安丝菌素苷类化合物及其药物组合物，其制备方法及其应用 技术领域：本发明涉及安丝菌素苷类化合物，其制备方法，以该化合物为活性成分的药物组合物，以及它在制备治疗病原菌感染病的药物中的应用及其在制备治疗和预防肺癌和白血病的药物中的应用。
背景技术：美登素或美登木素是一个于1972年首先从卫矛科植物美登木(Maytenusserrata，旧名M.ovatus)中分离到的抗癌化合物。它在植物中的含量极低，大约为2mg/kg(干样)，由于其抗KB细胞的ED50为10-4-10-5g/mL，使用药理跟踪检测才得以分离得到了该化合物。后来，发现其它采集于非洲的该科植物Maytenus buchanaii和Putterlickia verrucosa中美登素的含量较高，分别是14mg/kg和100mg/kg。从结构上讲，美登素属于大环内酰胺或I型多酮类化合物。其天然衍生物结构的主要变化是：1、C-3位羟基上酯基的不同，常见的酯基有简单脂肪酸酰基、N-取代的丙氨酸酰基。2、没有酯基侧链。÷没有C-3氧取代。≠没有C-3氧取代和C-4，5环氧丙环。≡没有N-甲基取代。尽管这类化合物主要是从卫矛科植物中分离得到，然而从其它科属的植物也有发现，例如Wani等报道从鼠李科植物Colubrina texensis分离出C-15氧取代的美登木素类化合物，colubrinol及其乙酸酯；Powell等也报道了从大戟科植物滑桃树(Trewianudiflora)种子中分离鉴定了一系列新的美登素类化合物。更值得注意的是从苔藓中也分离得到了美登素类化合物。最引人注目的是从微生物中发现了这类化合物。在筛选抗癌活性成分的过程中，Higashide等从分离自莎草科苔属植物叶子的微生物(最初鉴定为Nocardia sp.C-15003，后来更正成Actinosynnema pretiosum) 中得到了六个美登素衍生物，命名为安丝菌素P-0-P-4，分别是美登木素醇以及它的乙酸酯、丙酸酯、异丁酸酯、丁酸酯(P-3’)、异戊酸酯。随后从另一个橙色束丝放线菌亚种(A.pretiosumssp.Auranticum)中分离得了除上述六个化合物外的十五个新安丝菌素，其中P-3和P-4是主要成分。这些微生物为Takeda公司提供了充足地美登木素来源，使得他们得以通过半合成研究这类化合物的构效关系。临床前药理实验表明：在体外，美登素对白血病细胞系的抑制剂量为10-3-10-7g/ml；在体内，它对P-388淋巴白血病的有抑制作用，对小鼠L-1210白血病、Lewis肺癌、B-16黑素瘤的有效剂量为25-32g/kg天。其作用机理是覆盖微管的长春花碱结合点，从而阻止了微管的聚合。但是，在癌症患者身上的第一期和第二期临床实验结果却令人失望。在第一期临床，因肠胃毒性和神经毒性限制了用药剂量。第二期临床试验几种不同的肿瘤，但还是因为毒性明显，限制了使用剂量，以至于不能观察到明显疗效。然而，由于美登素类化合物的生理活性非常强，目前还在努力将它们开发为临床上有用的抗癌药，例如将美登素或美登素衍生物与以肿瘤细胞为靶点的抗生素结合制成导弹药物。研究还表明，美登素类化合物由于对昆虫有拒食活性从而有杀灭作用。目前为止，现有技术中未见有安丝菌素苷类化合物的报道。
发明内容：本发明的目的在于提供一种安丝菌素苷类化合物，其制备方法，以该化合物为活性成分的药物组合物，以及它在制备治疗病原菌感染病的药物中的应用及其在制备治疗和预防肺癌和白血病的药物中的应用。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案：
式(I)所示的安丝菌素苷类化合物：
R＝H安丝菌素苷P-0 R＝COCH3安丝菌素苷P-1 R＝COCH2CH3安丝菌素苷P-2 R＝COCH(CH3)2或CO(CH2)2CH3安丝菌素苷P-3 R＝COCH2CH(CH3)2或CO(CH2)3CH3安丝菌素苷P-4 R＝CO(CH2)2CH(CH3)2或CO(CH2)4CH3安丝菌素苷P-5 R＝CO(CH2)3CH(CH3)2或CO(CH2)5CH3安丝菌素苷P-6
上述安丝菌素苷类化合物的制备方法，包括使用配方组成不同于常规的混合溶剂对橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum ssp.aurantium ATCC31565)固体发酵产物进行提取以及安丝菌素苷类化合物的分离纯化到式(I)化合物。
具体地，用YMG培养基对橙色束丝放线菌进行固体发酵(3.5L)，培养物切成小块，用乙酸乙酯/甲醇/冰乙酸(80∶15∶6)浸提，反复浸提多次，合并提取液，减压浓缩蒸去有机相，剩余水相用氯仿萃取，氯仿和水相分液后，分别蒸干，然后对提取物和水相分别进行分离，应用反复正相、反相、大孔树脂、葡聚糖凝胶柱层析，抗真菌活性追踪、薄层层析和液相色谱—质谱联用仪检测将组分相同的洗脱液进行合并分别得式(I)中的化合物。
用于预防和治疗肺癌的药物组合物，其中含有治疗有效量的式(I)化合物和药学上可以接受的载体。
用于预防和治疗白血病的药物组合物，其中含有治疗有效量的式(I)化合物和药学上可以接受的载体。
此外，本发明提供了式(I)化合物在制备预防和治疗肺癌的药物上的应用，在制备预防和治疗白血病的药物上的应用以及在制备治疗病原菌感染病的药物上的应用。
发明人发现本发明化合物对肺癌、白血病、多种人体病原菌感染具有预防和治疗作用。本发明的药物组合物含有治疗有效量的式(I)化合物和药学上可以接受的载体。
本发明的化合物和药物组合物可用于制备预防和治疗肺癌、白血病以及抗人体病原菌的药物。
上述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等，粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明化合物可以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。优选的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、栓剂、鼻喷雾剂和注射剂，特别优选在肠道的特定部位释放的制剂。
本发明的药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。
本发明的药物组合物优选含有重量比为0.1％-99.5％的活性成分，最优选含有重量比为0.5％-95％的活性成分。
本发明化合物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01-10mg/kg体重，优选0.1-5mg/kg体重。可以一次或多次施用。
附图说明：图1为橙色束丝放线菌发酵及提取流程图；
图2为化合物安丝菌素苷P-2的分离流程。
具体实施方式：下面结合本发明的附图用实施例来使本专业技术人员更全面的了解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：
1、安丝菌素苷类化合物的制备(以安丝菌素苷P-2为例)：
橙色束丝放线菌为安丝菌素类化合物的产生菌。从该菌的发酵提取物中分离得到一系列安丝菌素类化合物(ansamitocins P-0，P-1，P-2，P-3，P-4)。本申请人利用固体发酵和液质联用检测及活性跟踪的方法，不仅检测到了安丝菌素类化合物，还从其水提物中分离到有抗癌和抗真菌活性的安丝菌素苷P-0，P-1，P-2，P-3，P-4，P-5，P-6。用液质联用也检测到了与安丝菌素P-0，P-1，P-2，，P-3，P-4相对应的葡萄糖苷(安丝菌素苷P-0，P-1，P-2，P-3和P-4)的分子离子峰。
1.1橙色束丝放线菌的固体发酵和化合物的提取
首先把橙色束丝放线菌菌种从甘油管中转移出，进行斜面活化。活化用培养基为固体YMG培养基[其组成为葡萄糖4g，麦芽提取物10g，酵母提取物4g，琼脂15g蒸馏水1000mL，pH7.2(灭菌前)]，28℃恒温培养箱中培养5天。固体发酵用YMG培养基。划线后28℃恒温培养箱中培养7天，发酵规模为3.5升。
把固体发酵物连同培养基一起划成小块，用乙酸乙脂/甲醇/冰乙酸(80∶15∶5)浸泡提取多次。过滤后，合并提取液，减压浓缩蒸去有机相，剩余水相用氯仿萃取多次。氯仿和水相分液后，分别蒸干。抗真菌活性实验表明，水相(15g)和CHCl3提取物(1.177g)均显示出极强的抗真菌活性，TLC显示安丝菌素类化合物主要在CHCl3提取物中，水相中则没有。为了确定水相中的抗真菌活性成分，因此用活性跟踪法对水提物进行了分离。本实验的指示真菌为橙色青霉(Penicillium.avellaneum UC-4376)。具体的发酵及提取流程如图1所示。
1.2水提物中活性化合物安丝菌素苷类成分的活性追踪分离(以安丝菌素苷P-2为例)
首先用中压反相柱层析进行初步分离，分别用30％MeOH，50％MeOH，70％MeOH，100％MeOH各1L进行洗脱，分成四部分。抗真菌实验表明50％MeOH，70％MeOH洗脱部分有抑制指示菌生长的活性。经反复凝胶柱层析、硅胶柱层析和反相硅胶柱层析，结合活性跟踪从水提物中分离得到一个活性化合物安丝菌素苷P-2。分离流程如图2所示。
得到的安丝菌素苷P-2纯度仍不好，因此用反相中压，以MeOH/H2O(1∶1)为洗脱剂进一步纯化得到化合物安丝菌素苷P-2.
2.化合物安丝菌素苷P-2的结构鉴定：
快速原子轰击质谱FABMS给出化合物的分子量为767，并且有裂去葡萄糖的碎片峰607。高分辨快速原子轰击质谱给出该化合物的分子式为C36H48ClN2O14(HRFAB-MS，实测值：767.2811计算值：767.2794)。
化合物安丝菌素苷P-2的碳谱(包括DEPT)给出36个信号：包括4个甲基，3个甲氧基，5个亚甲基，15个次甲基和9个季碳。根据HMQC和HMBC实验，我们确定了安丝菌素苷P-2的结构为安丝菌素类化合物。根据C-1”位质子与C-1的远程相关关系，确定了糖的取代位置是在酰氨键的N上，因此化合物安丝菌素苷P-2的化学结构式鉴定为如图1所示，并对全部的NMR光谱数据进行了指定，确定为一新化合物。
3、化合物安丝菌素苷P-2的抗菌和抗癌活性测试：
化合物安丝菌素苷P-2是以橙色青霉(P.avellaneum UC-4376)作为指示菌进行分离得到的，所以推测该化合物还有抗其他真菌和细菌的活性。于是我们进行了其它抗菌活性检测。
3.1抗菌活性
指示菌：橙色青霉(P.avellaneum UC-4376)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis).
实验方法：纸片扩散法
活性指标：有无透明的抑菌圈以及抑菌圈的大小，抑菌圈越大，表明活性越强。
表1、安丝菌素苷P-2的核磁共振数据。 No 13C 1Hb HMBC 1 172.9s / / 2 34.7t 2.50(m)，2.20(m) C-1，C-3，C-4 3 77.8d 4.76(dd，2.9，10.0) C-1，C-2，C-4，C-4a，C-5(w) 4 62.0s / / 5 68.0d 2.72(d，9.3) C-3，C-4，C-6a 6 39.2d 1.18(m) C-6a 7 75.9d 4.20(dt，2.8，11.1) C00-7 8 37.4t 1.53(m) C-7，C-9，C-10 9 81.8s / / 10 89.7d 3.55(m) C-9 11 129.3d 5.53(dd，8.1，15.2) C-9，C-13 12 134.0d 6.63(dd，11.0，15.8) C-10，C-13，C-14 13 125.5d 6.26(d，10.8) C-11，C-12，C-14，C-15，C-15a 14 141.5s / / 15 47.5t 3.61(m)，3.32(m) C-1，C-13，C-14，C-14a，C-21 16 123.4s / / 17 126.3d 7.21(s) C-15，C-16，C-19，C-21 18 137.3s / / 19 155.3s / / 20 157.1s / / 21 115.2d 7.17(dt，1.9，5.0) C-14，C-17，C-20 MeO-10 56.9q 3.36(s，3H) C-10 NHCO-9 159.3s / / MeO-20 57.1q 3.98(s，3H) C-20 1’ 175.2s / / 2’ 27.7t 2.77(m)，2.56(m) C-3’ 3’ 8.5q 1.08(t，7.4，3H) C-1’，C-2’ 4a 12.1q 0.8(s，3H) C-1，C-4，C-5，C-6 6a 14.7q 1.21(d，6.3，3H) C-5，C-6，C-7 14a 15.8q 1.75(s，3H) C-13，C-14，C-15 1” 84.4d 5.74(dd，9.4，13.4) C-1，C-2’ 2” 71.7d 3.13(t，9.3) C-1”，C-5” 3” 78.6d 3.48(m) C-2” 4” 73.0d 4.25(t，9.4) C-3”，C-3”，C-5” 5” 77.0d 6.90(br d，16.0) C-1’，C-3’ 6” 62.9t 3.64(m)，3.45(m) C-4”
表2.安丝菌素苷P-2对指示菌的抑制作用
Table 2.Inhibitory activities of compound ansamitocinoside P-2 against tested
microorganisms at 100g/disc
菌株 P.a vellaneum UC-4376 Staphylococcus aureus Mycobac terium tuberculosis
活性 100g/disc(MIA) - -
结论：从表2活性结果可以看出，该化合物对橙色青霉(P.avellaneum UC-4376)有一定的生长抑制作用。但是在100g/disc的浓度下，化合物安丝菌素苷P-2没有表现出对其它测试细菌的抑制活性。
3.2抗肿瘤生物活性体外筛选实验
筛选方法：四氮唑盐(methyl-thiazol-tetozolium，MTT)还原法*硫酰罗丹明B(sulforhodamine B，SRB)蛋白染色法
细胞株：P388小鼠白血病*和A-549人肺腺癌
作用时间：48*-72小时
结果评定：无效：10-5mol/L＜85％
弱效：10-5mol/L≥85％或10-6mol/L＞50％
强效：10-6mol/L＞85％或10-7mol/L＞50％
表3、安丝菌素苷P-2对小鼠白血病细胞P388和人肺腺癌细胞A-549的抑制率。
Table 3.The inhibitory rate of ansamitocinosideP-2 against tumor cells
浓度(M) 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 IG50 95％可信限 评价
(M)
细胞株 P388
抑制率 100 99.9 93.3 41.5 15.7 0.07 0.03-0.15 强效
细胞株 A-549
抑制率 90.6 83.7 72.0 0 0 6.47 0.56-75.29 弱效
结论：从表3可以看出，安丝菌素苷P-2在浓度为10-6M时，对小鼠白血病细胞P388有强效抑制作用，对人肺腺癌细胞A-549有弱效的抑制作用，所以该化合物对肿瘤细胞有选择的抑制作用，所以活性部位可以作为有关癌细胞的化学抑制剂。
实施例2：
片剂：安丝菌素苷P-2 1mg
乳糖 180mg
玉米淀粉 50mg
硬脂酸镁 3mg
实施例3：
胶囊剂：安丝菌素苷P-2 1mg
乳糖 190mg
硬脂酸镁 2mg
制备方法：将安丝菌素苷P-2与助剂混合，过筛，在合适的容器中均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，安丝菌素苷P-2含量为1mg。
实施例4：
安瓿剂：安丝菌素苷P-2 1mg
氯化钠 9mg
制备方法：将安丝菌素苷P-2和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液在无菌条件下装入安瓿瓶中。