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1、10申请公布号CN104120144A43申请公布日20141029CN104120144A21申请号201410323880622申请日20140708C12N15/82200601A01H5/0020060171申请人上海交通大学地址200240上海市闵行区东川路800号72发明人王贵荣李斌连唐克轩74专利代理机构上海汉声知识产权代理有限公司31236代理人牛山陈少凌54发明名称基于发根植株再生的植物免组织培养转基因方法57摘要本发明公开了一种基于发根植株再生的植物免组织培养转基因方法，本发明将发根农杆菌中的ROL基因A，B，C，D和目的基因构建到一个位点特异性重组载体系统CRE/LOXP。
2、中，ROL基因作为筛选标记。用包含CRE/LOXP载体系统的农杆菌液体浸泡幼嫩植株切段；切段伤口处在黑暗中诱导出发根后转入光下诱导再生植株，并化学处理，ROL基因在植株化学处理的过程中被敲除，这样就获得了只含有目的基因的转化植株。本发明的方法在有菌条件下进行，不需要组织培养，省去了选选择压力筛选、转染、除菌等步骤，应用前景广泛。51INTCL权利要求书1页说明书3页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页附图1页10申请公布号CN104120144ACN104120144A1/1页21一种基于发根植株再生的植物免组织培养转基因方法，其特征在于，包括如下步。
3、骤步骤一，构建包含目的基因和ROL基因的CRE/LOXP载体系统，将该系统转入农杆菌C58C1中，并通过震荡培养使菌液的OD值达到0409备用；步骤二，取长度为1030CM的植物幼嫩带叶枝条切段，浸泡于步骤一所得的农杆菌的溶液中，浸泡时间为24小时；步骤三，取出浸泡过的植物切段，清洗，放置于装有营养土的透明玻璃花盆中，避光培养3060天；步骤四，待植物切段生根后，铲掉表面土层，将部分根裸露于空气中，把花盆转入光下，诱导植株再生；步骤五，用雌二醇喷洒光下诱导出来的植株敲除ROL基因，最后获得只含目的基因的转化株系；步骤六，对步骤五所得转基因株系进行分子检测和转基因功能验证，从而得到纯合阳性转化子。
4、。2根据权利要求1所述的植物免组织培养转基因方法，其特征在于，步骤一中，所述CRE/LOXP载体系统，包括P1，P2，P3，P4四个部分，其中ROL基因为筛选标记。3根据权利要求1所述的植物免组织培养转基因方法，其特征在于，步骤三中，所述营养土成分为添加1/10MS培养液的基质。权利要求书CN104120144A1/3页3基于发根植株再生的植物免组织培养转基因方法技术领域0001本发明属于生物工程领域，具体涉及一种基于发根植株再生的植物免组织培养转基因方法。背景技术0002农杆菌介导的植物遗传转化技术，是把外源基因导入植物体内的最有效途径。基于该技术的植物转基因方法主要是通过组织培养来实现的，。
5、其不足之外非常明显1植物受体材料必须建立起高效的植株再生系统；2转基因过程中包括植株再生、选选择压力筛选、转染，除菌、生根、炼苗、移栽等步骤，过程非常繁琐，工作量巨大。0003目前真正建立起高频率植株再生体系的植物非常少，然而，绝大多数植物却很容易被诱导出发根，并且通过发根获得再生植株。目前发根来源的植株再生途径不能应用到植物转基因技术中，因为ROL基因的导入使得再生植株失去顶端优势不能正常生长。如果能将发根来源植株中的ROL基因删除，则可利发根来源的植株再生途径实现大部分植物的外源基因遗传转化。发明内容0004本发明针对现有技术中的缺陷，提供一种基于发根植株再生的植物免组织培养转基因方法。本。
6、发明的方法实现了从发根再生植株中除掉ROL基因，获得恢复顶端优势的正常转基因植株；省去组织培养、选择压筛选、除菌等繁琐步聚。0005本发明是通过以下的技术方案实现的，本发明的方法包括如下步骤0006步骤一，构建包含目的基因和ROL基因的CRE/LOXP载体系统，将该系统转入农杆菌C58C1中，并通过震荡培养使菌液的OD值达到0409备用；0007步骤二，取长度为1030CM的植物幼嫩带叶枝条切段，浸泡于步骤一所得的农杆菌的溶液中，浸泡时间为24小时；0008步骤三，取出浸泡过的植物切段，清洗，放置于装有营养土的透明玻璃花盆中，避光培养3060天；0009步骤四，待植物切段生根后，铲掉表面土层，。
7、将部分根裸露于空气中，把花盆转入光下，诱导植株再生；0010步骤五，用雌二醇喷洒光下诱导出来的植株敲除ROL基因，最后获得只含目的基因的转化株系；0011步骤六，对步骤五所得转基因株系进行分子检测和转基因功能验证，从而得到纯合阳性转化子。0012步骤一中，所述CRE/LOXP载体系统，包括P1，P2，P3，P4四个部分，其中ROL基因为筛选标记。雌二醇诱导下，处于两个LOXP之间的ROL基因和CRE基因最终被删除掉。0013步骤三中，所述营养土成分为添加加1/10MS培养液的基质。0014步骤五中，所述雌二醇的浓度为115MOL/L。当雌二醇诱导XVE表达时，CRE说明书CN104120144。
8、A2/3页4被XVE激活，LOXP序列之间的转录单元被切除，下游的目的基因在G1090启动子的控制下表达。0015本发明方法将发根农杆菌中的ROL基因A，B，C，D和目的基因构建到一个位点特异性重组载体系统CRE/LOXP中，ROL基因作为筛选标记。ROL基因属已知基因，ROL基因A，B，C，D中的A，B，C，D四个序列整体发挥作用，本发明将ROL基因构建到重组载体并作为筛选标记，是一种创新性实验操作。然后用包含CRE/LOXP载体系统的农杆菌浸泡幼嫩植物切段；切段伤口处在黑暗中诱导出发根后转入光下诱导植株再生，最后用化学处理敲除掉ROL基因，这样就获得了只含有目的基因的转化植株。该方法不需要。
9、组织培养，省去了选择压力筛选、转染、除菌、生根、炼苗、移栽等步骤，而且适用于常规途径植株再生困难的植物，具有很大的应用前景。0016与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果1可以从发根再生植株中除掉ROL基因，获得恢复顶端优势的正常转基因植株；2省去组织培养、选择压筛选、除菌等繁琐步聚。附图说明0017通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显0018图1为本发明操作流程图；0019图2为CRE/LOXP载体系统。具体实施方式0020下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具。
10、体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如SAMBROOK等分子克隆实验室手册NEWYORKCOLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS,1989中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。0021实施例0022本实施例涉及基于发根植株再生的植物免组织培养转基因方法如图1所示，包含如下步骤0023步骤一，参考文献周洁等杨树，无选择标记转基因体系的建立，构建一个包含G10H和ROL基因的CRE/LOXP载体系统如图2所示，并将该系统转入OD值为04第1组、06第2组、09第3组的发根农杆菌；本实施例中采用的发根农杆菌为发根农杆菌C58C1，通过公开的市售渠道可以获得；0024图2中。
11、G1090，35S，OLEXA46分别为不同的启动子；NOS为终止子；LOXP为切除位点；XVE为雌激素受体反式激活因子；CERINTER为重组酶基因；TARGETGENE为目的基因；P1P4分别代表4个不同的转录单元。0025步骤二，从大田中剪取长度为20CM左右的小蔓长春花带叶枝条该植物由上海辰山植物园提供，本领域通过公开的渠道可以获得，有切口的一端在步骤一所述的农杆菌溶液中分别浸泡2小时第1组、3小时第2组、4小时第3组；0026步骤三，把浸泡过的小蔓长春花枝条拿出来用自来水清洗3次，洗去切口处农杆说明书CN104120144A3/3页5菌，在装有营养土的透明玻璃花盆中避光培养30天第1。
12、组、48天第2组、60天第3组；所述营养土成分为添加1/10MS培养液的基质；所述1/10MS培养液可从公开渠道购买得到；0027步骤四，待发根长出来后，铲掉上面土层将部分发根裸露在外面；然后把花盆转入自然光下诱导植株再生；0028步骤五，用1MOL/L第1组、15MOL/L第2组、8MOL/L第3组的雌二醇喷洒诱导出来的小蔓长春花植株，获得不含ROL基因的植株；0029步骤六，对转基因株系进行分子检测和转基因功能验证，从而得到纯合阳性转化子。0030实施结果，发明人对以上三组实验获得的再生小蔓长春花植株进行检测，均为不含ROL基因的植株，且均获得了阳性转化子。综上所述，本发明方法将发根农杆菌。
13、中的ROL基因A，B，C，D和目的基因构建到一个位点特异性重组载体系统CRE/LOXP中，ROL基因作为筛选标记。然后用包含CRE/LOXP载体系统的农杆菌浸泡幼嫩植物切段；切段伤口处在黑暗中诱导出发根后转入光下诱导植株再生，最后用化学处理敲除掉ROL基因，这样就获得了只含有目的基因的转化植株。本发明的方法不需要组织培养，省去了选择压力筛选、转染、除菌、生根、炼苗、移栽等步骤，而且适用于常规途径植株再生困难的植物，具有很广泛的应用前景；显然，本发明的方法并不限于本发明实施例中列举的小蔓长春花，实施例不限制本发明的保护范围。0031以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。说明书CN104120144A1/1页6图1图2说明书附图CN104120144A。