营养生长特异性启动子及由此而得的基因重组植物 【技术领域】
本发明涉及使用植物基因的启动子进行有益植物的育种。更具体地说，涉及使用水稻的3β羟化酶2基因(下面称为OsGA3ox2)的启动基因进行有益植物的育种。
技术背景
人为地改变植物形状，特别是通过抑制伸长生长而引起的矮态是作物育种中极为重要的目标。矮态是正常的伸长生长调节相关的基因发生突变的结果所导致的生长异常。植物的伸长生长是细胞分裂和细胞伸长两者共同作用所致，但它们通过温度、光等外界环境因素和植物激素等内部环境因素等各种因素的综合影响来调节。从而，可以推断在与矮态有关的基因中，有与植物激素的合成和其受体直接相关的基因、与它们的表达调控有关地基因等多种种类。其中，已知赤霉素生物合成途径中的异常是矮态的原因之一。
高等植物中的赤霉素生物合成分为3个阶段，分别通过存在于质体、内质网膜、细胞质中的酶催化。GA12醛以后的第三阶段存在早期13位羟化酶和非羟化酶两条途径。两条途径均是通过赤霉素3位的碳被3β羟化酶羟基化而产生生理活性，又通过2位的碳被2β羟化酶羟基化而失去活性。
水稻中，已知至少存在两种3β羟化酶基因(OsGA3ox1和OsGA3ox2)。其中之一的OsGA3ox2显示与已知的水稻矮态基因的D18(dy)基因座对应。另一方面，水稻的2β羟化酶基因OsGA2ox1作为属于2-酮戊二酸依赖性酶基因群中的新基因已被分离出来。曾尝试通过调控这些与赤霉素的活性型与无活性型转换直接相关的酶的表达，来抑制植物的伸长生长(化学和生物，第38卷、2000年、131页～139页)。其中的一个尝试是在转化植物体内通过调控2β羟化酶基因的表达水平，改变内源活性赤霉素含量，得到所需高度的转化植物。但是，使用现有的组成型启动子肌动蛋白启动子来强制性地使OsGA2ox1在植物体全株中表达时，除茎和叶之外，繁殖器官的赤霉素总是被代谢掉，因而在内源赤霉素含量锐减至显示出极矮态的转化体中，需要大量赤霉素的繁殖器官的正常发育也受到阻碍。因而，在通过2β羟化酶基因的过量表达来开发矮态转化植物时，需要利用在营养生长组织中特异性发挥作用的启动子来抑制对繁殖器官的影响。
人们研究了烟草中编码3β羟化酶的基因(Nty基因)在植物中表达组织的定位(参照Plant Journal(1999)20(1)，15-24)。在该项研究中，将Nty基因的启动子区与GUS基因连接，观察在植物体的各种组织中的表达情况。结果，与Nty基因启动子区连接的GUS基因被限定于包括营养生长组织在内的发生赤霉素作用的部位。该研究只是发现了编码3β羟化酶的基因的表达与赤霉素作用的相关关系。并未发现可以实际应用的营养组织特异性启动子。
因此，如果能够从水稻基因中取得活性高、可以实际应用的用于营养生长组织表达的启动子，则可以对包括水稻等作物在内的有益植物的品种改良做出很大贡献。
发明的公开
本发明涉及通过基因工程方法进行的植物育种，其目的在于提供在营养生长组织中(特别是茎和/或叶)具有高活性的植物基因启动子、含有该启动子的表达载体及其应用方法。
本发明人发现水稻的3β羟化酶2(OsGA3ox2)基因在营养生长组织中(特别是茎和/或叶)显示高的启动子活性，并根据该发现完成了本发明。
本发明提供：具有启动子活性、用于在植物的营养生长组织中特异性地表达外源基因的DNA。该DNA是具有SEQ ID NO.1(图2A～C)所示序列或其部分的序列、且具有与SEQ ID NO.1的序列等同的启动子活性的DNA。这里，SEQ ID NO.1所示的序列是包括水稻OsGA3ox2结构基因的5’上游、第1外显子、第1内含子和第2外显子的一部分的序列。在本发明的一个实施方案中，该DNA在严谨条件下与具有SEQ ID NO.1所记载的序列或其部分的多核苷酸杂交。
本发明还提供：用于在营养生长组织(特别是茎和/或叶)中特异性地表达外源基因的表达载体。该表达载体是具有SEQ ID NO.1所示的序列或其部分的序列、包含具有与SEQ ID NO.1的序列等同的启动子活性的水稻OsGA3ox2基因启动子，还包含与该启动子可表达地连接的外源基因。在一个实施方案中，上述外源基因可以是具有抑制茎和/或叶伸长的功能的基因。在另一个实施方案中，上述外源基因是编码2β羟化酶的基因。本发明也提供：用上述表达载体转化的植物细胞(可以是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞)、由该植物细胞再生的植物体、该植物体的子代和繁殖体、以及由该子代得到的种子。
本发明还提供将希望在植物营养生长组织中特异性表达的外源基因引入植物中的方法。该方法包括用上述表达载体转化植物细胞的步骤；以及使该转化植物细胞再分化，获得植物体的步骤。
上述外源基因可以是具有抑制茎和/或叶伸长的功能的基因。通过在上述方法中使用这样的基因，可以培育矮态植物。另外，在上述方法中，植物细胞可以是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞。
附图简述
图1是显示构建本实施例中使用的表达载体pBI101-Hm3的模式图。
图2A～C是显示包含OsGA3ox2的5’非翻译序列、第1外显子、第1内含子以及第2外显子的一部分的区的序列的图。图中，大写字母的碱基表示外显子位点(1567位～2039位和2151位～2406位)，下方表示编码的氨基酸序列。图2A～C中还显示了限制酶的识别位点。
图3是照片，显示茎的GUS组织染色结果。
图4是照片，显示用与本启动子连接的OsGA2ox1基因转化的矮态植物。
实施发明的最佳方式
下面，更详细地解说本发明。
(水稻OsGA3ox2基因启动子的分离)
水稻OsGA3ox2基因启动子是从水稻的基因组文库中筛选得来。可以使用美国CLONTECH Laboratories Inc.，Palo Alto，CA所售的水稻基因组DNA文库(Rice Genomic Library)。
本发明人采用分离的水稻OsGA3ox2 cDNA作为筛选用探针。
首先使用λ噬菌体构建的水稻基因组文库感染大肠杆菌，形成噬菌斑。按照常规的方法，将该噬菌斑转移到硝酸纤维素等膜上，用已标记的筛选用探针杂交。杂交结束后洗涤，进行放射自显影，从确认已杂交的噬菌体中制备DNA。
将制备的噬菌体DNA用适当的限制酶组合消化，将该消化物通过琼脂糖凝胶电泳分离。将分离的DNA片段转移至尼龙膜，使上述筛选用探针与其杂交，根据信号强度和带型的不同进行筛选。
认为信号最强的克隆包含OsGA3ox2基因，信号弱的克隆包含类似OsGA3ox2但不是OsGA3ox2的基因。另外，通过带型的比较可以识别缺失了部分基因的克隆。并且，通过基于带型构建的各个克隆的物理图谱，可以确定具有推定构成启动子的结构基因5’上游的长度约为1.6Kbp左右的克隆。
如上所述，可以分离得到完整的OsGA3ox2基因组基因。
通过将OsGA3ox2基因组基因的碱基序列与OsGA3ox2 cDNA的碱基序列比较，可以确定启动子区。作为启动子序列，当基因组基因含有内含子时，不仅包含结构基因的5’上游区，也可包含第1内含子等区。本启动子序列优选SEQ ID NO.1所示的序列(再参照图2A～C)。SEQ ID No所示的序列包含水稻OsGA3ox2结构基因的5’上游、第1外显子、第1内含子以及第2外显子的一部分。
(通过测定GUS活性确定启动子的活性部位)
确定OsGA3ox2基因的启动子区后，可以切出该序列，掺入到植物表达用载体中。为了评价所掺入的启动子的活性，可以在该启动子的下游连接报道基因，例如连接编码适当的酶的基因，构建质粒。将该质粒引入植物细胞中，观察基因的表达，例如测定、观察酶活性。以植物为宿主时，例如通常使用pBI221等质粒，以β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的表达作为指标进行测定，本说明书中测定GUS表达的方法也适用。
GUS活性可以采用例如植物细胞工程学、第4卷、第4号、281页～286页(1992)、同书第5卷、第5号、407页～413页(1992)、PlantMole.Biol.Reporter 5(4)387-405(1987)中所记载的顺序测定，但测定方法并不限于此。简单地说，将植物体的各组织或切片浸于含有1mM5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸(X-Gluc)、7％(v/v)甲醇和50mM磷酸钠缓冲溶液(pH7.0)的组织化学底物溶液中，然后以进行反应所需的适当的温度和时间(例如，引入CaMV启动子等与GUS的融合基因的情况下，为37℃、30分钟～4小时)进行温育。为防止褐变及GUS的失活，可以添加二硫苏糖醇(DTT)等还原剂。例如：2mM的DTT可以在切割后迅速添加；(制备切片时)在琼脂包埋的阶段添加；在切片的过程添加；或在切片的减压排气时添加。另外5mM浓度的DTT可在37℃时的GUS反应时添加。然后添加乙醇使反应停止、脱色，将组织或切片置于显微镜或立体显微镜下观察。
使用OsGA3ox2基因的启动子区的各种缺失体、例如用使其从5’上游一侧缺失各种长度的OsGA3ox2基因启动子区与GUS基因融合的质粒测定启动子活性，可以确定该活性所必需的部位等。这样确定活性部位的方法已是本领域技术人员公知的。从而，例如除去OsGA3ox2基因的启动子区中不需要的序列而获得的具有与OsGA3ox2基因的启动子等同活性的序列，也在本发明的范围之内。
确定了OsGA3ox2基因的启动子区及其活性部位后，还可以改变其序列、提高启动子活性，或使之改变表达的组织特异性。例如，部分改变OsGA3ox2基因的启动子区或其活性部位而得到的具有与改变前等同活性的序列，也在本发明的范围之内。
具有SEQ ID NO.1(图2A～C)序列的启动子区在营养生长组织中特异性地表达其活性。因而，本说明书中，启动子的活性为“等同”是指活性的强度至少与作为基准的启动子区的活性的强度为相同程度，同时活性的特异性也至少与作为基准的启动子区的活性的特异性为相同程度。应该注意，术语“等同”并不意味着与作为基准的启动子区比较时，排除了活性的强度及活性的特异性明显高的情况。“具有与SEQ ID NO.1的序列等同的启动子活性”是指例如：在与本说明书的下述实施例相同的条件下，在原生质体中表达GUS基因时，该GUS活性约为SEQ ID NO.1序列的GUS活性的50％以上，优选约70％以上，更优选约90％以上，且在营养生长组织中特异性地表达该活性。
本发明范围内所包括的序列可以包括在严谨条件下可以与OsGA3ox2基因的启动子区或其活性位点杂交的序列。本说明书中使用的“严谨性杂交条件”或“严谨性”是指比具有对于靶正确的、几乎正确的互补性的靶序列和探针的解链温度(Tm)低约5℃～约20℃或25℃的范围条件。正如本说明书中所使用的，解链温度是全部双链核酸分子中有一半解离为单链的温度。计算核酸Tm的方法是本领域众所周知的(例如：Berger和Kimmel(1987)METHODS IN ENZYMOLOGY，VOL.152：GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES，SanDiego：Academic Press，Inc.以及Sambrooks等，(1989)MOLECULARCLONING：A LABORATORY MANUAL，第2版，第1-3卷Cold SpringHarbor Laboratory，在下文称为“Sambrook”)(均被本说明书作为参考引用)。如标准文献所示，Tm值的简单的估计方法可以通过核酸存在于1MNaCl的水溶液中时的等式：Tm＝81.5+0.41(％G+C)计算。(例如：参照Anderson和Young，Quantitave Filter Hybridization in NUCLEIC ACIDHYBRIDIZATION(1985))。其他文献对于Tm的计算，也有考虑了结构和序列特征的更精巧的计算。杂交的解链温度(严谨性杂交条件)受探针长度和性质(DNA、RNA、碱基组合物)以及靶的性质(存在于溶液中或固定化的DNA、RNA、碱基组合物)、以及盐和其他成分的浓度(例如甲酰胺、葡聚糖硫酸酯、聚乙二醇的存在和不存在)等种种因素的影响。这些因素的影响是众所周知的，在该领域的标准文献中已有研究。例如参照Sanbrook(同前面所载)和Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1997)。典型的严谨杂交条件是pH7.0～8.3的小于约1.0M的钠离子盐浓度，典型的是约0.01～1.0M的钠离子盐浓度，以及对于短探针(例如10～50个核苷酸)至少为约30℃温度、对于长探针(例如：超过50个核苷酸)至少为约60℃的温度。如前所述，严谨条件可以通过添加甲酰胺这样的去稳定剂来实现，这种情况下可以使用更低的温度。例如：当2种多核苷酸可以在严谨杂交条件下相互特异性地杂交得到的情况下，可认为是具有实质性序列同一性。本说明书中使用的术语“实质性同一性”、“实质性序列同一性”或“实质性相似性”是指当为核酸时，2种多核苷酸之间的序列相似的尺度。或者，实质性序列同一性可以作为2种多核苷酸(或多肽链)序列之间的百分同一性描述。2个序列在下述情况下可认为是实质性地相同：两者至少约60％相同，优选至少约70％相同，或至少约80％相同，或至少约90％相同，或至少约95％相同，或至少约98％～100％相同。序列同一性的其他程度(例如小于“实质性”序列同一性)可以通过在不同的严谨条件下的杂交来表征。典型的序列(核苷酸或氨基酸)的百分同一性是通过确定2个序列之间的最佳比对，然后比较2个序列来计算。例如：在蛋白质表达中所使用的外源性转录物可以描述为：与参照序列(例如对应的内源性序列)进行了比较时具有同一性或相似性的特定的百分比。序列的最佳比对可根据Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444的用于相似性方法的搜索，通过计算机运行这些算法(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)、或者通过检验，用Smith和Waterman(1981)Adv.appl.Math.2：482的局部同源性算法来进行。选择通过各种方法得到的最佳比对(即得到了最高百分比的同一性)。通常，这些算法是通过“比较窗口”(通常至少为18个核苷酸的长度)进行2个序列的比较，鉴定和比较序列相似性的局部区，从而会有小的插入或缺失(即空位)。典型的插入和缺失的长度为不包含插入或缺失的参照序列的百分之二十以下。经常会希望参照特定的长度或区域描述2个序列间的序列同一性(例如可以描述为2个序列在至少500个碱基对的长度中，至少具有95％的同一性)。通常是长度至少为约50、100、200、300、400或500个碱基对、氨基酸或其他残基。序列同一性的百分比是通过下述步骤计算的：比较整个比较区中最佳比对的2个序列的步骤；确定相同的核酸碱基(例如A、T、C、G或U)在两序列中出现的位置数，得到匹配位置数，然后与参照序列或比较区中的碱基总数进行比较，确定匹配位置数(或百分比)的步骤。适合于测定序列相似性的另一个算法是BLAST算法，刊载于Altschul(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；以及Shpaer(1996)Genomics 38：179-191。用于执行BLAST分析的软件可以通过NationalCenter for Biotechnology Information(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)公开获得。当与数据库序列中的同一长度的字串比对时，该算法通过鉴定序列中匹配或者满足阳性评价的阈值分值T的长度为W的短字串，来首先找出高分片段配对(HSP)。T被称为邻近字串分值阈值(Altschul等，如前述文献)。这些最初的邻近字串的命中起到了开始搜索的核心的作用，该搜索是用于发现包含这些字串的更长的HSP。只要累计比对分值可以增加，字串的命中就沿着各序列向两个方向延伸。各个方向上的字串命中的延伸在下述情况下停止：累计比对分值从最大值下降未知数X；由于1个以上的负分值残基比对累积，结果累计分值为0以下；或者到达了其中一个序列的末端。BLAST算法的参数W、T和X决定比对的敏感度和速度。BLAST程序中使用11的字长(W)、BLOSUM62打分矩阵中(参照Henikoff(1992)Proc.Natl.Acd.Sci.USA89：10915-10919)50的比对(B)、10的预测值(E)、M＝5、N＝4以及两链的比较作为缺省值。术语BLAST是指进行两个序列之间相似性的统计分析的BLAST算法。参照Karlin(1993)Proc.Natl.Acd.Sci.USA90：5873-5787。BLAST算法所提供的相似性的一个尺度是最小和概率(P(N))，它提供了2个核酸序列或氨基酸序列之间偶然发生匹配性的概率指标。或者指2个核酸序列相似的其他指标，是第1核酸编码的多肽与第2核酸编码的多肽具免疫学交叉反应性。
本说明书中，在营养生长组织中“特异性地”表达是指：作为靶的基因产物在营养生长组织中比在同一植物体的其他组织或器官的至少一种中有更多的表达。“营养生长组织”是指植物中，与有性繁殖没有直接关系的组织，包括构成根、茎和叶这样的营养器官的所有组织。在营养生长组织中“特异性地”表达是指：例如基因产物在茎和叶的至少一个中比在同一植物体的任意部位的开花器官中有更多的表达。这样的表达特异性可以通过在与本说明书的下述实施例同样的条件下构建转化植物来评价。
(表达盒与重组质粒的构建及其应用)
具有已确认了活性的OsGA3ox2基因的启动子区或其活性部位的序列可以连接到适当的植物表达载体中。可以在连接到该植物表达用载体中的序列的3’端引入适当的接头序列，例如具有多克隆位点的接头，制备适合于植物宿主的表达盒。因而，本说明书中，“用于插入外源基因的位点”是指：包含接头或与接头有相同作用的序列的位点。在该表达盒中可以根据要求包含其他的调控元件。例如：为了提高表达效率等目的，可以包含终止序列。该终止序列可经由具有上述多克隆位点的接头序列与启动子序列连接。该表达盒还可以含有针对所使用的特定宿主生物的适当的选择标记基因。
在上述植物表达盒的启动子的3’下游，例如在多克隆位点，可表达地连接要表达的外源基因，构建重组质粒。本说明书中，“外源基因”是在除OsGA3ox2基因以外的水稻或其他植物中，相对于内源性基因或植物而言的外来的基因，是指期望该基因产物在营养生长组织(特别是茎和/或叶)中表达的任意的基因。
可使用这样产生的重组质粒转化植物细胞。植物细胞的转化可以通过使用农杆菌的方法、对原生质体电穿孔的方法等本领域公知的任意的方法进行。例如植物细胞原生质体的制备可以按照Kyozuka等，Mol.Gen.Genet.206：408-413(1987)中记载的方法进行。对于单子叶植物，优选的使用农杆菌的转化方法可以例举本发明人开发的PCT/JP/03920中记载的方法。根据该方法，即使在单子叶植物中，也可以迅速且高效地得到转化植物，不过植物转化所采用的方法并不限定于此。
根据常规方法，可使转化的植物细胞再分化，形成转化植物组织，进一步得到重组了的植物体。构建用于转化的重组质粒时，OsGA3ox2基因启动子例如可以连接入可在细菌和植物两个宿主中表达的二元载体中。这样的二元载体也是本领域技术人员所周知的。例如，使用包括农杆菌表达系列的pBI系列等的载体时，则可利用由微生物对植物感染的系统。通过使用适当的重组质粒，可以将目标外源基因引入包括水稻等单子叶植物和烟草等双子叶植物的任意的可转化的植物中。
植物细胞可以是任意的植物细胞。植物细胞可以是培养细胞、培养组织、培养器官、或植物体的任意形态。优选是培养细胞、培养组织、或培养器官，更优选是培养细胞。本发明的生产方法中可使用的植物物种是可以进行基因引入的任意的植物物种。
本发明的生产方法中可以使用的植物物种可以例举茄科(Solanaceae)、禾本科、十字花科(Brassicaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、豆科(Leguminosae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、唇形科(Lamiaceae)、百合科(Liliaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、伞形科(Umbelliferae)的植物。
茄科的植物可以例举烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、曼陀罗属(Datura)、番茄属(Lycopersion)或碧冬茄属(Petunia)的植物，例如包括烟草、茄子、马铃薯、西红柿、辣椒、牵牛花等。
禾本科的植物可以例举稻属(Oryza)、大麦属(Hordenum)、黑麦属(Secale)、甘蔗属(Saccharum)、稗属(Echinochloa)或玉蜀黍属(Zea)的植物，例如包括水稻、大麦、黑麦、稗子、高粱、玉米等。
十字花科的植物可以例举萝卜属(Raphanus)、芸苔属(Brassica)、拟南芥属(Arabidopsis)、山俞菜属(Wasabia)或荠属(Capsella)的植物，例如包括白萝卜、油菜、拟南芥、山俞菜、荠菜等。
蔷薇科的植物可以例举Orunus、苹果属(Malus)、Pynus、草莓属(Fragaria)或蔷薇属(Rosa)的植物，例如包括梅、桃、苹果、梨、凤梨形草莓、蔷薇等。
豆科的植物可以例举大豆属(Glycine)、豇豆属(Vigna)、菜豆属(Phaseolus)、豌豆属(Pisum)、野豌豆属(Vicia)、落花生属(Arachis)、车轴草属(Trifolium)、(Alphalfa)或苜蓿属(Medicago)的植物，例如包括大豆、赤豆、菜豆、豌豆、蚕豆、落花生、三叶草、苜蓿等。
葫芦科的植物可以例举丝瓜属(Luffa)、南瓜属(Cucurbita)或香瓜属(Cucumis)的植物，例如包括丝瓜、南瓜、黄瓜、甜瓜等。
唇形科的植物可以例举薰衣草属(Lavandula)、薄荷属(Mentha)或紫苏属(Perilla)的植物，例如包括薰衣草、薄荷、紫苏等。
百合科的植物可以例举葱属(Allium)、百合属(Lilium)或郁金香属(Tulipa)的植物，例如包括葱、蒜、百合、郁金香等。
藜科的植物可以例举菠菜属(Spinacia)的植物，例如包括菠菜。
伞形科的植物可以例举当归属(Angelica)、胡罗卜属(Daucus)、鸭儿芹属(Cryptotaenia)或芹属(Apitum)的植物，例如包括香独活、胡萝卜、鸭儿芹、芹菜等。
本发明的启动子发挥作用而得到的“植物”也包含可以引入基因的任意植物。“植物”包含单子叶植物和双子叶植物两方面。这样的植物包含任意的有益植物，特别是包含作物、蔬菜和花卉。优选例如水稻、玉米、高粱、大麦、小麦、黑麦、稗子、谷子、芦笋、马铃薯、白萝卜、大豆、豌豆、油菜、菠菜、西红柿、牵牛花等。但并不只限于此。本发明的方法所适用的最优选的植物是水稻，特别是日本水稻。
如上所述，OsGA3ox2基因启动子可以在营养生长组织(特别是茎和/或叶)中特异性地表达。从而，作为外源基因，可以通过利用具有抑制茎和/或叶伸长的功能的基因构建矮态植物。本说明书中，“具有阻止茎和/或叶伸长的功能的基因”包含其基因产物可以抑制茎和/或叶的伸长的基因和该基因本身显示抑制茎和/或叶的伸长的功能的基因。其中基因产物可以抑制茎和/或叶伸长的功能的基因(例如编码与赤霉素分解系统有关的酶(特别是2β羟化酶(该酶通过使赤霉素基本骨架上2位的碳羟基化，将活性型赤霉素(GA1和GA4)(由3β羟化酶活化赤霉素基本骨架上3位碳)转化为无活性型赤霉素(GA8和GA34))的基因、编码与细胞壁的扩大伸长有关的酶(例如与各种细胞壁多糖类合成酶等(例如：葡聚糖酶、纤维素酶和半纤维素酶))的基因；该基因本身显示抑制茎和/或叶的伸长的功能的基因包括：例如营养生长组织(特别是茎和/或叶)伸长时表达的内源性基因(例如：与赤霉素的合成系统有关的基因(例如：拟南芥GA4基因))、与赤霉素合成系统有关的酶(例如：20氧化酶、3β羟化酶)的反义RNA、以及可以降解这样的内源性基因的核酶。矮态植物的植株筛选及用其进行植物品种改良的方法是本领域的技术人员所周知的。植物的矮化可能涉及与上述赤霉素的信号转导系统有关基因、以及与油菜素内酯合成系统和信号转导系统有关的基因。
上述转化植物的构建还可以用于将矮化以外的性状赋予植物。例如：通过使用编码毒性蛋白质的外源基因，可以实现对摄食茎叶的害虫等的防治。任何利用营养生长组织中(特别是茎和/或叶)的特异性基因表达的有益植物的构建，均在本发明的范围内。通过本发明的启动子表达的基因中也包括编码分解化学物质的蛋白质的基因。这样的蛋白质可以例举可分解除草剂的蛋白质。通过使用编码可分解除草剂的蛋白质的外源基因，可以通过应用该除草剂筛选出所需植物。
本发明的启动子的作用，除原代转化植物外，也可以遗传给其子代植物。在原代转化植物和下一代植物及其繁殖体(例如花粉)、以及由该繁殖体繁殖的种子中，本发明的启动子均可发挥作用。引入到子代的启动子的遗传可以用该启动子的序列作为探针，通过DNA印迹分析来确认。
根据本发明，可以提供来自水稻基因的在营养生长组织(特别是茎和/或叶)中活性高、具有实用性的启动子的应用。从而，本发明不仅对水稻品种的改良，也可用于其他各种植物的品种改良。
(实施例)
下面例举实施例具体地说明本发明。这些实施例并不用于限定本发明。实施例中使用的材料、试剂等，除特别指定之外，均可从商业供应途径获得。
(实施例1：通过水稻OsGA3ox2启动子的GUS基因的表达)
1.水稻OsGA3ox2基因组基因的分离：从基因组文库中筛选
(植物材料)
将水稻种子(Oryza sativa)(日本品种：“日本晴”、“Dontokoi”
“Koshihikari”等)在1％的次氯酸钠中浸泡1小时灭菌，然后用灭菌蒸馏水充分冲洗。使其在土壤中发芽，然后在温室中生长。
(步骤)
用水稻基因组DNA作为模板实施PCR，根据报告的GA3β羟化酶序列间的保守区设计简并引物(5’引物：5’-GTNGTNAARGTNGGNGARRT-3’(SEQ ID NO.2)；3’引物：5’-AYYTARTCRTTGGANGTNAC-3’(SEQ ID NO.3))。这些产物中的一个推定的氨基酸序列引物类似于报告的GA3β羟化酶所对应的区。从已报告的GA3β羟化酶序列中获得了对应于预期大小的210bp的DNA片断。将该PCR产物作为用于筛选水稻基因组文库的探针使用。分离出一些克隆，然后根据各基因组克隆的限制图谱分为2组。最后测定各组中1个序列，将各克隆称为OsGA3ox1及OsGA3ox2(OsGA3ox1及OsGA3ox2分别称为水稻GA3β羟化酶-1和水稻GA3β羟化酶-2)。从而分离出包含完整GA3β羟化酶基因的克隆OsGA3ox1和OsGA3ox2。OsGA3ox1同时包含本发明人作为探针使用的片段和序列，而OsGA3ox2则包含片段中相应区不同的序列。使用特异性引物，使用从水稻茎尖以及未开花的花器分离出的总RNA，通过反转录PCR(RT-PCR)获得编码GA3β羟化酶的全长cDNA克隆。为了进行RNA凝胶印迹分析和DNA凝胶印迹分析，使用了作为基因特异性探针的来源于OsGA3ox2总cDNA的BssHII-PvuII(519bp)片段和来源于OsGA3ox1的KpnI-PvuII(310bp)片段。将各特异性的探针作为探针用于基因组DNA印迹杂交时，未检出交叉杂交(未显示数据)。各cDNA(OsGA3ox1或OsGA3ox2)分别含有编码379个氨基酸或370个氨基酸的多肽的可读框(未显示数据)。基因组OsGA3ox2包含具有短尺寸(110bp)的1个内含子。该内含子位于与之前报告过的双子叶植物中GA3β羟化酶相同的位置。另一克隆OsGA3ox1含有2个内含子。其中一个位于与OsGA3ox2的情况相同的位置。它们几乎是同样大小(110bp)。另一个位于辅因子的结合位点，辅因子2-酮戊二酸(400bp)的结合位点(未显示数据)。两个克隆的推定氨基酸序列相对于其他的GA3β羟化酶具有高度的相似性，而他们互相显示了最高的相似性(56.6％的同一性和88.2％的相似性)。
2.具有OsGA3ox2基因启动子的重组质粒的构建
图1显示了具有水稻OsGA3ox2基因启动子的载体的构建。
为了获得可包含水稻OsGA3ox2基因5’端非翻译区的片段，要将1.中得到的克隆用BamHI和HindIII消化，通过琼脂糖电泳回收约2.5Kbp的片段。为了确认OsGA3ox2基因的启动子的功能，使用了植物细胞用表达载体pBI101(CLONTECH Laboratories Inc.，Palo Alto，CA)。该载体依次具有胭脂氨酸合酶启动子(NOS-Pro)、用于赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II编码区(NPTII(KON R))、胭脂氨酸合酶的终止子(NOS-T)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)编码区和胭脂氨酸合酶的终止子(NOS-T)。将该pBI101用HindIII和SmaI消化。为了插入该表达载体，再将上述OsGA3ox2基因片段用SmaI消化。得到的片段具有克隆插入序列从第1号到第2406号的序列，包含5’非翻译序列、第1外显子、第1内含子和第2外显子的一部分(图2A～C)。片段的5’端是BamHI位点，3’端是SmaI位点。将该片段连接入上述限制酶消化的表达载体，构建了含有与GUS报导基因融合的pBI101-Hm3。为了使其具有潮霉素抗性，还在该表达载体的GUS编码区的下游插入了潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因(位于花椰菜花叶病毒35S(35S)和胭脂氨酸合酶基因的终止子(Tnos)之间)。
3.水稻种子的转化和GUS基因的表达
将水稻的代表性品种日本晴的种子除去稻壳，然后在无损伤的状态下，在70％乙醇中浸泡10秒钟，之后水洗，通过在0.1％的Tween20和2.5％的次氯酸钠(NaClO)水溶液中浸泡30分钟，进行杀菌。用水充分冲洗后，将水稻用于下述无菌操作。
(预培养)
将种子播种于含有2，4-D的N6D培养基(30g/l蔗糖、0.3g/l酪蛋白氨基酸、2.8g/l脯氨酸、2mg/l 2，4-D、4g/l脱乙酰吉兰糖胶、pH5.8)，于27℃～32℃温育5天。这期间种子发芽。
(植物表达用载体)
用上述构建的pBI101-Hm3，转化农杆菌EHA101(Hood等，J.Bacteriol.，168：1291-1301(1986))。EHA101是辅助质粒的vir区来源于强致病性农杆菌A281的农杆菌。将农杆菌在补充了潮霉素(50mg/l)的AB培养基(葡萄糖(5g/L)、K2HPO4(3g/L)、NaH2PO4·2H2O(1.3g/L)、NH4Cl(1g/L)、KCl(150mg/L)、CaCl2·2H2O(10mg/L)、F2SO4·7H2O(2.5mg/L)、pH7.2、细菌培养用琼脂(1.5％)(3g/200ml)、1M MgSO4·7H2O(120μl/100ml))中，在25℃下在暗处培养2～3天。
(农杆菌感染)
将转化的农杆菌悬浮于添加了2μg/ml乙酰丁香酮的AAM培养基(AA-1(×1000)1ml(MnSO4·4～6H2O(1000mg/100ml)、H3BO3(300mg/100ml)、ZnSO4·7H2O(200mg/100ml)、Na2MoO4·2H2O(25mg/100ml)、CuSO4·5H2O(2.5mg/100ml)、CoCl2·6H2O(2.5mg/100ml)、KI(75mg/100ml))、AA-2(×1000)1ml(CaCl2·2H2O(15.0g/100ml))、AA-3(×1000)1ml(MnSO4·7H2O(25g/100ml))、AA-4(×1000)1ml(Fe-EDTA(4.0g/100ml))、AA-5(×1000)1ml(NaH2PO4·2H2O(15.0g/100ml)、AA-6(×200)5ml(烟酸(20mg/100ml)、盐酸硫胺素(200mg/100ml)、盐酸吡哆醇(20mg/100ml)、肌醇(2000mg/100ml))、AA-Sol(×100)10ml(L-精氨酸(5300mg/300ml)、甘氨酸(225mg/300ml))、AA-KCl(×50)20ml(KCl(3g/20ml))、酪蛋白氨基酸(500mg/L)、蔗糖(68.5g/L)、葡萄糖(36g/L)、L-谷氨酰胺(900mg/L)、L-天冬氨酸(300mg/L)、pH5.2)中。将预培养的上述种子在该悬浮液中浸泡90秒，然后移植到2N6-AS培养基(30g/l蔗糖、10g/l葡萄糖、0.3g/l酪蛋白氨基酸、2mg/l 2，4-D、10mg/l乙酰丁香酮、4g/l脱乙酰吉兰糖胶、pH5.2)中。在黑暗处在25℃下保温3天，进行协同培养。
(除菌和筛选)
协同培养结束后，用含有500mg/l羧苄青霉素的N6D培养基，从种子中冲洗掉农杆菌。接着，按下述条件筛选转化种子。
第1次筛选：将种子置于含有补充了羧苄青霉素(500mg/l)和潮霉素(50mg/l)的含有2～4mg/l的2，4-D的N6D培养基上，在30℃下保温7天。
第2次筛选：将种子置于含有补充了羧苄青霉素(500mg/l)和潮霉素(50mg/l)的含有2～4mg/l的2，4-D的N6D培养基上，再在30℃下保温7天。
(再分化)
在下述条件下，使经筛选的转化种子进行再分化。
第1次再分化：将筛选的种子置于补充了再分化培养基(羧苄青霉素(50mg/l)和潮霉素(25mg/l))的MS培养基(30g/l蔗糖、30g/l山梨糖醇、2g/l酪蛋白氨基酸、2mg/l细胞分裂素、0.002mg/l NAA、4g/l脱乙酰吉兰糖胶、pH5.8)上，在30℃下保温2星期。
第2次再分化：使用与第1次再分化中使用的相同的再分化培养基，再在30℃下保温2星期。
(盆栽)
将再分化的转化体移到发根培养基(补充了潮霉素(25mg/l)、不含激素的MS培养基)上，确认了根的发育后，栽入花盆。
4、GUS染色的组织特异性表达
为了研究植物组织中的上述启动子引起的基因表达，进行了GUS活性的组织化学分析。该组织化学分析可以按植物细胞工学、第4卷、第4号、281～286页中记载的步骤实施。本方法根据Jefferson等的方法(EMBO J 6：3901-3907(1987))，同时参照Kosugi等的改良(Kosugi等，Plant Science 70：133-140(1990))。简单地解释如下：将切下的切片包埋在5％(w/w)琼脂中，然后将琼脂块用微型切片机切成薄片。将厚度为100～130μm的组织切片浸泡在含有1mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸(X-Gluc)、7％(v/v)甲醇和50mM的磷酸钠缓冲溶液(pH7.0)的组织化学底物溶液中，然后在37℃下温育4小时。将2mM的DTT在切下后迅速添加；在琼脂包埋的阶段添加；在切片的过程添加；或在切片的减压排气时添加。另外将5mM浓度的DTT在37℃时的GUS反应时添加。添加乙醇使反应停止、脱色，然后将切片置于显微镜下观察。结果可见水稻的茎部具有高GUS活性。将茎部置于显微镜下观察，可见茎壁因GUS活性而被染成蓝色(图3)。
(实施例2：水稻OsGA3ox2启动子引发的2β羟化酶基因的表达)
除了在实施例1的第2节中，作为水稻OsGA3ox2启动子区，除了以水稻OsGA3ox2基因的XbaI位点到SmaI位点的区取代水稻OsGA3ox2基因的BamHI位点到SmaI位点的区(参照图2A～C)，用编码2β羟化酶的基因(OsGA2ox1)的编码区取代GUS编码区之外，均与实施例1相同，对水稻种子进行转化和再生，制备转基因植物。
以下对植物表达载体的构建进行说明。
为了扩增来源于水稻(Oryza sative L.、品种：日本晴)的基因组DNA，制备了根据下述基因的保守区设计的2种简并寡核苷酸引物(正向引物、5’-GGNTTYGGNGARCAYWCNGAYCC-3’(SEQ ID NO.4)；和反向引物5’-GGISHISCRAARTADATIRTISWLA-3’(SEQ IDNO.5))：推定的拟南芥属GA 2β-羟化酶基因、过氧化物酶的Marahmacrocarpa mRNA(登记号(Accession No.)Y09113；MacMillan，PlantPhysiol.113，1369-1377(1997))、水稻GA20氧化酶基因(登记号U50333；Toyomasu等，Physiol.Plant.99，111-118(1997))、水稻GA3β羟化酶基因和其他的2-酮戊二酸依赖性过氧化物酶。将扩增片段(约80bp)克隆到pCRII(Invitrogen，Carlsbad，CA)，然后证实它们的序列。64个独立的克隆之一含有新的2-酮戊二酸依赖性样的氨基酸，推定这是由水稻GA2β羟化酶基因编码。使用该部分氨基酸序列搜索DDBJNucleotide Sequence Database，获得了一个水稻EST克隆(登记号C72618)。根据该EST克隆的序列设计寡核苷酸引物(正向引物、5’-GCGGCGTTCTTCGCG-3’(SEQ ID NO.6)；反向引物5’-CTATTGTGAATGAGTACATT-3’(SEQ ID NO.7))，在PCR中使用水稻基因组DNA作为模板。将扩增的片段克隆到pCR II(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，然后确认它们的序列。将该230bp片段作为对cDNA克隆和基因组克隆进行筛选用的探针使用。
用如上所述制备的探针，对由水稻未成熟种子构建的cDNA文库和由用Sau3AI部分消化的水稻基因组DNA构建的基因组文库进行筛选。杂交在65℃下述溶液中进行14小时：5×SSC(1×SSC为0.15MNaCl、15mM柠檬酸钠)、5×Denhardt’s溶液(1×Denhardt’s溶液为0.02％Ficoll、0.02％聚乙烯吡硌烷酮(PVP)、0.02％牛血清白蛋白(BSA))、0.5％(w/v)SDS和20mg/l鲑精DNA。然后将滤膜在室温下在2×SSC、0.1％(w/v)SDS中洗涤。将通过筛选得到的cDNA称为OsGA2ox1，它包含含有382个氨基酸序列的1,146bp的可读框(数据未显示)。将OsGA2ox1的cDNA的5’端用限制性内切酶EcoRI切下，3’端用限制性内切酶EcoRV切下，使其产生平端，以便于符合读框地连接到pBI101载体中，接着连接该载体的SmaI位点。将实施例1的2.节中得到的水稻OsGA3ox2基因的XbaI-HindIII片段再用XbaI和SmaI消化。在上述pBI101载体中，将该OsGA3ox2片段连接到OsGA2ox1上游的XbaI-SmaI位点。
图4显示已成长的植物。图4的右侧显示了从转化种子得到的植物体，左侧表示未经处理的对照植物(日本晴)。转化植物与对照植物比较，高度明显降低、矮化。这表明通过本发明的启动子可以在茎中表达2β羟化酶。
工业应用性
本发明中的OsGA3ox2基因启动子在茎叶中具有非常高的活性。从而，本发明可用于通过对营养生长组织进行基因操作而进行水稻等植物的品种改良。
序列表
<110>独立行政法人农业生物资源研究所(NATIONAL INSISTUTE OF AGROBIOLOGICAL
SCIENCES)
<120>营养生长特异性启动子及用其获得的转基因植物
<130>AR024PCT
<160>7
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>2406
<212>DNA
<213>Oryza sativa
<220>
<221>外显子
<222>(1567)..(2039)
<220>
<221>外显子
<222>(2151)..(2406)
<400>1
ggatcccacc caatggcgac gcgccctctg ctccatcgat cccgacaacg catccagaag 60
gcgccggcga cacctcgccg ccgatcgtcc gccgccccta gtcgccgcca tctctcgatc 120
atccccctgt cccttccctt ccacgcacgg ccggccattc catcgccgcc tacctccaga 180
cccaatgcat cctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc 240
tctctctctc tctctctctc tgttaatttt gtaatgtatt agcaaccatt catggatgga 300
tggatgatga tgatcatggc ctctgtcctc tgtttttact cgtggctgca gactagtgct 360
gtcttttctc ttgtttgctg ttctagaatc tgtgtgctgt tttctaaaca aattactgtt 420
tatatttgtt ttgttttgtt tatttttgta gttgtaatat aaggttagtc ttcttagtaa 480
atatattgaa aaaagaagaa gtagataaca cggtttgaat cttggtaatt gtaccgtgct 540
cgacaaatta ggacgtaatc ctttcgtttc agattataaa atattttgac tttagtcaaa 600
gtcatgttgt ttcaagtttg actaatttta tagataaata taataatatt tataatatta 660
aattagttaa ttaaatatat tttcataata aatttgtctt gagttaaaaa tattactact 720
ttttctataa aattggtcaa acttaaagca gtttgatttt gactaaagtc aaaacgtctt 780
ataacctgaa acggatgtag tactgtatat gggaactagc atgaagatct tgctactgaa 840
agtaaaatat cgaatgaaat tcgacgtgta tgagaattat acggtaatca taattaatta 900
gaagtggctg catgtgagaa tatttggttc taaagcagac agacgaatta aaaaaaaaca 960
ccacggcaac ggaggacgct actgttcctg tgaaattcct atgtttaatt acctaatctg 1020
ttttattgta atgtgataat taaaaattac tctggtgctt atttcacatt gtgattttac 1080
tttactataa cataacttaa tttgtatgaa tatgtgtgtt tattaattgg gtggcagtgc 1140
cactagccag ccagggagtg gtgatgagca tactagctag atttgtgttg tgtagctaag 1200
ctggtggcct tgtgtgctcc acatcactcc aaaccctctg tcccaatcac cacatttttt 1260
cctctccaaa tctattaatt aatgatccat ttcaattctt catcactgat ttattcacca 1320
attaattctc tctttttttt ttcttccact acgctccaaa acttctctcc ctatatatac 1380
ctctcccttg tacttgtcca gttcttacac tcgtctcact ttactactca ttccactatt 1440
gtaaagtcat agaaaaaatt tatatagaga gaaaaaatta gtgtttgtta ttgttactgg 1500
ctttctgcca gacgagacga gcgagcgcgc gagtgtgttg ctctggtcat ctcgtcgtcg 1560
tcggcg atg ccg acg ccg tcg cac ttg aag aac ccg ctc tgc ttc gac 1608
Met Pro Thr Pro Ser His Leu Lys Ash Pro Leu Cys Phe Asp
1 5 10
ttc cgg gcg gcg agg cgg gtg ccg gag acg cac gcg tgg ccg ggg ctg 1656
Phe Arg Ala Ala Arg Arg Val Pro Glu Thr His Ala Trp Pro Gly Leu
15 20 25 30
gac gac cac ccg gtg gtg gac ggc ggc ggc ggc ggc ggc gag gac gcg 1704
Asp Asp His Pro Val Val Asp Gly G1y Gly Gly Gly Gly Glu Asp Ala
35 40 45
gtg ccg gtg gtg gac gtc agg gcg ggc gac gcg gcg gcg cgg gtg gcg 1752
Val Pro Val Val Asp Val Arg Ala Gly Asp Ala Ala Ala Arg Val Ala
50 55 60
cgg gcg gcg gag cag tgg ggc gcg ttc ctt ctg gtc ggg cac ggc gtg 1800
Arg Ala Ala Glu Gln Trp Gly Ala Phe Leu Leu Val Gly His Gly Val
65 70 75
ccg gcg gcg ctg ctg tcg cgc gtc gag gag cgc gtc gcc cgc gtg ttc 1848
Pro Ala Ala Leu Leu Ser Arg Val Glu Glu Arg Val Ala Arg Val Phe
80 85 90
tcc ctg ccg gcg tcg gag aag atg cgc gcc gtc cgc ggc ccc ggc gag 1896
Ser Leu Pro Ala Ser Glu Lys Met Arg Ala Val Arg Gly Pro Gly Glu
95 100 105 110
ccc tgc ggc tac ggc tcg ccg ccc atc tcc tcc ttc ttc tcc aag ctc 1944
Pro Cys Gly Tyr Gly Ser Pro Pro Ile Ser Ser Phe Phe Ser Lys Leu
115 120 125
atg tgg tcc gag ggc tac acc ttc tcc cct tcc tcc ctc cgc tcc gag 1992
Met Trp Ser Glu Gly Tyr Thr Phe Ser Pro Ser Ser Leu Arg Ser Glu
130 135 140
ctc cgc cgc ctc tgg ccc aag tcc ggc gac gac tac ctc ctc ttc tgg 2040
Leu Arg Arg Leu Trp Pro Lys Ser Gly Asp Asp Tyr Leu Leu Phe Cys
145 150 155
tatatataca tatatatata ctctcccatg cattccatgc acatacactc tacgtatata 2100
tctacctcta cgtatatatc tacgtattga tctacgtata atatacgcag t gac gtg 2157
Asp Val
160
atg gag gag ttt cac aag gag atg cgg cgg cta gcc gac gag ttg ctg 2205
Met Glu Glu Phe His Lys Glu Met Arg Arg Leu Ala Asp Glu Leu Leu
165 170 175
agg ttg ttc ttg agg gcg ctg ggg ctc acc ggc gag gag gtc gcc gga 2253
Arg Leu Phe Leu Arg Ala Leu Gly Leu Thr Gly Glu Glu Val Ala Gly
180 185 190
gtc gag gcg gag agg agg atc ggc gag agg atg acg gcg acg gtg cac 2301
Val Glu Ala Glu Arg Arg Ile Gly Glu Arg Met Thr Ala Thr Val His
195 200 205
ctc aac tgg tac ccg agg tgc ccg gag ccg cgg cga gcg ctg ggg ctc 2349
Leu Asn Trp Tyr Pro Arg Cys Pro Glu Pro Arg Arg Ala Leu Gly Leu
210 215 220
atc gcg cac acg gac tcg ggc ttc ttc acc ttc gtg ctc cag agc ctc 2397
Ile Ala His Thr Asp Ser Gly Phe Phe Thr Phe Val Leu Gln Ser Leu
225 230 235 240
gtc ccg ggg 2406
Val Pro Gly
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：用于GA3β羟化酶基因的模板和简并引物。
“n”为A、T、C或G。
<400>2
gtngtnaarg tnggngarrt 20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：用于GA3β羟化酶基因的模板和简并引物。
“n”为A、T、C或G。
<400>3
ayytartcrt tggangtnac 20
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：正向引物，基于编码参与GA生物合成途径的酶的基因中的保守区
而设计的。“n”为A、T、C或G。
<400>4
ggnttyggng arcaywcnga ycc 23
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：反向引物，基于编码参与GA生物合成途径的酶的基因中的保守区
而设计的。”n”为肌苷。
<400>5
ggnshnscra artadatnrt nswna 25
<210>6
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：正向引物，基于EST克隆(登记号C72618)设计的。
<400>6
gcggcgttct tcgcg 15
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：反向引物，基于EST克隆(登记号C72618)设计的
<400>7
ctattgtgaa tgagtacatt 20