多取代尿嘧啶类化合物、制备方法及其用途 【技术领域】
本发明涉及一种抗HIV病毒试剂，进一步说是S-DABO类似物2-(取代芳基或烷氧基羰基甲基硫)-5-烷基-6-萘甲基-尿嘧啶方法、用途。该系列化合物不仅具有显著的抗HIV-1病毒活性，而且也能对HIV-2 SOD病毒株产生抑制作用，对HIV-1(IIIB)变异株病毒SO561945(Y181C和K103A双突变株)也显示出一定的耐受性，除HIV-1RT外该系列化合物可能还作用于其它靶点。
背景技术
艾滋病(AIDS)即获得性免疫缺陷综合症(Acquired immune deficiency syndrome)是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV).所致。
逆转录酶(Reverse transcriptase，RT)因其在HIV从mRNA反转录为DNA的过程中起主导作用，而成为抗艾滋病毒药物设计的重要靶点。
在HIV RT靶点药物中，非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)如已被FID批准用于临床治疗的奈维拉平(Nevirapine)，地拉韦定(Delavirdine)和依非韦伦(Efavitrenz)及被用于短期的临床研究的α-APA R089439；MKC-442和HBY 097等，因其高效低毒、副作用小等特点而倍受关注。经典NNRTIs只作用于HIV-1RT，对HIV-2 RT和其它逆转录酶均无效。这些NNRTIs类药物明显提高了抗HIV感染和AIDS的临床疗效，具有很显著的优点，但是它们用于治疗后很短的时间就会使HIV-1产生抗性，该缺陷极大地限制了其抗病毒潜力地发挥，因此增加现有药物的抗耐药性和筛选新颖结构的候选物是抗艾滋病药物研究的重点。
【发明内容】
本发明的目的是在于获得一种S-DABO类逆转录酶抑制剂2-(取代芳基、烷基或烷氧基羰基甲基硫)-5-烷基-6-(1-萘甲基)尿嘧啶类化合物。
本发明的目的是获得上述化合物的制备方法。
本发明的目的是获得上述化合物的应用。
二氢烷氧苄基嘧啶二酮(S-DABO)类似物是近年来发现的一类NNRTIs，经过大量的结构改造，现已发现了一系列高活性衍生物，显示了较好的应用前景。本发明采用分子对接方法从理论上模拟了该类抑制剂与HIV-1 RT的作用方式，并基于此作用模型对其进行结构修饰，在该衍生物嘧啶环的C2侧链β位引入羰基以加强与氨基酸残基Lys103间的氢键作用，增强配体小分子和受体酶间的亲合力；在C2侧链末端引入大体积的各取代芳环，以充分填充了Pro236的hairpin位的柔性结合腔，或引入各种烷基、烷氧取代基，增强化合物的亲脂性：同时在C-5位引入各种烷基或烷氧基起协同作用，设计合成了一系列2-(芳基羰基甲基硫)-5-烷基-6-萘甲基-尿嘧啶目标化合物。生物活性测试结果表明该类化合物不仅具有良好的抗HIV-1活性，具有较高的选择性指数，且对HIV-2 SOD病毒株产生抑制作用，对K103N和Y181C双突变病毒株也显示出一定的耐受性，且对HIV-2 SOD病毒株产生抑制作用，对K103N和Y181C双突变病毒株SO561945也显示出一定的耐受性。
本发明根据HIV-1逆转录酶的三维结构，设计并合成了一系列全新结构的化合物-2-(取代芳基、烷基或烷氧基羰基甲基硫)-5-烷基-6-萘甲基-尿嘧啶。这类化合物在嘧啶环C2侧链引入氢键受体和疏水性取代基以增强抑制剂分子与酶间的氢键和疏水作用，提高抗病毒活性。
本发明提供了一类具有如下结构通式的化合物：
其中：
R1为H或C1-5的烷基；
R2为C1-6的烷基；C1-6的烷氧基；芳环-R3；芳杂环-R3；C3-6环烷基-R3；芳环、芳杂环、C3-6环烷基上的取代基R3为H、1-3个相同或不同的：C1-3的烷基、卤素、C1-3的醚基、OH。
该类化合物的制备方法如下：
以5-烷基-6-(1-萘甲基)硫尿嘧啶2为原料，分别与各种α-卤代酮或各种α-卤代乙酸酯，在溶剂中，K2CO3催化下，加热搅拌进行S-烷基化反应，制得本发明目标化合物-2-(取代芳基、烷基或烷氧基羰基甲基硫)-5-烷基-6-萘甲基-尿嘧啶，其反应式如下所示：
其中：
(1)5-烷基-6-(1-萘甲基)硫尿嘧啶按文献(G.Meng，F.E.Chen，et.al.Chem.Pharm.Bull.2003，51，779)方法制备，反应式如下所示：
(2)R1＝H或C1-6的烷基；R2＝C1-6的烷基、C1-6的烷氧基、芳环-R3、芳杂环-R3、C3-6环烷基-R3(其中芳环、芳杂环、C3-6环烷基上的取代基R3为H、1-3个相同或不同的：C1-3的烷基、卤素、C1-3的醚基、OH)；X＝Cl、Br、I。
(3)5-烷基-6-(1-萘甲基)硫尿嘧啶与各种α-溴代酮或各种α-溴乙酸酯的摩尔比为1∶1～1.5，反应温度控制在为25-80℃之间，反应时间为10-24小时。
(4)所用的溶剂可以是甲苯、二氯甲烷、二甲基甲酰氨中的一种或它们的混合物。
本发明的化合物不仅合成方法简单而且是一种抗HIV病毒试剂，可作为抗AIDS的药物候选物。生物活性测试结果表明：
1)这类化合物普遍具有抗HIV病毒活性，其中部分化合物对HIV-1(IIIB)病毒显示出较强的抑制作用，且具有较小的细胞毒性和较高的选择性指数。
2)其中一些化合物在抑制HIV-1的同时也能对HIV-2 SOD病毒株产生抑制作用。
3)该类化合物对Y181C和K103C突变耐受性增强，某些化合物对HIV-1(IIIB)变异株病毒SO561945显示出一定的抑制活性。
本发明化合物结构新颖，具有较高抗HIV病毒活性，较小的细胞毒性和较高选择性指数。本发明化合物制备方法简单、条件温和，适合产业化生产，可望进一步开发成为抗AIDS的药物。
【具体实施方式】
通过下述实施例将有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容
实施例1：2-[(取代苯基羰基甲基硫)-6-(1-萘甲基)-5-异丙基尿嘧啶的合成反应的一般操作：
将5-烷基-6-(1-萘甲基)-2-硫尿嘧啶(3mmol)和K2CO3置于烧瓶中，加入10ml干燥DMF，室温搅拌反应半小时，加入α-溴代酮R1COCH2Br(3.3mmol)，继续55℃搅拌反应，TLC跟踪约22小时原料点消失，停止反应，将反应液倒入30mL冰水中，搅拌析出沉淀，过滤，用水洗涤沉淀，抽滤烘干，得粗品，进一步柱层析纯化可得各种白色粉末。用适当溶剂重结晶可得5-烷基-6-(1-萘甲基)-2-(取代芳基羰基甲基硫)尿嘧啶的白色晶体。
以不同的5-烷基-6-(1-萘甲基)-2-硫尿嘧啶与不同α-溴代酮用上述方法分别获得目标产物，部分结果如下：
操作如上，柱层析分离(P∶E＝2∶1)得白色粉末1a，产率：54％；熔点：187.1-187.8℃；1HNMR(DMSO，500MHz)δppm：(s，3H，CH3)，2.30(s，3H，Ph-CH3)，4.12(s，2H，SCH2)，4.43(S，2H，CH2naphthyl)，6.88-7.46(m，11H，ArH)，12.73(s，brs，1H，NH)
操作如上，柱层析分离(P∶E＝2.5∶1)得白色粉末1d，产率：60％；熔点：184.8-185.8℃；
1H NMR(DMSO，500MHz)δppm：1H NMRδ1.95(s，3H，CH3)，4.12(s，2H，SCH2)，4.43(S，2H，CH2naphthyl)，7.05-8.11(m，11H，ArH)，12.77(s，brs，1H，NH)
操作如上，柱层析分离(P∶E＝1∶1)得白色粉末1j，产率：34％；熔点：177.9-178.2℃；1HNMR(DMSO，500MHz)δppm：0.91(s，3H，J 7.35，CH3)，2.44(q，J 7.35，2H，CH2)，4.12(s，2H，SCH2)，4.41(S，2H，CH2naphthyl)，7.03-7.91(m，11H，ArH)，12.79(s，brs，1H，NH)。
操作如上，柱层析分离(P∶E＝2∶1)得白色粉末1m，产率：60％；熔点：181.0-182.0℃；
1H NMR(DMSO，500MHz)δppm：1.13(d，6H，J 6.60，2CH3)，2.98(m，1H，J 6.6，CH2)，4.13(s，2H，SCH2)，4.49(S，2H，CH2naphthyl)，7.02-7.93(m，12H，ArH)，12.66(s，brs，1H，NH)
操作如上，柱层析分离(P∶E＝2∶1)得白色粉末1o，产率：51％；熔点：183.9-184.6℃；1HNMR(DMSO，500MHz)δppm：1.15(d，6H，J 6.85，2CH3)，2.97(m，1H，J 6.85，CH)，3.73(s，3H，OCH3)，4.16(s，2H，SCH2)，4.42(S，2H，CH2naphthyl)，6.81-7.96(m，11H，ArH)，12.62(s，brs，1H，NH)。
操作如上，柱层析分离(P∶E＝1∶1)得白色粉末1q，产率：62％；熔点：187.1-187.4℃；1HNMR(DMSO，500MHz)δppm：1.17(d，6H，J＝6.8，2CH3)，2.96(m，1H，J＝6.8，CH)，4.11(s，2H，SCH2)，4.44(S，2H，CH2naphthyl)，6.96-7.90(m，11H，ArH)，12.65(s，brs，1H，NH)
实施例2：2-[(烷氧基羰基甲基硫)-6-(1-萘甲基)5-异丙基尿嘧啶的合成反应的一般操作：
将5-烷基-6-(1-萘甲基)-2-硫尿嘧啶(3mmol)和K2CO3置于烧瓶中，加入10ml干燥DMF，室温搅拌反应半小时，加入BrCH2COO R1的α-溴乙酸酯(3.9mmol)，继续25℃搅拌反应约10小时，TLC跟踪到原料点消失，停止反应，减压旋蒸除去溶剂，加入30mlCH2Cl2溶解残余物，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸去溶剂得粗品，进一步柱层析纯化可得各种白色粉末。用适当溶剂重结晶可得5-烷基-6-(1-萘甲基)-2-(烷氧基羰基甲基硫)尿嘧啶的白色晶体。
以不同的5-烷基-6-(1-萘甲基)-2-硫尿嘧啶与不同α-溴代烷基酸乙酯用上述方法分别获得目标产物，部分结果如下：
操作如上，柱层析分离(P∶E＝2.5∶1)得白色粉末1g，产率：52％；熔点：163.2-163.8℃；
1H NMR(DMSO，500MHz)δppm：0.99(t，J 7.0，3H，CH3)，1.96(s，3H，CH3)，3.76(s，2H，SCH2)，3.86(q，J 7.0，2H，OCH2，)，4.28(S，2H，CH2naphthyl)，7.18-8.17(m，7H，ArH)，12.77(s，brs，1H，NH)。
操作如上，柱层析分离(P∶E＝2∶1)得白色粉末1l，产率：51％；熔点：143.5-143.9℃；1HNMR(DMSO，500MHz)δppm：0.89(s，3H，J 7.35，CH3)，2.43(q，J 7.35，2H，CH2)，3.39(s，3H，OCH3)，3.74(s，2H，SCH2)，4.28(s，2H，CH2naphthyl)，7.17-8.14(m，7H，ArH)，12.73(s，brs，1H，NH)。
操作如上，柱层析分离(P∶E＝2∶1)得白色粉末1t，产率：37％；熔点：125.2-125.8℃；1HNMR(DMSO，500MHz)δppm：0.93(d，6H，J 6.7，CH3)，1.17(m，1H，J 6.85，CH)，2.96(m，1H，J6.85，CH)，3.78(s，2H，SCH2)，3.81(q，2H，J 6.7，OCH2)，4.36(S，2H，CH2naphthyl)，7.08-8.18(m，7H，ArH)，12.68(s，brs，1H，NH)。
实施例3抗HIV生物活性测试
体外细胞水平的抗HIV-1病毒活性由比利时Katholleke大学Rega药物研究所测定，主要包括：对HIV-1感染的MT-4细胞的抑制活性，细胞毒性两方面。方法描述如下：使化合物在HIV-1感染的MT-4细胞中，于感染HIV-1不同时间，用MTT法测定药物对HIV诱变的细胞病变的保护作用，计算使50％的细胞免于HIV诱导的细胞病变所需的浓度半数有效浓度IC50，毒性测定与抗HIV活性实验平行操作，也在MT-4细胞培养中，用MTT法测定化合物使50％未感染细胞发生细胞病变的浓度(CC50)，并计算选择性指数SI＝CC50/IC50。
材料与方法：
各化合物的抗HIV活性由药物对HIV在细胞中引起的细胞病变的抑制作用效率来监控。采用MT-4细胞进行细胞培养。采用的病毒株有三种：HIV-1病毒株IIIB，HIV-2病毒株ROD和典型的NNRTIs选择性变异株SO561945，变异部位和变异类型为：K103N和Y181C，这些变异对经典的NNRTIs(nevirapine，delavirdine，sustiva，HEPT，etc.)均可产生耐药性。
具体操作如下：将化合物用DMSO或水溶解后用磷酸盐缓冲食盐水溶液稀释，将3×105MT-4细胞用100μL各化合物不同浓度此溶液在37℃预培养1h。然后向该混合物中加入100μL适当的病毒稀释液，将细胞于37℃培养1h。洗涤三次后，将细胞再次分别悬浮于含有或不含化合物的培养介质中。接着将细胞在5％CO2氛围中，于37℃下再培养7天，并于感染后第三天用含有或不含化合物的培养介质替换补充培养液。每种培养条件都重复操作两次。对病毒的细胞病变作用每天都用反向光学显微镜监控。典型来讲，本实验中所用的病毒稀释液常常会在病毒感染后第五天导致细胞病变。药物抑制浓度以药物对病毒细胞病变作用产生50％抑制作用而同时对细胞无直接毒性的浓度(IC50)表示。值得强调的是，当化合物水溶性较差，需要用DMSO才能溶解时，DMSO体积比浓度相对于水来讲，一般低于10％，(DMSO在MT-4细胞培养介质中最终浓度小于2％)。因为DMSO能影响测试化合物抗病毒活性，对含有相同浓度DMSO溶液抗病毒活性对比空白实验也应该平行操作进行。另外，DMSO最终浓度(1/1000)远远低于影响HIV-1在T-细胞中复制所需浓度。
本发明用HEPT和DDI作对照品，部分目标化合物对HIV-1 IIIB的抑制活性结果见表1；化合物对HIV-2 ROD和HIV-1 IIIB变异株SO561945的抑制活性结果见表2。
表1.抗HIV-1 IIIB活性
Entry R1 R2 IC50，μMb CC50，μMc SId
1a Me (4’-CH3)Ph 0.67 ≥251 ≥374
1b Me (4’-OCH3)Ph 0.37 ＞290 784
1c Me CH3 1.12 85 76
1d Me (4’-F)Ph 0.18 ≥275 ≥1527
1e Me (4’-Cl)Ph 0.55 ≥198 ≥360
1f Me CH3O 6.99 ≥296 ≥42
1g Me CH3CH2O 7.00 ≥287 ≥41
1h Me (4’-CH3)Ph 0.32 6 19
li Et (4’-OCH3)Ph 0.045 178 3955
1j Et (4’-F)Ph 0.078 ≥240 ≥3076
1k Et (4’-Cl)Ph 0.26 56 215
1l Et CH3O 4.72 ≥196 ≥42
1m i-Pr Ph 0.046 238 5173
1n i-Pr (4’-CH3)Ph 0.24 225 937
1o i-Pr (4’-OCH3)Ph 0.030 ≥203 ≥6766
1p i-Pr CH3 0.41 43 105
1q i-Pr (4’-F)Ph 0.078 186 2384
1r i-Pr (4’-Cl)Ph 0.32 ＞270 ＞843
4s i-Pr CH3O 4.49 179 40
1t i-Pr CH3CH2O 1.41 175 ＞125
1u i-Pr (2’，4’-CH3)Ph 0.24 27 112
HEPT 5.06 405 80
DDI 5.37 ≥529 ≥98
表2.抗HIV-2 ROD和SO561945活性
IC50，μM IC50，μM
No No
HIV-2ROD SO561945a HIV-2ROD SO561945a
1a ≥13.61 ≥251 1m 22.0 19.6
1b ≥0.42 ≥290 1n ≥225 ≥225
1c ≥84.9 ≥58.2 1o 13.4 5.82
1d ≥275 ≥275 1p ＞43.1 ＞43.1
1e 19.8 ≥198 1q ≥32.2 188
1f ≥296 ≥296 1r ＞270 ＞270
1g ≥293 ≥317 1s ＞179 ＞179
1h ≥1.25 ≥5.62 1t ≥41.1 ＞175
1i ≥18.9 ＞178 1u 4.00 2.67
1j 16.3 24.2 HEPT NA ＞405
1k ≥0.26 ＞56 DDI 2.71 7.15
1l ≥196 ≥196
实验结果表明，化学结构通式中所包含的化合物普遍具有抗HIV病毒活性，其中部分化合物对HIV-1(IIIB)病毒显示出较强的抑制作用，且具有较小的细胞毒性和较高的选择性指数。尤其从表2可见其中一些化合物在抑制HIV-1的同时也能对HIV-2SOD病毒株产生抑制作用，对Y181C和K103C突变耐受性增强(如化合物(1j，1m，1o，1u等)，说明它们在作用方式上有异于经典NNRTIs。