、 E277N+L279S/T、 V280N+N282S/T、 Y284S/T、 S283N+V285S/T、 Y284N、 D292N+K294S/T、 K293N+Y295S/T、 E294N、 F299S/T、 I298N+L300S/T、 K301N+G303S/T、 F302N、 G303N+G305S/ T、 S304N+Y306S/T、 Y306N+S308S/T、 R312N+F314S/T、 F314N+K316S/T、 H315N+G317S/T、K316N+R138S/T、 G317N、 R318N+A320S/T、 S319N+L321S/T、 L321N+L323S/T、 V322N+Q324S/T、 Y325N+R327S/T、 R327N+P329S/T、 P329N+V331S/T、 L330N+D332S/T、 D332N+A334S/T、 R333N、 A334N+C336S/T、 T335N+L337S/T、 L337N、 R338N、 K341N、 F342N+I344S/T、 T343N+Y345S/ T、 Y345N+N347S/T、 M348S/T、 H354N+G356S/T、 E355N+G357S/T、 G357N+D359S/T、 R358N、 Q362N+D364S/T 、E372N+E374S/T 、E374N 、G375N 、E388N+A390S/T 、M391N+G393S/T 、 K392N+K394S/T、 G393N+Y395S/T、 K394N+G396S/T、 R403N+V405S/T、 I408S/T、 K409N+K411S/ T、 E410N、 K411N+K413S/T 和 K413N。
     10. 条款 7 限定的多肽， 其中所述一个或多个 N-X-S/T 基序建立在其中预期作为 “N” 残基的所述残基具有超过 50％的相对侧链表面可接近性的位置。
     11. 条款 10 限定的多肽， 其中所述一个或多个突变选自以下中的一个或多个 ：
     Y1N、 S3N+K5S/T、 G4N+L6S/T、 F9N+Q11S/T、 V10N+G12S/T、 K22N、 R37N、 Q44N+V46S/ T、 V46N+G48S/T、 D47N+D49S/T、 G48N+Q50S/T、 Q50N+E52S/T、 E52N+N54T、 S53N+P55S/T、 C56S/T、 L57N+G59S/T、 S61N+K63S/T、 I66N+S68S/T、Y69S/T、 S68N+E70S/T、 E70N+W72S/ T、 W72N+P74S/T 、 P74N+G76S/T 、 K80N+C82S/T 、 L84N+V86S/T 、 T87N+N89S/T 、 K91S/T 、 I90N+N92S/T、 K91N+G93S/T、 R94N+E96S/T、 K100N、 A103S/T、 S102N+D104S/T、 A103N+N105S/ T 、D104N+K106S/T 、V107S/T 、K106N+V108S/T 、V108N+V110S/T 、E113N+Y115S/T 、 R116N+A118S/T、 E119N+Q121S/T、 K122S/T、 Q121N+S123S/T、 S123N+E125S/T、 E125N+A125S/ T、 P129N+P131S/T 、 S138N 、 T140N+L142S/T 、 S141N+L143S/T 、 K142N 、 A146N+A148S/T 、 E147N+V149S/T 、A148N+F150S/T 、 V149N+P515S/T 、 F150N+D152S/T 、 P151N+V153S/T 、 D152N+D154S/T、 V153N+Y155S/T、 D154N+V156S/T、 Y155N+N157S/T、 V156N、 S158N+E160S/ T、 T159N+A161S/T、 E160N+E162S/T、 A161N、 E162N+I164S/T、 T163N+L165S/T、 I164N+D166S/ T、 L165N+N167S/T 、 D166N+I168S/T 、 I168N+Q170S/T 、 T169N 、 Q170N 、 S171N+Q173S/T 、 T172N、 Q173N+F175S/T、 S174N+N176S/T、 F175N+D177S/T、 F178S/T、 D177N、 F178N+R180S/ T、 T179N+V181S/T 、 R180N+V182S/T 、 G183+E185S/T 、 E185N+A187S/T 、 D186N+K188S/ T、 K188N+G190S/T 、 P189N+Q181S/T 、 K201N+D203S/T 、 V202N+A204S/T 、 D203N+F205S/ T、 E224N+G226S/T 、 T225N+V227S/T 、 G226N+K228S/T 、 K228N 、 E239N 、 E240N+E242S/T 、 T241N+H243S/T、 H243N+E245S/T、 K247N+N249S/T、 I251S/T、 R252N+I254S/T、 P255N+H257S/ T 、H257N+Y249S/T 、A262S/T 、A261N+I263S/T 、A262N+N264S/T 、I263N+K265S/T 、 K265N+N267S/T、 E277N+L279S/T、 V280N+N282S/T、 D292N+K294S/T、 K293N+Y295S/T、 E294N、 K301N+G303S/T 、 G303N+G305S/T 、 F314N+K316S/T 、 K316N+R138S/T 、 R318N+A320S/T 、 L321N+L323S/T、 R327N+P329S/T、 D332N+A334S/T、 R333N、 R338N、 K341N、 F342N+I344S/T、 T343N+Y345S/T、 H354N+G356S/T、 E355N+G357S/T、 G357N+D359S/T、 E372N+E374S/T、 E374N、 G375N、 M391N+G393S/T、 K392N+K394S/T、 G393N+Y395S/T、 I408S/T、 E410N 和 K413N。
     12. 条款 1 限定的多肽， 其中所述一个或多个突变选自以下中的一个或多个 ：
     Y1N、 K22N、 R37N、 C56S/T、 G60S/T、 Y69S/T、 E83S/T、 D85N、 K91S/T、 R94S/T、 K100N、 A103S/T、 V107S/T、 S110N、 K122S/T、 R134N、 S136N、 S138N、 Q139N、 K142N、 V156N、 A161N、 T169N、 Q170N、 T172N、 F178S/T、 D177N、 K228N、 E239N、 I251S/T、 N260S/T、 A262S/T、 Y284S/T、 Y284N、 E294N、 F299S/T、 F302N、 G317N、 R333N、 L337N、 R338N、 K341N、 M348S/T、 G358N、 E374N、 G375N、 I408S/T、 E410N 和 K413N。13. 条款 1 限定的多肽， 其中所述一个或多个突变选自以下中的一个或多个 ：
     T172N、 K228N、 I251T 和 A262T。
     14. 一种糖基化人因子 IX 多肽类似物， 其中所述多肽相对于野生型人因子 IX 多肽 在除 N157 或 N167 之外的一个或多个位置被糖基化。
     15. 条款 14 限定的多肽， 其中所述多肽在一个或多个位置被糖基化， 所述位置选 自以下中的一个或多个 ：
     Y1、 S3、 G4、 F9、 V10、 Q11、 G12、 R16、 K22、 R29、 T35、 R37、 T39、 F41、 W42、 Q44、 V46、 D47、 G48、 D49、 Q50、 E52、 S53、 N54、 L57、 N58、 G59、 S61、 K63、 D65、 I66、 N67、 S68、 Y69、 E70、 W72、 P74、 F77、 G79、 K80、 N81、 E83、 L84、 D85、 V86、 T87、 N89、 I90、 K91、 N92、 R94、 K100、 N101、 S102、 A103、 D104、 N105、 K106、 V108、 S110、 E113、 G114、 R116、 E119、 N120、 Q121、 K122、 S123、 E125、 P126、 V128、 P129、 F130、 R134、 V135、 S136、 S138、 Q139、 T140、 S141、 K142、 A146、 E147、 A148、 V149、 F150、 P151、 D152、 V153、 D154、 Y155、 V156、 S158、 T159、 E160、 A161、 E162、 T163、 I164、 L165、 D166、 I168、 T169、 Q170、 S171、 T172、 Q173、 S174、 F175、 N176、 D177、 F178、 T179、 R180、 G183、 E185、 D186、 K188、 P189、 K201、 V202、 D203、 E213、 E224、 T225、 G226、 K228、 E239、 E240、 T241、 H243、 K247、 N249、 I251、 R252、 I253、 P255、 H257、 N258、 N260、 A261、 A262、 I263、 N264、 K265、 A266、 D276、 E277、 P278、 V280、 N282、 S283、 Y284、 D292、 K293、 E294、 N297、 I298、 K301、 F302、 G303、 S304、 Y306、 R312、 F314、 H315、 K316、 G317、 R318、 S319、 L321、 V322、 Y325、 R327、 P329、 L330、 D332、 R333、 A334、 T335、 L337、 R338、 K341、 F342、 T343、 Y345、 N346、 H354、 E355、 G357、 R358、 Q362、 E372、 E374、 G375、 E388、 M391、 K392、 G393、 K394、 R403、 N406、 K409、 E410、 K411 和 K413。
     16. 条款 14 限定的多肽， 其中所述多肽在一个或多个位置被糖基化， 所述位置选 自以下中的一个或多个 ：
     Y1、 S3、 G4、 F9、 V10、 Q11、 K22、 R37、 Q44、 V46、 D47、 G48、 Q50、 E52、 S53、 N54、 L57、 G59、 S61、 I66、 N67、 S68、 E70、 W72、 P74、 K80、 L84、 T87、 N89、 I90、 K91、 R94、 K100、 N101、 S102、 A103、 D104、 N105、 K106、 V108、 E113、 R116、 E119、 N120、 Q121、 S 123、 E125、 P129、 S138、 T140、 S141、 K142、 A146、 E147、 A148、 V149、 F150、 P151、 D152、 V153、 D154、 Y155、 V156、 S158、 T159、 E160、 A161、 E162、 T163、 I164、 L165、 D166、 I168、 T169、 Q170、 S171、 T172、 Q173、 S174、 F175、 N176、 D177、 F178、 T179、 R180、 G183、 E185、 D186、 K188、 P189、 K201、 V202、 D203、 E224、 T225、 G226、 K228、 E239、 E240、 T241、 H243、 K247、 N249、 R252、 P255、 H257、 N260、 A261、 A262、 I263、 K265、 E277、 V280、 D292、 K293、 E294、 K301、 G303、 F314、 K316、 R318、 L321、 R327、 D332、 R333、 R338、 K341、 F342、 T343、 H354、 E355、 G357、 E372、 E374、 G375、 M391、 K392、 G393、 N406、 E410 和 K413。
     17. 条款 14 限定的多肽， 其中所述多肽在一个或多个位置被糖基化， 所述位置选 自以下中的一个或多个 ：
     Y1、 K22、 R37、 N54、 N58、 N67、 N81、 D85、 N89、 N92、 K100、 N101、 N105、 S110、 N120、 R134、 S136、 S138、 Q139、 K142、 V156、 A161、 T169、 Q170、 T172、 N176、 D177、 K228、 E239、 N249、 N258、 N260、 N282、 Y284、 E294、 N297、 F302、 G317、 R333、 L337、 R338、 K341、 N346、 R358、 E374、 G375、 N406、 E410 和 K413。
     18. 条款 14 限定的多肽， 其中所述多肽在一个或多个位置被糖基化， 所述位置选自以下中的一个或多个 ：
     T172、 K228、 N249 和 N260。
     19. 条款 14-18 中任一项限定的多肽， 其中所述高糖基化多肽包含至少一个聚糖。
     20. 一种治疗血友病的方法， 所述方法包括向患者给予治疗有效量的前述条款中 任一项限定的多肽。
     21. 一种用于治疗血友病的条款 1-19 中任一项限定的多肽。
     22. 条款 1-19 中任一项限定的多肽在制备用于治疗血友病的药物中的用途。
     23. 一种药物组合物， 所述药物组合物包含用于治疗血友病的条款 1-19 中任一项 限定的多肽。
     24. 一种用于制备条款 1-19 中任一项限定的多肽类似物的方法， 所述方法包括以 下步骤 ：
     (a) 位点定向诱变人因子 IX 以将一个或多个 N-X-S/T 基序掺入至编码人因子 IX 的 DNA 中 ；
     (b) 将所得核酸构建体转染至生产细胞中 ； 以及
     (c) 从转染的生产细胞中纯化所述多肽类似物。 25. 一种核酸构建体， 其编码条款 1-19 中任一项限定的人因子 IX 多肽类似物。
     26. 一种重组载体， 其包含条款 25 限定的核酸构建体。
     27. 一种用条款 26 限定的载体转染的细胞。
     28. 条款 27 限定的细胞， 所述细胞为真核生产细胞。
     29. 条款 27 或条款 28 限定的细胞， 所述细胞为哺乳动物细胞， 例如中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞 ( 例如 CHO-K1) 或人胚肾 (HEK) 细胞 ( 例如 HEK293F)。
     30. 一种药物制剂， 其包含条款 1-19 中任一项限定的多肽。