一种嵌合基因的构建方法及其应用 【技术领域】
本发明属于分子生物学领域，涉及基因工程中一种嵌合基因的构建方法，其氨基酸序列连接的方向有一部分和传统的方向相反，有更多的自由氨基端，类似生物体内天然存在的状况，促进构建全新的分子的研究。背景技术
人体是一种复杂的多细胞有机体，细胞之间都是通过有关的细胞因子或激素来交流相互之间的信息。这种信息交流的成功有赖于位于细胞膜表面的受体，正是通过受体与细胞因子或激素的相互作用，才使有关的信号转导到细胞内，并引起细胞功能地变化。随着分子生物学研究的深入，人们发现了越来越多的特异的受体，如引起细胞凋亡的肿瘤坏死因子受体，引起血管内皮细胞增生的血管内皮生长因子受体等。受体在与细胞因子或激素的结合过程中，往往需要受体之间的相互结合成二聚体或多聚体，才能激活其下游的信号转导系统。因此，在体外构建有关的受体进行药物筛选时，应该构建这种受体的二聚体或多聚体，才能筛选到在体内有高度活性的药物。
利用现有的方法只能将受体的亚单位通过链接区将第1部分的羧基端和第2部分的氨基端相连，而在人体内受体的亚单位的氨基端是自由结合的，没有任何的限制。同样利用现有的方法构建重组抗体的过程中，只能将一种蛋白的某一段基因片段，称为第一链的羧基端通过链接区与同种或另一种蛋白的某一段基因片段，称为第二链的氨基端相连，而使形成的人工分子的氨基端区域受到限制；而利用现有的方法构建的核苷酸序列如图2所示即：第一链的氨基端→羧基端→链接区→第二链的氨基端→羧基端，其氨基端是自由的，没有任何的限制。发明内容
本发明的目的是利用传统的方法在体外表达细胞受体的二聚体，通过链接区将受体的相同或不相同的单体连接在一起，这种连接是通过将一个亚单位的羧基由链接区和另一个亚单位的氨基连接在一起，将势必影响到受体与其配基的结合。为了克服这种在人工分子的构建过程中自由氨基端与链接区相连而活性受到限制的缺点，通过本发明的方法，利用基因工程的手段，构建如下的受体结构，将使所获得的受体更类似于生物体内天然存在的的结构：即如图1所示：第1链的氨基端→羧基端序列→链接区→第2链的羧基端→氨基端序列。这样氨基端能自由结合，能不受任何限制地互相作用，更真实地模拟体内分子的天然存在的状况，是本发明的目的。
为了实现本发明的目的采取的方案：
1、一种嵌合基因的构建方法，在氨基酸序列合成时第一(或第二)链的方向为氨基端到羧基端通过链接区链接第二(或第一)链，其特征是所述的第一链和第二链在合成时都以羧基端和链接区相连，所述的第二(或第一)链方向为羧基端到氨基端；形成一条完整的DNA链的嵌合基因序列的方向为：第一(或第二)链的氨基端—羧基端—链接区一第二(或第一)链的羧基端—氨基端这样的序列。
2、所述的第一链和第二链构建成嵌合基因的基因片段，是同种蛋白基因的全部基因或部分基因或是来自不同蛋白的基因片段，是来自生物体内或是人工合成的基因片段；是确切的核苷酸序列，或是随机的核苷酸序列。
3、所述的链接区由0-2000个氨基酸构成，其最佳长度为1-40个氨基酸序列，一般为苷氨酸和丝氨酸组成的链接序列。
4、所述的第二链的氨基端加入一个琥珀终止密码子UAG，以使嵌合基因表达产物纯化。
5、所述的琥珀终止密码子UAG的后面通过链接区连接噬菌体的基因片段，使其与外源性基因片段融合，并表达于噬菌体的表面，利于蛋白之间互相作用的深入研究。
6、一种嵌合基因的构建方法的应用，通过逆转录一聚合酶链反应、拼接、测序和人工合成常见的分子生物学方法，证明用本发明的嵌合基因的构建方法所构成的嵌合基因，其特征是和生物体内天然存在的状况类似，有更多的自由氨基端，有利于其与受体和配基的自由结合，使羧基端的氨基酸先于氨基端的氨基酸，有利于细胞蛋白的合成，促进构建全新的分子的研究。
通过对基因的人工合成，不仅可以根据所用细胞的兼并密码子的使用频率来调整基因的序列，以提高蛋白的翻译水平，同时也可以根据氨基酸的序列，利用分子生物学的手段，来构建编码蛋白分子的基因。传统的人工合成蛋白的基因片段具有方向性，即在细胞内复制、转录和翻译时，合成的方向只能从氨基的5’端到羧基的3’端，遵循这一原则，方能得到具有活性的产物。
本发明所述的一种嵌合基因的构建方法，第一链和第二链都以羧基端和链接区相连，第二链的编码羧基端氨基酸的密码子位于传统人工合成基因的5’端，而编码氨基端氨基酸的密码子位于传统人工合成基因的3’端，使羧基端的氨基酸先于氨基端的氨基酸，利用细胞的蛋白合成机制来合成全新的分子，因为这种结构有更多的自由氨基端，使其与受体或配基结合时，充分自由结合，便于构建二聚体或多聚体，筛选到在体内具有高度活性的药物的深入研究。在本发明的嵌合基因构建的方法中，所述的链接区可以是任何氨基酸序列，由0-2000个氨基酸构成，其最佳长度为1-40个氨基酸序列；所述的第二链的氨基端加入一个琥珀终止密码子UAG，以利于嵌合基因表达产物的纯化。
丝状噬菌体是一种细菌的病毒，它可以借助细菌的DNA和蛋白质合成机制，来完成自身的复制，并且不引起细菌的死亡。最常见和常用的丝状噬菌体为M13，fd等，其外形呈棒状。M13的基因组为一条单链DNA，其为10个基因编码。这10个基因编码的蛋白质，组成了包被单链DNA的外衣。整个噬菌体的分子量为1.63×107Da，其中88％为蛋白质，12％为DNA。整个包衣有大约2700份的主要包衣蛋白pVIII。在噬菌体的一端，有各为5个拷贝的基因VII和VI编码的蛋白，参与和细菌的结合以及结束噬菌体的装配过程。噬菌体的另一端为各为5个拷贝的基因VII和IX编码的分别为33个和32个氨基酸的蛋白，参与噬菌体装配的起始和噬菌体稳定性的维持。目前已经报道了分别用基因III，VI，VII，VIII和IX来显示抗体于噬菌体表面的报道。利用噬菌体的基因III，VI，VII， VIII或IX基因与外源性基因片段融合，可以使外源性基因编码的蛋白产物显示在噬菌体的表面，这样达到了基因型与表现型的统一。特别是利用体内外的筛选技术所获得的与受体或配基结合的噬菌体，直接可以从中分离出编码的基因片段，用于更进一步的研究。
重组噬菌体抗体系统利用了M13噬菌体独特的生活周期，特别是在噬菌体表面表达的几个噬菌体蛋白的独特特性。丝状噬菌体M13长度约为895nm，直径为9nm。其为单链DNA，共有6407个碱基，为10个蛋白质编码。与其它的大多数细菌噬菌体不同的是，M13并不产生溶菌性的感染，而是在保持宿主存活的状态下，利用宿主的基因复制和蛋白合成机制来复制产生大量的噬菌体。在感染宿主的过程中蛋白III起着至关重要的作用，因为通过蛋白III与宿主细菌菌毛的结合，而使得噬菌体可以进入大肠杆菌体内。利用分子生物学方法，将抗体的相关基因片段通过与蛋白III或蛋白VIII等的融合，利用噬菌体的基因与外源性基因片段融合，使外源性基因编码的蛋白产物，表达于噬菌体的表面，而达到基因与功能的偶联，为研究蛋白之间的相互作用，开辟了一条新的途径。
除了噬菌体以外，还有许多动物和人类的病毒、细菌、酵母和细胞被用来在其表面显示外源性的蛋白质。如葡萄球菌的蛋白A，脊髓灰质炎病毒，酵母的α因子等，用来与外源性的蛋白质组成融合蛋白，使外源性的蛋白质表达在其表面，同样可以通过筛选技术，达到基因型和表现型的统一。
本发明的优点及应用：本发明的嵌合基因的构建方法所构建的嵌合基因的表达产物，使羧基端的氨基酸先于氨基端的氨基酸，有更多的自由氨基端，有利于其与受体或配基的自由结合，和生物体内天然存在的结构相似，不受传统氨基酸序列方向的限制，有利于细胞蛋白的合成，促进构建全新的分子的研究。附图说明
图1为本发明的方法所构建的嵌合基因的结构方向图
图2为常规方法所构建的嵌合基因的结构方向图
图中：
箭头为体内蛋白质合成的方向；
1、2、椭圆为嵌合基因的第一链与第二链；
3、基因片段的羧基端；
4、7、线条为链接区；
5、基因片段的氨基端；
6、矩形为琥珀终止密码子；
8、三角形为噬菌体的pIII(VI，VII，VIII或IX)基因所编码的蛋白片段。
图1表示体内嵌合基因构建方向为：第一链的氨基端→羧基端→链接区→第二链的羧基端→氨基端→琥珀终止密码子→链接区→噬菌体的pIII(VI，VII，VIII或IX)基因所编码的蛋白片段。
图2表示传统人工方法基因的构建方向为：第一链的氨基端→羧基端→链接区→第二链的氨基端→羧基端→琥珀终止密码子→链接区→噬菌体的pIII(VI，VII，VIII或IX)基因所编码的蛋白片段。具体实施方式
下面以人的生长激素受体的胞外区域二聚体的构建为例，说明本发明的实施过程：
下面以人的生长激素受体的胞外区域二聚体的构建为例，说明本专利的实施过程：1.1人生长激素受体的细胞外域的序列为：5’ATG CAA CCA GAC CCA CCA ATC GCT TTA AAC TGG ACT TTG TTG AAC GTC TCT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17TTG ACT GGT ATT CAC GCT GAT ATC CAA GTT AGA TGG GAA GCT CCA AGA AAC 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34GCC GAC ATT CAA AAA GGC TGG ATG GTT CTA GAA TAC GAA TTG CAA TAC AAG 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51GAA GTC AAC GAA ACT AAA TGG AAG ATG ATG GAT CCA ATC TTG ACC ACT TCT 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68GTT CCA GTT TAC TCT CTT AAG GTT GAC AAG GAA TAC GAA GTT AGA GTC AGA 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85TCC AAG CAA AGA AAC TCT GGT AAC TAC GGT GAA TTT TCC GAA GTA CTG TAC 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102GTC ACC TTG CCA CAA ATG TCT CAA3’ 103 104 105 106 107 108 109 1101.2若按照本专利披露的方法制备人生长激素受体的细胞外域的二聚体，则需要获得人生长激素受体的细胞外域的如下序列，在该序列中编码羧基端的氨基酸的密码子按次序依次位于新合成的DNA片段的5’端，而位于氨基端的第2个氨基酸的密码子则位于新合成DNA片段的3’端：5’CAA TCT ATG CAA CCA TTG ACC GTC TAC CTG GTA GAA TCC TTT GAA GGT TAC 110 109 108 107 106 105 104 103 102 101 100 99 98 97 96 95 94AAC GGT TCT AAC AGA CAA AAG TCC AGA GTC AGA GTT GAA TAC GAA AAG GAC 93 92 91 90 89 88 87 86 85 84 83 82 81 80 79 78 77GTT AAG CTT TCT TAC GTT CCA GTT TCT ACT ACC TTG ATC CCA GAT ATG ATG 76 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60AAG TGG AAA ACT GAA AAC GTC GAA AAG TAC CAA TTG GAA TAC GAA CTA GTT 59 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45 44 43ATG TGG GGC AAA CAA ATT GAC GCC AAC AGA CCA GCT GAA TGG AGA GTT CAA 42 41 40 39 38 37 36 35 34 33 32 31 30 29 28 27 26ATC GAT GCT CAC ATT GGT ACT TTG TCT GTC AAC TTG TTG ACT TGG AAC TTA 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9GCT ATC CCA CCA GAC CCA CAA 3’ 8 7 6 5 4 3 21.3通过现成的分子生物学方法，通过链接区将上述序列连接起来，形成如下的序列：5’ATG CAA CCA GAC CCA CCA ATC GCT TTA AAC TGG ACT TTG TTG AAC GTC TCT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17TTG ACT GGT ATT CAC GCT GAT ATC CAA GTT AGA TGG GAA GCT CCA AGA AAC 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34GCC GAC ATT CAA AAA GGC TGG ATG GTT CTA GAA TAC GAA TTG CAA TAC AAG 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51GAA GTC AAC GAA ACT AAA TGG AAG ATG ATG GAT CCA ATC TTG ACC ACT TCT 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68GTT CCA GTT TAC TCT CTT AAG GTT GAC AAG GAA TAC GAA GTT AGA GTC AGA 70 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85TCC AAG CAA AGA AAC TCT GGT AAC TAC GGT GAA TTT TCC GAA GTA CTG TAC 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102GTC ACC TTG CCA CAA ATG TCT CAA3’ 104 104 105 106 107 108 109 110CAA TCT ATG CAA CCA TTG ACC GTC TAC CTG GTA GAA TCC TTT GAA GGT TAC 110 109 108 107 106 105 104 103 102 101 100 99 98 97 96 95 94AAC GGT TCT AAC AGA CAA AAG TCC AGA GTC AGA GTT GAA TAC GAA AAG GAC 94 92 91 90 89 88 87 86 85 84 83 82 81 80 79 78 77GTT AAG CTT TCT TAC GTT CCA GTT TCT ACT ACC TTG ATC CCA GAT ATG ATG 77 75 74 73 72 71 70 69 68 67 66 65 64 63 62 61 60AAG TGG AAA ACT GAA AAC GTC GAA AAG TAC CAA TTG GAA TAC GAA CTA GTT 60 58 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45 44 43ATG TGG GGC AAA CAA ATT GAC GCC AAC AGA CCA GCT GAA TGG AGA GTT CAA 42 41 40 39 38 37 36 35 34 33 32 31 30 29 28 27 26ATC GAT GCT CAC ATT GGT ACT TTG TCT GTC AAC TTG TTG ACT TGG AAC TTA 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9GCT ATC CCA CCA GAC CCA CAA 3’ 8 7 6 5 4 3 2(链接区为黑字体)上述1-3序列是用以下方法来实现的：1.4人生长激素受体胞外区域的克隆：1.4.1从人外周血分离淋巴细胞：
1)抽取抗凝血，每毫升加入5单位肝素，一般需要20毫升的血液。
2)用等量的磷酸缓冲液稀释外周血。
3)为了分离血中的淋巴细胞，首先在各试管中加入3毫升淋巴细
胞分离液(上海生化试剂厂)，然后在每个试管中从管壁轻轻
加入5毫升稀释后的血液。
4)置低速离心机，2500转/分钟，离心20分钟。
5)此时可见试管中不同组分的条带，从上至下分别为血浆层(黄
色)，淋巴细胞层(白色)，分离液(无色)和红细胞层(红色)，
用毛细吸管轻轻吸取淋巴细胞层，置于另一10至15毫升的离
心管中。
6)用磷酸缓冲液作等量稀释，1000转/分离心10分钟。
7)小心弃上清，照步骤6用磷酸缓冲液洗两遍。
8)用磷酸缓冲液按每10毫升血液悬1毫升的比例重选沉淀。1.4.2总细胞RNA的提取：
1)将1毫升变性的溶液D(4摩尔的异硫氢酸胍，25毫摩尔的二
水柠檬酸钠，0.5％月桂酰基肌氨酸钠(重量/体积)，0.1摩尔
的二巯基乙醇，加入沉淀的细胞中(约107细胞)，悬起沉淀，
使细胞碎片裂解。
2)加入0.1毫升2摩尔pH4.0的醋酸钠，混匀，分成两小管。
3)每管中加入0.5毫升水饱和酚，充分混匀。
4)每管加入1毫升氯仿—异戊醇溶液，混匀约10秒钟。置冰浴15
分钟，如果未形成两层，另加入0.5毫升氯仿—异戊醇溶液。
5)置摄氏4度12000转/分钟离心20分钟。
6)上层水相转移至一新鲜离心管中，加等量异丙醇，置负摄氏20
度沉淀1小时；弃上清，用75％的乙醇洗一遍。
7)室温自然干燥沉淀的RNA，重悬于50微升无RNA酶的纯水中。1.4.3 cDNA的合成
1)将上述1.4.2所获得的总RNA取44微升加入一个无RNA酶的
离心管中。加入4微升(0.5微克/微升)的人工合成的下游
引物，分成两个离心管。下游引物的序列为：5’AGA ACC ACC
ACC ACC ACC TTG AGA CAT TTG TGG CAA GGT3’(其中
黑体为链接区序列)。
2)每管置入摄氏70度水浴中10分钟。然后置冰浴中3分钟。
3)制备以下混合液：
10X PCR缓冲液 8微升
15毫摩尔/升的氯化镁 8微升
10毫摩尔/升的dNTP 4微升
100毫摩尔/升的二巯基苏硫醇 8微升
4)加14微升上述混合液到每个RNA引物混合管中，轻轻混合，
短暂离心。置室温5分钟。
5)每管加入2微升(200单位)反转录酶Superscript II RT，置摄
氏42度60分钟。
6)置摄氏70度15分钟终止反应，置冰浴中。
7)瞬时离心，加2微升RNAase H于每个反应管，摄氏37度20
分钟。1.4.4生长激素受体细胞外区域的PCR扩增：
1)先合成生长激素受体细胞外区域的上游引物，其序列为：5’GTC
CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG CAA CCA GAC
CCA CCA ATC3’(带下划线的序列为限制性内切酶SfiI的酶切位
点)。生长激素受体细胞外区域的下游引物，其序列为：5’TTG AGA CAT TTG TGG CAA
GGT3’(黑体字为链接区序列)。
2)在500微升的PCR反应管中加入：
1.4.3制得的cDNA 2微升
2微摩尔的上游引物 10微升
2微摩尔的下游引物 0.5微升
去离子水 67.5微升
置摄氏94度5分钟后，立即置于冰上，瞬时离心，在管中加入：
10X Vent DNA聚合酶缓冲液 10微升
2毫摩尔的dNTP 10微升
Vent DNA聚合酶(2单位/微升) 1.0微升
混匀后，加入2滴液体石蜡覆盖液面后，瞬时离心。
于下列条件下反应：
3)摄氏94度1分钟，摄氏55度1分钟，摄氏72度2分钟，反
应35个循环，摄氏72度延伸10分钟，置于摄氏4度。
1.5人工合成步骤1.3所列的本发明所提出的新的DNA片段。
1.5.1人工合成下列DNA片段，其中片段1，3，5，7为正链，片段2，4，6，8为反链，按1.5.2到1.6.5的方法构建。
片段1：5’CAA TCT ATG CAA CCA TTG ACC
GTC TAC CTG GTA GAA TCC TTT GAA GGT TAC AAC GGT TCT AAC AGA CAA
AAG TCC AGA GTC 3’(黑体字为链接区序列)
片段2：5’AGT AGA AAC TGG AAC GTA AGA AAG CTT AAC GTC CTT TTC
GTA TTC AAC TCT GAC TCT GGA CTT TTG TCT GTT AGA ACC GTT GTA ACC
TTC AAA GGA TTC3’
片段3：5’AGA GTT GAA TAC GAA AAG GAC GTT AAG CTT TCT TAC GTT
CCA GTT TCT ACT ACC TTG ATC CCA GAT ATG ATG AAG TGG AAA ACT GAA
AAC GTC GAA AAG TAC 3’
片段4：5’GTT GGC GTC AAT TTG TTT GCC CCA CAT AAC TAG TTC GTA TTC
CAA TTG GTA CTTTTC GAC GTT TTC AGT TTT CCA CTT CAT CAT ATC TGG
GAT CAA GGT3’
片段5：5’CAA TTG GAA TAC GAA CTA GTT ATG TGG GGC AAA CAA ATT
GAC GCC AAC AGA CCA GCT GAA TGG AGA GTT CAA ATC GAT GCT CAC ATT
GGT ACT TTG 3’
片段6：5’TTG TGG GTC TGG TGG GAT AGC TAA GTT CCA AGT CAA CAA GTT
GAC AGA CAA AGT ACC AAT GTG AGC ATC GAT TTG AAC TCT CCA TTC AGC TGG
TCT 3’
片段7：5’TCT GTC AAC TTG TTG ACT TGG AAC TTA GCT ATC CCA CCA GAC
CCA CAA 3’
片段8：片段8：5’GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGCTTG TGG GTC TGG TGG GAT AGC TAA GTT CCA AGT CAA CAA
GTT GAC AGA CAA AGT ACC AAT GTG AGC ATC GAT GTT3’
(带下划线的序列为NotI的酶切位点，黑体字为链接区序列，斜黑体字
为琥珀终止密码子。)下面为上述1-8 DNA片段以及PCR上下游引物在人工合成的DNA双链中的位置： 上 游 引 物5’GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG CAA CCA GAC CCA CCA3’CAG GAG CGT TGA CGC CGG GTC GGC CGG TAC GTT GGT CTG GGT GGTATC GCT TTA AAC TGG ACT TTG TTG AAC GTC TCT TTG ACT GGT ATTTAG CGA AAT TTG ACC TGA AAC AAC TTG CAG AGA AAC TGA CCA TAACAC GCT GAT ATC CAA GTT AGA TGG GAA GCT CCA AGA AAC GCC GAC ATTGTG CGA CTA TAG GTT CAA TCT ACC CTT CGA GGT TCT TTG CGG CTG TAACAA AAA GGC TGG ATG GTT CTA GAA TAC GAA TTG CAA TAC AAG GAA GTCGTT TTT CCG ACC TAC CAA GAT CTT ATG CTT AAC GTT ATG TTC CTT CAGAAC GAA ACT AAA TGG AAG ATG ATG GAT CCA ATC TTG ACC ACT TCTTTG CTT TGA TTT ACC TTC TAC TAC CTA GGT TAG AAC TGG TGA AGAGTT CCA GTT TAC TCT CTT AAG GTT GAC AAG GAA TAC GAA GTT AGA GTCCAA GGT CAA ATG AGA GAA TTC CAA CTG TTC CTT ATG CTT CAA TCT CAGAGA TCC AAG CAA AGA AAC TCT GGT AAC TAC GGT GAA TTT TCC GAA GTATCT AGG TTC GTT TCT TTG AGA CCA TTG ATG CCA CTT AAA AGG CTT CAT
片 段 1CTG TAC GTC ACC TTG CCA CAA ATG TCT CAAGAC ATG CAG
下 游 引 物片 段 1GTT AGA TAC GTT GGT AAC TGG CAG ATG GAC CAT
片 段 2片 段 1 片 段 3
片 段 2片 段 3GAA AAG GAC GTT AAG CTT TCT TAC GTT CCA GTT TCT ACT ACC TTG片 段 2 片段4片 段 3ATC CCA GAT ATG ATG AAG TGG AAA ACT GAA AAC GTC GAA AAG TAC片 段 4片 段 5片 段 4片 段 5片 段 6
片 段 8 片 段 5GTC AAC TTG TTG ACT TGG AAC TTA GCT ATC CCA CCA GAC CCA CAA3’CAG TTG AAC AAC TGA ACC TTG AAT CGA TAG GGT GGT CTG GGT GTT片 段 6片 段 8 片 段 8
1．5．2人工合成的DNA片段的5’端磷酸化：
制备下列反应液：合成的DNA片段1-7(0.5微克/微升)各 1微升IOXT4DNA多核苷酸激酶缓冲液 7微升10毫摩尔的ATP 7微升噬菌体T4多核苷酸激酶(10单位／微升) 2微升加水 53微升瞬时离心，置摄氏37度水浴1小时。然后，取30微升于摄氏95度变性10分钟，然后缓慢冷却到室温。
1.5.3人工合成的5’端磷酸化的DNA片段的连接：
经变性后缓慢冷却到室温的DNA片段 30微升
5X T4 DNA连接酶缓冲液 9微升
10毫摩尔的ATP 4微升
T4 DNA连接酶 4魏氏单位
加水至 45微升
将连接产物在摄氏16度反应16小时。然后于摄氏65度反应15分钟。
1.5.4人工连接的DNA片段的纯化：
向1.5.3所制得的反应液中加入4.5微升的3摩尔的pH5.2的醋酸钠，
然后在加入90微升的无水乙醇，于负摄氏20度放置16个小时。然后离
心收集沉淀，再用75％的酒精洗一遍。于室温下自然干燥。然后溶于50
微升pH8.0的10毫摩尔三羟基氨基甲烷-1毫摩尔乙二胺四乙酸缓冲
液中。
1.5.5 DNA片段1的5’磷酸化：
合成的DNA片段1(0.5微克/微升) 1微升
10XT4DNA多核苷酸激酶缓冲液 1微升
10毫摩尔的ATP 1微升
噬菌体T4多核苷酸激酶(10单位/微升) 0.5微升
加水 6.5微升
瞬时离心，置摄氏37度水浴1小时。然后于摄氏65度反应15分钟。置于摄氏4度保存。
1.5.6人工连接的纯化的DNA片段的不对称PCR扩增：
制备下列反应液：
10X Vent DNA聚合酶缓冲液 10微升
2毫摩尔的dNTP 10微升
2微摩尔5’磷酸化的DNA片段1 0.5微升
2微摩尔的DNA片段8 10微升
1.5.4所制得的DNA片段 2微升
Vent DNA聚合酶(2单位/微升) 1微升
去离子水 67.5微升
然后先于摄氏72度反应10分钟，然后摄氏94度1分钟，摄氏62度1分钟，摄氏72度2分钟，35个循环。然后再在摄氏72度反应10分钟，于摄氏4度保存。
1.6本发明所描述的嵌合基因的制备：
1.6.1.嵌合基因的PCR扩增：
制备下列反应液
10X Vent DNA聚合酶缓冲液 10微升
2毫摩尔的dNTP 10微升
步骤1.4.4制得的DNA片段 2微升
步骤1.5.6制得的DNA片段 2微升
2微摩尔的步骤1.4.4制得的上游引物 10微升
2微摩尔的步骤1.5.1制得的DNA片段8 10微升
Vent DNA聚合酶(2单位/微升) 1微升
去离子水 55微升
先于摄氏94度反应5分钟，摄氏72度反应10分钟后，再在摄氏94度1分钟，摄氏62度1分钟，摄氏72度2分钟，35个循环。然后再在摄氏72度反应10分钟，于摄氏4度保存。
1.6.2.嵌合基因的纯化：
用pH8.0的三羟基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸缓冲液配制1.5％的低熔点琼脂糖凝胶。加入1.6.1.制备的PCR产物后，在紫外灯下回收750碱基对的DNA片段。溶于100微升pH8.0的10毫摩尔三羟基氨基甲烷-1毫摩尔乙二胺四乙酸缓冲液中。
1.6.3.嵌合基因的限制性内切酶消化：
将回收的PCR产物先后用SfiI和NotI进行酶切。
SfiI酶切反应：
纯化的PCR产物(0.25-1微克) 70微升
10X酶切缓冲液 8.5微升
SfiI(10单位/微升) 5微升
去离子水 1.5微升
加入85微升的液体石蜡，于摄氏50度进行4小时酶切反应。反应完毕后，置室温平衡，瞬时离心，将管壁上的液体甩下。然后进行NotI酶切。
NotI酶切反应：于上述酶切反应液中加入
3摩尔的氯化钠 3.6微升
10X酶切缓冲液 1.5微升
NotI(10单位/微升) 6微升
去离子水 3.9微升
摄氏37度酶切反应4小时后，加入100微升酚—氯仿—异戊醇(25∶24∶1)，振荡混合1分钟，离心5分钟。移上清至新的离心管中，加入10微升的3摩尔的pH5.2的醋酸钠，然后在加入200微升的无水乙醇，于负摄氏20度放置16个小时。然后离心收集沉淀，再用75％的酒精洗一遍。于室温下自然干燥。然后溶于50微升pH8.0的10毫摩尔三羟基氨基甲烷-1毫摩尔乙二胺四乙酸缓冲液中。
1.6.4.嵌合基因与pCANTAB-5-E的连接：
酶切的嵌合基因片段(150毫微克) 5微升
10XT4DNA连接酶缓冲液 5微升
酶切的pCANTAB-5-E(250毫微克) 5微升
T4 DNA连接酶(1魏氏单位/微升) 3微升
去离子水 31微升
同时设一对照管，即仅有载体，无嵌合基因DNA片段。在摄氏16度连接1小时，置摄氏70度10分钟灭活连接酶，乙醇沉淀，最后溶于20微升pH8.0的10毫摩尔三羟基氨基甲烷-1毫摩尔乙二胺四乙酸缓冲液中。于摄氏负20度保存。
1.6.5.嵌合基因与pCANTAB-5-E连接产物的转化及表达产物的纯化见Amersham Biosciences(目录号27-9401-01和27-9402-01)的说明。