一种来源于山菠菜的转录因子、编码它的 基因以及培育耐逆植物的方法 【技术领域】
本发明涉及一种来源于山菠菜的转录因子、编码它的基因以及利用该基因培育耐逆植物的方法。技术背景
环境中物理化学因素的变化，例如：干旱、盐碱和冷害使得农作物大规模减产。因此，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。高等植物细胞可有多种途径感受外界环境中物化参数的变化，从而将胞外的信号变为胞内信号，通过系列的磷酸化级联反应将信号传递给转录因子，转录因子再作用于功能基因，启动逆境应答的基因的表达从而提高植物的耐逆性。在植物中，AP2/EREBP类DREB转录因子家族中的一类能接受环境胁迫信号并且启动逆境应答基因。山菠菜(Atriplex hortensis)是一种耐盐植物。发明人已从山菠菜中克隆了DREB转录因子，命名为AhDREB，构建了分别适用于单、双子叶植物的表达载体，转化双子叶模式植物烟草。转基因烟草与明显的耐逆性。发明内容
本发明的一个目的是提供一种具有较强耐逆效果的AhDREB转录因子，该转录因子来源于山菠莱(Atriplex hortensis)，其氨基酸序列示于SEQID NO：1。该序列代表了山菠莱中DREB转录因子家族。应当说明的是，SEQ ID NO：1所示地氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的缺失，替换或增加得到的这种转录因子的衍生物或其片段，只要具有这种转录因子的功能也能够用于本发明。
本发明的另一个目的是提供一种编码转录因子AhDREB的基因，该基因可以具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。在SEQ ID NO：2中所示的基因代表了山菠菜中的一种DREB转录因子家族，它们都含有保守的AP2/EREBP结构域序列。
本发明的再一个目的是提供一种含有编码本发明的AP2/EREBP类转录因子基因的植物表达载体。
可使用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体。这些植物表达载体包括但不限于，双元农杆菌载体，例如Bin19(Bevan，M.，1984，核酸研究，12：8711-8721)以及用于单子叶植物微弹轰击的载体。载体还可包括3’非翻译区域。3’非翻译区域是指一种基因的部分，它含有一种包含聚腺苷酸信号和任何其它的可效应mRNA加工或基因表达的DNA片段。聚腺苷酸信号引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。3’区域的例子包括含有农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(例如胭脂碱合成酶(Nos基因))，和植物基因(例如大贮存蛋白基因)的3’转录的非翻译区。本发明的DREB转录因子的3’非翻译区域可被用于在植物中表达。
本发明的载体可含有适当的启动子。在本发明中可使用任何一种强启动子。这些启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒(CAMV 35S)。它可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。
本发明的表达载体在需要时也可包括增强子，不论是翻译增强子或转录增强子。这些增强子区域包括但不限于ATG起始密码子和邻接区域。起始密码子必需与编码序列的阅读框同相，以保证整个序列的翻译。翻译控制信号和起始密码子可以是多种不同的来源，可以是天然的或合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域，或来自结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，包括加入植物可选择性标记。可使用的选择性标记包括对抗生素抗性的酶，抗生素包括庆大霉素、潮霉素、卡那霉素等。同样，可使用产生通过颜色变化(例如GUS)或发光(例如荧光酶)耒识别的化合物的酶，或抗化学试剂(例如除莠剂)。
本发明的表达载体可通过使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体，直接的DNA转化，微注射，电穿孔等导入植物细胞。对这些技术的综述参阅Weissbach和Weissbach，植物分子生物学方法(Method for PlantMolecular Biology)，Academy Press，New York VIII，pp.421-463(1988)；和Geiserson和Corey，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)，第二版(1988)。
本发明的又一个目的是提供一种培育耐逆性植株的方法。该方法包括用本发明的转录因子AhDREB基因构建植物表达载体；用构建的表达载体转化植物组织；将转化的植物组织培育成植株。
可使用本发明的方法转化的植物宿主包括单子叶植物和双子叶植物，例如：水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。附图简要说明
图1是AhDREB基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列；
图2表示AhDREB植物表达载体的构建；
图3表示AhDREB1表达在山菠菜根中受盐诱导；
图4表示AhDREB1转基因烟草耐盐实验结果；
图5表示AhDREB基因在基因组中的组成分析结果。实施例实施例1山菠菜cDNA文库构建及转录因子AhDREB cDNA克隆，序列分析及逆境胁迫下AhDREB的表达
山菠菜种在盆中，50天后，以2.0％NaCl溶液浇灌。cDNA文库构建按Sambrook(1987)方法进行。收集新鲜叶片1g在液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入无水乙醇沉淀总RNA，之后，溶于水。经mRNA纯化试剂盒处理得到mRNA。取2ug mRNA进行逆转录反应，然后再进行二链合成。双链cDNA与EcoR1接头连接后磷酸化，经制备离心柱(Sephacry1-400)去除多余接头，然后与酶切的脱磷pExcell，载体(Pharmacia)连接，取5ul连接产物加入包装蛋白，建成cDNA文库。
以拟南芥DREB cDNA为探针筛选了2.5X105未扩增斑得到3个阳性斑，其扦入片段为1.43kb。该片段包括723bp的开放读码框架，编码由240个氨基酸组成的多肽，其5’端为43bp，3’端为665bp。山菠菜AhDREB cDNA全序列及氨基酸序列见图1。山菠菜AhDREB活性与环境胁迫的关系
以200mM NaCl溶液连续处理山菠菜4天，分别在1，2，3，4天收集叶片，提取RNA作Northern分析。结果表明DREB的转录在根中受盐胁迫诱导(图3)。实施例2AhDREB cDNA植物表达质粒的构建和农杆菌介导转化
AhDREB cDNA植物表达载体的构建按常规方法进行。双元表达载体pB1121含35S启动子和翻译增强子TMV的片段。将含35S启动子的植物表达载体直接转化农杆菌AGL1，将约5mm的无菌烟草叶片分别浸入稀释5倍的AGL1农杆菌液中，约30min后取出，放在无菌泸纸上，吸去菌液，接种在MS2培养基(MS基本培养基含1mg/L6-BA，0.1mg/LIAA)中共培养3天后转入筛选培养(MS2含100mg/L卡那霉素和600mg/L头孢霉素)。对照用含pB1121的农杆菌侵染，共得到AhDREB的转基因植株11棵。实施例3转基因植株的耐逆性鉴定
将转基因植株和对照植株分别移栽到含0.6％NaCl的MS培养基中继续生长，在0.6％NaCl浓度下，转基因植株生长发育良好而对照植株生长缓慢或逐渐萎蔫(图4)。实施例4AhDREB基因在山菠菜基因组中的分析
以AhDREB为探针，在不同严謹度下进行Southern Blot分析，当在45℃下洗膜时，呈现多条杂交带，表明山菠菜基因组中存在着AhDREB基因的同源基因。当在严谨条件下洗膜时的带型表明AhDREB基因在山菠菜基因组中的拷贝数约为1-2个拷贝(图5)。
序列表SEQ ID NO：1
MSYSYPPPLPSNTLNNFLSPKPVTMKTTGGPPKPTKLYRGVRQRHWGKWVA
EIRLPKNRTRLWLGTFDTAEEAALAYDKAAYKLRGDFARLNFPNLRHEGSHI
GGEFGEYKPLHSSVNAKLEAICESLAKQGNEKQGKSGKSKKKDVANNNNNT
SSSSSSSCCTTATAAADAPQQQQRMPENGGDVKTESTSDSEVGSGGSSPLSDL
TFGDNEEMGSENFLLESCPSHEIDWDAILSSESSEQ ID NO：2
CGTTGCTGTCGAATTTACTTACCCCCAAGCCCAGCCCCAACAMTGAGCTA
CTCATACCCACCTCCACTTCCTAGTAATACCCTTAACAACTTTCTATCTCCC
AAGCCTGTGACCATGAAAACAACTGGTGGGCCGCCCAAGCCCACTAAGC
TTTATCGTGGGGTTAGGCAACGTCACTGGGGTAAATGGGTTGCTGAGATCC
GTTTACCCAAGAACAGGACCCGGCTTTGGTTGGGTACCTTTGATACAGCTG
AGGAAGCTGCTTTGGCTTACGACAAGGCGGCTTACAAGCTGAGAGGTGAC
TTTGCGAGGTTGAATTTTCCTAATCTCCGCCATGAAGGGTCCCACATCGGTG
GCGAATTCGGCGAATACAAACCCCTTCATTCCTCCGTAAACGCAAAACTCG
AAGCCATTTGCGAGAGTCTAGCCAAACAGGGGAATGAAAAACAGGGGAAA
TCAGGAAAGTCCAAGAAGAAAGATGTTGCTAATAATAACAATAATACTTCAT
CTTCGTCATCTTCAAGCTGTTGTACAACAGCTACTGCTGCGGCCGATGCACC
GCAGCAGCAGCAGCGGATGCCGGAAAACGGCGGCGATGTAAAAACCGAGA
GCACCTCCGATAGTGAGGTGGGGTCCGGTGGATCGTCGCCGTTGTCGGATTT
GACATTCGGAGATAATGAAGAAATGGGATCGGAGAATTTCTTGTTGGAGTCA
TGCCCATCTCATGAGATTGATTGGGATGCTATATTATCATCTGAATCTTAATAAT
TTCATTTGTGGTCTTAAGTATGGGTTAATAAGGAGTATTAATTAAATTAAATTAGGGAGTTATAAAATGTGTCATCATAATATAAGTCATGTAATGTTGTGTAAATTTTTTCTTTTTTTTTTTTTAATTTTAATTAAAATTAGTAGGTTGGTAGTGGGTAGTTTCAGGGAGGAGTGATCTCTGCAATGAAGTTTTTGGAAATTGTAGGGACTCCATATTTGGTCTTCTTTGGTGAGGCAAGTGTTTTTTTGATCTTGCCTTTGATCAATTGAAGAGTAGTTTTTTTTTCTTATTGTTTATTTTATGTTTATAGTAGAAAAAATTTTAGGATTGTAATTTGATGATCATTTTTAGTGAAGTATTATTATTAATATTTTTATTAGTATAAAAAAAAATTGGACTGTTATCAAGGTAAGTGCTTATTTTGACTTCCATATTTGTATGTTGCTCTCTTTCTTTGATTCTTTCATATTTCTAGTGAGATCTGAACTATAATTAATATGGATTAAACCTTAAATTACTAGTGGTTTGTGTAACAGGATATGCTTGATGTTCCTGTTTTATACATAATCGGAGCTTTTGTCCCTGCAACAATGATTGCAGTGCTCTATTATTTTGATCACAGTGTGGCATCTCAACTTGCTCAGCAGCGACAGCAACG