控制和消除乳腺炎致病菌的微生物制剂及其应用.pdf

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摘要
申请专利号:

CN200910042278.4

申请日:

2009.08.28

公开号:

CN101693880A

公开日:

2010.04.14

当前法律状态:

终止

有效性:

无权

法律详情:

未缴年费专利权终止IPC(主分类):C12N 1/20申请日:20090828授权公告日:20120530终止日期:20140828|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 1/20申请日:20090828|||公开

IPC分类号:

C12N1/20; A61K35/74; A61P15/14; A01N63/02; A01P1/00; A23K1/18; A23L1/015; C02F3/34; C12R1/01(2006.01)N

主分类号:

C12N1/20

申请人:

华南理工大学

发明人:

蔡俊鹏; 鲁锋

地址:

510640 广东省广州市天河区五山路381号

优先权:

专利代理机构:

广州市华学知识产权代理有限公司 44245

代理人:

裘晖

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内容摘要

本发明公开了一种控制和消除乳腺炎致病菌的微生物制剂及其应用。本发明将蛭弧菌游泳体制备成控制和消除乳腺炎致病菌的微生物制剂。通过检测,所述微生物制剂对环境中的常见细菌,包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌等奶牛乳腺炎常见致病菌有很强的消除作用。相对于蛭弧菌蛭质体而言,虽然存在着制备繁琐、不易保存的弱点,但用蛭弧菌游泳体控制和消除乳腺炎致病菌具有起效快、活力强的优点。由于蛭弧菌游泳体对奶牛无毒副作用,因此由蛭弧菌游泳体制备得到的微生物制剂适合于奶牛大规模工厂化养殖,可以为牛奶的绿色加工生产提

权利要求书

1: 一种控制和消除乳腺炎致病菌的的微生物制剂,其特征在于:所述微生物制剂由蛭弧菌游泳体构成。
2: 根据权利要求1所述的微生物制剂,其特征在于:所述蛭弧菌为保藏日期为2009年8月7日、保藏编号为CCTCC NO:M 209169的蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDS01或保藏日期为2009年8月7日、保藏编号为CCTCC NO:M 209170的蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDS02的一种或两种。
3: 根据权利要求2所述的微生物制剂,其特征在于:所述微生物制剂中蛭弧菌BDS01游泳体和蛭弧菌BDS02游泳体按细菌数1∶1混合。
4: 权利要求1~3任一项所述微生物制剂的应用,其特征在于:所述微生物制剂用于控制和消除乳腺炎致病菌。
5: 根据权利要求4所述微生物制剂的应用,其特征在于:所述乳腺炎致病菌为奶牛乳腺炎致病菌。
6: 根据权利要求5所述微生物制剂的应用,其特征在于:所述奶牛乳腺炎致病菌为大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)或停乳链球菌(Streptococcusdysgalactiae)中的至少一种。
7: 根据权利要求5所述微生物制剂的应用,其特征在于:所述微生物制剂用于控制和消除奶牛乳腺炎致病菌是将所述微生物制剂处理奶牛乳腺、养殖环境、奶牛饲料或奶牛饮用水中的至少一种。
8: 根据权利要求7所述微生物制剂的应用,其特征在于: 所述微生物制剂以浸泡或喷洒方式处理奶牛的乳腺,所述微生物制剂中的蛭弧菌游泳体的浓度至少达到10 3 pfu/ml; 所述微生物制剂处理奶牛养殖环境是以喷洒方式处理奶牛养殖环境,所述微生物制剂中的蛭弧菌游泳体的浓度至少达到10 2 pfu/ml; 所述微生物制剂处理奶牛饲料,是将所述微生物制剂加入到奶牛饲料中,所述微生物制剂中的蛭弧菌游泳体的浓度至少达到10 2 pfu/ml,使用量至少达到15ml/kg; 所述微生物制剂处理奶牛饮用水,是将所述微生物制剂加入到奶牛饮用水中,所述微生物制剂中的蛭弧菌游泳体的浓度至少达到10 2 pfu/ml,使用量至少达到每立方米奶牛饮用水加入每100ml所述微生物制剂。
9: 根据权利要求8所述微生物制剂的应用,其特征在于: 所述微生物制剂处理奶牛乳腺,所述微生物制剂中的蛭弧菌游泳体的浓度为10 5 ~10 8 pfu/ml; 所述微生物制剂处理奶牛养殖环境,所述微生物制剂中的蛭弧菌游泳体的浓度范围为10 3 ~10 6 pfu/ml。

说明书


控制和消除乳腺炎致病菌的微生物制剂及其应用

    【技术领域】

    本发明涉及一种微生物制剂,特别涉及一种控制和消除乳腺炎致病菌的微生物制剂及其应用。

    背景技术

    奶牛乳腺炎(也叫乳房炎)是奶牛养殖业中发病率最高和造成损失最严重的疾病之一。据统计,临床型乳房炎占奶牛总发病的21%~23%,隐性乳房炎在奶牛群更普遍,发病率高达50%。奶牛乳房炎的发生对牛奶的产量和质量造成严重影响,给养牛业的发展造成了及其严重的经济损失。

    病原体感染是引起乳腺炎的主要原因,有细菌、真菌、病毒、支原体等。其中主要的致病菌是细菌,常见的有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌属和支原体。葡萄球菌和链球菌是临床型乳腺炎的主要病原菌,占50%以上,其次是大肠杆菌。这三种病原菌所致的乳腺炎常年发生,其它病原菌所致的乳腺炎多为散发或继发。

    目前常规的防治乳腺炎的方法主要有干乳期在奶牛乳腺内灌注抗生素,抗生素可根据当地流行病菌选择最佳药物,直接将药物注入乳内,药物浓度高,吸收快,疗效好。但缺点是可能会对乳腺组织产生刺激性,会引发新的炎症。如果长期大量使用抗生素会使致病菌耐药菌株增加,一些乳腺炎病例变得难以用常规方法治愈。此外,牛奶中抗生素残留会影响牛奶品质。因此市场不允许出售抗生素残留过量的牛奶,同时也造成牛奶生产者的经济损失。

    中草药防治奶牛乳腺炎具有无药物残留、经济效益高的优点,但有见效慢的缺点。基因工程疫苗采用疫苗防治乳腺炎的发生是较为安全、有效的方法。但是利用疫苗防治牛乳腺炎最常见的问题是细菌抗原的变异,造成疫苗在第一年效果很好,第二年却失去作用。其它的一些疗法包括,乳腺按摩、食物疗法和同种疗法等,它们的主要优点是没有副作用和不会造成牛奶中药物的残留问题,致病菌不会产生抗药性。但是,这些疗法中大部分都耗时、耗力、还需要把病牛单独处理。它们不适应现代化的规模养殖,生产效率较低。

    实验表明使用常规消毒剂生石灰、火碱、煤酚皂溶液、新洁尔灭等消毒奶牛养殖环境,可以大大降低奶牛乳腺炎的发病率,并且操作简便容易、起效快。但是这些常规消毒剂与牛粪、饲料残渣等有机物直接接触,造成消毒剂被大量的有机物所消耗,妨碍药物作用的发挥,大大降低了药物对病原微生物的杀灭作用,需要消耗大剂量的消毒药物。常规消毒剂是化学作用杀菌,如果喷洒到奶牛身体,会对奶牛的身体健康造成威胁,也可能会污染牛奶,在牛奶中残留从而影响牛奶品质。

    蛭弧菌是寄生于其他细菌,并能导致宿主细菌裂解的一类细菌。比一般细菌小,能通过细菌滤器,有类似噬菌体的作用。单细胞,呈弧形或逗点状,有时呈螺旋状,大小0.2~0.6×0.8~1.2微米,端生鞭毛,多为一根。革兰氏染色呈阴性,可以裂解革兰氏阴性菌。我们的最新研究表明,有些蛭弧菌可以裂解包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、停乳链球菌等一些常见奶牛乳腺炎致病菌。蛭弧菌的生活史分两个阶段:自由生活,能运动,不进行增殖的游泳体阶段和在特定宿主细菌的周质空间内进行生长繁殖的蛭质体阶段。蛭弧菌在游泳体阶段,识别并与宿主发生不可逆结合,然后侵入宿主。蛭弧菌进入宿主菌细胞周质空间后,主要通过降解宿主细胞的大分子成为单体,然后摄入用于其生物大分子的合成。随着细胞增殖和水解酶产生,使宿主细胞壁膜被破坏,从而裂解释放出蛭弧菌。

    蛭弧菌游泳体是指蛭弧菌侵入宿主细菌前的生长形式。蛭弧菌游泳体侵入宿主细菌的过程非常快,一般几秒钟内即可完成。相对于蛭弧菌蛭质体而言,虽然存在着制备繁琐、不易保存的弱点,但用蛭弧菌游泳体控制和消除乳腺炎致病菌具有起效快、活力强的优点。这些优点使得蛭弧菌游泳体同样适合作为抑止或清除生物体及其环境中致病菌的生物净化因子,从而克服了抗生素滥用带来的副作用和常规消毒剂对奶牛和牛奶品质的不利影响。

    【发明内容】

    为了克服现有技术中尚未应用蛭弧菌游泳体制备控制和消除乳腺炎致病菌的微生物制剂的不足之处,本发明的首要目的在于提供一种控制和消除乳腺炎致病菌的微生物制剂。

    本发明的另一目的在于提供所述微生物制剂的应用。

    本发明的目的通过下述技术方案实现:一种控制和消除乳腺炎致病菌的微生物制剂,由蛭弧菌游泳体构成;

    所述蛭弧菌优选为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDS01或蛭弧菌(Bdellovibriosp.)BDS02地一种或两种;

    所述蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDS01于2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 209169;对所述蛭弧菌BDS01进行负染后于电子显微镜下形态观察:BDS01呈单细胞,弧形,大小为0.9×0.25μm,端生鞭毛,鞭毛长度为4μm;所述蛭弧菌BDS01以双层平板法于28℃培养四天可形成直径1~2mm的透明圆形噬菌斑;

    所述蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDS02于2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 209170;将所述蛭弧菌BDS02进行负染后于电子显微镜下形态观察:BDS02呈单细胞,弧形,大小为0.65×0.2μm,端生鞭毛,鞭毛长度至少1.8μm;所述蛭弧菌BDS02以双层平板法于28℃培养四天可形成直径1~2mm的透明圆形噬菌斑;

    所述的蛭弧菌游泳体优选通过申请号“200710031166.X”,名称为“高密度蛭弧菌游泳体的发酵培养技术”国家发明专利申请公开的高密度蛭弧菌游泳体的发酵方法进行制备;

    所述蛭弧菌BDS01游泳体和蛭弧菌BDS02游泳体优选按细菌数1∶1混合;

    所述微生物制剂应用于控制和消除乳腺炎致病菌;

    所述的乳腺炎致病菌为奶牛乳腺炎致病菌;

    所述奶牛乳腺炎致病菌包括能引起奶牛乳腺炎的大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactia)和停乳链球菌(Streptococcusdysgalactiae);

    所述微生物制剂用于控制和消除奶牛乳腺炎致病菌是将所述微生物制剂处理奶牛乳腺、养殖环境、奶牛饲料和饮用水等;

    所述微生物制剂用于控制和消除奶牛乳腺的乳腺炎致病菌是要在每次挤奶前后以浸泡冲洗、或喷洒的方法处理奶牛的乳腺,若浸泡冲洗,时间为1min;若喷洒,将奶牛乳腺均匀喷洒两遍,要做到不留死角;挤奶后用蛭弧菌液浸泡或喷洒乳腺能及时封闭处于开张状态的乳头孔,防止细菌的进入;其中的蛭弧菌游泳体浓度至少达到103pfu/ml,其优选范围为105~108pfu/ml;

    所述微生物制剂用于控制和消除奶牛养殖环境的乳腺炎致病菌是以喷洒方式处理奶牛养殖环境包括牛舍,地面及牛床粪尿沟等;其中的蛭弧菌游泳体的浓度至少达到102pfu/ml,其优选范围为103~106pfu/ml;

    所述微生物制剂用于控制和消除奶牛饲料和奶牛饮用水的乳腺炎致病菌是将微生物制剂加入到奶牛饲料和奶牛饮用水中;蛭弧菌游泳体的使用浓度应大于102pfu/ml;直接用于饲料时,其使用量至少达到15ml/kg,优选使用量范围为20~35ml/kg;应用于饮用水,其使用量至少达到100ml/m3。

    本发明相对于现有技术,具有如下的优点及效果:

    1、本发明所述的微生物制剂在控制和消除奶牛乳腺炎致病菌中的应用效果显著。

    本发明中所述的微生物制剂在消除奶牛养殖环境、饲料、乳腺和饮用水中致病菌的效果显著:如表2~6所示,蛭弧菌游泳体对奶牛乳腺炎常见致病菌均有较高的消除率。

    2、本发明所述的微生物制剂在控制和消除奶牛乳腺炎致病菌应用中安全性好。

    微生物制剂中蛭弧菌游泳体通过裂解而消除可引起奶牛乳腺炎致病菌的方法是生物方法。蛭弧菌游泳体可侵染、裂解宿主细菌的特性使之适合作为抑止或清除生物体及其环境中致病菌的生物净化因子,且其在裂解完宿主细菌后,会因饥饿而自动消亡,从而克服了抗生素滥用带来的副作用和常规消毒剂对奶牛和牛奶品质的不利影响。同时,已有研究已证明,蛭弧菌对人等无毒。

    3、所述的微生物制剂杀菌力强。

    如表1~6所示,蛭弧菌BDS01游泳体和蛭弧菌BDS02游泳体联用,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌等奶牛乳腺炎常见致病菌有很强的杀灭作用。

    4、含有本发明所述的微生物制剂适合推广应用于奶牛养殖过程。

    蛭弧菌游泳体对人和奶牛无毒副作用。适合于奶牛大规模工厂化养殖,可以为牛奶的绿色加工生产提供保障并且为控制和消除奶牛乳腺炎致病菌提供了一种新方法。

    5、含有本发明所述防治乳腺炎的微生物制剂适用范围广,对其它哺乳动物(譬如人)的致病菌也有控制和消除作用。

    【具体实施方式】

    下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。

    实施例1

    (1)控制和消除乳腺炎致病菌的微生物制剂的制备

    使用的蛭弧菌菌株分别为蛭弧菌BDS01和蛭弧菌BDS02。蛭弧菌BDS01于2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M209169;对所述蛭弧菌BDS01进行负染后于电子显微镜下形态观察:BDS01呈单细胞,弧形,大小为0.9×0.25μm,端生鞭毛,鞭毛长度为4μm,将其以双层平板法于28℃培养四天可形成直径1~2mm的透明圆形噬菌斑。蛭弧菌BDS02于2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCCNO:M 209170;将所述蛭弧菌BDS02进行负染后于电子显微镜下形态观察:BDS02呈单细胞,弧形,大小为0.65×0.2μm,端生鞭毛,鞭毛长度至少1.8μm,将其以双层平板法于28℃培养四天可形成直径1~2mm的透明圆形噬菌斑。

    蛭弧菌游泳体通过申请号“200710031166.X”的国家发明专利申请公开的高密度蛭弧菌游泳体的发酵方法进行发酵:分别在2个装有100mL LB(Luria-Bertani)液体培养基(蛋白胨10g,酵母膏5g,蒸馏水1000mL,pH7.2)的锥形瓶中接种大肠杆菌(购自广东省微生物菌种保藏中心,编号GIM 1.137),200rpm、28℃摇床培养18小时,培养液分别于4℃、5000rpm离心15min,弃上清。分别将沉淀加入到2个装有100mL DNB(dilute nutrient broth)液体培养基(营养肉汤0.8g,酪蛋白酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,溶于1000ml蒸馏水中,pH值为7.2~7.6)的锥形瓶中,再分别加入从双层平板上挑取的蛭弧菌BDS01的噬菌斑和蛭弧菌BDS02的噬菌斑。恒温摇床250rpm、28℃培养36h。培养液分别于4℃6000rpm离心20min,取上清液,再将上清液分别于4℃16000rpm离心20min,保留沉淀,加入DNB液体培养基(营养肉汤0.8g,酪蛋白酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,溶于1000ml蒸馏水中,pH值为7.2~7.6)重新悬浮蛭弧菌沉淀物,蛭弧菌BDS01游泳体菌液和蛭弧菌BDS02游泳体菌液的浓度分别为109pfu/ml。

    微生物制剂A由浓度为109pfu/ml的蛭弧菌BDS01游泳体菌液组成;

    微生物制剂B由浓度为109pfu/ml的蛭弧菌BDS02游泳体菌液组成;

    将蛭弧菌BDS01游泳体菌液和蛭弧菌BDS02游泳体菌液按细菌数2∶1混合,得到微生物制剂C;

    将蛭弧菌BDS01游泳体菌液和蛭弧菌BDS02游泳体菌液按细菌数1∶1混合,得到微生物制剂D;

    将蛭弧菌BDS01游泳体菌液和蛭弧菌BDS02游泳体菌液按细菌数1∶2混合,得到微生物制剂E。

    (3)将微生物制剂应用于控制和消除奶牛乳腺炎致病菌

    A、制备常规消毒剂,做为对照组

    用无菌生理盐水配制质量百分比4%的甲酚皂、质量百分比2%的氢氧化钠,体积百分比0.2%的新洁尔灭、质量百分比20%的生石灰和体积百分比75%的酒精配制成等4种常规消毒剂。

    B、配制奶牛乳腺炎致病菌的菌液

    用普通营养肉汤(NB)培养基摇床培养,200rpm 30℃培养12~16h分别增殖大肠杆菌(Escherichia coli,购于广东省微生物菌种保藏中心,编号为GIM 1.137)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus,购于广东省微生物菌种保藏中心,编号为GIM1.142)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,购于广东省微生物菌种保藏中心,编号为GIM 1.143)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,购于中国普通微生物菌种保藏中心,编号为CGMCC1.1481)和停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae,购于广东省微生物菌种保藏中心,编号为GIM1.242)。上述各个菌的培养液分别于4℃6000rpm离心20min,弃上清液,沉淀菌体分别用无菌生理盐水重新悬浮,调整致病菌浓度至1010cfu/ml。

    C、步骤A制备的常规消毒剂和步骤(2)制备的微生物制剂作用于步骤B制备的菌液

    于20℃水浴条件下,分别在无菌试管中加入0.5ml步骤B制备的奶牛乳腺炎致病菌的菌液和质量百分比3%牛血清白蛋白0.5ml,每支无菌无菌试管中只加入一种步骤B制备的奶牛乳腺炎致病菌的菌液,得到待测样品。

    设置空白组、对照组和实验组:

    空白组为待测样品中加入4.0ml生理盐水,进行活菌计数前的处理同对照组和实验组,计算活菌的对数值,试验重复3次;

    对照组为在待测样品中分别加入4.0ml步骤A制备的常规消毒剂,每支待测样品只加入一种常规消毒剂,分别作用1分钟、10分钟和30分钟后取0.5ml菌药混合液与4.5ml中和剂(由5g/L硫代硫酸钠、10g/L卵磷脂和20g/L吐温80组成)混匀,放置10min后进行活菌计数,计算杀灭对数值,试验重复3次;

    实验组为在待测样品中分别加入4ml微生物制剂A、B、C、D和E,每支待测样品只加入一种微生物制剂,分别作用2、4、6和8小时后取0.5ml菌-菌混合液与4.5ml中和剂混匀,放置10min后进行活菌计数,计算杀灭对数值,试验重复3次。

    结果如表1,2所示。从表1中可以看出常规消毒剂起效快,一般10min内可基本上杀灭病原菌。从表2中可以看出单株蛭弧菌游泳体6个小时内可杀灭95%以上的病菌,2株混合蛭弧菌游泳体效果好于单株蛭弧菌游泳体,且最佳混合比例为1∶1。混合液6个小时内可杀灭99%以上的致病菌,8个小时后致病菌已基本检测不到。蛭弧菌游泳体通过菌裂解消除致病菌需要一个过程,所以起效慢,但是4个小时内可杀灭大部分的病原菌。蛭弧菌游泳体通过裂解消除致病菌属于生物防治,使用安全不会对环境造成污染,也不会对奶牛健康和牛奶品质造成影响。

    表1常规消毒剂对奶牛乳腺炎致病菌的杀灭效果

    表2微生物制剂对奶牛乳腺炎致病菌的杀灭效果

    实施例2

    (1)控制和消除乳腺炎致病菌的微生物制剂的制备

    制备过程同实施例1步骤(1),区别仅在于加入生理盐水重新悬浮蛭弧菌沉淀物,蛭弧菌BDS01游泳体菌液和蛭弧菌BDS02游泳体菌液的浓度分别为102pfu/ml,将蛭弧菌BDS01游泳体菌液和蛭弧菌BDS02游泳体菌液按细菌数1∶1混合,得到微生物制剂。

    (2)将微生物制剂应用于消除奶牛养殖环境中乳腺炎致病菌

    A、制备常规消毒剂,做为对照组

    用无菌生理盐水配制4%wt的甲酚皂。

    B、常规消毒剂和微生物制剂作用奶牛养殖环境

    在养殖场A、B牛棚内任取二十个地点,采集尘土5g用50mL的无菌生理盐水悬浮做菌悬液,取0.5ml于肉汤培养基做总活菌计数。同时于特异性检测培养基上做奶牛乳腺炎致病菌的计数。

    在A牛棚喷洒步骤(1)制备的微生物制剂24h后重新取样做菌悬液,按上述同样方法做活菌计数。在B牛棚喷洒常规消毒剂4%wt甲酚皂24h后重新取样做菌悬液,按上述同样方法做活菌计数。计数方法为取0.5mL菌悬液涂布平板。

    结果如表3所示,喷洒微生物制剂后奶牛养殖环境中的总菌落数和致病菌菌落数均大幅下降。尽管由实例1可知常规消毒剂的起效时间快,短时效果好,但是作用时间较短,24h后又重新染菌的可能性大。蛭弧菌游泳体起效慢,但持续作用时间长,效果明显好于常规消毒剂。

    表3常规消毒剂和微生物制剂分别作用奶牛养殖环境的效果

    其中各常见致病菌的鉴定用如下特异性检测培养基。总菌落计数平板30℃培养24h后,用影印平板法将此平板上的菌落影印至下述特异性检测培养基,观察并做镜检。

    大肠杆菌:大肠杆菌显色培养基,成份(g/L):特殊营养物37.9、显色剂0.2、琼脂12.0、pH值为6.8±0.2,25℃培养。大肠杆菌显蓝绿色,大肠菌群显无色,其它菌显黄色或无色,革兰氏阳性菌被抑制。

    金黄色葡萄球菌:金黄色葡萄球菌显色培养基(RFP),成份(g/L):改良BP基础50.0、琼脂18.0、显色物质40.2,pH值为7.2~7.4,25℃培养。此配方可以进行改良或增加营养成份以获得最佳的结果。黄色葡萄球菌显灰黑色,其外围有一不透明沉淀环。

    表皮葡萄球菌:金黄色葡萄球菌显色培养基(RFP),成份(g/L):改良BP基础50.0、琼脂18.0、显色物质40.2,pH值为7.2~7.4,25℃培养。此配方可以进行改良或增加营养成份以获得最佳的结果。表皮葡萄球菌显灰黑色,其外围无透明沉淀环。

    无乳链球菌:改良爱德华培养基,编号:CM0027B,成份(g/L):牛肉粉10.0、蛋白胨10.0、七叶苷1.0、氯化钠5.0、结晶紫0.0013、硫酸铊0.33、琼脂15.0、pH值为7.4±0.2。无乳链球菌生长良好,其他菌不生长。

    实施例3

    (1)控制和消除乳腺炎致病菌的微生物制剂的制备

    制备过程同实施例1步骤(1),区别仅在于加入0.2mol/L,pH值为7.2的磷酸氢钾缓冲液(PBS)重新悬浮蛭弧菌沉淀物,蛭弧菌BDS01游泳体菌液和蛭弧菌BDS02游泳体菌液的浓度分别为103pfu/ml,将蛭弧菌BDS01游泳体菌液和蛭弧菌BDS02游泳体菌液按细菌数1∶1混合,得到微生物制剂。

    (2)将防治奶牛乳腺炎的微生物制剂应用于消除奶牛乳腺上的致病菌

    用无菌小刷和200mL的无菌生理盐水轻轻刷洗十头奶牛的乳腺,制成菌悬液,做活菌计数。

    同一牛棚内另外二十头奶牛中十头用75%v酒精擦拭乳腺消毒,另外十头用步骤(1)制备的微生物制剂浸泡乳腺1min,24h后用无菌小刷和200mL的无菌生理盐水轻轻刷洗十头奶牛的乳腺,制成菌悬液,做活菌计数。

    乳腺炎致病菌的检测和计数方法同实例2。

    结果如表4所示,微生物制剂浸泡对乳腺炎致病菌的杀灭效果比常规消毒剂要好很多。资料表明99.5%的奶牛乳腺炎是由乳区细菌感染引起的,这些细菌多是通过乳头进入的。挤奶后用含有蛭弧菌BDS01的微生物制剂浸泡牛乳1min或喷洒两遍,使乳头封闭,从而最大限度的减少乳腺炎发生的概率。

    表4为75%v酒精和微生物制剂分别作用奶牛乳腺的效果

    实施例4

    (1)控制和消除乳腺炎致病菌的微生物制剂的制备

    制备过程同实施例1步骤(1),区别仅在于加入DNB液体培养基(营养肉汤0.8g,酪蛋白酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,溶于1000ml蒸馏水中,pH值为7.2~7.6)重新悬浮蛭弧菌沉淀物,蛭弧菌BDS01游泳体菌液和蛭弧菌BDS02游泳体菌液的浓度分别为102pfu/ml,将蛭弧菌BDS01游泳体菌液和蛭弧菌BDS02游泳体菌液按细菌数1∶1混合,得到微生物制剂。

    (2)将微生物制剂作用于奶牛饲料

    称取奶牛全混饲料0.5kg,浸入2kg的无菌水中,搅拌后静置10min,取0.5ml上清液涂布平板,做活菌计数。

    称取0.5kg奶牛全混饲料,加入0.5g抗生素饲料添加剂杆菌肽锌(商品名:雅来益力素,原粉,1kg/袋,购于济南鑫源兽药原料有限公司),浸入2kg的无菌水中,搅拌后静置10min,取上清制备菌悬液,同样方法做活菌计数。

    步骤(1)制备的微生物制剂按30ml/kg的量加入到饲料中,24h后称取0.5kg喷洒了蛭弧菌混合液的饲料浸入2kg的无菌水中,搅拌后静置10min,取上清制备菌悬液,做活菌计数。

    乳腺炎致病菌的检测和计数方法同实例2。

    结果如表5所示,喷洒微生物制剂后饲料中的总菌落和致病菌落数均大大减少,且少于加入抗生素添加剂的饲料,同时蛭弧菌游泳体是微生态制品,高效、安全、无毒、不产生耐药性。蛭弧菌可替代抗生素及其它化学药物作为饲料添加剂,能彻底解决抗生素及其它化学药物残留于奶制品中从而对人产生的危害,确保奶产品的优质。

    表5抗生素添加剂和微生物制剂分别应用于饲料的效果

    实施例5

    将控制和消除乳腺炎致病菌的微生物制剂作用于奶牛饮用水,具体过程如下:

    量取奶牛饮用水100ml,摇匀后取0.5ml直接涂布平板,做活菌计数。

    量取奶牛饮用水100ml,加入二氧化氯消毒粉10mg,24小时后同样方法做活菌计数。

    量取奶牛饮用水100ml,加入实施例4步骤(1)制备的微生物制剂10ml,24小时后取样做活菌计数。

    乳腺炎致病菌的检测和计数方法同实例2。

    表6二氧化氯和微生物制剂分别作用于奶牛饮用水的效果

    结果如表6所示,喷洒微生物制剂的饮用水的消毒效果好于加入常规消毒剂的引用水。水对奶牛的新陈代谢具有极其重要的作用,牛奶成分中水分含量约占87%。奶牛每生产1kg牛奶需要3~5kg水,这意味着高产奶牛每天需要90~110kg新鲜饮水。生产中,一些奶牛养殖户往往只注意精粗饲料的供应,在一定程度上忽视了奶牛饮水的重要性。在饲养奶牛过程中,奶牛的饮用水问题必须引起足够重视。在临床上常用的饮水消毒剂为氯制剂、季胺盐类和碘制剂。在饮水消毒时,如果药物的剂量掌握不好或对饮水量估计不准,可能会使水中的消毒药物浓度加大,若长期饮用,除可能引起急性中毒外,还可能杀灭或抑制奶牛肠道内的正常菌群,使奶牛的正常消化出现紊乱,对奶牛的健康造成危害。蛭弧菌是微生态制剂、安全、无毒、不会对奶牛的生长带来不良影响,也不会影响牛奶的品质,并且杀毒效果也好于常规消毒剂。

    上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。

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本发明公开了一种控制和消除乳腺炎致病菌的微生物制剂及其应用。本发明将蛭弧菌游泳体制备成控制和消除乳腺炎致病菌的微生物制剂。通过检测,所述微生物制剂对环境中的常见细菌,包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌等奶牛乳腺炎常见致病菌有很强的消除作用。相对于蛭弧菌蛭质体而言,虽然存在着制备繁琐、不易保存的弱点,但用蛭弧菌游泳体控制和消除乳腺炎致病菌具有起效快、活力强的优点。由于蛭弧菌游泳体。

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