一种用微弹轰击对兰花进行基因转化的方法 【技术领域】
本发明涉及生物工程领域中进行基因转化的方法，特别是对兰花进行基因转化的方法。背景技术
随着社会经济的不断发展和人民生活水平的不断提高，花卉已成为人们生活中的一类重要商品。兰花种类繁多，花形多姿多态，色彩艳丽，即可作切花，又可作盆花，是世界花卉产业中的主要花卉品种之一，具有重要的商业价值。兰花在国外早已商品化(多为热带兰)，全世界兰花商品年销售额达30多亿美元，约占国际花卉市场的1/3。
兰花育种是兰花产业技术的制高点，也是影响该产业发展的重要因素。不断推出新品种是加速和保证该产业持续发展的重要因素。但是由于兰花生长缓慢，生活周期长，种子成熟所需时间长，发芽率极低，且成苗非常困难，因此应用传统的杂交育种方法很难获得预期的新品种。基因转化技术是一种非常有效、快速的获得新品种地方法。目前，应用基因工程方法得到的许多农作物已进入大规模商品化生产，如抗棉铃虫的基因工程棉花、抗虫玉米和抗除草剂的大豆在美国和加拿大已分别占种植面积的40％、30％和60％。花卉基因工程育种已经开始，并逐渐成为该领域的一个研究热点。本发明的发明人已将花色相关基因CHS转入矮牵牛中，得到了花色改变的转基因矮牵牛新品种。
基因工程育种与常规育种相比有着省时省力和目标性强的优点。利用转基因技术来改善兰花品质，获得抗病、抗逆、提前开花、花色、花型改变的兰花新品种将具有巨大的商业优势和广阔的市场前景。所以利用现代基因工程技术提高兰花品质显得很有必要。但是，目前在兰花转化上进展较为缓慢，国际上只在6个属的兰花转化上有过报道。Kuehnle和Sugii(1992)应用微弹轰击法将卡那霉素抗性基因(NPTII)和番木瓜环斑病毒(PRV)外壳蛋白基因转入石斛兰杂交种(Dendrobium x JaquelynThomas)得到了转基因兰花，但转化效率不高，而且由于兰花对卡那霉素不敏感，不能有效抑制未转入基因的植株，易产生嵌合体。Chia等(1994)通过微弹轰击法将萤火虫荧光素酶基因(Luc)转入石斛兰(White Angel)，并利用Luc基因作为筛选标记，得到了转基因植株。但此法所需设备昂贵，且费时费力。Anzai等(1996)利用微弹轰击法成功转化了蝴蝶兰，但转化率和再生率都较低。Yang等(1999)利用微弹轰击法将NPTII基因和GUS基因转入兰属兰花(Cymbidium orchid)，得到了转基因植株。Yu等(2000)应用微弹轰击法转化石斛兰杂交种，用潮霉素抗性基因(HPT)作筛选标记，得到了转基因兰花，转化效率有所提高，约为5-10％。Knapp等(2000)应用基因枪法对三个属的兰花进行了转化：卡特兰属(Cattleya)；长萼兰属(Brassia)和一个杂交属Doritaenopsis(Doritis x Phalaenopsis)，利用除草剂抗性基因(bar)作为筛选标记，得到了转基因植株。Belarmino和Mii(2000)应用农杆菌介导的转化方法成功转化了蝴蝶兰(Doritaenopsis Coral x FantasyPhalaenopsis(Baby Hat x Ann Jessica))。他们将含有GUS基因和潮霉素抗性基因(HPT)的农杆菌LBA4404和EHA105与蝴蝶兰悬浮细胞共培养后，用50mg/L潮霉素筛选，7个月后得到了转基因植株，但转化效率较低。
目前所进行的兰花转化，效率都不是很高，采用的方法大多是微弹轰击法，受体材料多用原球茎(protocome)或类原球茎体(protocome like body，PLB)，由于从原球茎能直接出苗，不经过愈伤或从头开始的胚胎发生阶段，因而不能有效去除未转化的细胞，易产生嵌合体。而唯一采用农杆菌介导的转化方法的报道，受体材料又采用的是悬浮细胞，利用悬浮细胞作为受体材料，虽然可以避免产生嵌合体，但操作烦琐。发明内容
本发明的目的是提供一种高效、稳定、简便的应用微弹轰击对兰花进行基因转化的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种用微弹轰击法对兰花进行基因转化的方法，是用携带外源基因片段的质粒载体与金粉混合制成的子弹，对兰花愈伤组织进行轰击，将供体的外源基因片段转移到受体基因组中。
为了提高转化效率，将所述兰花愈伤组织在高渗培养基上预处理后再进行轰击。所述高渗培养基优选的为含0.4M甘露醇的高渗培养基，预处理时间为1小时。
制作子弹的金粉直径以1μm为宜。轰击采用BIO-RAD公司的PDS-1000/He基因枪，在1100psi的压力下进行，子弹飞行距离为5.5-6.5厘米，真空度为24-28毫米汞柱是较佳的轰击条件。轰击后，恢复培养2-4天后转入筛选培养基，所述筛选培养基中含有30mg/L潮霉素。得到的抗性愈伤组织转接入分化培养基，诱导出苗和生根，得到转基因兰花植株。
本发明巧妙地以兰花愈伤组织为受体材料，通过微弹轰击实现兰花的遗传转化，即避免了嵌合体的产生，又易于操作，转化效率达14％以上。本发明进行兰花基因转化的方法，适用于不同品种的兰花，使兰花基因工程育种成为可能，进而获得抗病、抗逆、稀有花色、多花大花、花期提前或延长的花卉，实现兰花育种及生产的产业化。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。附图说明
图1为质粒pCAMBIA1301结构示意图
图2为转基因植株PCR鉴定结果
图3为转基因兰花的southern杂交结果。具体实施方式
实施例1、用本发明的方法对兰花进行基因转化
本实施例中，以兰花Dendrobium phalaenopsis的愈伤组织为受体材料；以质粒pCAMBIA1301(其结构图谱如图1所示)为基因供体材料，该质粒含葡糖苷酸酶基因(GUS)和潮霉素抗性基因(HPT)。其中GUS基因为报告基因，可在底物存在下使转基因植物产生显色反应，HPT基因为选择标记基因，它赋予植物对潮霉素的抗性。
具体操作步骤如下：
1、将质粒与直径为1μm的金粉混合制成子弹；
2、将兰花愈伤组织在含0.4M甘露醇的高渗培养基上预处理1小时；
3、用制得的子弹轰击愈伤组织，轰击的条件为：采用BIO-RAD公司的PDS-1000/He基因枪，在1100psi的压力下进行轰击，子弹飞行距离为6厘米，真空度为25毫米汞柱；
4、轰击后马上转入普通的1/2MS培养基中恢复培养；
5、恢复培养3天后转入含30mg/L潮霉素的筛选培养基，经过两个月的筛选，得到抗性愈伤组织；
6、将抗性愈伤组织转接入分化培养基，诱导出苗和生根。
按上述转化方法，对供试材料进行了遗传转化处理。共转化43块愈伤组织，筛选得到6块抗性愈伤组织，其中有5块抗性愈伤组织正常分化成苗。转化效率约为14％。组织染色法检测GUS活性，4株有GUS活性。
实施例2、转基因植株的PCR检测
应用CTAB法提取总DNA，利用HPT基因引物进行PCR检测。根据HPT基因的核苷酸序列设计引物，两引物间的基因片段大小约为800bp。引物合成由上海博亚公司完成。PCR反应程序为：94℃，4分钟；94℃，50秒；50℃，50秒；72℃，1分钟，扩增30个循环，然后72℃延伸10分钟。结果如图2所示，图中，M，DNA分子量标准(λDNA/HindIII+EcoR I)；1-6，转基因植株；7，负对照；8，正对照pCAMBIA1301。从图中可以看出，转基因植株均扩增出一条800bp的特异条带，证明有外源基因转入。
实施例3、Southern杂交检测
随机取三株转基因植株进行southern检测。
应用CTAB法提取总DNA，基因组DNA用限制性内切酶HindIII酶切，用地高辛标记的GUS基因做探针，用德国宝灵曼公司的Dig DNA Labeling and Detection Kit进行杂交，杂交温度68℃。结果如图3所示，图中，1.λHindIII分子量标准；2.质粒正对照；3.未转基因的负对照；4、6.GUS组织染色阳性的转基因系；5.GUS组织染色阴性的转基因系，图中显示，三株转基因植株均杂出特异的条带，而未转基因的负对照则没有杂交信号。证实外源基因的确已经导入到受体材料中。