“细胞-组织”的培养方法 【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，具体地说是“细胞-组织”的培养方法。
背景技术
植物细胞大量培养技术是在植物组织培养快速繁殖的基础上发展起来的。具体的做法就是把植物细胞从试管或三角瓶内转移到微生物发酵的大型发酵罐里，给予适当的条件进行培养，使植物细胞像微生物一样在发酵罐里大量繁殖，然后从大量增殖的植物细胞内直接提取有用的物质。
目前，世界各国如美国、日本、德国、俄罗斯、英国等国的科学家、企业界都在加紧研究，密切注视着植物细胞大量培养工作。
我国在植物细胞大量培养技术研究上也取得了很好的成绩，在人参、黄连、西洋参、三七等药用植物细胞大量培养方面取得了不少科研成果。例如，用细胞大量培养技术从人参细胞提取的培养物，主要有效成分的含量达70％左右，比人工栽培的人参地有效成分高得多。
植物组织培养，就是分离植物体的一部分组织，如根、茎段、叶、花、幼胚等，在无菌试管中，配合一定的营养、激素、温度、光照等条件，使其产生完整植株。由于其条件可以严格控制，生长迅速，1个月左右即为一个周期，因此在植物的生产上有重要应用价值。
生物技术是我国、也是世界21世纪重点发展的技术领域。植物细胞大量培养技术虽然自1970年以来取得了不少成果，尤其是细胞繁殖速度快，污染率低，引人瞩目。但是无论在细胞的培养成本上，还是工艺的改进上，都存在着很多问题。而组培虽然被称为快速繁殖，但是它的繁殖速度离我们的理论值和期望值就显的太慢，而且污染率高，所以大多数组培室无论是数量还是成本都与我们社会要求有很大的差距。为解决细胞培养成本高，组织培养速度慢的问题，是否能找到一种既有细胞培养和组织培养的优点，又能克服细胞培养和组织培养缺点的方法，就成为该发明所要解决的问题。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种能增加繁殖速度、降低成本的“细胞-组织”的培养方法。
本发明的技术方案为：先将培养的植物组织在研钵体中加少许液体培养基研磨后接种，进入旋转式摇床，培养温度25±1℃，黑暗条件下进行细胞悬浮培养，将增殖的植物细胞悬浮液倒入有滤纸的布氏漏斗，抽去培养液，再用蒸馏水洗涤若干次，对培养的细胞进行细胞生长测定，选取细胞生长进入静止期的细胞再接入固体培养基进行丛芽增殖培养，选择生长良好的芽接入生根培养，最后出苗。
以上所述的细胞悬浮液体培养基的配制方法是用MS基础培养基添加BA0.3～0.6mg/L、NAA 1～5mg/L、LH 0.5～1.5mg/L、蔗糖19～22g/L混合配制而成。
固体培养基的配制方法是用MS基础培养基添加6BA和NAA分别为0.2～2mg/L、0.1～0.9mg/L。
本发明的“细胞-组织”的培养方法，能把过去组织培养方法增殖植物的速度提高20倍以上，成本下降50％。据统计，中药的80％来源于植物，而绝大多数药用植物是采摘野生的，这就意味着总有一天会把野生的药用植物采光。现在已有上百种药用植物紧缺或处于濒危状态，即使用种子人工栽培的方法生产药用植物，繁殖数量也是有限的。因此，使用植物“细胞-组织”培养技术，可以使培养的植物种苗生产速度比传统的组培速度快20倍。
将细胞培养与组织培养有机的结合，充分发挥细胞培养和组织培养的优点，结合成为“细胞-组织”培养就显出它强大的生命力，也就是本发明的最大创新点，并可以发展成为一个新兴的技术领域。
【具体实施方式】
实施例1：灯盏花(Erigeron breviscapus)的培养
1、灯盏花外植体的选择及培养：
由高产的亲本植株建立的培养物，其后代产量高于由低产的植株所建立的培养物。
A、选择：通过随机选取灯盏花野生植株20株，测定灯盏乙素含量，如下表(表1)所示：
表1 20株灯盏花中灯盏乙素的含量
Tab1 The scutellarin content in 20 individual Erigreron breviscapus(mg/g) D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 0.315 0.438 0.512 0.491 0.387 0.514 0.547 0.425 0.641 0.448 D11 D12 D13 D14 D15 D16 D17 D18 D19 D20 0.487 0.574 0.653 0.396 0.469 0.391 0.479 0.592 0.473 0.427 平均 4.79 最大 6.53 最小 3.15
选择灯盏乙素含量最高株(D8＝6.53mg/g)和最低株(D15＝3.15mg/g)进行愈伤组织诱导，建立无性系，分别标记为Dmax和Dmin。
b、培养诱导愈伤组织及灯盏乙素含量测定
取灯盏花叶片，用洗洁净水清洗干净后，在流水下冲洗10min，然后转到洁净工作台上，吸干水分，先用70％酒精灭菌30s，再转入0.1％的HgCl2溶液中灭菌6min，无菌蒸馏水冲洗5次，叶柄剪成0.4cm长的小段，叶片剪成0.5×0.5cm2的小块，接种于愈伤组织诱导培养基MS+6-BA0.2mg/L+NAA2mg/L+蔗糖30g/L，用0.7％的琼脂固化，高温灭菌前pH调为5.8，培养温度25±1℃。外植体接种后一周左右即可见明显膨大，20d左右形成直径约1cm左右的愈伤组织。将愈伤组织切割后转到同样培养基上进行继代增殖培养。F1代时，每瓶接种1.0g(DW)愈伤组织(干重0.12g，折干率为88％)，每种愈伤组织各接种10瓶，共1.2g(DW)。以后将增殖的愈伤组织全部接种作为下一次增殖的起始材料，增殖周期为18d。继代3代后，各取50g(鲜重)，测定灯盏乙素的含量。
表2不同细胞系愈伤组织中灯盏乙素含量
Dmax Dmin
F1 F2 F3 F1 F2 F3
愈伤组织收获量(FW)(g/瓶) 29.54 63.34 207.06 24.38 61.12 190.66
愈伤组织收获量(DW)(g/瓶) 3.230 7.724 20.364 2.942 7.113 20.816
愈伤组织生长率(干重)(％) 169.28 138.82 163.65 145.36 141.77 192.64
灯盏乙素含量(mg/g) 0.040 0.015
结果表明，来源于两株灯盏花的愈伤组织生长并无显著差异，愈伤组织中灯盏乙素的含量明显低于原植株，而且来源于不同植株的愈伤组织，其灯盏乙素的含量不同。灯盏乙素在来源于高含量植株的愈伤组织(Dmax)中的含量明显高于来源于低含量植株的愈伤组织(Dmin)。
2、进行细胞悬浮培养：
用100ml三角瓶(其他容器也可以，大小不限)，内盛25ml液体培养基MS+BA 0.4mg/L+NAA 3mg/L+LH 1.0g/L+蔗糖20g/L，进行细胞悬浮培养。对较大的愈伤组织块，先在研钵中加少许液体培养基研磨后接种。旋转式摇床转速125r/min，培养温度25±1℃，完全黑暗条件下培养。将已可收获的细胞悬浮液倒入有滤纸的布氏漏斗，抽去培养液，再用蒸馏水洗涤若干次，再抽干备用。
3、丛芽增殖培养：
选取上述生长进入静止期的备用细胞再接入固体培养基进行丛芽增殖培养，6BA和NAA的最适浓度分别为0.5mg/L、0.1mg/L。
4、根的诱导：
生根培养时，选择生长良好的芽接入生根培养基培养，生根用IBA0.01mg/L+MS培养基，经14天生根。
5、出瓶、炼苗移栽：
当根长0.5cm，叶生长到3-5片时，无须在培养瓶中练苗，直接把生根的灯盏花苗从培养瓶中取出，移入珍珠岩基质中，保持一定空气湿度、温度，经2周后，移至大田中栽培。
实施例2：铁皮石斛(Dendrobium candidum)的培养
1、铁皮石斛外植体的选择及培养：
选择铁皮石斛茎段，用洗洁净清洗干净后，在流水下冲洗2小时，然后转到洁净工作台上，吸干水分，先用70％酒精灭菌30s，再转入0.1％的HgCl2溶液中灭菌6min，无菌蒸馏水冲洗5次，茎段剪成1cm长的小段，接种于愈伤组织诱导培养基MS+6-BA3mg/L+NAA2mg/L+蔗糖30g/L，用0.7％的琼脂固化，高温灭菌前pH调为5.8，培养温度25℃。外植体接种后20天后可见明显芽。
2、铁皮石斛细胞悬浮培养：
取上述培养的芽，先在研钵中加少许液体培养基研磨后接种。用100ml三角瓶(其他容器也可以，大小不限)，内盛25ml液体培养基MS+BA0.5mg/L+NAA 1mg/L+LH 1.0g/L+蔗糖20g/L。进行细胞悬浮培养。旋转式摇床转速125r/min，培养温度25℃，完全黑暗条件下培养。将已可收获的细胞悬浮液倒入有滤纸的布氏漏斗，抽去培养液，再用蒸馏水洗涤若干次，再抽干，备用。
3、芽增殖培养及根的诱导：
选取细胞生长进入静止期的铁皮石斛细胞再接入固体培养基进行丛芽增殖培养，6BA和NAA的最适浓度分别为1mg/L，0.5mg/L。在芽生长过程中，植株生长到2cm左右在该培养基中可接着生根。
4、出瓶、炼苗移栽：
当根长1cm，无须在培养瓶中练苗，直接把生根的铁皮石斛苗从培养瓶中取出，移入珍珠岩基质中，保持一定空气湿度、温度，经2周后，移至栽培基质(如树干上等)栽培。