一种洁净简便高效降解核酸的方法 技术领域 本发明涉及利用过氧化物在紫外光照或金属离子存在下，生成羟基自由基，将大分子的核酸非特异性地降解成小片段的方法。
背景技术 核酸大分子非特异性地降解或分解成合适的片段在许多领域都是非常重要的。这些领域包括：1)DNA序列分析；2)DNA足迹技术；3)从细胞中提取蛋白质或酶的分离纯化过程；4)其他需要将大分子核酸降解的领域。
1)DNA序列分析
对于大分子核酸如基因组的DNA测序，鉴于每一个测序反应对DNA的长度有限制，一般需要先将大片段的DNA降解成较小的片段。常规方法是用核酸酶处理，或者超声波打段核酸片段，之后电泳分离。核酸酶价格昂贵，在测序之前需要彻底去除；而超声波法间歇性高频率打段核酸大分子的操作过程不易控制，因此合适的降解核酸的方法仍值得探索。
2)DNA足迹技术
DNA足迹技术主要用于检测和鉴定转录因子对DNA的序列特异性结合能力，如果同时进行DNA化学测序，即可判段出结合区的精确顺序。该技术仍然是目前最常用的研究DNA-蛋白质相互作用的最常用方法。通常，未与蛋白质结合的DNA都是用DNaseI来解降，但是核酸酶往往分子尺寸太大而不能获得高的分辨率(Chinese ScienceBulletin，2000，45(2)：2017-2028)，因此研究开发一类小分子DNA切割剂替代大分子核酸酶将十分有意义(Nature，1988，332(6165)：663)。
3)蛋白质或酶地制备
从细胞中提取酶等蛋白质分子过程中，首先要经过细胞破碎。细胞破壁之后，其胞内核酸的存在会增加体系的粘度从而干扰酶的分离纯化，特别是进行超滤操作时该现象更为突出。除了某些生物体自身含有高活性核酸酶，不存在此问题以外，一般情况下核酸必须通过加入沉降剂沉降或加入外源的核酸酶降解。另外，如果纯化的目标是以包含体的形式存在，因包含体在形成过程中会结合核酸，因此其预处理也是需要除核酸。
目前公开使用的有多种更专一的沉淀剂，即一些带正电的可以与带负电的核酸磷酸残基形成复合物的物质。按其效率由大到小的顺序，这些化合物是：聚乙烯亚胺，阳离子表面活性剂溴化十六烷基三甲基铵，硫酸链霉素以及硫酸鱼精蛋白。同样地，他们也会与某些酶形成我们所不希望存在的复合物。硫酸铵沉淀法可以很有效地除核酸，但同时也会将一些蛋白质去除，影响目的蛋白质的收率。
有一点十分重要的是：用于分解核酸的试剂不能损伤蛋白质，而且可以很容易将他们从纯化步骤中去除。通常人们在分离纯化之前的予处理阶段，用核酸降解酶来除核酸，然后在后面的阶段检测验证这些酶确已被去除。但是，这些酶都非常昂贵。因此，新的降解核酸的方法将十分有前途。
有时，核酸需通过阴离子交换层析(如：DEAE-和Q-等阴离子交换剂)高效去除，以保证蛋白质制品特别是用于人体注射目的的蛋白质药物绝对不含核酸。在这种情况下，细胞破碎液中的核酸也需要在上柱前先行降解，以降低粘度，避免核酸分子与分离介质或蛋白质结合从而损害分离纯化的效率。
综上所述，无论是从常规应用的角度或是从分离纯化角度，安全快速高效的核酸去除方法在蛋白质或酶制作过程中是十分重要的。
4)其他
在其他需要将大分子核酸降解的领域中，包括便于人体或动物吸收的核酸营养品等。
在发明的目的是提供一种高效快速降解大分子核酸生成小片段和去除细胞破碎液中核酸的新方法。
发明内容 本发明提供了一种利用过氧化物在有紫外光照、金属离子或它们同时存在下生成羟基自由基·OH的原理，可以高效快速地降解动物、植物或微生物细胞破碎液或其基因组DNA中核酸的新方法。
本发明所用的过氧化物的化学结构通式为：
R-O-O-H
式中R＝H，R’，COR’或OOR’；
R’＝CH3，CH2H5或CnH2n+1，n＜15；
C6HmX5-m，m＝0-5；C10HmX8-m，m＝0-8；C10HmX6-mO2，m＝0-6；
C14HmX10-m，m＝0-10；C14HmX8-mO2，m＝0-8；
X＝CH3，C2H5，NO2，N(CH3)2，N(C2H5)2，COOCH3，COOC2H5，F，Cl，Br
或I；
本发明所用的金属离子为：Fe2+，Cu2+，Cd2+，Co2+，Hg2+，Sn2+，Zn2+，Mg2+，Ca2+或其它过渡金属离子；
本发明所用的动物细胞是软体动体或脊椎动物细胞；
本发明所用的植物细胞是裸子植物或双子叶植物细胞；
本发明所作的微生物细胞是细菌或病毒；
本方法是将上述结构的过氧化物直接加到生物体细胞破碎液或基因组DNA中，使其终浓度为0.0001-1M，同时加入乙二胺基四乙酸-Fe2+络合物，至其终浓度为0.1-10mM，室温下反应1-60分钟，将细胞破碎液中的核酸全部降解；用金属离子Fe2+，Cu2+，Cd2+，Co2+，Hg2+，Sn2+，Zn2+，Mg2+，Ca2+或其它过渡金属离子替换Fe2+，均可将核酸降解，而以Fe2+，Cu2+，Cd2+，Co2+金属离子降解效果最佳；当用生物体细胞破碎液代替其基因组DNA时，不加或少加金属离子也能达到理想的降解效果；将上述过氧化物直接加到生物体基因组DNA中，至其终浓度为0.01M，同时用400nm光照和(或)加入乙二胺基四乙酸-Fe2+络合物处理30分钟，可将核酸全部降解。
本方法的用途，是用于包括除DNA足迹技术外的DNA序列分析，从细胞中提取蛋白质或酶的分离纯化过程核酸的降解以及其他需要将大分子核酸降解的领域。
附图说明 图1为过氧化氢降解大肠杆菌基因组DNA
1％琼脂糖凝胶电泳分析不同浓度的过氧化氢对基因组DNA的降解效率。栏1至5分别代表加入过氧化氢的不同浓度0.3M，0.1M，0.01M，0.001M，0.0001M。
图2为金属离子的存在影响过氧化氢对基因组大肠杆菌DNA的降解
1％琼脂糖凝胶电泳分析加入不同金属离子对过氧化氢降解基因组DNA的影响。栏1代表不加入金属离子的空白对照；栏2至10分别代表加入Cu2+，Hg2+，Cd2+，Co2+，Sn2+，Zn2+，Mg2+，Ca2+，Fe2+。
图3为金属离子的加入影响过氧化氢对大肠杆菌细胞破碎液中核酸的降解
1％琼脂糖凝胶电泳分析加入不同金属离子对过氧化氢降解大肠杆菌细胞破碎液中核酸的影响。栏1至9分别代表加入Cu2+，Hg2+，Cd2+，Co2+，Sn2+，Zn2+，Mg2+，Ca2+，Fe2+；栏10代表不加入金属离子的空白对照。
图4为紫外光照下过氧化氢对基因组DNA的损伤作用
栏1，加入EDTA-Fe2+，紫外光照；栏2，仅加入EDTA-Fe2+；栏3，加入0.01M过氧化氢和EDTA-Fe2+；栏4，加入0.01M过氧化氢和EDTA-Fe2+，紫外光照；栏5，加入0.01M过氧化氢，紫外光照；栏6，加入0.01M过氧化氢；栏7，大肠杆菌基因组DNA作为空白对照。
图5为过氧化氢对植物基因组DNA的损伤作用
栏1，大豆基因组，反应10min；栏2，玉米基因组，反应10min；栏3，大豆基因组，反应5min；栏4，玉米基因组，反应5min；栏5，大豆基因组不加入过氧化氢，空白对照；栏6，玉米基因组不加入过氧化氢，空白对照。
图6为其他过氧化物对大肠杆菌基因组DNA的降解作用
栏1，不加过氧化物；栏2，加入过氧化氢；栏3，加入过氧乙酸；栏4，过氧甲酸。
图7为过氧化氢存在对细胞内蛋白质的损伤作用
10％SDS-PAGE分析不同浓度的过氧化氢的存在对大肠杆菌细胞内蛋白质的损伤作用。蛋白质用考马斯亮蓝R-250染色。栏1-9分别代表不同浓度的过氧化氢；0.3M，0.1M，0.01M，0.001M，0.0001M，0％。
图8为过氧化氢对小鼠肝细胞基因组DNA的降解作用
栏1，不加过氧化氢对照，栏2，加入过氧化氢反应1分钟；栏3，加入过氧化氢反应2分钟；栏4，加入过氧化氢反应5分钟；栏5，加入过氧化氢反应10分钟。
本发明提供的方法具有以下特点：1)在工作浓度0.01M的过氧化物对蛋白质没有损伤作用；2)当使用过氧化氢时，其在紫外光照或金属离子存在下只分解成水分子，不会引入新的杂质；3)该反应灵敏快捷，操作简单，极适合应用于大规模制备蛋白质或酶过程中的核酸降解。
【具体实施方式】
实施例1 大肠杆菌细胞的破碎及其基因组DNA的提取
超净工作台中挑取单菌落，接种于10ml的LB液体培养基(Amp+)中，30℃，180rpm下振荡活化培养过夜(12-14h)。次日接种2％菌体于250ml新鲜培养液中，37℃，180rpm培养，至OD600吸收值为0.6，加入异丙基-β-D-巯基半乳糖IPTG至终浓度1mM，继续诱导表达3小时，离心(6,500rpm，10min)收集菌体。按湿重1∶5(W/V)加入冰冷缓冲液A(20mM Tris-HCl，pH8.0)，悬浮5分种，之后加入5g溶菌酶(Amresco公司)，获得细胞破碎液。取1000ml菌液在4500-5000rpm下离心5min。弃上清，保留沉淀。向沉淀中加入溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，pH8.0，10mM乙二胺基四乙酸EDTA)100ml，轻轻震荡，然后再向其中加入溶液II(0.2M NaOH，1％十二烷基磺酸钠SDS)20ml，轻轻混匀，这时溶液中出现絮状物。向其中加入溶液III(5M乙酸钠，60.0ml，冰乙酸11.5ml，H2O 28.5ml)20ml，冻存20-30min。10000rpm离心20min。取上清，用纱布过滤。滤液与等体积(或0.6倍体积)异丙醇混匀，放置10min。4℃下，10000rpm离心10min。弃上清，然后加入70％乙醇摇动，使沉淀重新溶解。4℃下，10000rpm离心10min。沉淀在自然的条件下干燥保存。
实施例2 过氧化物在金属离子存在下对核酸的降解
将过氧化氢直接加入到大肠杆菌基因组DNA(5.2×106bp)中至其终浓度为0.3M，0.1M，0.01M，0.001M，0.0001M，同时加入EDTA-Fe2+至其终浓度为10mM，反应5min。降解结果表明，0.01M过氧化氢反应5分钟即能将基因组核酸全部降解，确定0.01M为其工作浓度(图1)。
用不同金属离子替换Fe2+，考察其对基因组DNA的降解效率，表明Fe2+，Cu2+，Cd2+，Co2+等具有最佳的降解效果(图2)
用大肠杆菌细胞破碎液代替基因组DNA实验，结果表明不同金属离子的加入对降解效率的影响没有明显差别(图3)，因大肠菌细胞质中已经存在有金属离子，所以可以不加入或少量加入金属离子，也能达到理想的降解效果。
实施例3 过氧化氢在紫外光照下对核酸的降解
将过氧化氢直接加入到大肠杆菌基因组DNA中至其终浓度为0.01M，同时400nm光照处理30min，观察降解效果(图4)。
实施例4 过氧化氢对植物细胞破碎液中基因组DNA的降解
将过氧化氢直接加入到玉米基因组DNA(1×1011bp)和大豆基因组DNA(1.7×109bp)中至其终浓度为0.01M，同时加入EDTA-Fe2+至其终浓度为10mM，观察降解效果(图5)。
实施例5 其他过氧化物对大肠杆菌细胞破碎液中核酸杂质的降解
将过氧乙酸，过氧甲酸取代过氧化氢直接加入到细胞破碎液中至其终浓度为0.01M，同时加入EDTA-Fe2+至其终浓度为10mM，观察降解效果(图6)。与同浓度的过氧化氢比较，两者的降解效果也很显著。
实施例6 过氧化氢对目的蛋白质的损伤作用
10％SDS-聚丙烯酰胺电泳检测不同浓度H2O2对目标蛋白质的影响，反应30min，0.001M-0.3M H2O2均没有明显的损伤影响(图7)，因此对于工作浓度为0.01M的过氧化氢在降解核酸分子时不会损伤目的蛋白质分子。
实施例7 过氧化氢对动物细胞基因组DNA的降解
将过氧化氢直接加入到小鼠肝细胞基因组DNA中至其终浓度为0.01M，同时加入EDTA-Fe2+至其终浓度为10mM，观察降解效果(图8)，发现小鼠肝细胞基因组DNA全部降解。