在转基因动物中产生人源化抗体 【发明领域】
本发明涉及由转基因非人动物产生的人源化抗体。对非人动物进行基因工程化，以获得含一种或多种人源化免疫球蛋白基因座，该基因座能够在转基因非人动物中进行基因重排和基因转变，以产生各种人源化免疫球蛋白。本发明进一步涉及一种新颖的序列、重组载体和用于产生这些转基因动物的转基因载体。本发明的人源化抗体对人具有最小的免疫原性，适用于人类主体的治疗性处理。发明背景
由细菌、真菌、病毒和寄生虫导致的感染性疾病的治疗很大程度基于化疗。然而，抗药生物的出现要求不断开发新的抗生素。患有恶性疾病和癌症的患者的治疗也基于化疗。然而，这些治疗中的许多是无效的，并且患者的死亡率高。对于感染性疾病和癌症，需要改进和创新的治疗。抗移植器官排斥的甾体类治疗需要使用生物试剂(单克隆或多克隆抗体制剂)，该生物试剂在移植受体中逆转正在进行的同种异体免疫应答。从动物获得的免疫制剂地主要问题是人类患者中非人免疫球蛋白的免疫原性。为了减少非人免疫球蛋白的免疫原性，提出了在动物中对各个抗体基因进行基因工程化。具体地，已经证明通过融合动物可变(V)区外显子和人恒定(C)区外显子，可以获得嵌合抗体基因。然而，该方法只能去除由非人Fc区导致的免疫原性，而其余的非人Fab序列仍然可以是免疫原性的。在另一种方法中，将重链和轻链免疫球蛋白的人免疫球蛋白基因导入了小鼠基因组。尽管该基因工程方法导致在工程化的小鼠中表达人免疫球蛋白多肽，人免疫球蛋白的表达水平很低。这可能是由于免疫球蛋白的有效表达所必须的免疫球蛋白基因座中的物种特异性调节元件。如在被转染细胞系中所证明的，人免疫球蛋白基因中存在的条件元件在非人动物中可能不能正常起作用。
已经描述了免疫球蛋白基因中的一些条件元件。特别重要的是重链恒定区下游(3′)的增强子和轻链基因中的内含子增强子。此外，其它有待于鉴定的控制元件可能存在于免疫球蛋白基因中。在小鼠中的研究表明，免疫球蛋白分子的膜形式的膜和细胞质尾在对人Cγ1基因为杂合的小鼠血清中的人-小鼠嵌合抗体的表达水平中起重要作用。因此，对于动物中异源免疫球蛋白基因的表达，需要用通常存在于动物中相同位置的序列替代含增强子元件和编码跨膜区的外显子(M1外显子)和编码细胞质尾的外显子(M2外显子)的序列。
将人免疫球蛋白基因导入小鼠基因组导致各种人抗体所有组成成分在基因工程化小鼠中的表达。在小鼠和人中，通过基因重排产生抗体多样性。该过程导致编码许多具有不同抗原结合位点的抗体分子的许多不同重组V(D)J片段的产生。然而，在其它动物，如兔、猪、牛和鸟中，通过称作基因转变的很大程度不同的机制产生抗体多样性。例如，已经确切证明，在兔和鸡中，VDJ重排非常有限(产生的大约90％的免疫球蛋白具有3’近端VH1元件)，抗体多样性由基因转变和超变产生。相反，小鼠和人即使有基因转变，也非常少见。因此，预计在通过基因转变产生抗体多样性的动物中，基于基因重排的基因工程方法将产生具有低抗体滴度和有限的抗体多样性的动物。因此，用于产生用于人类治疗的非免疫原性抗体制剂的大动物的基因工程需要其它的基因工程策略。相关文献
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参与猪、羊和牛中抗体所有组成成分的多样化的机制综述于Butler，J.E.(1998)，″Immunoglobulin diversity，Bcell and antibodyrepertoire development in large farm animals″，Rev Sci Tech 17：43。羊中的抗体多样化描述于Reynaud，C.A.，C.Garcia，W.R.Hein，andJ.C.Weill(1995)，″Hypermutation generating the sheepimmunoglobulin repertoire is an antigen-independent process″，Cell80：115；和Dufour，V.，S.Malinge，and F.Nau.(1996)，″The sheep IgVariable region repertoire consists of a single VH family″，JImmunol 156：2163。发明概述
本发明的一种实施方案提供了具有人免疫球蛋白多肽序列的至少一部分的人源化抗体(人源化免疫球蛋白)。
本发明的人源化抗体是由经遗传工程化而含有一种或多种人源化Ig基因座的转基因非人动物产生的。
本发明的人源化抗体优选从主要通过基因转变和超变产生抗体多样性的转基因非人动物，如兔、猪、鸡、羊、牛和马制备。这些抗体可以通过用需要的抗原，如感染剂(如细菌或病毒)或其部分或片段免疫转基因动物而制备。
与从非人动物制备的非人源化抗体相比，这些人源化抗体对灵长类动物，特别是人的免疫原性减少。因此，本发明的人源化抗体适用于人类主体的治疗性处理。
本发明的另一种实施方案提供了人源化抗体的制剂，该抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。本发明的优选抗体是多克隆抗体制剂，根据本发明，它对灵长类动物，特别是人具有最小的免疫原性。
优选的多克隆抗体制剂由人源化的免疫球蛋白分子组成，该分子具有至少一种由人恒定区基因片段编码的重链或轻链恒定区多肽序列。更优选地，免疫球蛋白分子的重链或轻链可变区也是由人基因片段编码。
在另一种实施方案中，本发明提供了包含人源化抗体制剂和可药用载体的药物组合物。
本发明的另一种实施方案提供了来自非人动物，优选主要依赖基因转变产生抗体多样性的动物的Ig基因片段的5′和3′侧翼区的新序列。具体地，本发明提供了编码鸡Cλ、兔Cγ和Cκ、牛Cγ1，2，3和绵羊Cγ1，2的基因下游(3′，3-端)的新核苷酸序列和兔Cγ5′的新序列。
在另一种实施方案中，本发明提供了用于用相应的人Ig基因片段替代非人动物Ig基因片段的重组载体。这些载体包含在5′端和3′端与侧翼序列连接的人Ig基因片段，其中侧翼序列与靶动物Ig基因片段的侧翼序列同源。
优选的重组载体是用于替代动物Ig恒定区的那些。例如，提供了用于替代兔重链恒定区基因的重组载体。优选的载体从5′至3′含有SEQ IDNO：12或SEQ ID NO：13所示核苷酸序列，或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的一部分，人重链恒定区基因片段，SEQ ID NO：10所示核苷酸序列或SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的一部分。另一种优选的载体含有SEQID NO：51所示核苷酸序列，该序列的特征在于具有与来自于兔重链恒定区基因的5′和3′侧翼区的侧翼序列连接的人Cγ1基因。
也提供了用于替代兔轻链恒定区基因的重组载体。一种优选的载体含有SEQ ID NO：53所示的核苷酸序列，该序列的特征在于具有与来自于兔轻链Cκ1基因基因的5′和3′侧翼区的侧翼序列连接的人Cκ。
提供了其它用于替代鸡轻链恒定区基因的重组载体。一种优选的载体含有SEQ ID NO：57所示的核苷酸序列，其特征在于具有与来自于鸡轻链Cλ基因基因的5′和3′侧翼区的侧翼序列连接的人Cλ2。
提供的其它重组载体包括用于替代动物Ig V区元件的那些。例如，提供了一种用于替代兔重链V区元件的重组载体，该载体含有SEQ ID NO：52。提供了一种用于替代兔轻链V区元件的重组载体，该载体含有SEQ IDNO：54。
在另一种实施方案中，本发明提供了转基因构建体或载体，所述转基因构建体或载体含有至少一种人源化Ig基因座，即来源于非人动物的Ig基因座或来源于非人动物Ig基因座的一部分，其中该基因座或基因座的部分经基因修饰而含有至少一种人Ig基因片段。这些人源化的Ig基因座具有在非人动物中进行基因重排和基因转变的能力，从而产生多样的人源化免疫球蛋白所有组成成分。
本发明提供的一种人源化Ig基因座是含有一个或多个V基因片段、一个或多个D基因片段、一个或多个J基因片段、以及一个或多个恒定区基因片段的人源化重链基因座，其中至少一个基因片段是人重链基因片段。人源化重链基因座中的基因片段以未重排、部分或完全重排的构型彼此并列。优选的人源化重链基因座含有人恒定区基因片段，优选含Cα或Cγ。更优选的人源化基因座含有多个V基因片段和至少一个人V基因片段，以及一个人重链恒定区片段。人V基因片段位于非人V基因片段下游。
另一种人源化Ig基因座是含有一个或多个V基因片段、一个或多个J基因片段、以及一个或多个恒定区基因片段的人源化轻链基因座，其中至少一个基因片段是人轻链基因片段。人源化轻链基因座中的基因片段以未重排或重排的构型彼此并列。优选的人源化轻链基因座含有人恒定区基因片段，优选含Cλ或Cκ。更优选的人源化轻链基因座进一步含有多个V基因片段和至少一个人V基因片段。人V基因片段位于非人V基因片段下游。甚至更优选的人源化轻链基因座含重排的人VJ片段，置于许多(如10-100)非人或人来源的VL基因片段下游。
本发明的另一种实施方案涉及通过从非人动物分离Ig基因座或Ig基因座的一部分，并且将需要的人Ig基因片段整合至分离的动物Ig基因座或Ig基因座的分离部分而制备含人源化Ig基因座的转基因载体的方法。通过以保持基因座在非人动物中进行有效基因重排和基因转变的方式进行连接或同源重组，将人Ig基因片段整合至分离的动物Ig基因座或Ig基因座的分离部分。通过同源重组进行的人Ig基因片段的整合可以通过使用本发明的重组载体而完成。
在另一种实施方案中，本发明提供了制备能够产生人源化抗体的转基因动物的方法。该转基因动物可以通过将含人源化Ig基因座的转基因载体或含人Ig基因片段的重组载体导入受体细胞或动物细胞，并且从基因修饰的受体细胞或细胞得到动物而获得。
提供了含一种或多种人源化Ig基因座的转基因动物和来源于所述转基因动物的细胞(例如来自于免疫的转基因动物的B细胞)。本发明的转基因动物可以对转基因的人源化Ig基因座进行基因重排和基因转变，以产生多样的人源化免疫球蛋白分子所有组成成分。附图简述
图1.牛Cγ3′侧翼序列。引物表示于有阴影的块中。5′引物位于CH3，3′引物位于M1。克隆11、克隆3和克隆5的序列分别表示于SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5。
图2.绵羊Cγ3′侧翼序列。引物表示于有阴影的块中。5′引物位于CH3，3′引物位于M2。克隆11和克隆1的序列分别表示于SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9。
图3.兔Cγ基因的新的3′端侧翼序列(SEQ ID NO：10)。
图4.兔Cκ1基因3′的新核苷酸序列(SEQ ID NO：11)。
图5.兔Cγ基因5′的新核苷酸序列(SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13)。SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13之间的序列(大约1000 nt的空位)有待确定。
图6.人、小鼠、大鼠、绵羊、牛和骆驼Cγ基因3′的M1和M2区的序列比较。
图7a.用于以人Cκ替代兔Cκ的DNA构建体。一个含编码人Cκ的DNA序列的0.5kb片段侧翼为来自于兔Cκ1基因的序列。上游序列(5′Cκ)为2.8kb，下游序列(3′Cκ)为2.6kb。该载体也含有用于阳性选择的lox-neo盒和用于阴性选择的Hsv-Tk盒。
图7b.用于以人Cγ1替代兔Cγ的DNA构建体。一个含编码人Cγ1的DNA序列的1.8kb片段侧翼为来自于兔Cγ基因的序列。上游序列(5′Cγ)为1.9kb，下游序列(3′Cγ)为3.1kb。该载体也含有用于阳性选择的lox-neo盒和用于阴性选择的Hsv-Tk盒。
图8.含有人免疫球蛋白重链Cγ1基因片段的DNA片段(SEQ ID NO：51)，其侧翼为50个来源于兔Cγ基因侧翼区的核苷酸。来源于兔Cγ基因侧翼区的侧翼序列用下划线标出。
图9.含有与兔V元件具有大于80％序列等同性并且编码人V元件多肽序列的V基因片段的DNA片段(SEQ ID NO：52)。来源于兔VH1和J基因的侧翼区的侧翼序列用下划线标出。
图10.含有人免疫球蛋白重链Cκ基因片段的DNA片段(SEQ ID NO：53)，其侧翼为50个来源于兔轻链免疫球蛋白κ1基因的核苷酸。来源于兔Cκ基因侧翼区的侧翼序列用下划线标出。
图11.含有与兔V元件具有大于80％序列等同性并且编码人V元件多肽序列的V基因片段的DNA片段(SEQ ID NO：54)。来源于兔V和J基因的侧翼区的侧翼序列用下划线标出。
图12.含有编码人免疫球蛋白轻链恒定区Cλ2的基因的DNA片段(SEQID NO：57)，其侧翼为50个(用下划线标出)来源于鸡Cλ基因侧翼序列的核苷酸。
图13.用ET系统修饰鸡轻链基因座。通过同源重组修饰具有全长轻链基因座的鸡基因组BAC克隆。在第一步中，通过插入选择盒而去除Cλ，在第二个同源重组步骤中，该盒与人Cλ基因交换。
图14.含有与鸡V基因片段具有80％序列等同性并且编码人VJ免疫球蛋白多肽多肽的VJ基因片段的DNA片段(SEQ ID NO：58)。来源于鸡免疫球蛋白V和J基因的侧翼区的侧翼序列用下划线标出。
图15.修饰的鸡轻链基因座。发明详述
本发明的一个实施方案提供了人源化的免疫球蛋白(抗体)。
“人源化抗体”或“人源化免疫球蛋白”表示具有人免疫球蛋白多肽序列(或由人Ig基因片段编码的多肽序列)的至少一部分的免疫球蛋白分子。本发明的人源化免疫球蛋白分子可以从经基因工程化而产生人源化免疫球蛋白分子的转基因非人动物分离。相对于从动物制备或从来源于动物的细胞制备的非人源化免疫球蛋白，这些人源化免疫球蛋白分子对灵长类动物，特别是人的免疫原性较低。
此处用到的“非人动物”包括，但不限于，兔、猪、鸟类(如鸡、火鸡、鸭、鹅等)、绵羊、山羊、牛和马。优选的非人动物是主要依赖于基因转变和/或体细胞超变而产生抗体多样性的动物，如兔、猪、鸟类(如鸡、火鸡、鸭、鹅等)、绵羊、山羊、和牛。特别优选的非人动物是兔和鸡。
在人和小鼠等动物中，在重链基因座上有多个拷贝的V，D和J基因片段，在轻链基因座上有多个拷贝的V和J基因片段。这些动物中的抗体多样性主要由基因重排产生，即由基因片段的不同组合形成重排的重链可变区和轻链可变区。然而，在其它动物(如兔、鸡、绵羊、山羊和牛)中，基因重排在抗体多样性的产生中不起显著作用。例如，在兔中，仅有很少的V基因片段，最常见是V区3′末端的V基因片段，用于基因重排以形成连续的VDJ片段。在鸡中，只有一个V基因片段(邻接于D区，或“3′近端V基因片段″)，一个D片段和一个J片段用于重链重排；只有一个V基因片段(3′近端V片段)和一个J片段用于轻链重排。因此，在这些动物中，在连接多样化得到的最初重排的可变区序列中几乎没有多样化。重排的Ig基因的进一步多样化通过基因转变而完成，基因转变是一种过程，其中来源于上游V基因片段的短序列替代了重排Ig基因中V基因片段内的短序列。
此处用到的“Ig基因片段”是指编码Ig分子各部分的DNA的片段，这些片段存在于动物和人的种系中，并且一起进入B细胞以形成重排的Ig基因。因此，此处用到的Ig基因片段包括V基因片段、D基因片段、J基因片段和C区基因片段。
此处用到的“人Ig基因片段”包括人Ig基因片段的天然存在序列、人Ig基因片段的天然存在序列的简并形式，以及编码与人Ig基因片段的天然存在序列所编码的多肽基本等同的多肽序列的合成序列。“基本”表示氨基酸序列的等同性程度为至少约85％-95％。
本发明的优选人源化免疫球蛋白分子含有人重链或轻链恒定区多肽序列的至少一部分。更优选的免疫球蛋白分子含有人重链或轻链恒定区多肽序列的至少一部分，和人可变区多肽序列的至少一部分。
在本发明的另一种实施方案中，提供了一种人源化抗体的制剂。
“人源化抗体制剂”表示从转基因非人动物(如动物血清、乳汁或卵黄)制备或从来源于转基因非人动物的细胞(如B细胞或杂交瘤细胞)制备的一种分离的抗体产品或纯化的抗体产品。
人源化抗体制剂可以是多克隆抗体制剂，该多克隆抗体包括人源化免疫球蛋白分子的所有组成成分(repertoire)。人源化抗体制剂也可以是单克隆抗体制剂。
尽管与非人源化单克隆抗体制剂相比，人源化单克隆抗体制剂对人的免疫原性也减少，但人源化的多克隆抗体制剂是本发明的优选实施方案。已经认识到，当以大量重复给药时，人源化的单克隆抗体在灵长类动物(如人)中仍然激发一定程度的免疫应答(抗独特型应答)，这是因为单克隆抗体的独特的和新的独特型。本发明独一无二地认识到，多克隆抗体的总体免疫原性较少依赖于抗独特型应答。例如，由非人动物制备的只有恒定区元件被人源化的多克隆抗体(例如，具有由人基因片段编码的恒定区，以及具有由非人动物的内源性基因编码的可变区的多克隆抗体)对灵长类动物基本无免疫原性。
不希望受到任何理论的限制，本发明人提出，这种人源化多克隆抗体制剂的免疫原性降低是由于该制剂含有极大量具有许多不同独特型的不同抗体，所述独特型很大程度由重链和轻链互补决定区(CDR)中的新氨基酸序列所限定。因此，当将这种制剂给予人等灵长类动物时，制剂中每种单个免疫球蛋白分子的给药量可能太低，因此不能针对每种免疫球蛋白分子引起免疫应答。因此，即使多克隆抗体制剂中的抗体都针对同一抗原，具有多种不同独特型和可变区的人源化多克隆抗体制剂对接受者具有最小的免疫原性。为进一步减少任何潜在的残余免疫原性，可以制备由具有人Ig基因片段所编码的可变区和恒定区这两者的免疫球蛋白分子组成的人源化多克隆抗体制剂。
在一种优选实施方案中，本发明提供了包含具有人重链或轻链恒定区多肽序列的至少一部分的人源化免疫球蛋白分子的抗体制剂。更优选地，除人恒定区多肽序列的至少一部分，本发明的抗体制剂中的人源化免疫球蛋白进一步包含人可变区多肽序列的至少一部分。
本发明的优选人源化抗体制剂由从转基因非人动物制备的人源化抗体组成，该动物的抗体多样性主要由基因转变产生，该动物如兔、鸟类(如鸡、火鸡、鸭、鹅等)、绵羊和牛；优选为兔和鸡。
一旦制备了能够产生多样化的人源化免疫球蛋白分子的转基因非人动物(如下文所进一步阐述)，通过用抗原免疫该动物就可以容易获得抗该抗原的人源化免疫球蛋白和人源化抗体制剂。可以用各种抗原免疫转基因宿主动物。这些抗原包括，存活的、减毒的或死亡的微生物，如病毒和单细胞生物(如细菌和真菌)，微生物片段或从微生物分离的抗原性分子。
用于免疫动物的优选细菌抗原包括从金黄色葡萄球菌纯化的抗原，如5型和8型荚膜多糖、α毒素等毒性因子的重组形式、粘附素结合蛋白、胶原结合蛋白、和纤连蛋白结合蛋白。优选的细菌抗原也包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、肠球菌、肠杆菌和肺炎克雷白氏杆菌的减毒形式，或这些细菌细胞的培养物上清液。可以用于免疫的其它细菌抗原包括纯化的脂多糖(LPS)、荚膜抗原、荚膜多糖和/或外膜蛋白的重组形式、纤连蛋白结合蛋白、内毒素和铜绿假单孢菌、肠球菌、肠杆菌和肺炎克雷白氏杆菌的外毒素。
用于产生抗真菌的抗体的优选抗原包括真菌的减毒形式或其外膜蛋白，该真菌包括，但不限于，白色假丝酵母，近平滑假丝酵母，热带假丝酵母，和新型隐球酵母。
用于免疫以产生抗病毒抗体的优选抗原包括病毒的被膜蛋白和病毒的减毒形式，所述病毒包括，但不限于呼吸道合胞病毒(RSV)(特别是F蛋白)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、巨细胞病毒(CMV)、EBV和HSV。
可以通过用分离的肿瘤细胞或肿瘤细胞系；肿瘤相关抗原免疫转基因动物，产生用于癌症治疗的治疗性抗体，所述肿瘤相关抗原包括，但不限于，Her-2-neu抗原(抗该抗原的抗体可用于治疗乳腺癌)；CD20，CD22和CD53抗原(抗这些抗原的抗体可用于治疗B细胞淋巴瘤)，(3)前列腺特异性膜抗原(PMSA)(抗该抗原的抗体可用于治疗前列腺癌)，和17-1A分子(抗该抗原的抗体可用于治疗结肠癌)。
可以采用任意方便的反式将这些抗原可以给予转基因宿主动物，可以使用或不使用佐剂，并且可以根据预定的方式给药。
免疫后，可以对被免疫的转基因动物的血清或乳汁进行分级分离，以便纯化特异于抗原的药物级多克隆抗体。在转基因鸟类中，可以通过对鸟卵进行分级分离而制备抗体。可以通过层析(亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等)，用硫酸铝等盐、乙醇等有机溶剂或聚乙二醇等聚合物进行选择性沉淀而获得浓缩的、纯化的免疫球蛋白级分。
为制备单克隆抗体，从被免疫的转基因动物分离脾细胞，用于与转化的细胞系融合产生杂交瘤，或通过标准分子生物学技术克隆编码抗体的cDNA并且在转化的细胞中表达。制备单克隆抗体的程序是本领域公知的。见，例如欧洲专利申请0 583 980 A1(″Method For GeneratingMonoclonal Antibodies From Rabbits″)，美国专利No.4,977,081(″Stable Rabbit-Mouse Hybridomas And Secretion ProductsThereof″)，WO97/16537(″Stable Chicken B-cell Line And Method ofUse Thereof″)，和EP 0 491 057 B1(″Hybridoma Which Produces AvianSpecific Immunoglobulin G″)，在此引入其公开内容作为参考。从克隆的cDNA分子体外产生单克隆抗体的方法描述于Andris-Widhopf etal.，″Methods for the generation of chicken monoclonal antibodyfragments by phage display″，Immunol Methods 242：159(2000)，和Burton，D.R.，″Phage display″，Immunotechnology 1：87(1995)，在此引入其公开内容作为参考。
在本发明的另一种实施方案中，纯化的单克隆或多克隆抗体与适用于在灵长类动物特别是人中给药的适当药用载体混合，以便提供药物组合物。可以用于该药物组合物中的可药用载体可以任意和所有的溶剂、分散介质、等渗剂等。除了对受体或其中所含有的抗体的疗效有害的任何常规介质、试剂、稀释剂或载体外，其在本发明的药物组合物中的使用是适当的。载体可以是液体、半固体，如糊，或固体载体。载体的例子包括油、水、盐溶液、乙醇、糖、凝胶、脂质、脂质体、树脂、多孔基质、粘合剂、填料、包衣、防腐剂等，或其组合。
本发明进一步涉及新的核苷酸序列和载体，以及该序列和载体在制备产生人源化免疫球蛋白的转基因非人动物中的用途。
简言之，非人动物的基因工程包括将一个或多个人Ig基因片段整合至动物基因组，以产生一个或多个人源化Ig基因座。应该理解的是，根据基因修饰中所使用的方法，人Ig基因片段可以被整合在动物的内源性Ig基因座(例如作为定向插入的结果)，或整合在动物的不同基因座。也就是说，人源化Ig基因座可以位于动物内源性Ig基因座通常所在的染色体位置，或位于动物内源性Ig基因座通常所在位置以外的染色体位置。不论在染色体上的什么位置，本发明的人源化Ig基因座具有在非人动物中进行基因重排和基因转变的能力，从而能够产生多样化的人源化免疫球蛋白分子所有组成成分。具有进行基因重排和基因转变的能力的Ig基因座此处也称作“功能性”Ig基因座，由功能性Ig基因座产生的具有多样性的抗体此处也称作“功能性”抗体或“功能性”抗体所有组成成分。
在一种实施方案中，本发明提供了用于产生人源化Ig基因座和制备能够产生人源化免疫球蛋白分子的转基因动物的新序列。具体地，本发明提供了来自于非人动物，优选主要依赖于基因转变而产生抗体多样性的动物(如兔、猪、绵羊、山羊、牛、鸟类，如鸡、火鸡、鸭、鹅等)的Ig基因片段5′和3′侧翼区的序列。
编码恒定区的基因的5′和3′侧翼区是特别重要的，因为这些序列含有的非翻译调节元件(如增强子)对于血清中高Ig表达是关键的。编码重链恒定区的基因的3′侧翼区也含有编码免疫球蛋白膜形式的膜和细胞质尾的外显子(Volgina et al.Immunol 165：6400，2000)。已经证明抗体膜形式的膜和细胞质尾对获得抗体在小鼠血清中的高水平表达是关键的(Zou et al.，Science 262：1271，1993)。因此，对侧翼序列的鉴定允许了用人的等价物替代Cγ基因的外显子和间插内含子，以及保持编码跨膜和细胞质尾区的内源性外显子和内源性非编码增强子序列。
在一种实施方案中，本发明提供了非人动物重链恒定区的3′侧翼序列。更具体地，提供了编码兔Cγ、牛Cγ1，2，3和绵羊Cγ1，2的基因下游(3′，3-端(prime))的核苷酸序列。特别优选的核苷酸序列包括SEQID NO：10(兔Cγ的3′)，SEQ ID NOS：3-5(牛Cγ1，2，3的3′)和SEQ IDNOS：8-9(绵羊Cγ1，2的3′)。
在另一种实施方案中，本发明提供了非人动物轻链恒定区的3′侧翼序列。更具体地，本发明提供了编码兔Cκ的基因下游(3′，3-端)的核苷酸序列。特别优选的核苷酸序列包括SEQ ID NO：11(兔Cκ的3′)。
在一种实施方案中，本发明提供了非人动物重链恒定区的5′侧翼序列。更具体地，提供了编码兔Cγ的基因上游(5′，5-端)的核苷酸序列。特别优选的序列包括SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13。
本发明的另一种实施方案非人动物轻链恒定区的5′侧翼序列。
本发明提供了上述新的侧翼序列的部分。“一部分”表示能够介导人Ig基因片段和靶动物Ig基因片段之间的同源重组的侧翼核苷酸序列的一个片段。一般地，对于在ES细胞或成纤维细胞中的重组，一部分是至少约200个碱基对，优选至少约400个碱基对，对于在大肠杆菌中的重组，一部分是至少约40个碱基对，优选至少约50个碱基对。上述新的侧翼序列的部分的例子包括SEQ ID NOS：59-60，61-62，63-64，65-66，67-68和69-70(分别由图8-12和14中加下划线的序列表示)。
另一方面，本发明提供了用于以相应的人Ig基因片段替代非人动物Ig基因片段的载体。这些载体此处也称作“重组载体”，包括与5′端和3′端的侧翼序列连接的人Ig基因片段，其中侧翼序列与靶动物Ig基因片段的侧翼序列有足够介导人基因和动物基因片段之间的同源重组的同源性程度。一般地，为完成ES细胞和成纤维细胞等动物细胞中的同源重组，重组载体中的侧翼序列和靶基因的侧翼序列之间应该有至少约200个碱基相同；为完成大肠杆菌中的同源重组，应该有至少约40个碱基相同。
提供了用于替代动物免疫球蛋白重链恒定区基因的重组载体，该载体从5′至3′含有靶动物重链恒定区基因5′侧翼区的同源核苷酸序列，人重链恒定区基因(如人Cγ10)，以及靶动物重链恒定区基因3′侧翼区的同源核苷酸序列。
提供了用于替代兔重链恒定区基因的优选重组载体。一种这样的载体从5′至3′含有SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示核苷酸序列或其一部分，人重链恒定区基因片段，SEQ ID NO：10所示核苷酸序列或SEQ IDNO：10所示核苷酸的一部分。另一种这样的载体含有SEQ ID NO：51(兔8)，其特征在于具有与来自于兔重链恒定区基因5′和3′侧翼区的侧翼序列连接的人Cγ基因。
也提供了用于替代动物免疫球蛋白轻链恒定区基因的重组载体。该载体从5′至3′含有靶轻链恒定区基因5′侧翼区的同源核苷酸序列，人轻链恒定区基因(如人Cκ或Cλ)，以及靶轻链恒定区基因3′侧翼区的同源核苷酸序列。
优选的载体包括用于替代兔轻链恒定区基因的载体。优选的载体含有SEQ ID NO：53所示核苷酸序列，该序列的特征在于具有与来自于兔轻链Cκ1基因5′和3′侧翼区的侧翼序列连接的人Cκ基因。
提供的其它重组载体包括那些用于替代动物Ig V区元件的载体。例如，提供了用于替代兔重链V区元件的重组载体，该载体含有SEQ ID NO：52。提供了用于替代兔轻链V区元件的重组载体，该载体含有SEQ ID NO：54。
本发明的重组载体可以包含其它序列，这些序列促进选择进行了成功重组事件的细胞。例如，可以将编码对新霉素、博莱霉素、嘌呤霉素等的抗性的标记基因包含在重组载体内，以促进选择进行了成功重组事件的细胞。
在本发明的另一方面，提供了携带一种或多种人源化Ig基因座的转基因构建体或载体。
在一种实施方案中，本发明提供了含人源化Ig重链基因座的转基因构建体，所述人源化Ig重链基因座含有一个或多个V基因片段、一个或多个D基因片段、一个或多个J基因片段、以及一个或多个恒定区基因片段，其中至少一个基因片段是人重链基因片段。这种人源化重链基因座中的基因片段以未重排构型(或“种系构型”)、或部分或完全重排的构型彼此并列。人源化重链基因座在非人动物中具有进行基因重排(如果基因片段没有完全重排)和基因转变的能力，从而产生具有人多肽序列的多样化的重链所有组成成分，或“人源化重链”。
在一种优选实施方案中，人源化重链基因座含有至少一种C区基因片段，该片段为人恒定区基因片段，优选为Cα或Cγ(包括Cγ亚类1，2，3和4的任意一种)。
在另一种更优选的实施方案中，转基因的人源化重链基因座含有人源化V区和人源化C区，即，具有至少一个人VH基因片段的V区和具有至少一个人C基因片段的C区(如人Cα或Cγ)。
优选地，人源化V区包含至少约10-100个重链V(或“VH”)基因片段，其中至少一个是人VH基因片段。根据本发明，包含在转基因中的人VH基因片段与宿主动物的VH基因片段，特别是包含在转基因上游区中的动物VH基因片段具有至少约75％至约85％的同源性。如前面所述，人VH片段包括天然存在的人VH基因片段，天然存在的人VH基因片段的简并形式，以及编码与人重链V区多肽基本等同(即约85％-95％)的多肽序列的合成序列。
人VH基因片段优选位于转基因基因座中非人VH片段的下游。优选地，转基因中的非人VH基因片段是来自于宿主动物Ig基因座中3′VH区的VH基因片段，包括3′近端VH1。
在另一种实施方案中，本发明提供了含人源化轻链基因座的转基因构建体，所述人源化轻链基因座能够在宿主动物中进行基因重排和基因转变，从而产生具有人多肽序列的多样化的轻链所有组成成分，或“人源化轻链”。
人源化轻链基因座含有一个或多个V基因片段、一个或多个J基因片段、以及一个或多个恒定区基因片段，其中至少一个基因片段是人轻链基因片段。这种人源化轻链基因座中的基因片段以未重排构型(或“种系构型”)、或部分或完全重排的构型彼此并列。
在一种优选实施方案中，人源化轻链基因座含有至少一种C区基因片段，该片段为人恒定区基因片段，优选为Cλ或Cκ。
在另一种优选的实施方案中，转基因的人源化轻链基因座含有人源化V区和人源化C区，即，具有至少一个人VL基因和/或至少一个重排的人VJ片段的V区和具有至少一个人C基因片段的C区(如人Cλ或Cκ)。
优选地，人源化V区包含至少约10-100个轻链V(或“VL”)基因片段，其中至少一个是人VL基因片段。包含在转基因中的人VL基因片段与宿主动物的VL基因片段，特别是包含在转基因上游区中的动物VL基因片段具有至少约75％至约85％的同源性。如前面所述，人VL片段包括天然存在的人VL基因片段，天然存在的人VL基因片段的简并形式，以及编码与人轻链V区多肽基本等同(即约85％-95％)的多肽序列的合成序列。
人VL基因片段优选位于转基因基因座中非人VL片段的下游。优选地，转基因构建体中的非人VL基因片段选自宿主动物轻链基因座中3′VL区的VL基因片段，包括3′近端VL1。
在另一种优选实施方案中，人源化轻链基因座包含重排的人VJ片段，位于许多(如10-100)非人或人来源的VL基因片段的下游。
本发明的另一方面涉及制备含人源化Ig基因座的转基因载体的方法。这些方法包括从非人动物分离Ig基因座或其一部分，将所需人Ig基因片段插入分离的动物Ig基因座或动物Ig基因座的分离部分。以保留基因座在非人动物中进行有效基因重排和基因转变的能力的方式进行连接或同源重组，从而将人Ig基因片段插入分离的动物Ig基因座或其部分。
优选地，从通过基因转变产生抗体多样性的动物，如兔和鸡分离含有进行人源化的Ig基因座的DNA片段。这些大的DNA片段可以通过筛选从非人动物的基因组DNA制备的质粒、粘粒、YACs或BACs等文库而分离。完整的动物C区可以包含在一个质粒或粘粒克隆中，随后进行人源化。YAC克隆可以携带最多至2兆碱基的DNA片段，因此完整的动物重链基因座或其大部分可以在一个YAC克隆中分离，或经重新构建以使其包含在一YAC克隆中。BAC克隆可以携带更小的DNA片段(约150-250kb)。然而，含Ig基因座的重叠片段的多个BAC克隆可以被独立人源化，随后一起注射至动物受体细胞，其中重叠片段在接受的动物细胞中重组，以产生连续的Ig基因座。
可以通过各种方法将人Ig基因片段整合至载体(如BAC克隆)上的Ig基因座中，所述方法包括通过同源重组连接DNA片段或插入DNA片段。整合人Ig基因片段是以使人Ig基因片段可操作性连接至转基因中的宿主动物序列的方式进行的，以产生功能性的人源化Ig基因座，即能够进行基因重排和基因转变的Ig基因座，所述基因重排和基因转变导致多样化的人源化抗体所有组成成分的产生。
优选地，通过同源重组将人Ig基因片段整合至Ig基因座中。同源重组可以在细菌、酵母和其它细胞中通过高频率的重组事件而进行。例如，用含有动物Ig基因座或其大部分的YAC转化酵母细胞。随后，用前面所描述的重组载体进一步转化所述酵母细胞，该载体携带与5′侧翼序列和3′侧翼序列连接的人Ig基因片段。重组载体中的5′和3′侧翼序列与YAC上的动物Ig基因片段的侧翼序列同源。作为同源重组的结果，用人Ig基因片段代替YAC上的动物Ig基因片段。替代地，用含动物Ig基因座或其大部分的BAC转化大肠杆菌等细菌细胞。用携带与5′侧翼序列和3′侧翼序列连接的人Ig基因片段的重组载体进一步转化所述细菌细胞。重组载体中的5′和3′侧翼序列介导重组载体上的人Ig基因片段和BAC上的动物Ig基因片段之间的同源重组和交换。人源化的YACs和BACs可以容易从细胞分离，并且用于制备转基因动物。
在本发明的另一方面，提供了制备能够产生人源化免疫球蛋白的转基因动物的方法。
根据本发明，可以将上述一种或多种携带人源化Ig基因座的转基因载体导入动物的一个或多个受体细胞，并且从一个或多个受体细胞衍生动物，从而制备能够产生人源化免疫球蛋白的转基因动物。
优选地，受体细胞来自于通过基因转变和超变产生抗体多样性的非人动物，如鸟类(如鸡)、兔、牛等。在这些动物中，3′近端V基因片段优先用于产生免疫球蛋白。通过替代动物的3’近端V基因片段或通过置于3’近端V基因片段紧邻处而将人V基因片段整合至转基因载体上的Ig基因座，导致人V区多肽序列在大多数免疫球蛋白中表达。替代地，可以将重排的人V(D)J片段插入转基因载体上的免疫球蛋白基因座的J基因座。
将含有人源化Ig基因座的转基因载体导入一个或多个受体细胞，然后通过随机整合或定向整合而整合至一个或多个受体细胞的基因组。
对于随机整合，可以通过标准转基因技术将含有人源化Ig基因座的转基因载体导入动物的受体细胞。例如，可以将转基因载体直接注射至受精卵的原核中。也可以通过在卵受精之前将精子与转基因载体共孵育而导入转基因载体。可以从受精卵发育成转基因动物。导入转基因载体的另一种方式是通过转染胚胎干细胞并且随后将基因修饰的胚胎干细胞注射至发育中的胚胎。替代地，可以直接将转基因载体(裸露的或与促进剂结合)注射至发育中的胚胎。最终，从含有整合至转基因动物的至少一些体细胞的基因组中的人源化Ig转基因的胚胎产生嵌合的转基因动物。
在一种优选实施方案中，将含有人源化Ig基因座的转基因随机整合至来源于内源性免疫球蛋白基因表达受损的动物株的受体细胞(如受精卵或发育中的胚胎)的基因组中。这些动物株的使用允许来自于人源化转基因Ig基因座的免疫球蛋白分子的优先表达。这些动物的例子包括Alicia和Basilea兔株，以及无丙种球蛋白血症的鸡株。替代地，可以使具有人源化免疫球蛋白转基因或基因座的转基因动物与内源性免疫球蛋白表达受损的动物株交配。可以获得对于受损的内源性Ig基因座和人源化转基因Ig基因座为杂合的后代。
对于定向整合，可以将转基因载体导入适当的动物受体细胞，如胚胎干细胞或已经分化的体细胞。此后，可以通过标准方法选择其中的转基因被整合至动物基因组并且通过同源重组被相应的内源性Ig基因座替代的细胞。然后可以将所选择的细胞与去核的核转移单位细胞，如卵母细胞或胚胎干细胞融合，这些细胞为全能的，可以形成有功能的新生动物。根据已经确立的常规技术进行融合。见，例如，Cibelli et al.，Science(1998)280：1256。也可以通过显微手术采用注射移液管进行卵母细胞去核和核转移。(见，例如Wakayama et al.，Nature(1998)394：369.)然后将得到的卵的细胞收获于适当培养基中，并且转移至同步的受体中，用于产生转基因动物。替代地，可以将所选择的基因修饰的细胞注射至发育中的胚胎，该胚胎随后发育成嵌合动物。
在本发明的另一方面，也可以将上述一种或多种重组载体导入一个或多个受体细胞，所述载体携带连接于与内源性Ig基因片段的侧翼序列同源的5’和3’侧翼序列的人Ig基因片段，选择其中的内源性Ig基因片段通过同源重组而被人Ig基因片段替代的细胞，并且从所选择的基因修饰的一个或多个受体细胞衍生动物，从而制备产生人源化免疫球蛋白的转基因动物。
类似于转基因载体的定向插入，适于作为该方法中的受体细胞的细胞包括胚胎干细胞或已经分化的体细胞。携带人Ig基因片段的重组载体可以通过任何可行的方法，如转染，被导入这些受体细胞中。此后，可以通过标准方法选择其中通过同源重组用人Ig基因片段取代了相应的内源性Ig基因片段的细胞。这些基因修饰的细胞可以作为核转移程序中的核供体细胞，用于克隆转基因动物。替代地，可以将所选择的基因修饰的胚胎干细胞注射至发育中的胚胎，该胚胎随后发育成嵌合动物。
由前述任一种方法产生的转基因动物形成了本发明的另一种实施方案。转基因动物在基因组中具有至少一个，即一个或多个人源化Ig基因座，由其产生功能性的人源化抗体所有组成成分。
在一种优选实施方案中，本发明提供了基因组中具有一个或多个人源化Ig基因座的转基因兔。本发明的转基因兔可以对人源化Ig基因座进行重排和基因转变，并且表达功能性的人源化抗体所有组成成分。
在一种优选实施方案中，本发明提供了基因组中具有一个或多个人源化Ig基因座的转基因鸡。本发明的转基因兔可以对人源化Ig基因座进行重排和基因转变，并且表达功能性的人源化抗体所有组成成分。
来自于本发明的转基因动物的细胞，如来自于用一种抗原免疫的转基因动物所建立的B细胞或细胞系也是本发明的一部分。
在本发明的另一方面，提供了通过给予纯化的人源化抗体组合物，优选人源化多克隆抗体组合物而治疗需要对疾病进行治疗的灵长类动物，特别是人类主体的疾病的方法。
用于给药的人源化多克隆抗体组合物的特征一般在于含有多克隆抗体群，其免疫球蛋白浓度为0.1-100mg/ml，更通常1-10mg/ml。抗体组合物可以含有各种同种型的免疫球蛋白。替代地，抗体组合物可以含仅一种同种型的抗体，或含一些选择的同种型的抗体。
大多数情况下，抗体组合物由从动物制备的没有额外修饰，如化学或酶修饰的修饰免疫球蛋白，即人源化抗体组成。替代地，免疫球蛋白级分可以接受酶消化(如用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤溶酶、糖苷酶、核酸酶等)、加热等处理，和/或进一步分级分离。
一般将抗体组合物给药至血管系统，方便地通过注射或经植入适当静脉中的导管进行静脉给药。以适当的速度给予抗体组合物，一般为约10分钟至24小时，更通常约30分钟至约6小时，根据患者可接受液体的速度。可以在单次输注或一系列输注中给予有效剂量，可以每日一次、每周一次、每月一次或每三个月一次进行重复输注，取决于抗体制剂的半衰期和临床适应症。对于应用于上皮表面，抗体组合物可以以足够提供想要达到的最终结果的量应用于需要治疗的表面，并且可以根据需要而重复。
可以用抗体组合物结合和中和人体组织中导致疾病或引发不需要的或异常免疫应答的抗原性实体。此处的“抗原性实体”的定义包括任意可溶性或细胞表面结合的分子，包括蛋白和细胞或导致疾病的生物体或试剂，它们至少能够结合抗体，优选也能够刺激免疫应答。
作为单独治疗或与化疗联合进行的抗感染剂的抗体组合物给药导致感染颗粒的清除。抗体的单次给药一般使感染性颗粒减少10-100倍，更常见减少1000倍以上。同样，恶性疾病患者中作为单独治疗或与化疗联合进行的抗体治疗一般使恶性细胞的数目减少10-100倍，或1000倍以上。可以在延长的时间中重复治疗，以保证感染性颗粒、恶性细胞等的完全清除。在一些情况下，在缺乏可检测量的感染性颗粒或不良细胞的情况下，用抗体制剂进行的治疗将持续延长的时间段。同样，用抗体治疗调节免疫应答可以由治疗性抗体的单次或多次给药组成。治疗可以在没有任何疾病症状的情况下持续延长的时间段。
可以与剂量足以抑制感染性疾病或恶性疾病的化疗联合使用目标治疗。在自身免疫病患者或移植物受体中，可以与剂量足以抑制免疫反应的免疫抑制剂治疗联合使用抗体治疗。
通过以下实施例进一步说明本发明，但并不对其进行限制。实施例1牛、绵羊和兔Cγ基因3’的新序列
用QIAamp DNA血液试剂盒(QIAGEN)从西门塔牛的血液中分离基因组DNA。用分离的基因组DNA作为模板并且用以下引物PCR扩增牛Cγ基因3’的基因组区(即牛Cγ基因3’侧翼序列)：5′引物：5′cgcaagcttCCTACACGTGTGTGGTGATG3′(SEQ ID NO：1)；3′引物：5′cgcaagcttAAGATGGWGATGGTSGTCCA3′(SEQ ID NO：2)(通用简并代码：W＝(A/T)S＝(G/C))。5’引物的大写部分来自于Cγ的外显子3，小写部分代表末端HindIII限制位点。3’引物的大写部分是根据来自于人M1外显子和小鼠M1外显子的公开序列设计的简并序列，小写部分代表末端HindIII限制位点。用EXPAND长模板PCR系统(Roche)获得1.3kb PCR片段。用凝胶纯化该片段，用HindIII消化并且克隆至Bluescript克隆载体中。得到的克隆属于三个群，相互之间的不同之处在于用BamHI，EcoRI和XhoI获得的限制片段模式。对从每一个群获得的一个克隆进行测序，序列表示于图1(SEQ ID NOS：3-5)。
用QIAamp DNA血液试剂盒(QIAGEN)从美利奴绵羊的血液中分离基因组DNA。用分离的基因组DNA作为模板并且用以下引物PGR扩增绵羊Cγ基因3’的基因组区(即绵羊Cγ基因3’侧翼序列)：5′引物：5′cgcggatccCCTACGCGTGTGTGGTGATG3′(SEQ ID NO：6)3′引物：5′cgcggatccACCGAGGAGAAGATCCACTT3′(SEQ ID NO：7)5’引物的大写部分来自于Cγ的外显子3，小写部分代表末端BamHI限制位点。3’引物的大写部分是根据来自于人M2外显子和小鼠M2外显子的公开序列设计的简并序列，小写部分代表末端BamHI限制位点。用EXPAND长模板PCR系统(Roche)获得2.9kb PCR片段。用凝胶纯化该片段，用BamHI消化并且克隆至Bluescript克隆载体中。得到的克隆属于两个群，相互之间的不同之处在于用HindIII，EcoRI和XhoI获得的限制片段模式。对从每一个群获得的一个克隆进行测序，序列表示于图2(SEQ IDNOS：8-9)。
从基因组粘粒克隆(来自于Knight et al.，J Immunol(1985)1245-50，″Organization and polymorphism of rabbit immunoglobulin heavy chaingenes″的cos 8.3)亚克隆含Cγ基因及其来自于A2同种异体兔的侧翼序列的10kb EcoRI片段。用标准方法测定Cγ的5’和3’核苷酸序列，分别见图3和5，SEQ ID NO：10，12，13。
从VJk2Ck In pSV2neo的EcoRI/BamHI亚克隆测定兔Cκ1的3’的序列。核苷酸序列表示于图4，SEQ ID NO：11。
从上述3’侧翼序列推测由牛、绵羊和兔M1和M2外显子编码的氨基酸序列。这些氨基酸序列与公开的骆驼、人和小鼠M1和M2序列进行了对比，见图6。实施例2用于以人Cγ1片段替代兔内源性Cγ基因片段的载体
从a2纯合兔的兔胚胎成纤维细胞分离基因组DNA。采用以下引物，通过PCR扩增兔Cγ上游的DNA序列(即兔Cγ的5’侧翼序列)：
5′taattatgcggccgcCTTCAGCGTGAACCACGCCCTC 3′(SEQ ID NO：39)，具有5′NotI位点和
5′GTCGACGCCCCTCGATGCACTCCCAGAG 3′(SEQ ID NO：40)。
采用以下引物，扩增兔Cγ下游的DNA序列(即兔Cγ的3’侧翼序列)：
5′ggtaccCTCTCCCTCCCCCACGCCGCAGC 3′(SEQ ID NO：41)，具有5′KpnI位点和
5′atatctcagaACTGGCTGTCCCTGCTGTAGTACACGG 3′(SEQ ID NO：42)，具有5′XhoI位点。
从人外周血淋巴细胞分离人基因组DNA。用以下引物扩增编码人Cγ1的DNA片段：
5′GTCGACACTGGACGCTGAACCTCGCGG 3′(SEQ ID NO：43)和
5′GGTACCGGGGGCTTGCCGGCCGTCGCAC 3′(SEQ ID NO：44)。
用限制酶消化片段，克隆至Bluescript载体。随后，将lox neo盒插入SalI位点，将Hsv-tk盒插入XhoI位点。最终的构建体的示意图见图7a。实施例3用于以人Cκ片段替代兔内源性Cκ基因片段的载体
从b5纯合兔的兔胎成纤维细胞分离基因组DNA。采用以下引物，通过PCR扩增兔Cκ1上游的DNA序列(即兔Cκ1的5’侧翼序列)：
5′gcggccgcTGGCGAGGAGACCAAGCTGGAGATCAAACG 3′(SEQ ID NO：45)，具有5′NotI位点
5′GTCGACGCAGCCCAAAGCTGTTGCAATGGGGCAGCG 3′(SEQ ID NO：46)。
采用以下引物，扩增兔Cκ1下游的DNA序列(即兔Cκ1的3’侧翼序列)：
5′atatggtaccGCGAGACGCCTGCCAGGGCACCGCC 3′(SEQ ID NO：47)，具有5′KpnI位点
5′GGATCCCGAGCTTTATGGGCAGGGTGGGGG 3′(SEQ ID NO：48)。
从人外周血淋巴细胞分离人基因组DNA。用以下引物扩增编码人Cκ的DNA片段：
5′ATATGTCGACCTGGGATAAGCATGCTGTTTTCTGTCTGTCCC 3′(SEQ ID NO：
49)
5′CTAGGTACCAGCAGGTGGGGGCACTTCTCCC 3′(SEQ ID NO：50)。
用限制酶消化片段，克隆至Bluescript载体。随后，将lox neo盒插入SalI位点，将Hsv-tk盒插入XhoI位点。最终的构建体的示意图见图7b。实施例4用相应的人基因片段替代兔胎成纤维细胞中的内源性Cγ和Cκ基因片段
通过标准方法制备兔胎成纤维细胞。一次传代后，用5μg图5a所示的NotI线性化的Cγ定向载体，或用5μg图51b所示的NotI线性化的Cκ定向载体转染成纤维细胞，将其种植于96孔板中(2×103细胞/孔)。用600μg/ml G418进行阳性选择和用200nM FIAU进行阴性选择后，将具有抗性的集落双份平铺于两个96孔板，分别进行DNA分析和冷冻保存。进行PCR和/或DNA印迹分析以鉴定人Cγ1基因片段整合至基因组中的细胞。如实施例5中的描述将具有整合的人Cγ1基因的细胞用于兔的克隆。实施例5兔的克隆
通过每12小时皮下注射卵泡刺激素(FSH)(0.3mg×2和0.4mg×4)，使成熟的荷兰Belton兔。在最后一次FSH注射后12小时，通过静脉给予0.5mg促黄体生成素(LH)诱导排卵。通过LH注射后17小时的排卵高潮回收卵母细胞。成熟后16-19小时对卵母细胞进行机械去核。在紫外光下用bisBENZIMIDE(HOECHST 33342，Sigma，St.Louis，MO)染料评估染色体去除。使用一次180V/cm的电脉冲15us(ElectrocellManipulator 200，Genetronics，San Diego，CA)，使去核的卵母细胞与活跃分裂的成纤维细胞融合。3-5小时后，用钙离子载体(6μM)(#407952，Calbiochem，San Diego，CA)对卵母细胞机械活化4分钟，用2mM 6-二甲基氨基嘌呤(DMAP，Sigma)在含3mg/ml牛血清白蛋白(无脂肪酸，Sigma)CR2(Specialty Media，Lavalett，NJ)中对卵母细胞活化3小时。活化后，将胚胎在仓鼠胚胎培养基(HECM)-Hepes中洗涤5次，然后在37.8℃，含5％CO2的空气中，在含3mg/ml无脂肪酸的BSA的CR2培养基中培养2-48小时。然后将胚胎转移至同步化的受体中。通过PCR分析后代中的转基因片段。实施例6构建含具有人Cγ1基因片段和编码人VH结构域多肽序列的VH基因片段的兔重链基因座的一部分的DNA片段
对来自于a2同种异型兔的兔重链Cγ基因的上游和下游区(即5′和3′侧翼序列)进行测序。采用重叠的寡核苷酸，通过PCR产生DNA片段(SEQ ID NO：51)，其中DNA片段从5′至3′含有来源于兔γ基因5′侧翼区的序列，人Cγ1基因，以及来源于兔Cγ基因3′侧翼区的序列(图8)。
通过标准程序产生来自于a2同种异型兔的基因组BAC文库，用兔Cγ的特异性探针筛选。鉴定了含兔重链基因片段的BAC克隆。在大肠杆菌中，使用SEQ ID NO：51的DNA片段和pET系统，通过同源重组用人Cγ1基因替代该BAC克隆上的兔Cγ基因。该替代是通过两个连续的重组步骤完成的：首先用标记基因替代兔Cγ基因片段；然后用人Cγ1基因片段替代标记基因。
通过用合成的VH基因片段替代3’近端VH1片段而进一步修饰含兔重链基因和插入的人Cγ1基因的修饰BAC克隆(图9)。采用重叠的寡核苷酸制备合成的VH基因片段(SEQ ID NO：52)，该片段包含5’侧翼序列，3’侧翼序列，以及编码几乎等同于Huang和Stollar(J.Immunol.151：5290-5300，1993)描述的人免疫球蛋白重链可变区的多肽的序列。合成VH基因片段的编码序列是基于公开的兔VH1基因序列(a2，Knight andBecker，Cell 60：963-970，1990)设计的，其80％以上等同于兔VH基因片段。合成VH片段中的5′和3′侧翼序列来源于a2同种异型兔VH1基因的上游和下游区。使用pET或redεβγ系统，通过同源重组用SEQ ID NO：52的合成VH基因替代BAC克隆上的兔VH1基因。用标准程序扩增和纯化修饰的BAC克隆。实施例7构建含具有人Cκ基因片段和编码人VL结构域多肽序列的VJ基因片段的兔轻链基因座的一部分的DNA片段
对来自于b5同种异型兔的兔轻链Cκ1基因的上游和下游区(即5′和3′侧翼序列)进行测序。采用重叠的寡核苷酸，通过PCR产生DNA片段(SEQ ID NO：53)，其中DNA片段从5′至3′含有来源于兔κ1基因5′侧翼区的序列，人Cκ1基因，以及来源于兔Cκ1基因3′侧翼区的序列(图10)。
通过标准程序产生来自于b5同种异型兔的基因组BAC文库，用兔Cκ1的特异性探针筛选。鉴定了含兔轻链基因片段的BAC克隆。在大肠杆菌中，使用pET或redεβγ系统，通过同源重组用人Cκ1基因替代该BAC克隆上的兔Cκ1基因。该替代是通过两个连续的重组步骤完成的：首先用标记基因替代兔Cκ1基因片段；然后用人Cκ1基因片段替代标记基因。
通过将重排的VJ DNA片段插入兔轻链基因座的J区而进一步修饰含兔轻链基因和插入的人Cκ1基因的修饰BAC克隆(图9)。重排的VJ DNA片段编码由Pritsch等(Blood 82(10)：3103-3112，1993)和Lautner-Rieske等(Eur.J Immunol.22(4)，1023-1029，1992))描述的人免疫球蛋白可变区多肽(图7)。重排的VJ片段的核苷酸序列设计为使核苷酸水平上与Lieberman等(J.Immunol.133(5)，2753-2756，1984)公开的兔Vκ序列具有最大的序列同源性。该重排的VJ DNA序列80％以上等同于已知的兔Vκ基因。采用重叠的寡核苷酸，通过PCR使重排的VJ DNA片段连接于5’和3’侧翼序列，得到SEQ ID NO：54的DNA片段(图11)。5’侧翼序列来源于兔Vκ的5’，3’侧翼序列来源于兔J2的3’。随后在大肠杆菌中，使用pET或redεβγ系统，将SEQ ID NO：54的DNA片段插入兔轻链基因座。插入的方式使兔轻链区含有兔Vκ1基因片段，兔J1和J2片段，其间的序列被重排的VJ DNA片段替代。同样，用标记基因替代兔的V至J区，然后用重排的VJ DNA片段替代标记基因，以便完成该插入。用标准程序扩增和纯化修饰的BAC克隆。实施例8表达人源化免疫球蛋白轻和/或重链转基因的转基因兔
根据Fan等(Pathol.Int.49：583-594，1999)的描述产生转基因兔。简言之，用标准方法使雌兔过量排卵，并且与雄兔交配。从输卵管收集原核阶段的受精卵，置于适当的培养基中，如补加了20％胎牛血清的Dulbecco′s磷酸缓冲盐水。在一对操纵器的帮助下将外源性DNA(如来自于实施例4和/或5的人源化BAC克隆，在注射前线性化)微注射至雄性原核中。将形态学上表现为存活的受精卵转移至假孕兔的输卵管中。假孕是通过注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)而诱导的。大约0.1-1％注射的受精卵发育成存活的转基因兔。采用转基因的特异性探针的DNA印迹分析证实了转基因在基因组中的整合。
采用从转基因兔的B细胞(在血液、脾和/或淋巴结中)分离的RNA制备cDNA。用人转基因(人CH基因片段或合成的人源化VH基因片段)的特异性引物从cDNA产生扩增产物。对扩增产物的观察表明该转基因在转基因动物中重排，重排的转基因在动物中转录。对扩增产物进行测序，来自于上游V基因的供体序列的存在表明导入动物种系的转基因进行了基因转变。
用ELISA分析测定转基因生成(founder)兔的血清中含人IgG和/或人κ轻链抗原决定簇的抗体的存在。实施例9从具有Alicia和/或Basilea兔株的遗传背景的转基因兔中产生人源化抗体
Alicia株缺乏VH1基因片段，因此Ig重链表达受损。例如，通过使用上述实施例4-5从Alicia兔建立的胎成纤维细胞，或使用上述实施例8与雄性Alicia兔交配的雌性Alicia兔的受精卵，产生能够在Alicia兔株的遗传背景中表达人源化重链分子的转基因生成兔。也获得了对Alicia Ig表型为纯合并且对人源化重链转基因为纯化的转基因动物。在ELISA中检测血清中人源化重链(如人重链恒定区)的存在。相对于从整合至野生型(非Alicia)兔的转基因产生的抗体浓度，这些具有人源化Ig重链的纯合Alicia动物中的抗体浓度显著更高，如高约10-100倍。
Basilea株不表达κ1轻链，该位置上专门表达κ2和λ轻链。例如，通过使用上述实施例4-5从Basile兔建立的胎成纤维细胞，或使用上述实施例8与雄性Basilea兔交配的雌性Basile兔的受精卵，产生能够在Basilea兔株的遗传背景中表达人源化轻链分子的转基因生成兔。也获得了对Basilea Ig轻链表型为纯合并且对人源化轻链转基因为纯化的转基因动物。在ELISA中检测血清中人源化轻链的存在。相对于具有野生型(非Basile)遗传背景的转基因兔中的人源化轻链浓度，纯合Basile动物中的人源化轻链浓度显著更高，高约10-100倍。转基因生成兔互相交配，产生具有以下性状的转基因兔：(1)具有至少一种人源化轻链转基因，(2)具有至少一种人源化重链转基因，(3)对Alicia重链基因座为纯合，和(4)对Basilea轻链基因座为纯合。实施例10构建含具有人Cλ2基因片段和编码人VL结构域的VJ基因片段的修饰的鸡轻链基因座的DNA片段
用鸡轻链Cλ和鸡Vpsi25(在轻链基因座最5’的V基因片段)的特异性放射性标记的探针筛选来源于jungle fowl鸡的基因组BAC文库。鉴定了含完整λ轻链基因座的BAC克隆。在大肠杆菌中，如下使用pET系统(Zhang et al.，Nat.Biotechnol.18(12)：1314-7，2000)，通过同源重组用人Cλ2基因替代该BAC克隆上的鸡Cλ2基因。
用Tn5基因的特异性引物通过PCR产生含卡那霉素选择盒的第一个DNA片段。将5’引物(5′catacacagccatacatacgcgtgtggccgctctgcctctctcttgcaggTATGGACAGCAAGCGAACCG 3′，SEQ ID NO：55)设计为在5’末端(小写字母)包含来源于鸡轻链Cλ基因的5’侧翼区的50bp。将3’引物(5′atcagggtgacccctacgttacactcctgtcaccaaggagtgggagggacTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG3′，SEQ ID NO：56)设计为在末端(小写字母)包含来源于鸡轻链Cλ基因的3’侧翼区的50bp。
采用重叠的寡核苷酸，合成第二个DNA片段(SEQ ID NO：57)，其中DNA片段从5′至3′含有来源于鸡轻链Cλ基因5′侧翼区的序列，人Cλ2基因，以及来源于鸡Cλ基因3′侧翼区的序列(图12)。
用在诱导型启动子作用下表达recE和recT功能的重组质粒转化鸡轻链BAC克隆的大肠杆菌细胞。然后用上述第一个DNA片段转化用重组治疗转化的细胞，此后在含卡那霉素的培养基中选择。鉴定抗卡那霉素的克隆，通过限制酶消化证实经同源重组用卡那霉素选择盒替代了鸡Cλ片段。
在第二个同源重组步骤中，用上述第二个DNA片段转化卡那霉素选择盒阳性细胞。筛选被转化细胞的卡那霉素抗性丢失，这表示人Cλ2基因替代了卡那霉素选择盒。通过限制酶消化和/或序列分析证实交换。
ET克隆程序概括于图13。
通过插入重排的VJ DNA片段进一步修饰含鸡轻链基因座和插入的人Cλ2基因片段的BAC克隆。重排的VJ DNA片段编码Kametani et al.(J.Biochem.93(2)，421-429，1983)描述的人免疫球蛋白可变区多肽IGλ链V-1区NIG-64(P01702)(图14)。重排的VJ片段的核苷酸序列设计为使核苷酸水平上与McCormack等(Cell 56，785-791，1989)公开的鸡Vλ1序列具有最大的序列同源性。该重排的VJ DNA序列80％以上等同于已知的鸡轻链V基因。使重排的VJ DNA片段连接于5’和3’侧翼序列，得到SEQID NO：58的DNA片段(图14)。5’侧翼序列来源于鸡Vλ1的5’，3’侧翼序列来源于鸡J的3’。如图15所示，随后在大肠杆菌中，使用pET系统，将SEQ ID NO：58的DNA片段插入鸡轻链基因座。插入的方式使鸡轻链基因座上从鸡Vλ1基因片段的5’末端至鸡J区的3’末端的区域被重排的合成VJ DNA片段替代。同样，用标记基因替代鸡的V-J区，然后用重排的VJ DNA片段替代标记基因，以便完成该插入。用标准程序扩增和纯化修饰的BAC克隆。实施例11构建含具有人Cγ1基因片段和编码人VH结构域多肽序列的VH基因的鸡重链基因座的一部分的DNA片段
用标准程序产生jungle fowl鸡的基因组BAC文库，用鸡Cγ1的特异性探针筛选。鉴定了含完整λ重链基因座的BAC克隆。对重链Cγ基因的上游和下游区(即5’和3’侧翼区)进行测序。在大肠杆菌中，如下使用pET系统，通过同源重组用人Cγ1基因替代该BAC克隆上的鸡Cγ基因。
用Tn5基因的特异性引物通过PCR产生含卡那霉素选择盒的第一个DNA片段。将5’引物和3’引物设计为末端包含来源于鸡重链Cγ1基因的5’和3’侧翼区的50bp。
采用重叠的寡核苷酸，通过PCR产生第二个DNA片段，其中DNA片段从5′至3′含有来源于鸡重链Cγ基因5′侧翼区的约50bp的序列，人Cγ1基因，以及来源于鸡Cγ基因3′侧翼区的约50bp的序列。
用在诱导型启动子作用下表达recE和recT功能的重组质粒转化鸡CYBAC克隆的大肠杆菌细胞。然后用上述第一个DNA片段转化用重组治疗转化的细胞，此后在含卡那霉素的培养基中选择。鉴定抗卡那霉素的克隆，通过限制酶消化证实经同源重组用卡那霉素选择盒替代了鸡Cγ片段。
在第二个同源重组步骤中，用上述第二个DNA片段转化卡那霉素选择盒阳性细胞。筛选被转化细胞的卡那霉素抗性丢失，这表示人Cγ1基因替代了卡那霉素选择盒。通过限制酶消化和/或序列分析证实交换。
通过用合成VH基因片段替代3’近端VH1片段(即V区中的3’近端VH1基因)而进一步修饰含插入的人Cγ1基因的BAC克隆。基于公开的鸡VH1基因序列(Arakawa et al.，EMBO J 15(10)：25402546，1996)设计合成的VH基因片段。合成的基因片段80％以上等同于鸡VH基因片段，并且其编码的氨基酸序列等同于由Matthyssens和Rabbitss(Steinberg CMand Lefkovits I，(eds).The Immune System：132-138，S.Karger，NY1981)描述的人免疫球蛋白重链可变区多肽的氨基酸序列。采用重叠的寡核苷酸，通过PCR合成包含5’和3’侧翼序列的合成VH片段。5’和3’侧翼序列来源于鸡VH1基因的上游和下游区。采用pET系统，通过同源重组用合成VH片段替代BAC克隆上的鸡VH1基因。用标准程序扩增和纯化修饰的BAC克隆。实施例12表达人源化免疫球蛋白轻和/或重链转基因的转基因鸡
通过以下文献中描述的标准技术实施转基因鸡的产生：Etches et al.，Methods in Molecular Biology 62：433-450；Pain et al.，Cells TissuesOrgans 1999；165(3-4)：212-9；Sang，H.，″Transgenic chickens--methods and potential applications″，Trends Biotechnol 12：415(1994)；和WO 200075300，″Introducing a nucleic acid into an aviangenome，useful for transfecting avian blastodermal cells forproducing transgenic avian animals with the desired genes，bydirectly introducing the nucleic acid into the germinal disc of theegg″。
简言之，将修饰的BAC克隆线性化，并且与转染试剂混合，以促进DNA摄取至细胞中。将制剂注射至紧邻于胚盘的多细胞阶段的鸡胚胎中。关闭卵壳上的窗，并且孵育卵。通过PCR和采用转基因的特异性探针的DNA印迹分析鉴定孵化出的嵌合鸡。通过采用转基因的特异性探针的DNA印迹分析证实了转基因在基因组中的整合。使重链和轻链转基因动物互相杂交，以产生表达具有人源化重链和轻链的转基因鸡。
采用从转基因鸡的B细胞(在血液、脾和/或淋巴结中)分离的RNA制备cDNA。用人转基因(如人CH基因片段和/或合成的人源化VH基因片段)的特异性引物从cDNA产生扩增产物。对扩增产物的观察表明该转基因在转基因动物中重排，重排的转基因在动物中转录。对扩增产物进行测序，来自于上游V基因的供体序列的存在表明导入动物种系的转基因进行了基因转变。
用ELISA分析测定转基因鸡的血清中含人IgG和/或人κ轻链抗原决定簇的抗体的存在。实施例13在具有无丙种球蛋白血症表型的转基因鸡中产生功能性的人源化抗体
产生了具有以下性状的转基因鸡：(1)具有至少一种人源化轻链转基因，(2)具有至少一种人源化重链转基因，和(3)对无丙种球蛋白血症表型为纯合。这些动物在血液和卵中产生抗体，可以从两种来源的任一种纯化抗体。总体上，卵中的抗体浓度为血液中抗体浓度的约5％-50％。可以选择卵中含高水平人源化抗体的动物，使其杂交产生后代。替代地，可以产生特异性将抗体分泌至卵中的转基因动物。实施例14产生表达人源化免疫球蛋白的转基因鸡
按Pain等(Development 122，2339-2348；1996)的描述分离和培养鸡胚胎干细胞。产出后立即从卵获得鸡胚胎。轻柔吸取而取出完整的胚盘，缓慢机械分离胚胎，将细胞种植于灭活的STO饲养细胞上的ESA完全培养基。ESA培养基由以下成分组成：含10％FCS的MEM培养基，2％鸡血清，1％牛血清白蛋白，10ng/ml卵白蛋白，1mM丙酮酸钠，1％非必需氨基酸，1μM以下核苷酸的每一种：腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、胸苷，0.16mMβ巯基乙醇。ESA完全培养基补加了10ng/ml bFGF，20ng/ml h-IGF-1，1％vol/vol鸟类-SCF和1％vol/vol h-LIF，1％vol/vol h-IL-11。在7.5CO2和90％湿度下37℃孵育细胞培养物。48小时后，将新鲜胚盘细胞加入最初体积的ESA完全培养基的一半中的培养物。额外孵育3天后，用新鲜ESA完全培养基部分(50％)更换培养物的培养基，此后每天更换。对于细胞收获，用PBS洗涤培养物，在链霉蛋白酶溶液中(0.025％w/v)孵育。用各种含有人源化Ig基因座的线性化的转基因构建体转染解离的细胞。在选择性抗体存在下用STO饲养细胞(上述)孵育被转染的细胞。每周两次将细胞转移至新鲜的饲养细胞上。分离抗生素抗性细胞，通过PCR证实人源化Ig基因片段整合至随机位点或相应的鸡免疫球蛋白基因座。
随后，将基因修饰的细胞注射至受体胚胎。在受体胚胎中，刺激(6Gy-钴源)新产出的卵。用微移液管将100-200个基因修饰的细胞注射至胚下腔。关闭卵壳上的窗，孵育卵。通过PCR评估孵化出的鸡的体细胞嵌合性。通过体细胞嵌合体的交配评估种系嵌合性。实施例15转基因动物的免疫
在第0，14和28天用纯化的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)(弗氏不完全佐剂中的5μg)对基因工程化的鸡进行肌内免疫。在第35天，从动物中取血，制备血清。用溶于PBS中的1μg/ml HBsAg包被的ELISA板(NUNC，Denmark)在室温下孵育1小时。随后，通过用溶于PBS的1％脱脂干奶粉(NFM)(300μl/孔)孵育而封闭结合位点。在PBS/1％ NFM中稀释鸡血清，加入包被的孔中。孵育1小时后，用PBS/0.05％ Tween 20洗涤板3次，用偶联于辣根过氧化物酶的山羊抗人Ig检测结合的Ig。用1 mg/ml二盐酸邻苯二胺(Sigma)检测偶联的山羊抗体。加入1M HCl溶液终止比色反应，在490nm下测量吸光度。使用了未免疫鸡的血清作为对照。来自于未免疫鸡的血清不与HBsAg反应。在1∶250的稀释度下，在未包被和HBsAg包被的板中测得的光密度为低于0.2。相反，来自于免疫鸡的血清含有与HBsAg反应的人源化抗体。在1∶250的血清稀释度下，测得的光密度为2.3。进一步稀释血清时(稀释度为25600)，测得的光密度减少至0.1。没有检测到与山羊抗鸡IgG-HRP偶联物的抗体反应。这证明基因工程化的鸡在免疫后产生人源化的抗HBsAg抗体。
在第0和14天用纯化的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)(弗氏不完全佐剂中的10μg)对基因工程化的兔进行肌内免疫。在第28天，从动物耳取血，制备血清。用溶于PBS中的1μg/ml HBsAg包被的ELISA板(NUNC，Denmark)在室温下孵育1小时。随后，通过用溶于PBS的1％脱脂干奶粉(NFM)(300μl/孔)孵育而封闭结合位点。在PBS/1％ NFM中稀释兔血清，加入包被的孔中。孵育1小时后，用PBS/0.05％ Tween 20洗涤板3次，用偶联于辣根过氧化物酶的山羊抗人Ig检测结合的Ig。用1 mg/ml二盐酸邻苯二胺(Sigma)检测偶联的山羊抗体。加入1M HCl溶液终止比色反应，在490nm下测量吸光度。使用了未免疫兔的血清作为对照。来自于未免疫兔的血清不与HBsAg反应。在1∶100的稀释度下，在未包被和HBsAg包被的板中测得的光密度为低于0.4。相反，来自于免疫兔的血清含有与HBsAg反应的部分人抗体。在1∶100的血清稀释度下，测得的光密度为2.8。进一步稀释血清时(稀释度为25600)，测得的光密度减少至0.2。没有检测到与山羊抗兔IgG-HRP偶联物的抗体反应。这证明基因工程化的兔在免疫后产生人源化的抗HBsAg抗体。实施例16用人源化抗体产生的对病毒感染细胞系的补体介导的细胞毒性
37℃下用100μl PBS中的0.1mCi 51Cr标记表达HbsAg的人肝癌细胞系1小时。用表达抗HbsAg人源化免疫球蛋白的基因工程化兔或鸡的血清孵育2000个51Cr标记的细胞。37℃下2小时后，用闪烁计数器测量放射活性，以便测定51Cr向上清液中的释放。为测定最大释放，加入1％Triton X100。按如下公式计算细胞裂解度：％裂解＝实验CPM±自发CPM#/总CPM#±自发CPM。用来自于未免疫兔的血清(1∶30稀释)的标记细胞孵育没有导致细胞裂解(＜10％)。然而，用来自于免疫兔的血清孵育细胞导致80％的细胞裂解。通过热处理(56℃下30分钟)灭活补体导致免疫兔的血清无活性。这些结果证明，由遗传工程化的兔产生的人源化抗体与HbsAg阳性细胞结合，并且导致补体依赖性裂解。实施例17抗金黄色葡萄球菌的转基因动物免疫
在第0,14和28天用金黄色葡萄球菌胶原粘附素蛋白的重组片段(弗氏不完全佐剂中的100μg)对基因工程化的鸡进行肌内免疫。在第35天，从动物中取血，制备血清。用溶于PBS中的2μg/ml胶原粘附素蛋白包被的ELISA板(NUNC，Denmark)在室温下孵育1小时。随后，通过用溶于PBS的1％脱脂干奶粉(NFM)(300μl/孔)孵育而封闭结合位点。在PBS/1％NFM中稀释鸡血清，加入包被的孔中。孵育1小时后，用PBS/0.05％ Tween20洗涤板3次，用偶联于辣根过氧化物酶的山羊抗人Ig检测结合的Ig。用1mg/ml二盐酸邻苯二胺(Sigma)检测偶联的山羊抗体。加入1M HCl溶液终止比色反应，在490nm下测量吸光度。使用了未免疫鸡的血清作为对照。来自于未免疫鸡的血清不与胶原粘附素蛋白反应。在1∶250的稀释度下，在未包被和胶原粘附素蛋白包被的板中测得的光密度为低于0.2。相反，来自于免疫鸡的血清含有与胶原粘附素反应的人源化抗体。在1∶250的血清稀释度下，测得的光密度为2.3。进一步稀释血清时(稀释度为25600)，测得的光密度减少至0.1。没有检测到与山羊抗鸡IgG-HRP偶联物的抗体反应。这证明基因工程化的鸡在免疫后产生人源化的抗金黄色葡萄球菌胶原粘附素抗体。
在第0和14天用金黄色葡萄球菌胶原粘附素蛋白的重组片段(弗氏不完全佐剂中的100μg)对基因工程化的兔进行肌内免疫。在第35天，从动物取血，制备血清。用溶于PBS中的2μg/ml HBsAg包被的ELISA板(NUNC，Denmark)在室温下孵育1小时。随后，通过用溶于PBS的1％脱脂干奶粉(NFM)(300μl/孔)孵育而封闭结合位点。在PBS/1％ NFM中稀释兔血清，加入包被的孔中。孵育1小时后，用PBS/0.05％ Tween 20洗涤板3次，用偶联于辣根过氧化物酶的山羊抗人Ig检测结合的Ig。用1mg/ml二盐酸邻苯二胺(Sigma)检测偶联的山羊抗体。加入1M HCl溶液终止比色反应，在490nm下测量吸光度。使用了未免疫兔的血清作为对照。来自于未免疫兔的血清不与胶原粘附素蛋白反应。在1∶100的稀释度下，在未包被和胶原粘附素蛋白包被的板中测得的光密度为低于0.2。相反，来自于免疫兔的血清含有与胶原粘附素反应的人源化抗体。在1∶250的血清稀释度下，测得的光密度为2.3。进一步稀释血清时(稀释度为25600)，测得的光密度减少至0.1。没有检测到与山羊抗兔IgG-HRP偶联物的抗体反应。这证明基因工程化的兔在免疫后产生人源化的抗金黄色葡萄球菌胶原粘附素抗体。实施例18在小鼠模型中防止金黄色葡萄球菌感染
在第0-1天，用16mg含金黄色葡萄球菌胶原粘附素蛋白的特异性抗体的免疫球蛋白级分(来自于实施例17)或来自于未免疫动物的免疫球蛋白级分对未接受过免疫的动物进行被动免疫。在第0天，每只小鼠用4×107CFU金黄色葡萄球菌进行侵袭，在随后的7天内检测死亡率。对照组中的死亡率为80％，用含金黄色葡萄球菌胶原粘附素蛋白的特异性抗体的免疫球蛋白级分处理的组中的死亡率为10％，数据表明胶原粘附素蛋白可以保护小鼠免受金黄色葡萄球菌侵袭。实施例19从转基因动物制备的抗原特异性杂交瘤
用抗原(如KLH，人红细胞或绵羊红细胞)免疫转基因动物。在免疫后的多个时间取出脾细胞，分别与来源于兔和鸡的骨髓瘤细胞系融合。融合后将细胞铺于96孔板，检验上清液中人源化抗体的存在。为证明抗体含人免疫球蛋白序列，用与人重链和轻链免疫球蛋白反应的荧光标记的抗体染色。进行有限稀释，以将杂交瘤纯化为多克隆性。实施例20评估免疫原性
在第0天从5只cynomologous猴收集血浆样品。随后，通过静脉给药将纯化的部分人多克隆抗体制剂(5mg/kg)给予5只cynomologous猴。以双周的间隔重复6次给药。密切监测猴中的副作用(如过敏性休克，这是由体温升高所反应的)。7个月后从血样中收集血清。用CNBr活化的琼脂糖通过标准程序产生含纯化人IgG或部分人IgG的亲和树脂。将猴血清样品(3ml)加入含10mg人或部分人IgG的Ig亲和树脂(4ml)。随后，用PBS洗涤柱。用0.1M glcyin/HCl pH2.5从柱上洗脱结合的猴免疫球蛋白，然后用PBS透析2次。用人IgG作为标准，采用BCA分析测定被洗脱级分的蛋白含量。这些级分中的蛋白总量证明，用部分人IgG治疗，在受治疗动物中没有导致显著抗体应答。实施例21用人源化抗体治疗动物
通过硫酸铵沉淀和离子交换层析，从基因工程化兔的血清或从基因工程化鸡的卵黄中纯化人源化多克隆免疫球蛋白。用100万个表达HbsAg的人肝癌细胞注射SCID小鼠。约60天后，用从未免疫的兔血清中分离的抗体处理的动物死亡。这与未处理的肝癌细胞受体相似。相反，用从免疫的兔血清中分离的抗体处理的小鼠存活150天以上。这证明在基因工程化的兔中产生的人抗体能够从SCID小鼠中消除人癌细胞。
序列表
序列表<110>温姆-范.斯库坦等<120>在转基因动物中产生人源化抗体<130>14750<140>WO 01/24348<141>2001-08-03<160>58<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>1cgcaagcttc ctacacgtgt gtggtgatg 29<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>2cgcaagctta agatggwgat ggtsgtcca 29<210>3<211>1714<212>DNA<213>牛<400>3cctacacgtg tgtggtgatg cacgaaactt tacggaatca ctacaaagag aagtccacct 60cgaggtctcc gggtaaatga gcctcgcgcc gctgatctag tggacgttcc ctcatccacc 120cacccctccc cccaccccgg gctccaggtc cagccagggc gccctagccc ctccctgtgt 180gcattcctcc tgggccgccg tgaataaagc acccaggccg ccctgggacc ctgcaacgct 240gtgctggttc tttccgaggc agagccctgg tggccgccag gcctgcgggg gtgggctgag 300ccgactctgg gccactttgt tcagcatctg tgggggagct gaccccactc cgggccagac 360acacagtgag tgggtccagc aggccacctg ggggctgccc aaggccacag aggggcttgg 420ccagaggcac agctccacgg tcccctccag ccaccacctg ctgggccggc ctctggacag 480gaaccgggga agcccccgag accctcaggg attgaggccc aatgcttccc gcctctgctc 540cagcccacgc tgtggggcag ggccacatcc ttgtccccag gcccctgtcc 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ccatcgctcc cgactacagg aacatgatcg ggcagggggc ctaggccctt 2400cgttctcaca gcctgcctcc ctggccagca ggagcccccg cctccgcctc ggaccccatg 2460gctctctgct ctggccgctc cggacccctc cgcctcggga gaagcgcgca gctgatgcct 2520gccggcccct ccacgcagca gtgcggacag cacgcatctg tcgtccaccc ggcaggaccc 2580cacccagggc cagccctgac cgccagcctc ctggactcag ggctcctctg agaaaaggcc 2640cacttgttgg tcccctcagc ccacacccag gcagcctccg gtgggtgctt ccctggaccc 2700cagcctgagg cctatgcttg ttctcctgtg gctcttactc agaggcccgt gctggactcc 2760cacccacagg gacagtgccc tgctccaacc ctcactgcac tgggggtcat ggggccacct 2820tctgtgcagg ggtcctggct ccaaggagaa cactcgaagg gcctgcttgg ccacctggca 2880ccacgggagc cccgctgggt agcttggcag ggacccctga gtagaggtgg gtgcacccag 2940ccagaaagcc tgctggatgg acaggagcct ggcgtccggg ccccaggcag gcagacacgg 3000cttcatggac aggagaggcc aaggaacatc agcaaagaga gacagctggg ccgggcgttc 3060cagccagacc catcctgcag cccagcatcg gccccgtgta ctacagcagg gacagccagt 3120<210>11<211>2587<212>DNA<213>兔<400>11gcgagacgcc tgccagggca ccgccagtga ccctgaggcc cagcctcgcc gctccctccc 60ctcagtggac ccattcccac cacagtcctc cagcccctcc cctcccggcc ctcaccccct 120ccttggcttt aaccttgcga atgttggtga gatggatgaa taaagtgaat ctttgcactt 180gtgacttctc tctgcttctt catttaatgg ttattactca tggtttccca gttgccctaa 240agtcaccgcc atttcatcct ccatcccacc ctgccctgct gtcctccggg agacaccact 300ccctgaaacc cacaggcccc tgtcttcaca ccgccgaccc cgaccacacg tgaggggctt 360gcttcgtgtc tcactcccct catcgagccc cagagtcctc ctttagtgtt cttacagtca 420catacagtta tacagtttga gtcaatccaa cctgccctgc caatttccca aaacaaagat 480tttcagaata aaacagctat gaagaaagtc atttatggaa gcatgatata caacaacaaa 540acaatgcaaa caacctaact gaataagcag agggaaatgt tcagacacac tatggggctt 600gggcttcatg gagtattaca ccttcattac atttttaaac ttgtattaag gagctcctat 660attacaagga ttatactaga gcactttcca tgacctaatt aattctcatt acactgtgag 720gttaaaagca ttagttaaaa tattgggcag gctccctata gccaacagtt gttcatattc 780cataacccaa ccatcattta ggtgactcag ggtccttgtc caccaagaac tttggcaaga 840atgttcagag caacttcctt tataaaagtc aaaaattgga agtaactcaa atgtctacca 900acagtagaat gggctgttaa ttggcatatg tttacatatt agaatgctgt ttaataaaga 960gaattaacaa actacaacta tccctaataa cataggtgac tcataaacat gatgttaagc 1020acaagaaccc aaacacaaaa gacacactgt gtatgttttc atccatagga agttcaaaac 1080tagttaaaaa ttgaattaga aattgagatg aagtttactc ttggctgggg gtgtggagtg 1140aggcggtgcc tggtggggga cagaaagtgg ctgctggggt cttggtgatg ttctagtcct 1200cactgtggtg tgtgctactc tgaaaatgta ttgagtacac aattaggttt tgtgctttca 1260ttatactcca aagtaagttc tcataaacat tgccttacac ggggtctaca gataagagag 1320actaagagga atgagtaaca gatcaaggcc acacagctgg taggcatggg cctgggatca 1380aaccctgtct gcccaattct gctctcttga gccctacact attctttcca gcactggaat 1440gccatgcaga acagggagta ggacatgcta cctccctagg gtctcctcct ttacccacct 1500aaccaggagc acccatacat agaaacagga tggaaaagac catcagcaat ggaacaaggg 1560agagattaac cttgttcagt attgtgatcc catgtaggaa agattgtggg aggagggctg 1620cacacagagc accgtccccc ttctatgtgc ccaccgctct gtgccccctt atctgctcac 1680ccgcccagcg tgcattcact cagcaccctt ttcgcctgcc ctctgaaaga ggtgcagaag 1740taactaaacc agcttccctc cttcagtgac ttggaatcca gttttcctcc tctatttccc 1800cctccttttc agtgcaggag cctggagaaa tgtgatttgt gttattataa atttcccaca 1860tcattttgtg taagggaaaa tatactcaac agtcataact ggtaaaactg ctgtgaaaac 1920taagagaagt aattcatgcg aaggttgagc accagccttg tatatactaa gagatccaga 1980agtgttagtc accgttagaa ataagaagga gtagctcaat ttgactagtt cctggttcac 2040tccttgaaca tgttcttcag ttatcatctt tcagtcccaa atgattgaac ttggaattaa 2100ctcacatgga ttctagacct gtgccgagaa tggctgccac tcgtgctcta gagctctggg 2160gatgaggctg tccctactgt ggtgtgctac aggtctaaca acacaccagg ttttgaagac 2220ttagcactat gaatatatat atatattata ttccaataaa tttaacatac tttctacttt 2280cattgcatgt tgagatagta atctactttg gatatatttg gttaaaccaa actattctca 2340agacaaattt cataggttta tggttttttt acaatttaat caaaatataa acatagtcca 2400aacaattaat ccatttaaag tggagaatgg cccaagtgtt tgggcccctg ctacccattt 2460ttaagaccag atgttgctct tggcttctgg cttttgcttg gctcagccct ggccattgca 2520gccatctgag gagtaaacag tggatggaag acatctcccc ccaccctgcc cataaagctc 2580gggatcc 2587<210>12<211>1205<212>DNA<213>兔<220><221>未明确<222>(997)<223>第997位的n不确定<220><221>未明确<222>(1127)<223>第1127位的n不确定<400>12cttcagcgtg aaccacgccc tcccgctgag tctcacgcac ccccggtgca ggcagtccgg 60cctcacctgg aaggtgcact gactgaagac actgcaaggg gtgagagcat ttctcaggaa 120agagccctga gtttagaagg ccagagagca gagggctgag ggctgccttg cgctgcaacc 180catggaaaca caggcttagc agatgttcaa gctccgggag tccacactgg gtgagggcag 240gcgtccagcc tgacatggcc cccacagact cgcccacagg tgacgccaga tgaggacggt 300caaggatcgg gggatcctac atgcccaggg gcaccaagac agccaggaga gcaccagagg 360ccacaagaga ggcctgggac agtctccctg ctgacatcca gagcccaggc cccacttggc 420agagctggct gagaacacgt ctctgcggtg gaagctgccc cgtcctgggt gttgctcggc 480gggctaagcc gactgacgcg gggcgggcca ggccatcggc cccacggcct gcagcttcct 540ccccagccca ggccacgtgg gctcctggct gaactggccg ctcgctgagc tctcaccccc 600ccacccagca gcaggccggg cggtgctgcc atgagctcca ttcccaccac acaagcgaca 660gcccgggcag cgccccaggc ccacggggcg tttgctgtgc ggctcgcact cgctgctcag 720ggccagcgca gggtgcagca gggactcacc aacccgcccc gactcggctg gcacgtttac 780tggaggcctc tgagcctgac cgtggcagtg gggcccgagc aggctccagg ctgccccctg 840caccctgggc ttgccgctcc gggacccctg gtgggcacct tcccagatgt gctcccaccg 900tgcctccttg gggctctggg ctcatagcgg tcactctccg ccttctctcc tcccagccct 960ttcctgcctc cctatggccc catctagctc tgccctntct agagcctcta cctggaagga 1020atctgctgtt ggaccaagac accacccgca gcacaggtgg gcgccttgca ctgtgctagg 1080ccctccccgc acagaaaagg gccctaggct ctggaggctg ctgctgnctc tggggctggc 1140atcgggcgca ccctgcaccc tgcaccctga ggaaactcag gcctgcccgc tccaggcctg 1200tccct 1205<210>13<211>668<212> DNA<213>兔<400>13gaagctttac ttgttggggg cgggcaggtc taagggacct gccaggtgtg ggggctgggc 60ttgactcagc aggagccttc tagaaggaaa gctctggaga aggtgggggc agagggcggg 120aaaggcctgt gaggaggcgg gtggtgggca gggccactgg gaagggaggg ctgggggtga 180cactcaggtt ggcactgggg aggacctgag gaggcaggtg ccaggcacag agctgaacct 240gggcagggca ggggcaggta acaagaagga ttctccttgg agcctggtcc agggtggtcc 300agggcggtcc agggcctggg gtttgcaagc tgggctgtga cagggcctct ctccccaggg 360gcaagcagca aagcctgggc acagagccca aagcccccac acagagaagc tccccagggc 420agggcctgca gggcttgggg gaccttcttg gagcaggcag aggacagagg catgagatca 480gcctcccaga ggctggaatg ataggtccag caggaggggc ccacatgggc tctggttagc 540aggagaaaac agcccccagg tccccatggc caccacgcac cgactgctgg tgaagctttg 600ggtggcagac gagagccaca tggcagctgc tcctgtcact ctctgggagt gcatcgaggg 660gcgtcgac 668<210>14<211>45<212>PRT<213>骆驼<400>14Glu Pro Leu Leu Glu Glu Glu Ser Cys Ala Glu Ala Gln Ser Gly Glu 1 5 10 15Leu Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Ser Ile Phe Ile Thr Leu Phe Leu
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20 25 30Ser Val Cys Tyr Ser Ala Thr Val Thr Phe Phe Lys
35 40<210>16<211>44<212>PRT<213>人<400>16Glu Leu Gln Leu Glu Glu Ser Cys Ala Glu Ala Gln Asp Gly Glu Leu 1 5 10 15Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Thr Ile Leu Ile Thr Leu Phe Leu Leu
20 25 30Ser Val Cys Tyr Ser Ala Thr Val Thr Phe Phe Lys
35 40<210>17<211>44<212>PRT<213>人<400>17Glu Leu Gln Leu Glu Glu Ser Cys Ala Glu Ala Gln Asp Gly Glu Leu 1 5 10 15Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Thr Ile Phe Ile Thr Leu Phe Leu Leu
20 25 30Ser Val Cys Tyr Ser Ala Thr Val Thr Phe Phe Lys
35 40<210>18<211>44<212>PRT<213>小鼠<400>18Gly Leu Gln Leu Asp Glu Thr Cys Ala Glu Ala Gln Asp Gly Glu Leu 1 5 10 15Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Thr Ile Phe Ile Ser Leu Phe Leu Leu
20 25 30Ser Val Cys Tyr Ser Ala Ala Val Thr Leu Phe Lys
35 40<210>19<211>44<212>PRT<213>小鼠<400>19Gly Leu Asp Leu Asp Asp Val Cys Ala Glu Ala Gln Asp Gly Glu Leu 1 5 10 15Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Thr Ile Phe Ile Ser Leu Phe Leu Leu
20 25 30Ser Val Cys Tyr Ser Ala Ser Val Thr Leu Phe Lys
35 40<210>20<211>45<212>PRT<213>小鼠<400>20Pro Gly Leu Gln Leu Asp Glu Thr Cys Ala Glu Ala Gln Asp Gly Glu 1 5 10 15Leu Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Thr Ile Phe Ile Ser Leu Phe Leu
20 25 30Leu Ser Val Cys Tyr Ser Ala Ala Val Thr Leu Phe Lys
35 40 45<210>21<211>44<212>PRT<213>小鼠<400>21Glu Leu Glu Leu Asn Glu Thr Cys Ala Glu Ala Gln Asp Gly Glu Leu 1 5 10 15Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Thr Ile Phe Ile Ser Leu Phe Leu Leu
20 25 30Ser Val Cys Tyr Ser Ala Ser Val Thr Leu Phe Lys
35 40<210>22<211>44<212>PRT<213>小鼠<400>22Glu Leu Glu Leu Asn Gly Thr Cys Ala Glu Ala Gln Asp Gly Glu Leu 1 5 10 15Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Thr Ile Phe Ile Ser Leu Phe Leu Leu
20 25 30Ser Val Cys Tyr Ser Ala Ser Val Thr Leu Phe Lys
35 40<210>23<211>44<212>PRT<213>绵羊<400>23Leu Leu Leu Glu Glu Glu Ser Cys Ala Asp Ala Gln Asp Gly Glu Leu 1 5 10 15Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Ser Ile Phe Ile Thr Pro Phe Leu Leu
20 25 30Ser Val Cys Tyr Ser Ala Thr Val Thr Leu Phe Lys
35 40<210>24<211>44<212>PRT<213>绵羊<400>24Leu Leu Leu Glu Glu Glu Ser Cys Ala Asp Ala Gln Asp Gly Glu Leu 1 5 10 15Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Ser Ile Phe Ile Thr Leu Phe Leu Leu
20 25 30Ser Val Cys Tyr Ser Ala Thr Val Thr Leu Phe Lys
35 40<210>25<211>19<212>PRT<213>牛<400>25Leu Leu Leu Glu Glu Glu Ile Cys Ala Asp Asp Leu Asp Gly Glu Leu 1 5 10 15Asp Gly Leu<210>26<211>19<212>PRT<213>牛<400>26Leu Leu Leu Glu Glu Glu Ile Cys Ala Asp Ala Gln Asp Gly Glu Leu 1 5 10 15Asp Gly Leu<210>27<211>43<212>PRT<213>兔<400>27Leu Gln Leu Asp Glu Ser Cys Ala Glu Ala Gln Asp Gly Glu Leu Asp 1 5 10 15Gly Leu Trp Thr Thr Ile Thr Ile Phe Ile Ser Leu Phe Leu Leu Ser
20 25 30Val Cys Tyr Ser Ala Thr Val Thr Leu Phe Lys
35 40<210>28<211>27<212>PRT<213>骆驼<400>28Val Lys Trp Ile Phe Ser Ser Val Val Glu Leu Lys Arg Thr Ile Val 1 5 10 15Pro Asp Tyr Arg Asn Met Ile Gly Gln Gly Ser
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20 25<210>30<211>27<212>PRT<213>人<400>30Val Lys Trp Ile Phe Ser Ser Val Val Asp Leu Lys Gln Thr Ile Ile 1 5 10 15Pro Asp Tyr Arg Asn Met Ile Gly Gln Gly Ala
20 25<210>31<211>27<212>PRT<213>人<400>31Val Lys Trp Ile Phe Ser Ser Val Val Asp Leu Lys Gln Thr Ile Ile 1 5 10 15Pro Asp Tyr Arg Asn Met Ile Gly Gln Gly Ala
20 25<210>32<211>27<212>PRT<213>小鼠<400>32Val Lys Trp Ile Phe Ser Ser Val Val Glu Leu Lys Gln Thr Leu Val 1 5 10 15Pro Glu Tyr Lys Asn Met Ile Gly Gln Ala Pro
20 25<210>33<211>27<212>PRT<213>小鼠<400>33Val Lys Trp Ile Phe Ser Ser Val Val Glu Leu Lys Gln Thr Ile Ser 1 5 10 15Pro Asp Tyr Arg Asn Met Ile Gly Gln Gly Ala
20 25<210>34<211>27<212>PRT<213>小鼠<400>34Val Lys Trp Ile Phe Ser Ser Val Val Glu Leu Lys Gln Thr Leu Val 1 5 10 15Pro Glu Tyr Lys Asn Met Ile Gly Gln Ala Pro
20 25<210>35<211>27<212>PRT<213>小鼠<400>35Val Lys Trp Ile Phe Ser Ser Val Val Gln Val Lys Gln Thr Ala Ile 1 5 10 15Pro Asp Tyr Arg Asn Met Ile Gly Gln Gly Ala
20 25<210>36<211>27<212>PRT<213>小鼠<400>36Val Lys Trp Ile Phe Ser Ser Val Val Gln Val Lys Gln Thr Ala Ile 1 5 10 15Pro Asp Tyr Arg Asn Met Ile Gly Gln Gly Ala
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兔重链的核苷酸<400>51tgacctacct accctgccaa ggtcaggggt cctccaaggc aagggatcac atggcaccac 60ctctcttgca gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag 120cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt 180gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct 240acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg 300cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa 360agttggtgag aggccagcac agggagggag ggtgtctgct ggaagccagg ctcagcgctc 420ctgcctggac gcatcccggc tatgcagccc cagtccaggg cagcaaggca ggccccgtct 480gcctcttcac ccggaggcct ctgcccgccc cactcatgct cagggagagg gtcttctggc 540tttttcccca ggctctgggc aggcacaggc taggtgcccc taacccaggc cctgcacaca 600aaggggcagg tgctgggctc agacctgcca agagccatat ccgggaggac cctgcccctg 660acctaagccc accccaaagg ccaaactctc cactccctca gctcggacac cttctctcct 720cccagattcc agtaactccc aatcttctct ctgcagagcc caaatcttgt gacaaaactc 780acacatgccc accgtgccca ggtaagccag cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg 840acaggtgccc tagagtagcc tgcatccagg gacaggcccc agccgggtgc tgacacgtcc 900acctccatct cttcctcagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 960ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 1020gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 1080cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 1140gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1200aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg tgggacccgt 1260ggggtgcgag ggccacatgg acagaggccg gctcggccca ccctctgccc tgagagtgac 1320cgctgtacca acctctgtcc ctacagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc 1380cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt 1440ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa 1500gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt 1560ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct 1620gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatgag cgctgtgccg 1680gcgagctgcc cctctccctc ccccccacgc cgcagctgt 1719<210>52<211>390<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：编码人VH元件多肽序列的VH基因片段，其侧翼序列来源于
兔免疫球蛋白DNA<400>52tgagtgacag tgtcctgacc atgtcgtctg tgtttgcagg tgtccagtgt gaggtgcagc 60tgttggagtc cgggggaggt ctcgtccagc caggggggac cctgagactc acctgcgcag 120tctctggatt caccttcagt agctatgcaa tgagctgggt ccgccaggct ccagggaagg 180ggctggaatg ggtcggagcc attagtggta gtggtagcac atactacgcg gacagcgtga 240aaggccgatt caccatctcc agagacaact ccaagaacac gctgtatctg caaatgaaca 300gtctgagagc cgaggacacg gccgcctatt actgtgcgaa agacacagtg aggggccctc 360aggctgagcc cagacacaaa cctccctgca 390<210>53<211>445<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：含有人免疫球蛋白轻链Cκ基因片段，其侧翼为50个来源于
兔轻链免疫球蛋白κ基因的核苷酸<400>53catccacatg gcacccaggg gagatgtcca ctggtaccta agcctcgcca tcctgtttgc 60ttctttcctc aggaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc 120agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg 180ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca 240cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag 300cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc 360ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttagagcga gacgcctgcc agggcaccgc 420cagcgaccct gaggcccagc ctcgc 445<210>54<211>632<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：编码人Vκ元件多肽序列的Vκ基因片段，其侧翼序列来源于
兔免疫球蛋白DNA<400>54ggcaggctgc tcccacccca tgcaggaggc agtaccaggc aggacccagc atggacatga 60gggtccctgc tcagctcctg ggactcctgc tgctctggct cccaggtaag gagggaaaca 120acaaaaattt tattcagcca gtgtagccac taatgcctgg cacttcagga aattcttctt 180agaacattac taatcatgtg gatatgtgtt tttatgttcc taatatcaga taccagatgt 240tacatccaga tgacccagtc tccatcctct ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 300atcacttgcc gagccagtca gggcattagc aattacttag cctggtatca gcagaaacca 360gggaaggttc ccaagctcct gatttatgct gcatccactt tgcaatctgg ggtcccatcg 420cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctta ccatcagcag cctgcagcct 480gaagatgttg ccacctatta ctgtcaaaag tacaacagtg cccctccact tttcggcgga 540gggaccaagg tggagatcaa acgtaagtgc actttcctaa tgttcctcac cgtttctgcc 600tgatttgttt gctttttcca ttttttcgct at 632<210>55<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>55catacacagc catacatacg cgtgtggccg ctctgcctct ctcttgcagg tatggacagc 60aagcgaaccg 70<210>56<211>71<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>56atcagggtga cccctacgtt acactcctgt caccaaggag tgggagggac tcagaagaac 60tcgtcaagaa g 71<210>57<211>419<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：编码人免疫球蛋白轻链恒定区Cλ2的基因，其侧翼为
来源于鸡轻链基因的核苷酸<400>57catacacagc catacatacg cgtgtggccg ctctgcctct ctcttgcagg tcagcccaag 60gctgccccct ccgtcactct gttcccgccc tcctctgagg agcttcaagc caacaaggcc 120acactggtgt gtctcataag tgacttctac ccgggagccg tgacagtggc ttggaaagca 180gatagcagcc ccgtcaaggc gggagtggag accaccacac cctccaaaca aagcaacaac 240aagtacgcgg ccagcagcta tctgagcctg acgcctgagc agtggaagtc ccacagaagc 300tacagctgcc aggtcacgca tgaagggagc accgtggaga agacagtggc ccctacagaa 360tgttcatagt agtcccactg gggatgcaat gtgaggacag tggttcctca ccctccctg 419<210>58<211>416<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：编码人VJ免疫球蛋白多肽的VJ基因片段，
其侧翼序列来源于鸡免疫球蛋白DNA<400>58ttgccgtttt ctcccctctc tcctctccct ctccaggttc cctggtgcag tcagtgctga 60ctcagccgcc ctcggtgtca gcagccccgg gacaagaagt cacgatctcc tgctccgggt 120ctagtagcaa cattggcgat aatttcgtct cttggtacca gcagctgcct ggcactgccc 180ctaagcttct gatctatgat aacaacaaga gaccctcggg catccctgac cgattctccg 240gttccaaatc cggcacctca gccacattag gcatcactgg gctccaaacc ggcgacgagg 300ctgactatta ctgtgggact tgggacagca gcctttctgt tggtatgttt gggggcggga 360cacgcgtgac cgtcctaggt gagtcgctga cctcgtctcg gtctttcttc ccccat 416