用于冷冻犬精液的组合物，应用该组合物冷冻犬精液的 方法和使用该冷冻犬精液进行人工授精的方法 【技术领域】
本发明涉及用于冷冻犬精液的组合物，应用该组合物冷冻犬精液的方法和使用该冷冻犬精液进行人工授精的方法。更具体地，本发明涉及用于冷冻犬精液的组合物，其中在精液冷冻后于预定时间内将精液解冻，精液中存活精子的数量及其形状和生存能力保持不变，以及应用该组合物冷冻犬精液的方法，和人工授精地方法，其包括将冷冻的犬精液在适当的地点和时间解冻，并将其插入雌犬阴道。背景技术
根据最新的工业发展，基因工程已成为一重要的研究领域。基因工程必然要使良好品种保存并发展，以及使人类寿命延长，基因工程的研究已超出了初始阶段，达到了一个相当高的水平。
对于家畜和宠物饲养，应用液体精液的人工授精通过将从同一雄性动物收集的精液与稀释液混合，以增加可供注射的液体的体积，可以使几个雌性动物授精。因此，通过进行人工授精，可以收集优异的或纯的精液，并使几个雌性动物同时被受精，由此可以产生优良的品种并保存纯的品种。
为了成功地获得具有上述几个优点的人工授精，开发出适当的稀释液已成为一个重要问题。由于数十年前已开始稀释液的研究，目前已开发出用于猪、马、牛的稀释液，并已投入应用。而用于犬精液的稀释液研究尚未成熟。
雌性动物的受精需要使用一种长时间保存动物精液而不损失优异精液的新鲜性的方法，该方法会对家畜和宠物行业的发展起到重要的贡献作用。
冷冻方法最适合于长时间保存精子。然而，还没有具体开发出犬精液的冷冻方法。尽管不十分清楚，未开发出犬精液冷冻方法的原因可能是未能完全开发出用于冷冻具有特殊性质的犬精液精子的试剂，以及应用该试剂的方法。发明公开
本发明的第一个目的在于提供用于冷冻犬精液的组合物，通过它可以冷冻具有特殊精子的犬精液，以用于保存。
本发明的第二个目的在于提供一种通过应用所述组合物冷冻从一个雄性犬收集的精液的方法，通过所述方法该精液可以储存很长一段时间并可以方便地被携带，通过所述方法该冷冻犬精液可以在适当的时间被解冻，以用于人工授精。
本发明的第三个目的在于提供一种应用根据冷冻方法冷冻的精液进行人工授精的方法，通过所述方法可以繁殖优异的动物，并且该方法可以被广泛推广。
为完成第一个目的，本发明提供了一种用于冷冻犬精液的组合物，其包括基于100ml蒸馏水的0.25-4.5g柠檬酸钠、0.45-4.0g右旋糖、0.01-0.3g青霉素、50,000-500,000 IU链霉素、0.25-0.45g过氧化氢酶、0.045-0.25g蛋黄、1.5-15ml甘油和0.02-0.1μg犬血清。
为完成第二个目的，本发明提供了应用该组合物冷冻犬精液的方法，其包括以下步骤：(a)通过按摩方法或电击(electrical shock)收集雄性犬的精液，(b)离心收集到的精液，分离并除去上清液，只留下下层的精液，(c)将下层的精液与组合物等体积混合，预冷混合物，(d)进一步将该组合物加入到步骤(c)得到的混合物中，将精液与该组合物的体积比降低至1∶2，再次冷却得到的混合物，和(e)将液体氮加入到步骤(d)得到的混合物中，冷冻该混合物。
为完成第三个目的，本发明提供了用于犬人工授精的方法，包括下列步骤：(a)检测雌犬准确的排卵期以改善生殖率，(b)将为完成本发明第二个目的的方法制备的冷冻的精液加入到0.3-1.5wt％氯化钠溶液和犬血清的混合物中，加热至30-40℃，将其解冻，(c)通过显微镜测定解冻的精液中精子的活动能力，和(d)将解冻的精液注入到雌犬的阴道，按摩雌犬的阴蒂。
本发明者进行了广泛的研究，开发了用于冷冻犬精液的方法以及应用其的组合物，发现了通过将犬血清与类似于用于牛或猪的常规稀释液的组合物相结合，可以冷冻储存犬精液，由此完成了本发明。
下面将更加详细地描述本发明。
先描述用于冷冻犬精液的组合物。
按照本发明的用于冷冻犬精液的组合物的制备是通过将用于调节缓冲功能、酸性(pH)和精子渗透压的0.25-4.5g柠檬酸钠、作为新陈代谢和能量源的0.45-4.0g右旋糖、作为用于防止感染的抗生素的0.01-0.3g青霉素、50,000-500,000 IU链霉素、0.25-0.45g过氧化氢酶、0.045-0.25g蛋黄、1.5-15ml甘油和0.02-0.1μg犬血清均匀混合到100ml蒸馏水中进行的。由此制备的组合物以大约2ml为单位冷冻，当使用时将其解冻。
按照本发明的组合物能够储存精液很长一段时间，并能同时维持冷冻精液中含有的精子的生存能力和活动能力，其含有在解冻后表现出正常繁殖能力和传递速率的犬血清。
下面，将描述应用该组合物的用于冷冻犬精液的方法。
冷冻犬精液第一步是先收集犬精液。作为精液收集方法，可以使用本领域公知的方法，而没有任何限制，优选按摩方法或电击(electricalshock)。下面简要描述应用最广泛的按摩方法。
由于精子与尿混合后迅速死亡，优选雄犬在收集精液前先小便。然后将雄犬的生殖器插入具有人工阴道的测试管中进行按摩，使雄犬的精液射入到测试管中。为了使通过该方法收集精液更有效，让发情的雌犬在雄犬周围徘徊。或者，将含有发情雌犬的阴道分泌物的冷冻棉花或海棉解冻，当收集精液时让雌犬闻到其气味。
在应用按摩方法收集精液时，将精液分成三份样品，在不同的试管中收集。其中，含有精子的精液样品是第二份收集的样品。每份样品收集的时间间隔大约是10-20秒。然而，在某些情况下第一和第二份样品间的时间间隔太短以至于无法辨别。在本发明中优选使用第二份样品。然而，当无法从第二份样品区别第一份样品时，将三份样品都收集到一个测试管中备用。
然后通过离心方法分离收集到的精液，弃去上清液，只留下下层沉积的精液，离心在大约500-1100RPM/分进行6分钟。
将下层沉积的精液与上述制备的组合物在室温等体积混合，然后预冷混合物。其中冷却时间为约10-20分钟，冷却温度为约5℃。在室温下进一步将预冷的混合物与组合物混合，得到精液与组合物以1∶2的体积比混合的混合物，然后再次在相同的温度和时间下进行冷却。经过预冷和再冷的冷却步骤，精液和混合物完全均匀混合。
然后通过滴管吸取预定量的再次冷却混合物，将2-3滴滴到干冰的表面。由于干冰的表面温度为大约-79℃，该混合物被冷冻到该温度。将该冷冻的混合物与干冰分离，置于装有约-196℃液氮的容器中，然后完全密封，由此完成了冷冻犬精液的过程。由于该冷冻的混合物在液氮中为小球状，该方法被称为“小球(pellet)方法”。
除了上述小球方法，犬精液可以通过应用吸管的方法进行冷冻，下面简要描述该方法。
将再次冷却的混合物细分为大约0.5ml的样品，放入吸管中。每20-30个吸管分成一组，浸入到含有液氮的容器中。当吸管浸入到容器中进行冷冻时，是将它们逐渐浸入，而不是立即浸入到容器的底部。开始，将它们浸入到容器的的上部，保持一段预定的时间，然后将它们浸入到容器的中部，保持一段预定的时间，然后浸入到容器的底部。
由此冷冻的精液可以运输和储存很长一段时间，如果需要在解冻后可以用作人工授精。
下面接着描述应用冷冻精液的人工授精方法。
首先，为了进行人工授精，进行测试以确定雌犬是否处于排卵期。排卵期测试采用本发明所属技术领域公知的方法进行，如阴道细胞测试或激素测试。
然后，通过如下方法将冷冻的精液解冻：将冷冻的精液加入到0.3-1.5wt％氯化钠溶液和加热的少量犬血清的混合物中，将混合物加热至30-40℃，其有利于维持精子的生存能力和形状。并且，尽管该混合物可以直接加热，但由于很难控制温度，优选将含有氯化钠溶液和犬精液的密封容器浸入到约50℃热水中进行加热。
在应用由此解冻的精液进行人工授精前，通过显微镜测定解冻的精液中精子的数量、形状和活动能力。成功的人工授精取决于向前移动的精子的数量。根据它们的活动能力将精子分为四类。
0类表示精子只是尾部移动，而不能向前移动的情况，1类表示少于20％的精子向前移动的情况，2类表示20-50％的精子向前移动的情况，3类表示50-80％的精子向前移动的情况，4类表示超过80％的精子向前移动的情况。当将解冻的精液置于玻片上并通过显微镜观察时，只有2类或更高类活动能力的精液可以用于人工授精。
然后，将解冻的精液注入到处于产卵期的雌犬的阴道，按摩雌犬的阴蒂，完成人工授精。
除了上述人工授精方法，解冻的精液可以通过外科手术的方式注入到雌犬的子宫。换句话说，肚脐下部切一大约2cm小口，拉起子宫，通过注射器直接将雄犬的精液注入到雌犬的子宫中。然后，依次缝合腹膜、腹肌和皮肤。进行发明的最佳实施方式
通过下面实施例进一步说明本发明，它们绝不是为了限制本发明的范围。实施例1冷冻犬精液的组合物的制备
应用混合器将基于100ml蒸馏水的下列组分的混合物均匀混合，以制备冷冻犬精液组合物。
柠檬酸钠 0.35g
右旋糖 2.5g
青霉素 0.02g
链霉素 100,000 IU
过氧化氢酶 0.35g
蛋黄 0.05g
甘油 2ml
犬血清 0.05μg犬精液的冷冻方法
通过电击(electrical shock)收集体重43kg的6岁牧羊犬的精液。收集的精液量为6.2ml。然后通过离心方法分离收集到的精液，弃去上清液，只留下下层沉积的精液，在500-1100RPM/分下离心6分钟。
将由此分离的下层精液与上述制备的组合物在室温等体积混合，然后预冷混合物。其中冷却时间为10-20分钟，冷却温度为约5℃。然后将组合物进一步加入到预冷的混合物中，使精液与组合物以体积比1∶2混合。然后将得到的混合物在相同的温度和时间下再次进行冷却。
然后通过滴管吸取预定量的再次冷却的混合物，将2-3滴滴到干冰的表面。由于干冰的表面温度为约-79℃，该混合物被冷冻到该温度。将该冷冻的混合物与干冰分离，置于装有约-196℃液氮的容器中，然后完全密封，由此完成了冷冻犬精液的过程。应用冷冻精液的人工授精
三个体重30kg的3岁雌性牧羊犬用作人工授精。通过阴道细胞测试以确定雌犬是否处于排卵期。
然后，需要将上述方法冷冻的精液解冻。解冻是通过如下的方法进行的：将冷冻的精液加入到0.3-1.5wt％氯化钠溶液和少量犬血清的混合物中，将混合物加热至38℃，保持5小时。
然后，在应用该解冻的精液进行人工授精前，通过将解冻的精液置于玻片上用显微镜观察，以检测存活精子的活动能力。成功的人工授精取决于向前移动的精子的数量。向前移动的精子的百分比大约为85％，其适合于人工授精。
下一步，将解冻的精液分成三份，然后注入到处于产卵期的雌犬的阴道。然后按摩每只雌犬的阴蒂5分钟，完成人工授精。
人工授精完成后1个月进行怀孕检测，结果所有三只雌犬都已怀孕。后来三只雌犬分别生出4、6和9只健康小狗。实施例2
在本实施例中，按照与实施例1相同的方法制备冷冻犬精液的组合物，只是使用的是0.02μg犬血清。
然后通过与实施例1相同的方法，应用该组合物进行犬精液的冷冻和人工授精。
在该实施方案中，使用一只体重40kg的5岁雄性牧羊犬和三只3岁的体重为25kg、30kg和28kg的雌性牧羊犬。
解冻精液的活动能力测试结果表明精子向前移动的百分比为60％，其适合用于人工授精。
人工授精完成后1个月进行怀孕检测，结果两只雌犬都已怀孕。后来两只雌犬分别生出5和6只健康小狗。对照实施例1
在该对照实施例中，按照实施例1制备用于冷冻犬精液的相同组合物，并按照与实施例相同的方法冷冻犬精液，除了组合物与犬精液的体积比为1∶1外。并按照与实施例1相同的方法收集同一只雄犬的犬精液。
按照与实施例1相同的方法解冻冷冻的精液，测试解冻的精液中精子的活动能力。测试结果表明精子向前移动的百分比小于20％，其不适合用于人工授精。对照实施例2
在该对照实施例中，按照与实施例1相同的方式制备用于冷冻犬精液的相同组合物，除了组合物中不含有犬血清外。冷冻方法和解冻方法与实施例1中相同，并按照与实施例1相同的方法收集同一只雄犬的犬精液。
按照该对照实施例冷冻和解冻的精子的活动能力测试表明，精子只是尾部活动，而不能向前移动，其不适合用于人工授精。
如上所述，本发明提供了用于冷冻犬精液的方法，其中犬精液由于其精子的特性，难于冷冻储存，本发明还提供了该方法中使用的组合物。因此，犬精液可以在冷冻状态下保存，由此可以保留犬的优良品种。并且，冷冻的雄性犬精液可以在适当的时间和地点用于人工授精，因此能够增加犬的出生率。