鉴定黄瓜白粉病抗性的引物序列及其鉴定方法 【技术领域】
本发明涉及生物技术中的DNA引物序列及其利用DNA引物序列鉴定黄瓜白粉病抗性的方法。
背景技术
黄瓜白粉病(powdery mildew，Sphaerotheca fuliginea L.)是一种广泛发生的世界性植物病害。该病靠气流进行传播，喜温湿、耐干燥。在温度和湿度适宜的条件下，其病原体孢子萌发，病害先出现在植物下部叶片正面或背面，表现为白色小粉点，后扩大为粉状圆形斑。在条件适宜时，白色粉状斑点继续扩展，连接成片，成为边缘不明显的大片白粉区，直到布满整个叶片，看上去像长了一层白毛，所以俗称“白毛病”，患有白粉病的叶片逐渐变黄、发脆，白毛由白色转变为灰白色，最后使叶片失去光合作用功能。白粉病在黄瓜整个生长期均能发生，严重危害叶片，进而影响植株生长、结瓜，造成黄瓜减产，给蔬菜生产企业带来经济损失。
我国十分重视黄瓜的抗病育种研究。从上个世纪50年代末，育种家就通过常规杂交、自交等育种方法进行黄瓜抗白粉病和抗霜霉病等的选育工作，并取得了显著成就，先后育成了一批优良品种，在生产上发挥了很大的作用。
常规的抗病育种方法虽然发挥了很大作用，但也存在许多缺点。常规抗病品种的选育主要是通过杂交和多代自交，抗病材料的选择和田间鉴定过程复杂，周期相对较长，而且可靠性差。并大量地消耗人力、物力、财力及地力，加之黄瓜白粉病的病原(Sphaerothecafuliginea(Schlecht)Poll.)——单丝壳白粉菌(属子囊菌亚门真菌)——为专性寄生菌，只能在活体寄主上存活，使得黄瓜白粉病的发生受季节限制，在非发病季节对该病的田间鉴定工作则难以进行。
RFLP、RAPD等分子标记技术地问世，为育种提供了一条新的途径。分子标记可以直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题。
分子标记技术在寻找与目标性状连锁的分子标记方面已有诸多报道，但与黄瓜白粉病抗性相关基因紧密连锁的分子标记目前尚未见报道。在利用分子标记进行抗性鉴定的过程中，特异性的引物序列是关键。
【发明内容】
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种鉴定黄瓜白粉病抗性的引物序列；本发明的另一个目的是用鉴定黄瓜白粉病抗性的引物序列鉴定黄瓜白粉病抗性的方法。
本发明的技术方案概述如下：
鉴定黄瓜白粉病抗性的引物序列，它由上游引物：5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′，下游引物：5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′组成。
一种使用上述引物序列的鉴定黄瓜白粉病抗性的方法，它包括如下步骤：(1)提取黄瓜基因组的DNA；(2)进行PCR扩增，在PCR扩增专用薄壁管中放入：所述黄瓜基因组DNA 15～30ng、上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′20～40ng、下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′20～40ng、dNTP 0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为：94℃预变性180～300秒，94℃变性60秒，47～53℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35个循环，再72℃延伸300～420秒，扩增完成；(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：将扩增产物采用6％变性聚丙烯胺凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入变性凝胶上样缓冲液，于95℃变性300秒，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚兰刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后在可见光下观察、照相；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜白粉病的抗性。
第二种鉴定黄瓜白粉病抗性的引物序列，它包括两组引物，所述第一组引物由上游引物：5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′，下游引物：5′-TTC TGA TTT TGA GTG AAA AAC-3′组成，所述第二组引物由上游引物：5′-CTC AAG TTT TTT TCT TGT TTC-3′下游引物：5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′组成。
一种使用第二种引物序列的鉴定黄瓜白粉病抗性的方法，它包括如下步骤：(1)提取黄瓜基因组的DNA；(2)进行PCR扩增：在两支PCR扩增专用薄壁管中分别放入：所述黄瓜基因组DNA 15～30ng、在第一支扩增专用薄壁管中放入第一组上游引物5′-CAG TAAATG AAA GAA AAG AAG-3′20～40ng、下游引物5′-TTC TGA TTT TGA GTG AAA AAC-3′20～40ng、在第二支扩增专用薄壁管中放入第二组上游引物：5′-CTC AAG TTT TTT TCT TGT TTC-3′20～40ng下游引物：5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′20～40ng、再在两支扩增专用薄壁管中分别加入dNTP 0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2单位，加无菌重蒸馏水至20μ，将所述两支PCR扩增专用薄壁管分别进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性180～300秒，94℃变性60秒，第一支PCR扩增专用薄壁管在50～55℃退火40～60秒，第二支PCR扩增专用薄壁管在53～56℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35个循环，再72℃延伸5～7分钟，扩增完成；(3)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析：将两个扩增产物均采用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入凝胶上样缓冲液，混匀，然后点样于事先制备好的含有0.5μg/ml溴化乙锭的琼脂糖凝胶上，采用5V/cm的电压进行电泳使溴酚蓝泳至凝胶的2/3，紫外观察箱观察照相；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的位置，鉴定黄瓜白粉病的抗性。
该技术鉴定结果与田间抗病吻合率达94％，而且具有快速、准确、不受环境条件影响等优点，在黄瓜白粉病抗性筛选上具有很大的应用价值。
【附图说明】
图1是第一种技术方案的电泳图；
图2和图3是第二种技术方案的电泳图。
【具体实施方式】
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明：
实施例1
一种使用鉴定黄瓜白粉病抗性的引物序列鉴定黄瓜白粉病抗性的方法，包括如下步骤：(1)提取黄瓜基因组的DNA，提取的方法为常规方法；(2)进行PCR扩增，在PCR扩增专用薄壁管中放入：黄瓜基因组DNA 30ng、上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′30ng、下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′30ng、dNTP 0.2mM、Mg2+1.5mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶1单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为：94℃预变性300秒，94℃变性60秒，48℃退火60秒，72℃延伸120秒，35个循环，再72℃延伸420秒，扩增完成；(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：将扩增产物采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入变性凝胶上样缓冲液，于95℃变性300秒，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚兰刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后在可见光下观察、照相；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜白粉病的抗性，由于抗病单株、感病单株或中间类型单株经扩增以后产生不同分子量的DNA片段，在凝胶上分离时其在凝胶上的迁移速率不同，从而形成位置上存在差异的条带，通过条带在凝胶上的相对位置就可对黄瓜白粉病材料的抗性进行快速鉴定。如图1所示：1为指示DNA标准条带的分子量200bp；2为抗性带；3为感性带，M为DNA标准，泳道1及3～9为抗病单株；泳道2及10～16为感病单株；泳道17～23为中间类型单株，纯合抗性株仅有抗性带，纯合感性株仅有感性带，杂合类型同时具有抗性带和感性带。
实施例2
一种使用鉴定黄瓜白粉病抗性的引物序列鉴定黄瓜白粉病抗性的方法，包括如下步骤：(1)提取黄瓜基因组的DNA，提取的方法为常规方法；(2)进行PCR扩增，在PCR扩增专用薄壁管中放入：黄瓜基因组DNA 15ng、上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′20ng、下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′20ng、dNTP0.15mM、Mg2+1.2mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶1.2单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为：94℃预变性180秒，94℃变性60秒，47℃退火40秒，72℃延伸60秒，25个循环，再72℃延伸300秒，扩增完成；(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：将扩增产物采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入变性凝胶上样缓冲液，于95℃变性300秒，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚兰刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后在KANGRIDE可见光下观察、照相；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜白粉病的抗性。
实施例3
一种使用鉴定黄瓜白粉病抗性的引物序列鉴定黄瓜白粉病抗性的方法，包括如下步骤：(1)提取黄瓜基因组的DNA，提取的方法为常规方法；(2)进行PCR扩增，在PCR扩增专用薄壁管中放入：黄瓜基因组DNA 20ng、上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′40ng、下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′40ng、dNTP 0.25mM、Mg2+2.0mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶0.8单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为：94℃预变性240秒，94℃变性60秒，53℃退火60秒，72℃延伸100秒，30个循环，再72℃延伸600秒，扩增完成；(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：将扩增产物采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入变性凝胶上样缓冲液，于95℃变性300秒，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚兰刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后在KANGRIDE可见光下观察、照相；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜白粉病的抗性。
实施例4
是第二种技术方案中使用鉴定黄瓜白粉病抗性的引物序列鉴定黄瓜白粉病抗性的方法，它包括如下步骤：(1)提取黄瓜基因组的DNA，提取的方法为常规方法；(2)进行PCR扩增：在两支PCR扩增专用薄壁管中分别放入：黄瓜基因组DNA 30ng、在第一支扩增专用薄壁管中放入第一组上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′30ng、下游引物5′-TTC TGA TTT TGA GTG AAA AAC-3′30ng、在第二支扩增专用薄壁管中放入第二组上游引物：5′-CTC AAG TTT TTT TCT TGT TTC-3′30ng下游引物：5′-ATA CAT AGC CATACA AAA AT-3′30ng、再在两支扩增专用薄壁管中分别加入dNTP 0.2mM、Mg2+1.5mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶1单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述两支PCR扩增专用薄壁管分别进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性300秒，94℃变性60秒，第一支PCR扩增专用薄壁管在50℃退火60秒，第二支PCR扩增专用薄壁管在53℃退火60秒，72℃延伸120秒，35个循环，再72℃延伸7分钟，扩增完成；(3)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析：将两个扩增产物均采用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入凝胶上样缓冲液，混匀，然后点样于事先制备好的含有0.5μg/ml溴化乙锭的琼脂糖凝胶上，采用5V/cm的电压进行电泳使溴酚蓝泳至凝胶的2/3，紫外观察箱观察照相；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的位置，鉴定黄瓜白粉病的抗性，图2所示的是第一支扩增产物，1为指示DNA标准条带的分子量200bp；2为指示DNA标准条带的分子量100bp；3为抗性带，图3所示的是第二支扩增产物，1为指示DNA标准条带的分子量100bp；2为性带，两个图中的M为DNA标准，泳道1及3～9为抗病单株；泳道2及10～16为感病单株；泳道17～23为中间类型单株，在图2中，抗病单株和中间类型单株具有抗性带，而感病单株无此条带，据此可鉴定出纯合感病个体；在图3中，感病单株和中间类型单株均具有感性带，而抗病单株无此条带，据此可以鉴定出纯合抗病个体。将图2和图3结合在一起观察和分析，可以当作一个共显性的标记。在第一组中无带的为纯合感性株，在第二组中无带的为纯合抗性株，在两组中均有条带的为杂合中间型，据此快速鉴定出纯合抗性株、纯合感性株及杂合中间型株，实现黄瓜白粉病抗性的快速鉴定。
实施例5
是第二种技术方案中使用鉴定黄瓜白粉病抗性的引物序列鉴定黄瓜白粉病抗性的方法，它包括如下步骤：(1)提取黄瓜基因组的DNA，提取的方法为常规方法；(2)进行PCR扩增：在两支PCR扩增专用薄壁管中分别放入：黄瓜基因组DNA 30ng、在第一支扩增专用薄壁管中放入第一组上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′40ng、下游引物5′-TTC TGA TTT TGA GTG AAA AAC-3′40ng、在第二支扩增专用薄壁管中放入第二组上游引物：5′-CTC AAG TTT TTT TCT TGT TTC-3′40ng、下游引物：5′-ATA CAT AGCCAT ACA AAA AT-3′40ng、再在两支扩增专用薄壁管中分别加入dNTP 0.25mM、Mg2+2.0mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶0.8单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述两支PCR扩增专用薄壁管分别进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性200秒，94℃变性60秒，第一支PCR扩增专用薄壁管在55℃退火60秒，第二支PCR扩增专用薄壁管在56℃退火60秒，72℃延伸120秒，30个循环，再72℃延伸10分钟，扩增完成；(3)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析：将两个扩增产物均采用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入凝胶上样缓冲液，混匀，然后点样于事先制备好的含有0.5μg/ml溴化乙锭的琼脂糖凝胶上，采用5V/cm的电压进行电泳使溴酚蓝泳至凝胶的2/3，紫外观察箱观察照相；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的位置，鉴定黄瓜白粉病的抗性。
实施例6
是第二种技术方案中使用鉴定黄瓜白粉病抗性的引物序列鉴定黄瓜白粉病抗性的方法，它包括如下步骤：(1)提取黄瓜基因组的DNA，提取的方法为常规方法；(2)进行PCR扩增：在两支PCR扩增专用薄壁管中分别放入：黄瓜基因组DNA 15ng、在第一支扩增专用薄壁管中放入第一组上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′20ng、下游引物5′-TTC TGA TTT TGA GTG AAA AAC-3′20ng、在第二支扩增专用薄壁管中放入第二组上游引物：5′-CTC AAG TTT TTT TCT TGT TTC-3′20ng下游引物：5′-ATA CAT AGC CATACA AAA AT-3′20ng、再在两支扩增专用薄壁管中分别加入dNTP 0.15mM、Mg2+1.2mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶1.2单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述两支PCR扩增专用薄壁管分别进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性180秒，94℃变性60秒，第一支PCR扩增专用薄壁管在48℃退火40秒，第二支PCR扩增专用薄壁管在50℃退火40秒，72℃延伸60秒，25个循环，再72℃延伸5分钟，扩增完成；(3)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析：将两个扩增产物均采用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入凝胶上样缓冲液，混匀，然后点样于事先制备好的含有0.5μg/ml溴化乙锭的琼脂糖凝胶上，采用5V/cm的电压进行电泳使溴酚蓝泳至凝胶的2/3，紫外观察箱观察照相；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的位置，鉴定黄瓜白粉病的抗性。