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1、10申请公布号CN102101882A43申请公布日20110622CN102101882ACN102101882A21申请号200910241990722申请日20091218C07K14/415200601C12N15/29200601C12N15/63200601C12N15/82200601C12N1/15200601C12N1/19200601C12N1/21200601C12N5/10200601C12N15/11200601A01H5/0020060171申请人中国农业大学地址100094北京市海淀区圆明园西路2号72发明人杨淑华黄小贞74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司。
2、11245代理人关畅54发明名称一种植物耐低温胁迫相关蛋白及其编码基因与应用57摘要本发明公开了一种植物耐低温胁迫相关蛋白及其编码基因与应用。该蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1序列表中的SEQID2的氨基酸残基序列；2将序列表中的SEQID2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有SEQID2的氨基酸残基序列相同活性的蛋白质。本发明的基因为培育耐低温植物新品种提供了基因资源，具有潜在的应用价值。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图2页CN102101885A1/1页21植物耐低温胁迫相关蛋白，是具有下。
3、述氨基酸残基序列之一的蛋白质1序列表中的SEQID2的氨基酸残基序列；2将序列表中的SEQID2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有SEQID2的氨基酸残基序列相同活性的蛋白质。2权利要求1所述的植物耐低温胁迫相关蛋白的编码基因。3根据权利要求2所述的植物耐低温胁迫相关蛋白的编码基因，其核苷酸序列是下列核苷酸序列之一1序列表中SEQID1的DNA序列；2编码序列表中SEQID2蛋白质序列的多核苷酸；3与序列表中SEQID1限定的DNA序列具有90以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。4含有权利要求2或3所述基因的表达载体5含有权利要求2或3所述基因的宿。
4、主菌。6含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。7扩增权利要求2或3所述基因任一片段的引物对。8根据权利要求7所述的引物对，其特征在于所述引物对为序列表中SEQID3和SEQID4。9权利要求2或3所述基因在改变植物耐低温胁迫能力中的应用。10一种构建低温敏感型拟南芥的方法，是将拟南芥中的植物耐低温胁迫相关蛋白灭活；所述植物耐低温胁迫相关蛋白为权利要求1所述的蛋白；所述灭活为点突变、缺失或插入突变拟南芥中的植物耐低温胁迫相关蛋白的编码基因。权利要求书CN102101882ACN102101885A1/6页3一种植物耐低温胁迫相关蛋白及其编码基因与应用技术领域0001本发明涉及一种植物耐低温胁。
5、迫相关蛋白及其编码基因在改变植物耐冷胁迫能力中的应用。背景技术0002植物生长在自然环境中，会受到各种各样的不良因素的影响，主要包括生物胁迫和非生物胁迫。前者主要是指各种病原微生物的入侵；后者则主要指盐，干旱，低温，高温等渗透胁迫。春去冬来，四季更替，温度的变化不仅是影响植物生长发育的重要环境因子之一，同时也是限制作物产量的主要非生物因素。很多农作物的大量减产是由于低温寒害造成的，因此，研究植物响应低温胁迫的生理生化反应及其分子机制，能够为提高植物抵抗低温寒害的能力创造条件。0003植物由于其生长的固定性，为了在一定范围的温度条件下能够正常的生长和发育，当外界环境温度发生变化时，植物自身会对这。
6、一变化作出反应，包括CA2信号的传递，一系列冷诱导基因的表达，还有各种新成代谢上的变化。近几年来，虽然有关植物如何响应低温分子机制研究已经比较深入，但是我们仍然不清楚植物到底是如何感知低温信号并传递低温信号到核内激活转录因子，进而调节基因转录或引起一系列生理生化反应。0004拟南芥是一种十字花科植物，由于其形态个体小，生长周期快，基因组小，重复序列少，并且全部基因组测序已经完成，且容易被人工诱变产生大量不同基因位点遗传变异突变植株，因此已成为一种典型的模式植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究。发明创造内容0005本发明的目的是提供植物耐低温胁迫相关蛋白及其编码基因在改变植物耐。
7、冷胁迫能力中的应用。0006本发明通过一个冷敏感突变体，发现导致该突变体冷敏感的基因，我们发现它的编码蛋白的新功能，就是能够调控冷胁迫引起的细胞死亡，即可以改变植物对冷胁迫的耐受能力。0007本发明的植物耐低温胁迫相关蛋白，即调控植物低温细胞死亡相关蛋白ATLSD1，来源于拟南芥ARABIDOPSISTHALIANA，是如下A或B的蛋白质0008A由序列表中SEQID2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；0009B将序列表中SEQID2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQID2衍生的蛋白质。其中，序列表中SEQID2是由。
8、183个氨基酸残基组成。0010本发明提供的植物耐低温胁迫相关基因，是调控温度诱导的细胞死亡相关基因，是在冷信号途径上起作用的基因，名称为ATLSD1ARABIDOPSISTHALIANALESIONSIMULATINGDISEASERESISTANCEL，该基因在拟南芥基因组数据库中的编号为说明书CN102101882ACN102101885A2/6页4AT4G20380，来源于哥伦比亚生态型的拟南芥，是下列核苷酸序列之一00111序列表中SEQID1的DNA序列；00122编码序列表中SEQID2蛋白质序列的多核苷酸；00133与序列表中SEQID1限定的DNA序列具有90以上同源性，且编。
9、码相同功能蛋白质的DNA序列。0014序列表中序列1的DNA序列由2272个碱基组成，该基因的读码框为自5端第1位到第1880位碱基，含有7个内含子，分别为自5端第199位到第318位碱基；自5端第381位到第505位碱基；自5端第635位到第723位碱基；自5端第829位到第1317位碱基；自5端第1458位到第1557位碱基；自5端第1630位到第1721位碱基；自5端第1794位到第1880位碱基。0015含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌及扩增ATLSD1中任一片段的引物对均属于本发明的保护范围。其中，上游引物和下游引物之间的距离在50到2000个碱基之间；该引物对其中的每。
10、一个引物的长度为15到25个碱基，如引物1LSD1R5TCCGTTGATGAAAGCGGAAAGTCG3SEQID3引物2LSD1F5GGAATAGAGGAAGAATTTGGA3SEQID4。0016本发明还提供一种构建低温敏感型拟南芥的方法，是将拟南芥中的植物耐低温胁迫相关蛋白灭活；所述植物耐低温胁迫相关蛋白为权利要求1所述的蛋白；所述灭活为点突变、缺失或插入突变拟南芥中的植物耐低温胁迫相关蛋白的编码基因。0017利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明的ATLSD1基因敲除或沉默后，植物表现为低温敏感。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，。
11、如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本发明的基因为培育耐低温植物新品种提供了基因资源，具有潜在的应用价值。0018下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。附图说明0019图1为冷敏感突变体LSD13的表型分析和图位克隆0020图2为ATLSD1调控温度依赖的细胞死亡验证具体实施方式0021我们通过筛选拟南芥EMS突变体库，发现了一个冷敏感突变体，克隆得到了这个在冷信号途径上起作用的基因。我们分析了该基因的生理生化功能，进一步了解了植物感知及应答环境温度的分子机制。以下述实施例说明其获得方法及其功能。0022实施例1、AT。
12、LSD1的图位克隆00231突变体CHS4的获得和表型分析0024我们通过筛选拟南芥EMS突变体库，发现了2个冷敏感突变体，原来命名为CHS41和CHS43。这两个突变体是同一个等位基因。我们发现突变体在低温条件下出现细胞死亡，叶片萎蔫的表型图1A，图2A。00252突变体的图位克隆说明书CN102101882ACN102101885A3/6页50026为了克隆得到基因，我们将突变体与另一生态型LER杂交后得到F2代，挑选低温敏感植株构建图位克隆的群体。利用BSA，初步将该突变基因定位第四条染色体的中部，经过SSLP和CAP或者DCAP标记进一步定位分析，把突变基因精细定位于F18F4与T7J。
13、7之间图1B，利用测序分析发现，在CHS41中，突变碱基位于AT4G20380以前报道过的基因ATLSD1最后一个外显子和内含子的交接处，由GA，造成了剪切错误，致使在CHS41中，MRNA多出将近90BP图1C。在CHS43中，突变碱基发生在第七个外显子上，由CT。这些突变造成了AT4G20380蛋白的不稳定，在突变体里，ATLSD1蛋白含量表达很低图1D。为了进一步证实是由于AT4G20380的突变造成了CHS41的冷敏感表型，我们做了互补实验，将野生型基因转入突变体植株，能够互补突变体的表型，因此进一步确定了该突变体确实是由于ATLSD1发生突变所致。因此我们将CHS41重新命名为LSD。
14、13图1E。上述突变体的鉴定，鉴定CHS41突变位点所用引物为LSD1RTCCGTTGATGAAAGCGGAAAGTCGTAQ1；LSD1FGGAATAGAGGAAGAATTTGGA。0027实施例2、ATLSD1调控温度依赖的细胞死亡0028在低温条件下突变体体内有大量细胞死亡，同时诱导表达了抗病基因PR1和PR2，并且积累了高水平的SA。00291用台盼蓝染色液染色，在体视镜下观察发现，低温处理之后，LSD13的叶片有大量细胞死亡图2A；00302NORTHERNBLOT用TRIZOL提取正常条件下和低温条件下野生型和突变体的RNA。以1XMOPS为电泳缓冲液，12甲醛变性胶进行电泳分离。。
15、用10XSSC将RNA转移到尼龙膜上，紫外交连后用于杂交。杂交过程选用CHURCHBUFFER，PCR扩增探针之后用同位素32PDCTP进行标记，杂交16H之后，洗膜三次，分别用2SSC，01SDS，15MIN；1SSC，01SDS，65下15MIN，05SSC，01SDS，65下15MIN；最后用X光片显影，结果显示CHS41体内的PR1，PR2大量诱导表达图2B。报告基因PR1GUS染色也证明在LSD13体内确实PR1表达高于WT图2C。00313甲醇提取WT和LSD13体内水杨酸，环己烷和乙酸乙酯萃取之后风干，乙腈溶解之后用HPLC测定，结果显示在LSD13中，不论是游离SA还是SAG，。
16、都高于WT图2D。00324LSD13在低温条件下也表现出细胞死亡。综上所述，我们得出结论ATLSD1调控温度依赖的细胞死亡。0033序列表0034400351003622720037DNA0038拟南芥属拟南芥ARABIDOPSISTHALIANALHEYNH003910040CTTACGCGTCATGTAAAAAAAAAAGAAGCGTAAATTACGAAAAACAGAGAGATAAATCCG600041GGCATTGAGATTTTGGAGATAGAGAGAGAGAAAAATCGAAATCTATTGTCTATCTCCTCA1200042ATTTGGATTGGATTTTCTGCATATCAT。
17、CGCTCTAGCTTTCGCGGGTTTTGGATTCGATTC1800043CTTACCCTTCTCCAATCGGTAAGAACAAGCTCCAAAGTTTGTTCCTTTTTTTCAATTTTC240说明书CN102101882ACN102101885A4/6页60044GCCAATTCTGTAATCTCATCATTGTCCTTGTTTGTTTGTTTGATTCAACACACAATTCTT3000045GTTTTGATTTGGATGCAGAAGTTTTTGGCTTTGAATTGGATTTGGGTTTCGTTCCAAAAT3600046CAGCTCTTTTTGTTAATCAGGTGAGTT。
18、TTTAGGTATTTGAATCTCCAATTGCTTCCTTGC4200047AATGACTAAGTATTGTGAAATGTTTAGGGTTTCATCTGTGTGGGTCTTGTTTTGAAGCAA4800048TTTGTGTGTGTTTGGATGAAAGTAGCAGATATGCAGGACCAGCTGGTGTGTCATGGTTGT5400049AGGAATTTATTGATGTATCCTAGAGGAGCATCTAATGTGCGTTGTGCGTTATGTAACACT6000050ATCAACATGGTTCCTCCTCCTCCTCCACCTCACGGTATCGATTTCTTTGTTGAATTTGA。
19、A6600051TTGAGGATGAGGTTAATATGCTCTGCAATTGTATTATAACTTGGGTTCTGATTCTGAATA7200052CAGACATGGCACACATTATATGTGGTGGTTGTAGAACAATGCTTATGTATACGCGTGGGG7800053CTAGTAGCGTAAGATGCTCTTGCTGTCAAACTACGAACCTTGTGCCAGGTATATTAATAA8400054TATCGTGACATCCATATCAATCCTTTTAAAGACCATGTATTATATTGCTTTATAAGGTCT9000055TTTAGTCCTTTAGAATCTTCTTTC。
20、ACACTTTTGTTTGATAACATTGTTCTGTGGAGATGA9600056TGCTTACGTAACGTATTTCCACTTTTCCCAAAGATGTATATGAATCTGAATTCTGAAAAT10200057ATCTGGGATTTGTAAAGCAGCTGAAAGTACTTAAAACAAAGCTTTTAGATGGTCCCGGTG10800058GACTAGGTAACTACTTGTTAGAGCTAGTAGGGTTTATTATTGTTTTGTTTGATCTACCAT11400059TAGATTCTTATCTTTAATTAGCGTCTAAGCTGTTGTCATTTAGCTGTATGATT。
21、ATCATTT12000060ATCCATGACTGCTTAAGAACATTGCTGATTACTTCGTTCATTAGTATTTCTTGGATTTTT12600061CTAGCATTAACATTGCTTGTTTTCTGAATCTGTGCGTGTCTTTTTTGAAATCGACAGCGC13200062ACTCCAATCAGGTTGCCCATGCTCCTTCCAGTCAGGTTGCGCAGATCAATTGTGGGCATT13800063GTCGGACGACCCTCATGTATCCTTACGGTGCATCATCCGTCAAATGCGCTGTTTGTCAAT14400064TCGTAACTAACGT。
22、TAATGTGATTATTCCTATCTATTAAGCCACCTCTGCATGGTTGAGTT15000065AAGTATAGAGATCTTTCTGTTGGAAATTTTCATTTCTGATTCATTTTGCATCCTTAGATG15600066AGCAATGGAAGGGTACCTCTCCCAACTAACCGGCCAAATGGAACAGCTTGTCCCCCCTCT16200067ACATCAACTGTGAGTTATCAAATTATGAATTTGTAATAGTTCTGTATATTCTTATGGAAC16800068TGGTACTTACTCTGTTCATCGATTTTTCATTTTACCAACAG。
23、TCAACACCACCCTCTCAGA17400069CCCAAACCGTTGTTGTAGAAAACCCCATGTCCGTTGATGAAAGCGGAAAGTTGGTGAGTA18000070TTTCTATCACCTGTGTTCTTCTTCTTATTTACCACATTAGAGGAAGATATGACAAAGTGA18600071CTGAAACACACAAATTGCAGGTGAGCAATGTTGTTGTTGGAGTGACAACTGACAAAAAGT19200072AATCAAGAATGAGTGAGATCTTAAAGATCAAATCCAAATTCTTCCTCTATTCCTGCGTTT19800073G。
24、GTTTGTGCATATTACATACGCGGAAAAACTGTATGTTATATATCTCTTGACTCCTTTTT20400074AACCCAAGAGAAAAAGCTTATCAGAATCTCTTGTTACTGCATTATTGGGGTTTATTCAAA21000075GTTGAAGACACAAGGTTTTTGCTCGAATAATTTGGCATTCTTTTGCTCCATGGAACTTGA21600076CCTTCTCTTCTGTTTGTTGACTTCTAAAACTCCATCGGCCCTTGTGGCATTGTTAATGTA22200077TGTATGAATATAATCTGATACACCAACCA。
25、ATCATTAAGATTTGGGTTTGAAA22720078200791830080PRT0081拟南芥属拟南芥ARABIDOPSISTHALIANALHEYNH00822说明书CN102101882ACN102101885A5/6页70083METGLNASPGLNLEUVALHISGLYCYSARGASNLEULEUMETTYRPRO00841510150085ARGGLYALASERASNVALARGCYSALALEUCYSASNTHRILEASNMET00862025300087VALPROPROPROPROPROPROHISASPMETALAHISILEILECYSGLY00883。
26、540450089GLYCYSARGTHRMETLEUMETTYRTHRARGGLYALASERSERVALARG00905055600091CYSSERCYSCYSGLNTHRTHRASNLEUVALPROALAHISSERASNGLN0092657075800093VALALAHISALAPROSERSERGLNVALALAGLNILEASNCYSGLYHIS00948590950095CYSARGTHRTHRLEUMETTYRPROTYRGLYALASERSERVALLYSCYS00961001051100097ALAVALCYSGLNPHEVALTHRASNVALASNMETSERAS。
27、NGLYARGVAL00981151201250099PROLEUPROTHRASNARGPROASNGLYTHRALACYSPROPROSERTHR01001301351400101SERTHRSERTHRPROPROSERGLNTHRGLNTHRVALVALVALGLUASN01021451501551600103PROMETSERVALASPGLUSERGLYLYSLEUVALSERASNVALVALVAL01041651701750105GLYVALTHRTHRASPLYSLYS0106180010730108240109DNA0110人工序列01110112011330114TCCGTTGATGAAAGCGGAAAGTCG20011540116210117DNA0118人工序列0119012001214说明书CN102101882ACN102101885A6/6页80122GGAATAGAGGAAGAATTTGGA19说明书CN102101882ACN102101885A1/2页9图1说明书附图CN102101882ACN102101885A2/2页10图2说明书附图CN102101882A。