生物人工胰及其制备方法.pdf

本发明一般地涉及用于在糖尿病动物中产生胰岛素的可植入装置及其制造方法。一些实施方式包括用于生物应用的两亲性生物膜(例如，作为替代的和/或补充的胰岛素源)。一些实施方式也包括包含在一个或多个两亲性膜中的活的胰岛素产生细胞，以防止或减少来自宿主的免疫反应和/或排斥。

1.  一种生产用于提供胰岛素的可植入装置的方法，其包括：
(A)提供至少一种用于产生胰岛素的可植入装置，所述装置包括：
在其边缘通过密封件结合的穿孔中段；
和
至少一个填充口，其被设计为允许所述穿孔中段充满胰岛素产生细胞；
(B)在所述穿孔中段上沉积生物相容的聚合物网状物；和
(C)在所述穿孔中段上形成至少一个免疫隔离膜。

2.  权利要求1所述的方法，其中，所述胰岛素产生细胞是猪内分泌细胞。

3.  权利要求1所述的方法，其中，所述生物相容的网状物是纳米垫。

4.  权利要求3所述的方法，其中，所述生物相容的网状物是由电纺纳米纤维形成的纳米垫。

5.  权利要求4所述的方法，其中，所述纳米纤维具有大约1纳米至大约25,000纳米的平均直径。

6.  权利要求1所述的方法，其中，所述生物相容的网状物由聚氨基甲酸酯形成。

7.  权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个免疫隔离膜由交联的两亲性共网状物形成。

8.  权利要求7所述的方法，其中所述交联的两亲性共网状物由聚(乙二醇)、聚二甲基硅氧烷和三(二甲基甲硅氧基)-苯基硅烷的组合形成。

9.  权利要求7所述的方法，其中所述交联的两亲性共网状物由聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)、聚二甲基硅氧烷和聚甲基氢硅氧烷的组合形成。

10.  权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个免疫隔离膜具有双连续亲水和疏水域，并且亲水孔的尺寸在约3.0nm至约4.0nm的范围内。

11.  权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个免疫隔离膜是两亲性水溶胀膜，所述两亲性水溶胀膜具有在约3.0nm至约4.0nm的范围内的双连续的亲水孔尺寸。

12.  权利要求1所述的方法，进一步包括以下步骤：
(D)用合适量的胰岛素产生细胞填充所述装置；和
(E)密封所述装置。

13.  一种生产用于提供胰岛素的可植入装置的方法，其包括：
(a)提供至少一种用于产生胰岛素的可植入装置，所述装置包括：
在其边缘通过密封件结合的穿孔中段；
和
至少一个填充口，其被设计为允许所述穿孔中段充满胰岛素产生细胞；
(b)在所述穿孔中段上沉积生物相容的聚合物网状物；
(c)在所述穿孔中段上形成至少一个免疫隔离膜；
(d)将所述装置植入到糖尿病哺乳动物中；
(e)用合适量的胰岛素产生细胞填充所述装置；和
(f)密封所述装置以产生所述胰岛素产生装置。

14.  权利要求13所述的方法，其中，所述胰岛素产生细胞是猪内分泌细胞。

15.  权利要求13所述的方法，其中，所述生物相容的网状物是纳米垫。

16.  权利要求15所述的方法，其中，所述生物相容的网状物是由电纺纳米纤维形成的纳米垫。

17.  权利要求16所述的方法，其中，所述纳米纤维具有大约1纳米至大约25,000纳米的平均直径。

18.  权利要求13所述的方法，其中，所述生物相容的网状物由聚氨基甲酸酯形成。

19.  权利要求13所述的方法，其中，所述至少一个免疫隔离膜由交联的两亲性共网状物形成。

20.  权利要求19所述的方法，其中所述交联的两亲性共网状物由聚(乙二醇)、聚二甲基硅氧烷和三(二甲基甲硅氧基)-苯基硅烷的组合形成。

21.  权利要求19所述的方法，其中所述交联的两亲性共网状物由聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)、聚二甲基硅氧烷和聚甲基氢硅氧烷的组合形成。

22.  权利要求13所述的方法，其中，所述至少一个免疫隔离膜具有双连续的亲水和疏水域，并且亲水孔的尺寸在约3.0nm至约4.0nm的范围内。

23.  权利要求13所述的方法，其中，所述至少一个免疫隔离膜是两亲性水溶胀膜，所述两亲性水溶胀膜具有在约3.0nm至约4.0nm的范围内的双连续的亲水孔尺寸。

24.  权利要求13所述的方法，其中，所述装置被植入皮下部位。

25.  权利要求13所述的方法，其中，所述装置被植入腹膜内部位。

26.  权利要求13所述的方法，其中，使用另外的胰岛素产生细胞的组织培养物补充所述装置。

生物人工胰及其制备方法
【0001】本发明产生于由国家科学基金会(NSF)基金DMR 02-43314资助的研究过程中。美国政府可以对其中的发明或多项发明拥有某些权利。
相关申请数据
【0002】本专利申请涉及2006年8月29日提交的美国临时专利申请第60/840,828号，其名称为“Implantable Devices For Producing Insulin(用于产生胰岛素的可植入装置)”，及其对应的PCT专利申请第PCT/US07/018975号，该PCT申请于2007年8月29日提交，名称为“Implantable Devices For Producing Insulin(用于产生胰岛素的可植入装置)”，并且涉及2007年8月3日提交的PCT公开号WO 20082008/019044，名称为“Amphiphilic Grafts and Co-Networks and Processfor Making Same”(两性接枝物和共网状物及其制造方法)。所有上面确定的专利申请在此通过引用整体并入。
技术领域
【0003】本发明一般地涉及用于在糖尿病动物中产生胰岛素的可植入装置及其制造方法。一些实施方式包括用于生物应用的两亲性生物膜(例如，作为替代的和/或补充的胰岛素源)。一些实施方式也包括包含在一个或多个两亲性膜中的活的胰岛素产生细胞，以便防止或减少来自宿主的免疫反应和/或排斥。
背景技术
【0004】许多医学缺陷和疾病是由于细胞不能产生正常的生物活性化合物而引起的。通过将所需的生物活性化合物和/或药剂的来源植入患有缺陷的个体，可以治疗许多这些缺陷。一个众所周知的、可以通过植入生物材料和/或药剂治疗的疾病是I型糖尿病，其中，胰脏胰岛细胞的胰岛素产生严重缺乏、受损或不存在。
【0005】I型或胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)是主要的、昂贵的公众健康问题，其引发肾脏和血管疾病、心脏病、失明、神经损害、重大残疾、以及早产儿死亡。一种治疗方法是移植产生胰岛素的胰岛细胞(9000至12000个胰岛/kg)，其能将血糖水平回复至正常，并且使患者无需摄取外源性胰岛素。如果能在疾病的早期阶段能使血糖、胰岛素和C-肽水平正常化，则可以避免糖尿病并发症。胰岛细胞移植的临床应用的主要障碍一直在于下述问题：移植物排斥、人体器官缺乏、以及获得其的花费。用于防止排斥反应的药物是昂贵的，增加感染风险，并且其自身能引起高血糖、高血脂、高血压和肾功能不全，虽然对于更低毒性的药物疗法正在取得进展。
【0006】注射胰岛细胞是引人注意的，因为其侵害性比胰脏整体器官移植物更小，并且具有更低的发病率。移植的人类胰岛(同种异体移植物)已经显示，在施用免疫抑制药物后，在肝脏中存活，但是难以获得可靠的长期功能。注射进肝脏通常伴随肝素化以避免血栓形成，其能增加眼并发症的风险。而且，人类胰岛是稀有且昂贵的细胞类型。因而，很多研究者建议使用动物细胞(异种移植物)，特别是猪胰岛。虽然猪胰岛相对地难以分离并且脆，但是猪是充足的。
【0007】遗憾的是，与同种异体移植物移植的免疫屏障相比，成功移植异种移植物的免疫屏障甚至更加难以克服。人类具有天然的预形成抗体，其能与糖Galα1，3Gal(Gal)反应，该糖在低级哺乳动物的细胞上表达，以引发超急性排斥。此外，通常有助于控制由补体激活诱导的损害的补体调节蛋白(衰变加速因子、膜辅因子蛋白、CD59)不能发挥作用，原因在于它们是物种特异性的。
【0008】根据上述假设，利用半透膜将活的同种异体的或异种的、产生胰岛素的胰岛细胞进行免疫隔离，可以提供纠正糖尿病的手段。为了避免超急性排斥，应阻止受体(recipient)的抗体“看见”外来蛋白和激活补体。包封材料也应该可靠地保护患者免受伴随动物细胞而无意转移的感染过程(例如，细菌)。用于免疫隔离的材料应允许胰岛素、葡萄糖、氧气和二氧化碳自由通过。这些分子具有小于35埃(3.5nm)的直径。研究表明30nm的孔径可排除免疫球蛋白、补体和细胞因子(如肿瘤坏死因子)的迁移以提供免疫隔离。除非能建立免疫耐受，否则，这些膜也应阻止异种抗原迁移出来进入宿主，在所述宿主中它们可激活间接通路，导致T辅助细胞激活。由直接细胞毒性引起的免疫移植排斥似乎是移植细胞损失的主要原因，因为供体细胞在免疫损害(CD4+T细胞耗竭的)小鼠中的生存能力较好。另外，CD4+细胞分泌干扰素-[γ]，其吸引和激活巨噬细胞和NK细胞。巨噬细胞转而募集T细胞辅助并引发排斥。B细胞体液介导免疫也在异种移植排斥中起作用。然而，有足够的证据表明免疫反应不是异种移植失败的唯一原因。
【0009】进行HEMA(甲基丙烯酸羟乙酯-甲基丙烯酸甲酯)中微囊包埋的卵巢细胞异体移植的研究的研究者发现，在抗体应答发生之前，细胞就开始失去功能。移植失败的其它原因包括：对包封材料化学的炎症反应、营养缺乏、包封材料内废物和自由基积聚、以及氧输送不足。
【0010】鉴于上述，在本领域对提供胰岛素以治疗和/或治愈糖尿病的改良的方法和/或可植入装置存在需求。
发明概述
【0011】本发明一般地涉及用于在糖尿病动物中产生胰岛素的可植入装置及其制造方法。一些实施方式包括用于生物应用的两亲性生物膜(例如，作为替代的和/或补充的胰岛素源)。一些实施方式也包括包含在一个或多个两亲性膜中的活的胰岛素产生细胞，以便防止或减少宿主的免疫反应和/或排斥。
【0012】在一个实施方式中，本发明涉及生产用于提供胰岛素的可植入装置的方法，其包括：(A)提供至少一个用于产生胰岛素的可植入装置，所述装置包括：在其边缘通过密封件(密封，seal)结合的穿孔中段(perforated mid-section)，和至少一个填充口(filling port)，该口被设计为允许所述穿孔中段用生产胰岛素的细胞充满；(B)在穿孔中段上放置生物相容的聚合物网状物(网络)；和(C)在所述穿孔中段上形成至少一个免疫隔离膜。
【0013】在另一个实施方式中，本发明涉及生产用于提供胰岛素的可植入装置的方法，其包括：(a)提供至少一个用于产生胰岛素的可植入装置，所述装置包括：在其边缘通过密封件(密封)结合的穿孔中段；和至少一个填充口，其被设计为允许穿孔中段填充有胰岛素产生细胞；(b)在穿孔中段上沉积生物学相容的聚合物网状物；(c)在所述穿孔中段上形成至少一个免疫隔离膜；(d)将该装置植入患糖尿病的哺乳动物中；(e)用适量的胰岛素产生细胞填充所述装置；和(f)密封所述装置以产生所述胰岛素产生装置。

附图简述
【0014】图1是与本发明一起使用的支架的一种实施方式的侧视图；
【0015】图2(a)和2(b)是用于通过电纺PU纳米垫涂覆支架的设备图解和旋转式支架装配的放大图；
【0016】图3是用于旋转支架的一种示例性装配，其具有这种包括三个喷丝嘴的装配；
【0017】图4是本发明的一个人工胰腺实施方式的图，其中，4(A)详解了俯视图，4(B)详解了剖面俯视图，4(C)详解了剖面侧视图，和4(D)详解了侧视图；
【0018】图5是7重量百分比Elas-Eon在DMF溶液中在25℃下的瞬时粘度对剪切速率的图。
【0019】图6是一组照片，所述照片比较了在最初的5分钟内沉积在SS框架上和支架的孔中的纳米纤维的量(9至10kv，从针尖至支架11cm)；
【0020】图7是一组照片，所述照片比较了在最初的30分钟内沉积在SS框架上和支架的孔中的纳米纤维的量(9至10kv，从针尖至支架11cm)；
【0021】图8是与本发明的BAP一起使用的PDMAAm/PMHMS/PDMS两亲性共网状物(co-network)膜的示例性合成方案；
【0022】图9A是图1或图4的装置的填充口的特写，图解了在所述口处的硅密封件的位置(尺寸为mm)；
【0023】图9B是适合于测定透过速率的一种类型的设备的图；
【0024】图10是被设计为测试BAP的爆破压力的装配的实例；
【0025】图11是根据本发明的一个实施方式的充满胰岛的BAP的示例性方案的说明；
【0026】图12是根据本发明的一个实施方式的反应方案的图解和所使用的缩写，所述图解详解了两亲性网状物和/或共网状物的合成；
【0027】图13图解了末端-官能化试剂SiH-MA的合成；
【0028】图14是SiH-MA的¹HNMR图谱；
【0029】图15是根据本发明的产物混合物的¹HNMR图谱；
【0030】图16是用不同的DMAAm∶AIBN比(400、800和1600)制备的代表性[PDMAAm(PDMS)]-g-PDMS-V接枝物(graft)的GPC迹线图；
【0031】图17是[PDMAAm(PDMS)]-g-PDMS-V(在表1中的样品35-400)的¹HNMR图谱；
【0032】图18是在本发明的一个实施方式中使用的选择成分的化学式；
【0033】图19是由具有不同交联剂浓度(4、8、13和16％)的G50-1600接枝物制备的APCN的sol含量和溶胀比的图；和
【0034】图20是说明两亲性网状物在THF、烃和水中所经受的构象变化的图。
发明详述
【0035】本发明一般性涉及在患糖尿病的动物中产生胰岛素的可植入装置和制造所述可植入装置的方法。一些实施方式包括在生物应用中使用的两亲性生物膜(例如，作为可选的和/或补充的胰岛素源)。一些实施方式还包括被包含住一个或多个两亲性膜中从而防止或减少宿主的免疫反应和/或免疫排斥的活的胰岛素产生细胞。
生物人造胰腺(BAP)：
【0036】在一个实施方式中，根据本发明的BAP被设计为可植入的和可移出的(可外植的)，并且被设计为含有适当数量的免疫隔离的猪胰岛，其“按需求”将需要量的胰岛素递送给宿主并且因而维持血糖量正常。
【0037】对于本发明的目的，公认的是由其他人发布了这样的假说，通过半透膜对活的胰岛素产生胰岛/细胞的免疫隔离提供了用于纠正糖尿病的方法。为了避免排斥作用，必须防止受体的抗体发觉外来蛋白质。封装材料必须可靠地保护患者免受无意地与动物细胞一起转移的细菌和病毒侵害。重要的是，免疫隔离的半透膜应该允许小分子如氧、二氧化碳、葡萄糖和胰岛素自由通过，但是应该防止大的抗体的进入。研究暗示大约30nm的孔径可以将免疫球蛋白、补体和细胞因子(例如，肿瘤坏死因子)排斥在外，提供了有效的免疫隔离。合适的免疫隔离膜可以由2005年7月28日提交的标题为“Amphiphilic Co-Networks，Films MadeFrom Amphiphilic Co-Networks and Uses for Such Co-Networks and Films”、PCT公开号WO 2006/073499中公开的网状物和/或共网状物形成，所述PCT公开通过引用以其全部并入本文。
【0038】在另一实施方式中，合适的免疫隔离膜可以由2007年8月3日提交的标题为“Amphiphilic Grafts and Co-Networks and Process for Making Same”、PCT公开号WO 2008/019044中公开的网状物和/或共网状物形成，所述PCT公开通过引用以其全部并入本文。
【0039】在一个实施方式中，本发明依赖于由PCT公开号WO 2008/019044中公开的网状物和/或共网状物形成的一种或多种膜。
【0040】在本发明的一个实施方式中，在此使用的膜是双(共)连续的(co-continuous)亲水和疏水片段的完全合成的两亲性共网状物(APCN)，其具有特意地被工程化以用于免疫隔离的纳米结构。这些纳米级构造保证了氧和水溶液(葡萄糖、胰岛素、养分、代谢废物CO₂)的快速反向转运。公开了基本上新的合成技术和表征方法以证明所产生的材料的新颖性。该制备方法允许精细调节膜的各种性质并产生可再生的材料。通过使用明确长度(分子量)和长度分布(分子量分布)的亲水和疏水片段，可以控制导管的大小和大小分布。生物相容性部分的使用保证了生物相容性表面的获得。通过合成参数等控制机械性能。进行了特别努力来显示膜的氧渗透性的优异性。
【0041】下面的部分涉及被设计为填充有活的猪胰岛的BAP和所述装置的制备的描述。BAP包括四部分，所有这四部分都是被特别设计和制造的：金属支架、加强纳米垫(nanomat)、免疫隔离聚合物两亲性共网状物(APCN)膜和密封件。这些部分被被整合成一个独特的装置，BAP。
【0042】本发明的一些方面包括：(1)合成适当的免疫隔离膜或多种膜，作为合适的胰岛素产生细胞的“支持装置”；(2)在没有免疫抑制药物的情况下，其能保护异种移植物(猪的PECs)免受宿主的免疫系统攻击；和(3)其是生物相容的并且展示出适于体内植入的机械性能。
【0043】本发明的一些实施方式能纠正或减轻哺乳动物如犬或人类的糖尿病。在一个实施方式中，通过植入生物人造胰腺(BAP)100实现纠正或减轻。在一个实施方式中，此BAP 100包含利用适合异种免疫隔离的聚合物膜104的免疫隔离装置，从而能够将产生胰岛素的猪内分泌细胞(PEC)封装在其内。因此，一些实施方式涉及在没有免疫抑制药物的情况下，纠正哺乳动物如犬和/或人的高血糖症。
【0044】所述BAP 100装置能采用多种形式的任一种，条件是该装置能容纳并维持活胰岛细胞，同时提供胰岛素给宿主。许多实施方式包括间隔部件102，其限定两个膜104之间的距离。例如，一些实施方式包括环或垫圈形状的间隔部件102，免疫隔离膜104能附着至其上。然而，在其它的实施方式中，该环可以用任意适合的形状取代，只要其在所附着的膜104之间提供间隔108，该间隔108足以提供可达约四个胰岛细胞直径的厚度，即，约600微米(从一个膜的外表面至另一膜的外表面所测量的厚度)。选择这个厚度的一个原因是氧必须扩散进入装置中，以支持细胞呼吸。因此，较薄的装置是有望可行的，但是，随着厚度增加超过600微米，预计细胞死亡会增加。然而，在厚度超过600微米时，可存在可行的实施方式。
【0045】在一些实施方式中，所述BAP 100(参见图4)包括一个或多个填充口106和/或排放口，用于填充BAP 100装置。例如，该装置可包括填充口106，其适合接收注射器针，以用胰岛细胞培养物填充该装置。此装置也可以包括一个或多个与填充口联合操作的排放口，其中，当胰岛细胞加至该装置时，允许被置换的气体通过排放口放出。
【0046】在一些实施方式中，所述BAP 100装置被植入糖尿病宿主中。各种植入位置中的任一种可以是适当的，只要该位置具有充足的血流，并且能提供足够的手段用以交换养分和废物从而维持活的胰岛细胞，并且将分泌的胰岛素分布至宿主全身。提供这类足够手段的一些植入位置包括皮下和腹膜内位置。
【0047】在一个实施方式中，本发明利用适合使外源细胞与免疫系统免疫隔离的膜104。在一些实施方式中，此类免疫隔离膜是生物相容的、生物稳定的、无污垢的、可植入的/可外植的、橡胶状的(机械性坚固的)、高O₂渗透性的、可灭菌的、柔软的和/或光滑的。同时，此类膜是半透性的，具有大小可控的导管尺寸，其允许O₂、水、代谢物和养分的向内扩散，以及胰岛素和废物(CO₂)的向外扩散，同时将免疫细胞和免疫蛋白质如IgG(分子量＝150,000g/摩尔)排除在外。在此公开的膜满足这些苛求标准，并且能被合成性适应BAP所需的特征。
【0048】本发明的一些半透膜包括两亲性膜，其具有孔径大小可控的双连续亲水和疏水域并且亲水孔/通道(即，导管)大小为约3.0至4.0nm。在没有免疫抑制的情况下，一些这样的膜可以使猪内分泌细胞(PECs)在哺乳动物体内存活高达三周或更长时间。合适的免疫隔离两亲性膜可以从各种化学术——包括允许产生两亲性共网状物(APCN)的各种化学术——合成。适当的化学反应包括但不限于，在2007年8月3日提交的、标题为“Amphiphilic Grafts and Co-Networks”的PCT公开WO 2008/019044和2005年7月28日提交的标题为“Amphiphilic Co-Networks，Films Made From Amphiphilic Co-Networks and Uses for Such Co-Networks and Films”的PCT公开WO 2006/073499中那些化学反应，两者都通过引用以其全部并入本文。
【0049】在一个实施方式中，APCN膜包括三种成分，PDMAAm(聚(N，N-二甲基丙烯酰胺))和PDMS(聚二甲基硅氧烷)以及PMHS(聚甲基氢硅氧烷)，其通过独特的聚合过程联合为显微均一两亲性网状物。此网状物(膜)允许亲水物质(水溶液)和疏水分子(氧)迅速同时并且反向扩散。
【0050】在另一实施方式中，用作免疫隔离两亲性膜的APCN可以从共连续的共价连接的亲水聚乙二醇(PEG)和疏水的聚二甲基硅氧烷(PDMS)片段来合成，通过三(二甲基甲硅氧基)-苯基硅烷单元交联。
【0051】一些实施方式包括两亲性水溶胀膜，其具有的大小可控的亲水性孔/通道(导管)的尺寸在约3.0至4.0nm的范围内。其它的实施方式包括包含上述膜的免疫隔离装置，并且可以包括生物人造胰腺装置。这样的装置受益于根据本发明的膜的性质，其包括生相容性；生物稳定性；无污垢；可植入/可外植的；机械性坚固的；高O₂渗透性；可灭菌的；柔软和光滑的。同时，本发明的膜是半透性的，具有大小可控的导管尺寸。因此，该膜使O₂、水、代谢物和养分向内扩散，并且使胰岛素和废物(例如，CO₂)向外扩散，但是将免疫系统组分如IgG(M_n＝150,000g/摩尔)排除在外。
【0052】一些实施方式能够保护异种植入物(例如，猪的PEC)免受宿主(如，犬)的免疫蛋白攻击，从而消除对免疫抑制药物的需要。
【0053】在一些实施方式中，所述膜是生物相容的，并展现出适合体内植入的机械性能。这通过用光学和电子显微镜检查BAPs周围组织的外部炎症、新血管形成和纤维化的迹象来完成。
【0054】大包封(Macro-encapsulation)能够保护大量的细胞，并且使细胞的植入和移去变得容易。在一些实施方式中，大包封膜是生物相容的，并具有抵抗断裂的所需机械性能。
【0055】在水中溶胀的两亲的网状物(即，包含近似相等数量的无规交联的共连续亲水和疏水链片段的网状物)通常具有期望的机械性能和充分确定的导管(conduit)。这些网状物响应于接触介质而迅速地进行构象重排(“灵敏的”介质响应微结构)。图20图解了在周围介质从四氢呋喃(THF)变为水(H₂O)、变为碳氢化合物(HC)时，迅速和可逆发生的结构重排。尽管不希望被任何特定的理论所束缚，此种对环境的适应性可以解释根据一个实施方式的某些两亲性网状物的生物相容性。由于根据本发明的两亲网状物是生物和血液相容的，并且在体内无污垢，因此它们能被开发用于生物应用，包括但不限于生物人造胰腺。
【0056】根据本发明的两亲性膜展现出免疫隔离膜所需的性质。例如，一些性质包括：(1)与宿主(例如，人)和客体(例如，猪胰岛)的生物相容性；(2)血液相容性；(3)六个月以上的生物稳定性；(4)快速的氧和水透膜转运；(5)平滑、光滑、无堵塞、无污垢和无血栓形成的表面；(6)可控的半透性：大小可控的导管尺寸，其具有窄的孔径分布(分子量筛截范围)，允许养分和生物活性分子(胰岛素)的水溶液通过以及代谢废物的排出，但是排斥免疫蛋白、抗体和白血球；(7)生理上令人满意的葡萄糖、胰岛素、养分和代谢物的双向流动；(8)薄膜壁(几微米)以最小化扩散路径；(9)具有良好机械性能(例如，强度、模量、延展性、疲劳)的、柔韧的/橡胶状膜，以植入和移出大量的(接近8×10⁵)的胰岛；(10)使所有上述性质能够长期(例如，六至十二个月)维持；(11)简单和有效的膜合成；(12)易于制造成明确限定的体积(例如，在2至7mL范围内)的可密封容器(管、囊、片)；(13)易于植入和移出；(14)可灭菌的；和(15)经济地提供以上所有性质。
【0057】在一个实施方式中，本发明的膜由完全合成的聚合物组成，其具有明确设计用于异种免疫隔离的纳米结构。在一个实施方式中，本发明的膜是共连续的、共价连接的、亲水片段(例如，聚乙二醇(PEG)、某些丙烯酸酯等)和疏水片段(例如，聚二甲基硅氧烷(PDMS))的两亲共网状物。这些纳米级构建物确保快速的反向转运O₂和水溶液(葡萄糖、胰岛素、营养物质、代谢废物CO₂)。高亲氧性PDMS组分——其O₂亲和性/渗透性比典型的水凝胶大一个数量级——确保充足的O₂供应给包封的组织。
【0058】在另一实施方式中，用于本发明的膜可以由PDMAAm、PDMS和PMHS——其通过独特的聚合过程结合成为精微均一的两亲性网状物——形成。此网状物(膜)使得亲水物质(水溶液)和疏水分子(氧)迅速同时地并且反向扩散。
【0059】在一些实施方式中，本发明的膜的性质可以被微调。例如，通过使用明确长度(即，分子量)和长度分布(即，分子量分布)的亲水和疏水片段，能控制导管尺寸和其尺寸分布。而且，机械性能可以通过操纵合成参数进行控制。另外，在一些实施方式中，生物相容的表面可以通过使用某些生物相容的预聚物种类获得。
【0060】在一个实施方式中，本发明的膜具有优良的O₂渗透性。在此实施方式中，进行了特别的努力以展示根据本发明的膜的优良的O₂渗透性。的确，根据本发明一个实施方式的膜的O₂透明度如此高，以至测量O₂渗透性的传统FATT方法是不合适的，并且本发明的膜必须要构建专用设备和发展定量测定本发明膜的O₂渗透性的新方法。为了比较的目的，典型水凝胶(藻酸盐、聚甲基丙烯酸羟乙酯柔软接触镜)的O₂渗透性是10至20屏障单位(barrer unit)，而本发明的O₂渗透性在约200至400屏障单位的范围内。因此，本发明的一些膜具有极高的氧渗透性。具体的氧渗透性通过组成和工艺条件控制。
【0061】在一个实施方式中，本发明涉及制备可移植/可移出装置用于将活的猪胰脏胰岛异种移植至糖尿病犬中，并因此能够消除和/或实质上减轻它们的糖尿病症状。在此实施方式中，本发明的膜适合保护客体组织(健康的猪胰岛)免受糖尿病宿主的免疫系统攻击，并且仍允许该胰岛与犬之间的分子传递，因此，在无需免疫抑制的情况下能够纠正高血糖症。在一个实例中，观察宿主动物三周然后移出该装置，并测量血糖。移出后血糖升高，从而证明该移植的胰岛负责纠正宿主的高血糖症。
【0062】在一些实施方式中，本发明的膜具有相对小的尺寸和高的O₂渗透性，允许由其制造的BAP进行腹膜内(IP)或皮下(SQ)植入。
【0063】一些可选实施方式包括两亲网状物的合成，所述两亲网状物包含利用疏水聚异丁烯(PIB)片段无规交联的约等量的亲水聚丙烯酸酯。这些材料的微观构造和性质被发现具有适合医学应用的表面和机械性能。在一些实施方式中，拉伸强度等于约0.5至约3.0MPa，并且伸长率等于约50％至600％。
【0064】在一个实施方式中，本发明包括通过亲水单体[N，N-二甲基丙烯酰胺(DMMAAm)、甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸N-(二甲基-氨基)乙酯(DMAEMA)和甲基丙烯酸磺乙酯(SEMA)]与疏水交联剂甲基丙烯酸酯-远螯聚异丁烯的自由基溶液共聚反应制备的两亲网状物。两亲性膜的进一步发展已经显示它们是生物相容的和非血栓形成的。包含大约50/50％的DMAEMA/PIB(Mn_PIB＝10,000g/摩尔)的网状物在大鼠中展示出色的生物相容性和稳定性，与组织充分整合，抗细菌污染，以及引起非常少或不引起纤维化或粘附。在细胞培养和蛋白质测试中，在两亲网状物上的细胞和总蛋白质数目与阴性对照(聚乙烯、硅橡胶、玻璃)相似，表明无毒性反应。利用人单核细胞的细胞粘附和抗粘附试验已经显示，相对于聚苯乙烯(阳性对照)，各种两亲网状物和玻璃(阴性对照)抑制单核细胞粘附。使用DMAAm或HEMA与50％PIB制造的两亲网状物也表现出，与玻璃、硅橡胶或聚乙烯相比，从人血浆中吸收较少的纤维蛋白原、哈格曼因子和白蛋白。这些数据与血球计数一起表明，根据本发明各种实施方式的两亲网状物在体内被很好地接受。
【0065】通过调节M_C，HI的长度(即，位于交联位置之间的亲水链片段的分子量)以及膜的总体亲水/疏水组成，可以实现半透性控制。分子量截留(MWCO)范围(导管大小控制)是亲水和疏水片段的长度的函数。因此，可以设计两亲聚合物，以使葡萄糖和胰岛素迅速逆向扩散，但阻碍或排除大的蛋白质如免疫球蛋白的通过。系统的实验表明，含大约50/50的PDMAAm/PIB并且M_C，HI为大约4500g/摩尔的两亲膜具有适合免疫隔离胰岛的半透性和扩散速率。这些膜允许葡萄糖和胰岛素(Mn分别等于180和5700g/摩尔)的逆向扩散，但阻止白蛋白(Mn大约66,000g/摩尔)的扩散。葡萄糖和胰岛素的扩散速率被认为适合胰岛隔离。置于此半透性两亲聚合物小管内的猪胰岛存活至少四个月并在葡萄糖激发后产生胰岛素。进一步，在一个实施方式中，装备有含猪胰岛的BAP的糖尿病大鼠在没有免疫抑制的情况下产生糖尿病逆转。
【0066】在另一实施方式中，本发明的两亲膜包含通过与一个或多个独特的亲氧多官能硅氧烷交联剂的硅氢化作用而共交联的明确限定的(就分子量和分子量分布而言)的聚乙二醇(PEG)和聚二甲基硅氧烷(PDMS)链。从这些组分形成的膜可允许葡萄糖和胰岛素迅速转运，但阻碍或排除IgG的扩散。这些扩散实施方式是通过使用荧光标记的胰岛素和IgG利用水溶胀的两亲膜实施的。在一系列相关的实施方式中，首先将选择的膜用IgG温育几天，随后用于测定葡萄糖和胰岛素扩散。葡萄糖和胰岛素通过这些膜的转运速率保持不变，表明IgG未堵塞膜导管。
【0067】在相同的一系列的实施方式中，O₂扩散经过根据本发明形成的膜的速率和程度如此高，以至它们甚至可以被考虑应用于长期佩戴的柔软接触镜(隐形眼镜)应用。除了光学透明度，这种应用的一个重要参数是最高的O₂渗透性。本发明的膜在干燥和水溶胀状态下是光学透明的。
【0068】据估计，需要大约12,000个胰岛/kg犬重量以逆转糖尿病状态。因此，一些实施方式在大约11Kg的犬中使用大约132,000胰岛当量(0.23mL细胞体积)。在一些实施方式中，BAP 100是由两个大约50微米厚的两亲性膜104制备的中空圆片(disc)，其边缘利用硅胶被粘贴至具有3.1厘米孔的0.60mm厚的不锈钢或钛环。图4显示了预期BAP 100的草图。金属环102提供加固/尺寸稳定性、X射线对比，并作为两个膜104之间的间隔108。
【0069】尽管图4详述了环状的实施方式，大量数目的构型是可能的。本发明能被构造为椭圆形的、蛋形的、矩形的、正方形的、三角形的、五角形的、六角形的、或任意其它相关的结构。
【0070】胰岛组织可以在含有10％胎牛血清、100IU/mL青霉素和100μg/ml链霉素的PRMI-1640培养基中培养过夜。在加载之前，通过在120℃高压灭菌15分钟对BAP 100装置进行灭菌，并且在组织培养罩中冷却。胰岛/细胞被加载至注射器中并且通过在金属环102上钻的0.4mm宽的口106而注射至两个膜104之间。注射在无菌条件下进行。装载后，所述口106用硅氧烷塞堵塞，该硅氧烷塞进而用氰基丙烯酸酯密封。在此实例中，装置的体积是0.46mL，其通过环的孔(3.1cm)和环厚度(0.60mm)确定。该体积适合容纳大约132,000个胰岛(0.23mL体积)加0.23mL的悬浮培养基(藻酸盐)。即用型填充BAP 100包含大约4.0层胰岛。因此O₂扩散的最大路径是大约2个胰岛直径(约300微米)。
【0071】单独饲养10至12千克的雄性犬，并允许其自由取得狗食和水。禁食12小时后，获取基线葡萄糖耐受试验、血清C-肽、肾功能(肌酸酐，BUN)和肝功能试验(AST、ALT、碱性磷酸酶)。葡萄糖耐受试验通过在2至3分钟内静脉给予葡萄糖500mg/Kg体重进行。绘制-5、0、5、10、15、20、30、45和60分钟时的血液葡萄糖和胰岛素水平。进行这些测试所需的血液量总计大约20mL。在前肢经由头静脉静脉内注射四氧嘧啶(50mg/kg)(Sigma Chemical Co.St.Louis，MO)和链唑霉素(STZ)(30mg/kg)(Zanosam-得自CCF pharmacy)诱导糖尿病。所述药物是作为溶液在无菌条件下新制备的，其以100mg/mL包含在柠檬酸三钠(trisodiumcitrate)缓冲液pH 4.5中，并通过0.22μm滤器过滤灭菌。
【0072】在一个实例中，在犬模型中，在放置BAP前、后以及移出BAP后，通过空腹血糖、IV葡萄糖耐受试验、胰岛素、以及C-肽水平，评估BAP实施方式的体内功能。根据此实例，在十二小时禁食后通过单次静脉注射新制备的链唑霉素(STZ)30mg/kg(Zanosar)和四氧嘧啶(ALX)50mg/kg，在重10至12Kg的雄性犬(n＝18)内化学诱导糖尿病。由于已知这些药物在注射后8至16小时引发低血糖，所述动物以125ml/hr的静脉内流体(intravenous fluid)(含5％葡萄糖的0.9％NaCl)保持24小时。在24小时内每六小时监测血糖水平。此后，每12小时定期喂食动物狗食，并且在每次喂食后每日接受两次人胰岛素70/300.5至1.5U/kg SQ(或更多，如果葡萄糖浓度超过250mg/dl)，以防止酮症和死亡。化学治疗后两周，空腹血糖＜250mg的犬不再使用。猪的C-肽和胰岛素使用放射免疫分析(LincoResearch，St.Charles，MO)测量。检测移植物和BAP内容物周围组织的排斥迹象(炎性浸润)、新血管形成、细胞凋亡、纤维化、和胰岛细胞脱粒。没有排斥发生。
【0073】接受STZ/ALX后二至四周，用大包封的猪细胞(每千克12,000个胰岛)治疗糖尿病。三种不同的聚合物被用于制造BAP大包封装置。每种聚合物在5个动物中测试。对于每一组，在全身麻醉下、使用正中线剖腹手术切口(见下面的手术技术)，将BAP植入腹膜中的网膜囊内(N＝3)或植入在腹壁上产生的皮下袋中(N＝2)。未使用免疫抑制。在化学治疗后前五天以及移植后前五天，在早晨进食之前，使用Accucheck血糖仪每天监测血糖水平。在移植后五天后，未给予外源胰岛素。
【0074】根据此实例，所有的犬在每周一、周三和周五使用血糖仪进行手术前和手术后每周的血清C肽、IV葡萄糖耐受试验(IVGTT)、胰岛素水平以及空腹血糖监测，以测定体内胰岛细胞功能。每周获取全血细胞计数(CBC)以评估炎症。在植入前以及三周时绘制肝功能试验(即，碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、和天冬氨酸氨基转移酶(AST))、肾功能试验(血液尿素氮(BUN和肌酸酐(Cr))，以发现可能的材料毒性。所述BAP在三周时被移出，犬恢复24至48小时，并且重复IVGTT和胰岛素水平，然后使用静脉BEuthansia-D(1mL/5kg)处死动物。
【0075】在一个实例中，每组五个动物接受装置，或腹膜内(IP)进入网膜囊中(N＝3)或皮下(SQ)进入(N＝2)。本发明的BAP膜的高O₂渗透性使得使用任一位置都是可行的。
【0076】在一个实例中，BAP被植入五只STZ糖尿病犬的每一只中，然后进行体内胰脏功能(PF)试验，其包括IV葡萄糖耐受试验(IVGTT)、血清胰岛素和血清C肽。在植入前和其后的每周进行这些试验。所述BAP在三周时移出，并且允许动物恢复一至三天。然后胰脏功能(PF)被再测试，以确认胰岛素和C肽分泌是来自BAP，而不是天然的胰脏。
【0077】在进一步的实例中，所述BAP从宿主回收，并且测试其内容物的活性、功能性、胰岛细胞。这可以通过免疫染色胰岛素和胰高血糖素和制备光学显微镜术的切片进行，以评估胰岛的形态学和颗粒化。另外，电子显微镜术能用于评价胰岛细胞的精细结构。BAP中缺失IgG的试验也可以实行，以显示来自宿主的免疫化学物质没有穿透BAP。
【0078】鉴于上述情况，在一个实施方式中，本发明的装置被设计为产生新的生物人造胰腺(BAP)，所述BAP被设计为纠正，例如，胰岛素依赖型糖尿病(I型糖尿病)。在一个实施方式中，这样的BAP是可植入的和可移出的，并且含有适当数目的免疫隔离猪胰岛，其“按需求”递送需要量的胰岛素并且因此维持血糖量正常。
【0079】为了证明操作原理，含活猪胰岛的BAP被装配并植入到胰腺切开(pancreatomized)的犬中，以纠正它们的高血糖症。如果这些使用犬模型的实验是成功的，那么所述BAP可以按比例增加，用于人糖尿病患者。
【0080】下列10部分涉及被植入到典型的约12千克犬中的BAP和所述装置的制备的描述。BAP包括五个关键部分，支架、加强纳米垫(nanomat)、免疫隔离两亲性共网状物(APCN)膜、密封件和猪胰岛。
支架：
【0081】在一个实施方式中，支架是用于猪胰岛的穿孔钢容器，其维持封装的胰岛和宿主组织之间的扩散途径恒定。支架展示了这样的机械性能(硬度、强度、模量、挠性)：所述机械性能适合于在用活的胰岛充满支架期间、在植入手术期间、在植入到犬中期间(6到12个月)以及移出期间操作所述BAP。
【0082】图1示出了按照本发明的用于BAP的支架的一个设计(尺寸为mm)。如可以在图1中见到的，所述支架是生物相容的不锈钢(315SL)的中空带状物(长75mm，高2.6mm，宽0.5mm)，其用激光切割而穿孔为6角形孔(0.5mm的对角线直径)。分开孔的支杆的宽度为0.05mm。支架的体积为接近约0.28ml(在另外的实施方式中，其可以是大约0.4ml)并且所述支架被设计为包封约120,000个胰岛(1000个胰岛/千克犬)。应该指出，本发明不限于具体大小的BAP。相反，本发明的BAP可以根据意图的受体以任何适当大小形成。在支架的末端是无孔区，每一端具有圆形的缝合孔(大约1.2mm的直径)，用于将植入的BAP缝合到相邻的组织。可选地，在另一实施方式中，通过将由相同材料制造的螺旋末端的金属线系上，外科医生可以将所述装置缝合到活组织。连接物的柔韧性特征使组织损伤最小化。
【0083】仍在另一实施方式中，除了上面所示的六角形形状外，其它的几何形状可以被使用，或代替上面所示的六角形形状。这样的形状包括但不限于，正方形、三角形、八角形、五角形等。此外，支架的特征和尺寸由光学显微镜法确定(参见，下面质量控制部分)。然而，本发明不限于任何一种大小的BAP。相反，BAP的大小可以按需要被改进为适合将被植入装置的动物或人。另一类型的BAP被示于图4中。
【0084】可以用于支架的其它材料是镍钛诺、钽、钛和它们的合金，或对意图的应用足够强、硬和弹性的生物相容的和生物稳定的聚合物材料。孔的形状可以是正方形或其它几何形状，包括非周期彭罗斯氏拼砌模式——其没有显示平移对称以在弯曲时降低支架的潜在扭结。但是应当注意，本发明不只限于上述的孔几何形状。相反，任何合适的孔几何形状都可以与本发明联合使用，只要本发明的BAP装置如意图/设计的起作用。
【0085】在一个实施方式中，支架的表面可以通过在所述支架表面产生微米级/纳米级粗糙度的蚀刻而被粗糙化。蚀刻增加了纳米纤维和支架的外表面之间的界面面积，并且因而通过纳米纤维和支架的机械联锁而锚定纳米纤维。几种合适的方法可用于粗糙化并且本发明不限于任何一种这样的方法。化学方法包括但不限于，使用宽范围的酸进行粗糙化。其它合适方法包括但不限于，冲击粗糙法(impact roughening)，如喷砂。
纳米垫：电纺聚氨基甲酸酯
【0086】BAP的成分之一是免疫隔离膜。所述膜通过电纺聚氨基甲酸酯纳米纤维来加固。在另一实施方式中，其它的加固纤维可以与本发明一起使用。其它合适的纤维包括其它的生物相容的聚合物，其它可电纺的生物相容聚合物，或其任何组合。
【0087】如在此处使用的，纳米纤维是平均直径在约1纳米至约25,000纳米(25微米)范围内的纤维。在另一实施方式中，本发明的纳米纤维是平均直径在大约1纳米至大约10,000纳米、或大约1纳米至大约5,000纳米、或大约3纳米至大约3,000纳米、或大约7纳米至大约1,000纳米、或甚至大约10纳米至大约500纳米的范围内的纤维。在另一实施方式中，本发明的纳米纤维是平均直径为小于25,000纳米、或小于10,000纳米、或甚至小于5,000纳米的纤维。仍在另一实施方式中，本发明的纳米纤维是平均直径为小于3,000纳米、或小于约1,000纳米、或甚至小于大约500纳米的纤维。在说明书的此处以及别处和权利要求书中，单独的范围限定可以被组合以形成另外的未说明的范围。
【0088】在另一实施方式中，所述纳米纤维可以具有小至0.3纳米的直径。而在另一实施方式中，纳米纤维的直径在3纳米至大约25微米之间。在进一步的实施方式中，纳米纤维的直径为大约100纳米至大约25微米。仍在另一实施方式中，纳米纤维的直径为大约100纳米至大约1微米。这样小的直径提供了高的表面积质量比，如，例如，大约300m²/g。在本发明的范围之内，纤维或纳米纤维可以是任何长度。
【0089】因此，膜的制备通过用转动的电纺聚氨基甲酸酯(PU)，优选Elast-EonE2D——其由AorTech Biomaterials制造并出售——涂覆支架开始。这种PU是生物相容的并且生物稳定的弹性体，其具有高PDMS含量、高的拉伸强度(30MPa)、高伸长率(500％)和良好的氧渗透性。在支架上进行的PU的电纺用PU纳米纤维(即，纳米垫)覆盖了支架的六角形孔。Elast-Eon被选择用于加固的一个原因是该PU含有PDMS软片段，其介导了APCN膜和所述加固纳米垫之间的分子相容性。根据材料科学的教导，只有所述加固剂和基质在分子上相容时，有效的加固才发生。进一步，该弹性体PU展示了所需要的加固剂的高伸长率和强度。
【0090】除了Elast-Eon E2D之外，物理和化学性质相当的或得到增强的另外的材料也可以被使用。这些材料可以包括广泛的热塑性和热同性材料。借助于可光解或可化学交联的部分，通过在用APCN膜涂覆纳米垫之前交联所述纳米垫可施加额外的粗糙。交联有助于抵抗涂覆期间和使用期间的性能退化。
【0091】在另一实施方式中，用于纳米垫的可选材料包括含有化学官能度的材料，所述化学官能度能够在APCN膜和纳米垫之间建立各种键，例如，在纳米垫和APCN之间的界面处的氢键、离子键或共价键，并且因此导致更强的纳米复合物。
【0092】在下面，图2示出了能够被用于制备上述纳米垫-涂覆支架的一种合适的装置。应该注意，本发明不只限于下面所示的装置。相反，其它合适的电纺装置可以在此使用以形成前述的纳米垫。装置由两个主要部分组成：(a)电纺平台；和(b)旋转装配件，以在喷丝嘴下旋转支架。
【0093】电纺平台，处于其最基本的形式，包括用金属针与喷丝嘴连接的高电压源和地面目标，所述地面目标在这种情况下为不锈钢支架。这种设置的元件之一是线性制动器，在其上安放所述纺织系统。此线性制动器允许所安放的喷丝嘴装配件以震荡运动纵向扫过支架，从而便于用PU纳米纤维均匀地涂层。另一元件是高精度真空/压力泵，用于调节金属针尖端的压力水平以防止电纺时溶液滴到支架上。
【0094】虽然目前的仪器用一个喷丝嘴进行操作，但是本发明不限于此。更确切地，任何数目的喷丝嘴可以与本发明联合使用。在一个实施方式中，纳米垫沉积的速率可以这样提高，通过安装另外的喷丝嘴并且将它们组织在旋转的支架周围相等的距离以最大化每单位时间递送的纳米纤维的数目。图3示出了旋转支架，其具有三个喷丝嘴或三个喷嘴——其以120°角度间隔排列(虚的蓝色箭头描述了喷嘴的方向)。然而，更多的喷嘴(例如，60个)也可以用于减少电纺的时间。
电纺溶液：
【0095】对于电纺纺丝原液(dope)的制备，应该考虑多个因素。首先，聚合物的分子量必须足够高以获得具有足够的粘度的纺丝原液，用于稳定的电纺。第二，传导性在溶液的可纺性中发挥作用。也就是说，在一个实施方式中，必须保证足够的传导性(离子，等)存在于电纺纺丝原液中。在一种情况下，这可以通过在所述电纺纺丝原液中包含各种盐来获得。
【0096】在根据本发明的一种方法中，如下制备电纺溶液(纺丝原液)：将大约5至大约12重量百分比的Elast-Eon溶解在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，或任选地溶解在四氢呋喃(THF)和含有可达50％THF的DMF的混合物中。在混合物中更大量的THF的情况下，溶剂的蒸发速率增加，这使得在喷嘴处的聚合物迅速固化，而因而发生的堵塞可以引起电纺的停止。
【0097】在另一实施方式中，DMF中的7重量百分比的Elast-Eon被用于电纺过程。图5示出了粘度，作为在25℃于DMF溶液中7重量百分比Elast-Eon的剪切速率的函数。
【0098】通过将DMF中的Elast-Eon浓度从7增加至15重量百分比，粘度显著增加(从0.05增至大约3Pa-sec)，而电纺不能开始。
【0099】典型地，靶支架和针尖之间的距离为大约8至大约14cm，并且在一种情况下为大约11cm，电压水平为大约7.5至大约12KV，并且在一种情况下为大约9KV。
支架的旋转
【0100】支架以大约60至大约200rpm持续旋转，以保证均匀的无定向纤维沉积在支架上。大约3000至大约6000rpm的速率能够产生沿着旋转支架的环绕纤维方向，其降低了膜的渗透效率。支架的这种持续的相对缓慢的旋转，和线性制动器的光栅化运动(rasterizing motion)(来回)一起，保证了支架的均匀涂层(即，纳米垫沉积)。
纳米垫沉积时间：
【0101】许多处理方案可以被用于保证电纺纳米垫和支架之间的强相互作用。例如，通过使用高度可设计的电纺平台来增加支架和喷嘴头之间的距离，可以产生较小直径的纳米纤维层。这有助于增进纳米垫和支架之间的强的机械相互作用。在随后的阶段，喷嘴头的高度可以被控制以提供另外的设计直径的纳米垫层。
【0102】为了将大约5mg的纳米纤维/纳米垫均匀地沉积在旋转的支架上，以约9至10KV在喷丝嘴的顶部至支架大约11cm的距离，进行电纺约45分钟。支架以大约100至200rpm旋转，并且线性制动器以大约2cm/sec使支架纵向地光栅化。
【0103】虽然纳米垫的沉积速率比0.10mg/min快得多，但是在电纺的最初5至10分钟期间，带电的纳米纤维优选地与不锈钢支架而不是开口(孔)连接。在最初大约5分钟期间，在孔中观察到可以忽略的纳米垫形成(见图6)。在不锈钢支架上沉淀足够的纤维后，金属的底色(grounding)减少，以便纳米纤维也开始沉积在孔上，并且形成连续的纳米垫(参见图7，30分钟图片)。为了增加电沉积的速率，导电金属线或带被插入到支架中。
免疫隔离膜：纳米垫加固的两亲性共网状物膜
【0104】如上所述，不同类型的两性网状物和/或共网状物可以用于形成本发明的两性膜。下面讨论了一些示例性两性网状物和/共网状物。然而，应该注意，本发明不限于下列实例。更确切地，任何适当的两性网状物和/或共网状物都可以与本发明联合使用，只要这种网状物和/或共网状物能够对活的胰岛素产生细胞提供“支持手段”。
【0105】在一个实施方式中，合适的两亲性网状物和/或共网状物可以在2005年7月28日提交的、标题为“Amphiphilic Co-Networks，Films Made FromAmphiphilic Co-Networks and Uses for Such Co-Networks and Films”的PCT公布号WO 2006/073499中找到，在此通过引用以其全部并入。
【0106】在另一实施方式中，合适的两亲性网状物和/或共网状物可以在2007年8月3日提交的、标题为“Amphiphilic Grafts and Co-Networks and Process forMaking Same”的PCT公开WO 2008/019044号中找到，在此通过引用以其全部并入。
【0107】在将PU纳米垫电纺到支架上之后，下一步是用APCN预聚物的甲苯溶液浸渍纳米垫，之后蒸发溶剂，并且将所述预聚物交联(固化)成最终的膜。溶剂蒸发和固化可以同时发生。
【0108】用于制造APCN的预聚物溶液的制备和其交联被详细描述在PCT公开号WO 2008/019044中，并且因而为了简洁起见，在此省略了详细讨论。在此实施方式中，APCN由三种成分组成：PDMAAm、PDMS和PMHS，其通过独特的聚合方法结合成精微均一的两亲性共网状物。该网状物(膜)允许亲水物质(水溶液)和疏水分子(氧)迅速同时并且逆流扩散。
【0109】图8概述了APCN膜制备的合成策略，并且介绍了使用的缩写。
【0110】现在简要描述了APCN膜的制备步骤。然而，APCN的这种实施方式的更详细说明被包含在下面。
2-丙烯酸-3-(1，1，3，3-四甲基二硅氧烷基)丙酯(SiH-MA)的合成：
【0111】向装备有特氟龙-涂层的搅拌棒并且放置在室温水浴中的1000ml圆底瓶中，加入四甲基二硅氧烷(134克，1摩尔)和甲基丙烯酸烯丙酯(126克，1摩尔)。通过加入Karstedt′s催化剂(0.5ml)诱导反应，并且搅拌填充物(装载料，charge)3小时。在此点加入三苯基膦(10ml)并且在50℃真空蒸馏(0.1毫巴(milibar))所述填充物。产物——112克无色液体——在旋带蒸馏柱上(75个盘，0.3毫巴)精馏，以产生41g(16％)的SiH-MA，沸点为62℃。
V-PDMS-MA的合成：
【0112】在室温下溶于23ml甲苯的V-PDMS-V(20克，1.4毫摩尔)和SiH-MA(0.37克，1.4毫摩尔)被放置在装备有特氟龙涂层的搅拌棒的500ml Erlenmeyer瓶中。通过加入Karstedt′s催化剂(0.02ml Pt(0)的3％二甲苯溶液)开始反应，搅拌填充物并且在50℃加热2小时。填充物的成分没有分离，并且所述产物混合物的溶液被使用，如同用于接枝物的制备。
【0113】通过¹H NMR光谱和GPC分析产物。平均的异丁烯酸酯(MA)官能度是1.0(即，MA/PDMS＝1.0)。GPC分析显示，填充物的分子量和分子量分布在术端官能化作用期间没有改变。
[PDMAAm(PDMS)]-q-PDMS-V接枝共聚物的合成：
【0114】在1000ml Erlenmeyer瓶中置入甲苯(383ml，340克)、新蒸馏的DMAAm(20克，177毫摩尔)和MA-官能化的PDMS(MA/PDMS＝1.0；20克在43ml甲苯中)的混合物。通过使Ar鼓泡通过溶液5分钟除去溶液中的空气，加入AIBN(0.3mg，0.18mmol)，用特氟龙活栓密封所述瓶，并置于65℃的加热炉中24小时。在共聚合之后，在减压下蒸发大量甲苯，并且在室温下在真空中干燥产物2天。产出物为38克的淡白色物质。
PDMAAm-PMHS-PDMS预网状物(pre-network)溶液的合成：
【0115】向溶于20克甲苯的[PDMAAm(PDMS)]-g-PDMS-V(0.9克，0.032mmol乙烯基基团)和PMHS(0.1克，0.33mmol)中加入Karstedt′s催化剂(0.5ml)，并在室温下将所述溶液搅拌24小时，以形成预网状物溶液。将新蒸馏的甲苯加入到溶液中，以将嵌段共聚物的浓度设置在大约6％至大约8％的范围内。
用预网状物溶液涂布PU纳米垫：
【0116】用PU纳米垫通过旋转电纺涂覆的不锈钢支架——在上面概述了其制备——在进口处具有硅隔膜，并且其以大约100°的角度(与垂直方向)被保持。预网状物溶液——在上面概述了其制备——被注射通过在进口处的硅密封件，进入到PU-涂覆的支架中。不断地视觉监测所述溶液前面的前进中的液体，并且调节PU-涂覆支架的角度，以便溶液前面的前进中的液体应该增加大约0.5至大约1cm/sec。在PU-涂覆支架完全充满预网状物溶液之后，支架的角度变成水平的，并且装置的容纳物被允许在室温下空气干燥大约30秒钟。在此预干燥步骤期间，PU-纳米垫的外表面变干，并且预网状物溶液的交联开始；然而，所述装置的内部仍然含有液体的预网状物(甲苯)溶液，并且纳米垫和在纳米垫上形成的膜两者都通过预网状物溶液而溶胀。在预干燥之后，装置的角度变为大约80℃(与垂直方向)，并且通过Pasteur移液管从装置除去其余的溶液。后退液体前端的速度(speedofthe receding liquid front)必须为小于大约0.5至大约1cm/s。
【0117】通过光学显微镜来确定膜的质量(参见，下面的质量控制部分)。确定下列方面：(1)支架的孔用纳米垫均匀地涂布；和(2)加固纳米垫和APCN膜形成均一的复合物(即，纳米垫被均匀地包埋在膜中)。
完成免疫隔离膜的制备：固化APCN
【0118】在此步骤，预聚合物-浸渍的纳米垫固化(交联)并干燥，这导致最终的免疫隔离膜。固化由溶解在预网状物溶液中的Karstedt′s催化剂介导。固化通过加热体系开始，继续，同时甲苯蒸发，通过在大约70℃加热24小时来结束。固化预聚合物产生最终的膜。重要的是，由于在APCN和纳米垫中共有的PDMS链的相容作用，预聚合物和加固纳米垫是分子相容的。
萃取膜：
【0119】在一个实施方式中，需要萃取膜以防止杂质在植入期间释放到宿主中。通过将装置放置在蒸馏水中并且轻轻地摇动至少一天来进行萃取。水萃取后，在空气中干燥装置3小时，接着在真空中干燥3小时。然后通过80/20己烷/甲苯混合物萃取所述装置1天，以保证疏水的可萃取物也被除去。为了除去甲苯，通过己烷萃取装置，最后用水萃取并且溶胀。疏水萃取后在水中溶胀的目的是防止高溶胀的膜在空气干燥期间收缩和折皱(收缩/折皱可引起永久的膜损害)。萃取后，用水溶胀膜，然后空气干燥3小时，之后在120℃下在真空中干燥24小时。
密封装置：
【0120】用几滴商业可用的硅弹性体密封剂(Kwik-Sil，Precision Instruments)密封装置的两个口，所述密封剂在密封剂的两种成分混合之后几分钟内固化。Kwik-Sil的PDMS成分甚至在水溶胀的状态提供了与APCN中的PDMS的良好粘合。密封显示出高的伸长率(大约500％)和拉伸强度(大约7MPa)，并且提供了极好的自密封塞，其能够被18或20号注射针穿刺几次而不损及所述密封。
【0121】图9A有助于显示覆盖所述装置的口的硅密封的位置。
质量控制
【0122】涂覆/密封的支架的质量通过下述进行确定：(A)光学显微镜和(B)爆破试验(burst testing)。
显微检查：
【0123】在涂覆/密封之后，通过光学显微镜检查支架，以确定(1)在孔的中心和邻近支柱(strut)处，覆盖所述支架的孔的纳米垫的厚度；和(2)电纺纳米纤维和纳米垫的特征、尺寸和结构(即，珠大小和珠密度；缠结和熔融交接处)。
【0124】通过光学显微镜对涂覆/密封支架的一般外观、不均一性的存在、销孔、在端口处的密封的外观等进行了彻底的检查。装备有DP70数码相机和具有5×、20×和50×放大倍率的物镜的Olympus DX51仪器可以用于提供需要的信息。在检查过程中获得的许多涂覆/密封支架的经验提供了有助于鉴别不平常的和/或可疑特征的直观图像。只有被鉴定为无瑕疵的装置进行爆破试验。
爆破试验：
【0125】在显微检查之后，对涂覆/密封支架的爆破压力进行了测试。图10概述了爆破压力测试设备。
【0126】在一个实施方式中，皮下注射针(18号)被插入到硅橡胶密封的支架的任一端。入口针(inlet needle)与线连接至将水输送到涂覆/密封支架的蠕动泵，同时出口针与线连接至水储存器中。在室温下，装置浸没在水中，并且用水冲洗装置较短的时间(大约1分钟)。满意的涂覆/密封装置的最终爆破压力在3至5psi的范围内。
【0127】对于质量控制，阀2被关闭并且压力缓慢增加至2至3psi。当达到该压力时，阀1也关闭并且监测压力。满意的涂覆/密封装置必须保持2至3psi的压力大约1分钟。通过该爆破压力测试的装置准备充满胰岛。
葡萄糖和胰岛素渗透速率
【0128】在原型免疫隔离装置的制备之后(即，在通过电纺聚氨酯纳米垫涂布支架并且沉积并固化APCN之后)，进行实验以测定这些装置的葡萄糖和胰岛素的渗透速率。在别处报告的涉及APCN膜组合物对渗透性影响的介绍性研究已经显示，具有PDMAAm₆₁/PMHS₆/PDMS₃₃(其中下标是重量百分数)的全部组成的APCN膜，在PU强化条件不存在的情况下，显示出期望的氧、葡萄糖和胰岛素渗透性，但是对于白蛋白和IgG实质上是非渗透的；因此，这种APCN组合物被用于制备免疫隔离装置。
【0129】首先，根据上述方法，通过将Elast-Eon E2D聚氨酯纳米垫电纺到支架上，涂布上述支架(长度75mm，宽度2.6mm，深度0.5mm，体积大约为100μL)，然后沉积、固化并且萃取PDMAAm₆₁/PMHS₆/PDMS₃₃膜，如上面所讨论的。沉积在支架上的PU纳米垫的量为大约1mg，而APCN的量为大约3mg，即，膜包含33％的PU纳米垫和67％的APCN；最终的免疫隔离膜的厚度为大约10μm。根据上述方法密封支架的两个口，并且所述装置用PBS缓冲液pH 7.4中的大约100μL的50mg/mL葡萄糖溶液通过20号注射器填充。然后，具有葡萄糖溶液的装置被放置在含有2至2.2ml的PBS缓冲液的圆柱形玻璃小瓶(6mm ID×9cm L)中，放置在37℃的温育箱中并被轻轻地摇动(翻滚)。图9B有助于显示实验布置。装置的葡萄糖渗透速率通过在10分钟后撤回20μL等分的PBS溶液并且使用含葡萄糖氧化酶的Autokit Glucose^TM测定葡萄糖浓度来获得，通过分光光度计(HP 845UVZVis)在505nm读取颜色。
【0130】同样的取样步骤被用于获得胰岛素渗透速率。在这些实验中，用含0.05％叠氮钠的大约0.3mg胰岛素/mL的PBS充满装置，以阻止细菌生长，用0.15％的正辛基β-D-吡喃葡糖苷稳定溶液以防止胰岛素聚集物的形成。通过在40分钟后抽回1ml等分的PBS溶液来量化扩散到PBS缓冲液中的胰岛素的量；使用含有考马斯亮蓝G-250染料的Bradford试剂，测定胰岛素浓度，在595nm读取颜色。在锌存在下，胰岛素形成二聚体或六聚体。
K_dim    K_hex
6N  <->  3N₂<->N₆
其中，N、N₂和N₆是胰岛素单聚体、二聚体和六聚体。二聚和六聚的平衡常数(K_dim和K_hex)分别是6.9×10⁴1/M和1.3×10¹³1/M²。在正常生理条件下，在肝组织中，胰岛素是单体，因此，该种渗透速率必须得到。胰岛素单体的浓度通过使用平衡常数来计算。
【0131】靶胰岛素递送是9.13μg单体胰岛素/cm²·hr。为了获得此种胰岛素，假定在一天摄取3次葡萄糖之后的1小时内装置将递送大约133μg的单体胰岛素(即，对于10kg的狗，大约400μg胰岛素/天)，并且免疫隔离装置的总的表面积(除了密封部分外)为14.56cm²(装置的4个7cm长的部分)。在装置内，用大约0.3mg总胰岛素/mL PBS缓冲液(其等于20.5μg单体胰岛素/mL)进行渗透实验。使用上面所示的平衡常数，从总胰岛素浓度计算单体胰岛素浓度。
【0132】表A总结了实验结果。实验1示出了相同免疫隔离装置的葡萄糖和胰岛素渗透速率；实验2至6示出了不同装置的葡萄糖或胰岛素的渗透速率。
表A：通过免疫隔离装置的葡萄糖和胰岛素的渗透速率

【0133】使用三种不同的装置获得的单体胰岛素的平均渗透速率是8.21mg/cm²·hr，即，该值显得稍微低于靶(见上面)。然而，通过充满胰岛的装置的胰岛素的渗透速率应该高于所得到的数据，原因在于胰岛中的总胰岛素浓度为大约6mg/mL(等于33μg的单体胰岛素/mL)，其显著高于实验中使用的浓度。使用大约6mg胰岛素/mL应该产生27至大约102μg/cm²·hr的渗透速率，即，该值显著高于靶胰岛素递送值。因而，可以得出结论，这些免疫隔离膜的胰岛素渗透率适合用于临床可接受的BAP。
将填充针和释放针插入到密封的装置中：
【0134】为了用流体或细胞充满装置并且将装置内的残余空气和液体释放，将18号注射器针插入穿过任一口的密封。针携带接头以接纳1mL注射器体。小心使用而不在注满过程中接触/损坏膜。BAP只保持在每一末端的坚固硅塞处或与插入的针一起。通过半透明的膜可以直观地监视填充的进程。当用胰岛悬浮液完全充满BAP时，首先除去填充针，随后除去退出针(exit needle)。
灭菌：
【0135】通过将填充针和释放针插入通过硅橡胶密封并且充满磷酸盐缓冲盐水的装置放置在含有相同缓冲液的管中，对所述装置进行灭菌，并且通过加热至125℃，在升高的压力下20分钟进行高压灭菌。在该过程中，装置保持其完整。
使用淋巴细胞的模型实验：
【0136】用小鼠脾淋巴细胞作为更难以获得胰岛细胞的替代代表性细胞进行最初的实验。新鲜制备的小鼠脾单核细胞在组织培养皿中温育过夜以除去粘着的单核细胞和巨噬细胞，洗涤并且用台盼兰计数以确定细胞群的数目和百分比生存力。然后，细胞(大约10⁸)重悬在0.5ml溶液中，用于注射到装置中。装置具有插入到每一末端的18号针。注射器被用于用培养基冲洗装置的内部，然后使所述装置成为空的。用含有细胞的注射器置换所述注射器，并且将细胞注射到装置中直到充满所述装置。除去针，并且在湿润的培养箱中，在Peri皿中，于37℃和5％CO₂(用于培养基的碳酸氢盐缓冲液系统)下，在生长培养基中温育充满的装置。3天和7天后，从装置中排出细胞并且通过存活细胞排斥台盼兰并且保持无色的能力测定它们的数目。
用胰岛充满装置：
【0137】图11有助于显示充满胰岛并且准备植入的BAP。剖面图(侧视图横截面)示出了中空带状物(支架)里面随机装满的胰岛。支架充满了等体积的胰岛和培养基。12kg的犬需要大约120,000个胰岛，即，0.42ml胰岛悬浮液(0.21ml胰岛组织加上0.21ml培养溶液)。支架的尺寸(以mm表示)是：高度0.5，宽度2.8，长度75(具有缝合孔平台95的总长度)，其产生0.105ml的体积；其它参数(以mm表示)：支柱高度(穿孔前原始SS管的壁厚度)0.1，支柱宽度0.05，邻近支柱之间的距离0.4，在带状物的对面的支柱之间的距离0.3(见图1)。估计12kg的犬需要4个这样的装置。
【0138】支架的高度(0.5mm)被设计为容纳大约4层胰岛。此4-层布置对于适当小的装置来说是最大血液接触和最小尺寸之间的折衷的产物。在该布置中，氧从血液(氧源)到最远胰岛的扩散距离大约为160至大约180微米(即，一个胰岛直径，大约150微米，加上膜的厚度，10至30微米)。(具有最大表面积用于最大血液接触的理想的120,000个胰岛的免疫隔离装置将会是大约150微米直径大约18米长的管；或大约105米长的管，用于70kg的人；这是明显不切实际的尺寸)。具有矩形(带状物)几何形状的4-层布置允许构建可处理的小BAP。
【0139】图11的下面部分示出了两个支柱之间的加固膜。由于电纺的物理性质，纳米垫倾向于在邻近支柱处更厚(大约30微米)，而在孔的中心更薄(大约10微米)。进一步，在纳米垫和APCN预聚合溶液浸渍期间，溶液倾向于在支柱周围积聚。由于这些作用，膜显示了轻微的波浪形表面(在图11中进行了强调)。
【0140】胰岛悬浮液填充入1ml塑料注射器，连接到一个针(入口)。小心操作而不在填充过程中接触/损坏膜，即，在针处用两个手指把持BAP。非常轻地将胰岛悬浮液推到BAP中，以最小化由于剪切造成的损伤。通过半透明的膜可以直观地监视填充的进程。当用胰岛悬浮液完全充满BAP时，首先除去填充针，随后除去退出针。当进口针被除去时，通过两个手指在进口密封附近把持装置；类似地，当除去退出针时，通过两个手指把持退出密封。也可以用镊子在硅塞或在缝合孔平台把持BAP。应该避免与膜接触以防止损坏膜。直到植入，充满胰岛的BAP通过缝合孔中的缝合悬挂在钩上，或者被放置在平面上的恒温培养溶液中。
【0141】可选地，胰岛悬浮液填充入1mL塑料注射器并且连接到一个针(入口)。如上所述，非常轻地将胰岛悬浮液推到BAP中来充满装置，以最小化由于剪切造成的损伤。通过半透明的膜可以直观地监视填充的进程。当BAP完全充满胰岛悬浮液时，其可以通过缝合孔中的缝合悬挂在钩上，或者被放置在平面上的恒温培养溶液中。
用于本发明的示例性两亲性网状物
【0142】各种类型的两亲性网状物和/或共网状物可以用于形成本发明的两亲性膜。下面讨论了一些示例性两亲性网状物和/或共网状物。然而，应该注意本发明不限于下列实例。更确切地，任何合适的两亲性网状物和/或共网状物都可以与本发明联合使用，只要这种网状物和/或共网状物能够提供用于活的胰岛素生产细胞的“支持手段”。
【0143】此外，虽然下面的实例使用D₅H作为交联剂，但是可以使用其它合适的交联化合物。例如，PMHS可以被用作交联剂。
【0144】在本实施方式中，讨论了由至少一种亲水聚合物和至少一种疏水聚合物制成的两亲性接枝物和共网状物，以及制备这样的两亲性接枝物和共网状物的方法。在另一实施方式中，本发明的BAP利用由至少一种聚硅氧烷和至少一种聚丙烯酰胺的组合形成的两亲性共网状物。而在另一实施方式方式中，本发明的BAP利用由至少一种聚硅氧烷、至少一种聚丙烯酰胺和至少一种交联剂的组合形成的两亲性共网状物。
聚合物：
【0145】如上面讨论的，本发明的交联两亲性共聚物网状物或共网状物包含至少一种疏水聚合物和至少一种亲水聚合物。
【0146】在一个实施方式中，本发明使用至少一种聚丙烯酰胺(例如，聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)(PDMAAm))与至少一种二链烯基和/或二炔基封端硅氧烷聚合物(例如，聚二甲基硅氧烷(PDMS)的组合，形成两亲性共网状物。在这样的实施方式中，至少一种聚丙烯酰胺作为亲水聚合物起作用，而至少一种二链烯基和/或二炔基封端聚硅氧烷硅氧烷聚合物作为疏水聚合物起作用。在一种情况下，用于形成本发明的两亲性共网状物的每一聚合物独立地具有大约5至大约5,000个重复聚合物单位，大约10至大约2,500个重复聚合物单位，或大约25至大约1,000个重复聚合物单位，或甚至大约40至大约500个重复聚合物单位。此处，以及说明书和权利要求中的其它地方，单独的范围限制可以被组合。
【0147】应该注意，本发明不限于具有上述数目的重复单位的聚合物。相反，本发明可以利用具有任何数目的重复单位的任何合适的亲水和疏水聚合物的组合，只要使用的聚合物能够形成两亲性共网状物。当选择用于形成本发明的两亲性共网状物的聚合物时需要虑及的另外的考虑因素是两亲性共网状物的意图的用途。例如，如果两亲性共网状物将要形成用作隐形眼镜的膜，那么，用于本发明的聚合物应该最少产生光学上透明的两亲性共网状物。如本领域普通技术人员将会明白的，取决于本发明的两亲性共网状物的期望用途，可以考虑用于形成这种网状物的聚合物的各种物理、化学和/或机械性质。
【0148】在另一实施方式中，本发明利用至少一种聚二甲基丙烯酰胺聚合物和至少一种聚二甲基硅氧烷聚合物的组合。示例性丙烯酰胺聚合物(例如，聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)(PDMAAm)))和聚二甲基硅氧烷聚合物(例如，乙烯基二遥爪聚二甲基硅氧烷(V-PDMS-V))分别以式(I)和(II)在下面示出，

其中n等于大约5至大约5,0005至大约5,000，或大约10至大约2,500，或大约25至大约1,000，或甚至大约40至大约500的范围内的整数，和

其中m等于大约5至大约5,000，或大约10至大约2,500，或大约25至大约1,000，或甚至40至大约500的范围内的整数。应该注意，本发明不仅仅限于式(I)和(II)丙烯酰胺聚合物和聚二甲基硅氧烷聚合物。确切而言，在该实施方式中，可以使用丙烯酰胺聚合物和二链烯基和/或二炔基封端聚二甲基硅氧烷聚合物的任何合适的组合。
【0149】式(II)的聚二甲基硅氧烷聚合物也可以，例如购自Gelest，Tulleytown，PA。可选地，如果期望，可以合成式(I)和(II)的聚合物，因而允许控制出现在式(II)聚合物中的重复单位的数目。
【0150】在另一实施方式中，用于本发明的所述至少一种二链烯基和/或二炔基封端聚二甲基硅氧烷聚合物可以选自根据如下示出的式(III)的任何聚合物：

其中，p等于大约5至大约5,000，或大约10至大约2,500，或大约25至大约1,000，或甚至大约40至大约500的范围内的整数；并且其中R₁和R₂独立地是C₁至C₆烷基基团，或甚至是C₁至C₄烷基基团；而R₃和R₄独立地是C₂至C₁₀链烯基基团，C₂至C₇链烯基基团，或甚至是C₂至C₅链烯基基团。在另一实施方式中，R₃和R₄独立为C₂至C₁₀炔基基团，C₂至C₇炔基基团，或甚至是C₂至C₅炔基基团。此外，此处，以及说明书和权利要求的其它地方，单独的范围限制可以被组合。
【0151】仍在另一实施方式中，R₁和R₂为同样的取代基团(例如，全部是甲基基团，全部是丙基基团或全部是丁基基团)，R₃和R₄是同样的取代基团(例如，全部是乙烯基基团或全部是链烯基基团)。
交联剂：
【0152】在一个实施方式中，本发明利用了含硅的交联剂。合适的含硅交联组分包括但不限于，多-SiH官能化环硅氧烷。在一个实施方式中，本发明的交联剂是或源自一种或多种烷基取代的环戊硅氧烷组分(例如，五甲基环戊硅氧烷-D₅H)。五甲基环戊硅氧烷(D₅H)是商业可得的并且其结构被示于下式(IV)中：

【0153】除了上面示出的交联化合物外，其它的交联组分可以与本发明联合使用，并且本发明不仅仅限于上面的交联组分。
两亲性共网状物的交联和形成：
【0154】在一个实施方式中，通过使用至少一种多-SiH官能化环硅氧烷交联剂(例如，D₅H)合成两亲性共聚物网状物和/或共网状物。图12概述了根据本发明的一种实施方式的起始成分，并且示出了已通过缩聚的D₅H(PD₅)域交联的两亲性共网状物的理想结构。
【0155】在该实施方式中，由PDMAAm、V-PDMS-V和D₅H形成的两亲性共网状物的合成如同在下而详细说明的那样。应该注意，本发明不只限于本实施方式。更确切地，本发明应该被广泛地依据包含在本文中的公开内容而被解释。
材料：
【0156】聚二甲基硅氧烷(V-PDMS-V，标称Mw＝17,000克/摩尔，由厂商提供，M_n，NMR＝14,000克/摩尔，由作者确定)，四甲基二硅氧烷，五甲基环戊硅氧烷(D₅H)，聚甲基氢硅氧烷(PMHS，标称Mw＝2,000g/mol))，Karstedt催化剂(3％Pt(O)在二甲苯中，“浅色”)购自Gelest，Tulleytown，PA。N，N-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)，偶氮二异丁腈(azobisisobutylonitrile(AIBN))，甲基丙烯酸烯丙酯，亚磷酸(85％)，三苯基膦(PPh₃)和溶剂四氢呋喃，甲苯，正己烷以及氯仿得自Aldrich。在AIBN引发剂(DMAAm/AIBN＝200)的存在下，在65℃，通过N，N-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)在30％甲苯溶液中的自由基聚合来制备PDMAAm；通过GPC-LS测定，Mw＝80,000克/摩尔。
仪器操作：
【0157】使用CDCl₃溶剂，在Varian Unity plus 400MHz分光计上获得¹H NMR光谱。在Waters GPC仪器上获得GPC eluogram，所述Waters GPC仪器装备有一系列6个Styragel柱(HR 0.5、HR 1、HR 3、HR 4、HR 5和HR 6；Waters)、折射率(RI)检测器(Optilab，Wyatt Technology)、双紫外吸光检测器(Waters 2487)、激光散射检测器(Minidawn，Wyatt Technology)和粘度计(Viscostar，WyattTechnology)。样品溶于THF中，并且流速被测定为1mL THF/min。
2-丙烯酸-3-(1，1，3，3-四甲基二硅氧烷基)丙酯(SiH-MA)的合成：
【0158】在室温下，向装备有特氟龙涂覆的搅拌棒并位于水浴中的1000mL圆底瓶加入四甲基二硅氧烷(134克，1摩尔)和甲基丙烯酸烯丙酯(126克，1摩尔)。通过加入Karstedt催化剂(0.5mL)开始反应，并且搅拌填充物3小时。在该点，加入PPh₃(10ml)并且在50℃真空蒸馏(0.1毫巴)所述填充物。在旋转带柱(spinning band column)(75皿，0.3毫巴)上精馏产物——112克无色液体，以产生41克(16％)的SiH-MA。沸点被测定为62℃。
MA-PDMS-V的合成：
【0159】在室温下，溶于23ml甲苯的V-PDMS-V(20克，1.4毫摩尔)和SiH-MA(0.37克，1.4毫摩尔)被放置在装备有特氟龙涂覆的搅拌棒的500mlErlenmeyer瓶中。通过加入Karstedfs催化剂(0.02ml)开始反应，搅拌填充物并且在50℃的温度下加热2小时。没有分离填充物的成分，并且产物混合物溶液被使用，如同用于接枝物的制备。
【0160】然后通过¹H NMR光谱术和GPC分析产物。平均的甲基丙烯酸酯(MA)官能度是1.0(即，MA/PDMS＝1.0)。根据GPC分析，由于末端官能化作用，GPC迹线的总形状没有改变。
[PDMAAm(PDMS)]-q-PDMS-V的合成：
【0161】在1000ml Erlenmeyer瓶中，放置甲苯(383ml，340克)、新蒸馏的DMAAm(20克，177毫摩尔)和MA官能化PDMS(MA/PDMS＝1.0；20克在43ml甲苯中)的混合物。然后，通过用Ar喷射5分钟，除去溶液中的空气，加入AIBN (0.3mg，0.18毫摩尔)，然后用特氟龙活栓密封所述瓶子，并置于65℃加热烤箱中24小时。在三聚作用之后，大量甲苯在减压下被蒸发，并且在真空中，在室温下干燥产物2天。产出物为38克的淡白色物质。
PDMAAm/PD₅/PDMS和PDMAAm/PMHS/PDMS共网状物的合成：
用D₅H的交联：
【0162】将Karstedfs催化剂(0.05ml)加入到先前溶于10克CHCl₃的[PDMAAm(PDMS)]-g-PDMS-V(0.9克，0.032毫摩尔的乙烯基基团)和D₅H(0.1克，0.33毫摩尔)的溶液中，得到的溶液在室温下搅拌24小时。然后，将所述溶液灌注到特氟龙模子(10×10cm)中并且放置在70℃的烤箱中24小时。在交联完成之后，从模子中取出产生的聚合物，用水(3×500mL/天)彻底萃取并且在室温下，在真空中干燥。水可萃取(sol)馏分的总量为5％，表明交联的程度高。产物为无色的光学透明的柔性膜，其可以被手工处理，因而暗示机械性质的合理组合。产物在水中和正己烷中溶胀，显示了APCN的特性。
用PMHS的交联：
【0163】用PMHS的交联类似于用D₅H的交联，除了使用PMHS(0.1克，1.66毫摩尔的SiH基团)代替D₅H之外。水可萃取(sol)馏分的总量为2％，表明基本上完成交联。干的产物，透明的柔性物质，在在水中和正己烷中溶胀，显示了APCN的特性。
存加入的PDMAAm存在下的交联：
【0164】向溶于10克CHCl₃的[PDMAAm(PDMS)]-g-PDMS-V(0.9克，0.032毫摩尔乙烯基基团)和PMHS(0.1克，1.66毫摩尔的SiH基团)加入在10克(11.3ml)THF中溶解的PDMAAm(M_w＝80,000克/摩尔，0.05克)。然后，加入Karstedt催化剂(0.05mL)并且在室温下搅拌溶液1小时。将填充物灌注到特氟龙模子(10×10cm)中并且放置在70℃的烤箱中24小时。在交联之后，从模子中取出聚合物，用水(3×500mL/天)彻底萃取并且在室温下，在真空中干燥。水可萃取(sol)馏分的总量为3％，表明基本上完成交联。干的产物为白色的柔性物质，其在水中和正己烷中溶胀，显示了APCN的特性。
方法：
溶胀测量：
【0165】预先称重的膜样品被放置在蒸馏水中，并且通过从水中移开膜，通过用面巾纸(tissue paper)吸收而除去被吸附到表面的水，并且称重来定时地测定溶胀程度。当水溶胀膜的重量保持不变24小时，在室温下记录平衡水溶胀(S_w)。下列等式被用于表示数据：
Sw＝100(m_溶胀-m_干燥)/m_干燥
其中，m_溶胀是水溶胀膜的质量，而m_干燥是干燥膜的质量。PDMAAm域的平衡水溶胀通过下式计算：
S_w，PDMAAm＝100(m_溶胀-m_干燥W_PDMAAm 0.01)/(m_干燥W_PDMAAm 0.01)
其中W_PDMAAm是膜的PDMAAm含量(重量百分比)。溶胀状态下的PDMS的重量馏分通过下式计算：
W_SW，PDMS＝100(m_干燥W_PDMS 0.01)/m_溶胀
其中W_PDMS是膜的PDMS含量(重量百分比)。
结果和讨论：
合成策略：
【0166】图12有助于显示合成策略，起始物质，产物的微观结构，并且说明了使用的缩写。接枝物简写成[PDMAAm(PDMS)]-g-PDMS-V，其中(PDMS)表示“主链”中PDMS交联段的存在。两亲性共网状物的缩写，例如，PDMAAm/PMHS/PDMS，依次表示亲水部分/交联剂/疏水部分。在一个实施方式中，第一步是在Karstedt催化剂存在下，V-PDMS-V和SiH-MA以1∶1的化学计量比进行的硅氢化作用。反应产生了由MA-PDMS-V(50％，大分子单体)、MA-PDMS-MA(25％，第一交联剂)和未反应的起始物质V-PDMS-V(25％，第二交联剂)组成的统计学的三种成分混合物。在这种实施方式中，全部的三部分都需要并将被使用。
【0167】第二步是DMAAm与MA-PDSM-V和MA-PDMS-MA的自由基三聚作用，其产生由携带-PDMS-V分支的PDMAAm主链组成的高分子量的、略有交联的可溶接枝物。乙烯基甲硅烷基末端不与MA基团共聚合，因而，产物保持可溶的。在此实施方式中，三聚作用被控制，通过调节引发剂(AIBN)的浓度控制三聚物的分子量而不达到凝胶点。在第三和最后的步骤中，接枝物被共交联，通过氢硅化侧乙烯基硅烷基团与第二交联剂V-PDMS-V和聚氢硅氧烷(D₅H或PMHS)，产生靶APCN。-PDMS-V和聚氢硅氧烷是疏水的，并且在PDMS域中被螯合，因此，PDMAAm域的固化不妨碍交联。APCN是光学上清澈的，表明没有大量的相聚结。交联/膜注塑期间没有域聚集，这是因为PDMAAm和PDMS已经在接枝阶段进行了共价连接(见图12)。
【0168】APCN包含两种PDMS链(见图12)：一种与具有交联位点的PDMAAm部分连接，即，经-PDMS-V分支与聚氢硅氧烷(D₅H或PMHS)的硅氢化作用通过交联而形成，而一种连接两个交联位点，即，经-PDMS-V与聚氢硅氧烷的硅氢化作用通过交联而形成。因而，在第一反应中形成的所有三种成分被掺入到APCN中并且执行重要的功能。
【0169】上述APCN被有意设计为免疫隔离膜。已经发现，溶胀数据是葡萄糖、胰岛素和氧渗透性的良好预测器，即，葡萄糖和胰岛素的扩散率与共网状物中的亲水域的体积分数和PDMAAm(S_w，PDMAAm)的溶胀比成比例，并且氧渗透率与水溶胀膜中的PDMS的体积分数成比例。因而，简单的溶胀研究提供了用于优化合成条件的重要指导。
末端官能化剂，SiH-MA的合成和表征：
【0170】在一个实施方式中，本发明始于SiH-MA的合成(见图13，其说明了末端官能化剂SiH-MA的合成)。SiH-MA的功能是将V-PDMS-V转化为具有MA末端的PDMS，即，产生大分子单体MA-PDMS-V和第一交联剂MA-PDMS-MA。
【0171】合成平稳进行并且通过蒸馏分离产物。在一个实施方式中，可确定的是，期望在蒸馏之前将PPh₃加入到填充物中，以防止在升高的温度下SiH-MA的原位聚合。PPh3，一种催化剂毒物，防止SiH基团在水分(和/或其他质子污染物)的存在下氧化为自由基，这将介导SiH-MA的聚合。在PPh3的存在下，体系足够稳定并产生合理的SiH-MA产量。
【0172】通过¹H NMR光谱术确定SiH-MA的结构(见图14)。如可以从图14中见到的，光谱在4.67ppm显示了多重谱线，这表示SiH基团的存在，和在1.9、5.6nm(对于烯烃)和6.2ppm(对于甲基质子)的特征性共振，所述共振与MA基团有关。SiH-MA与V-PDMS-V通过硅氢化作用基本上定量结合，并且因此获得具有MA末端的PDMS(见下面)。
MA-PDMS-V的合成：
【0173】应用化学计量的量的起始材料，V-PDMS-V∶SiH-MA＝1∶1，通过V-PDMS-V与SiH-MA的硅氢化来制备大分子单体MA-PDMS-V。产物是MA-PDMS-MA(25％)、MA-PDMS-V(50％)和未反应的V-PDMS-V(25％)的统计学混合物(见图12中的步骤1)。
【0174】图15示出了混合物的¹H NMR谱，并且示出了甲基丙烯酸酯(a、d和f质子)和乙烯基甲硅烷基(a、b和c质子)基团的共振特性。与SiH质子(4.67ppm)有关的共振完全消失。CH₂质子的共振，其通过Si-CH＝CH₂与SiH-MA的硅氢化产生，在0.4ppm(i质子)出现。
【0175】主要产物，MA-PDMS-V实际上是大分子单体，其MA基团与DMAAm进行共聚(见图12的步骤2)，并且产生具有-PDMS-V分支的接枝物。在自由基条件下，乙烯基甲硅烷基末端不与MA反应，但是，需要它们通过硅氢化进行交联(见图12中的步骤3)。
【0176】反应混合物被使用，如同不分离单独的分子那样，以制备与-Si-CH＝CH₂基团相配的高分子量接枝物(见图12中的接枝物)。在一个实施方式中，使用V-PDMS-V/SiH-MA化学计量低于或高于单位元素(unity)(即，0.5、0.8、1.5)填充物的接枝物的合成产生了对于某些应用不令人满意的产物，如产物是例如，不透明、微相(microphase)分离的接枝物，或具有不溶的部分。
接枝物[PDMAAm(PDMS)]-q-PDSM-V的合成：
【0177】该接枝物的合成需要DMAAm和MA-PDMS-V大分子单体以及MA-PDMS-MA交联剂的自由基介导的三聚作用，并且产生由DMAAm主链组成的高分子量接枝物，所述主链携带与PDMS段略有交联的-PDMS-V分支。由于填充物中MA-PDMS-MA的存在(见图12中的步骤2)，接枝物被略有交联并且具有高分子量。MA-PDMS-MA与DMAAm共聚合，其有益地增加了分子量，并且扩大了接枝物的分子量分布。在自由基条件下，V-PDMS-V中的乙烯基甲硅烷基基团不与甲基丙烯酸酯共聚合。未反应的起始物质V-PDMS-V“载一程(take a ride)”并且在交联中将被掺入到靶共网状物中(见图12中的步骤3)。图12示出了接枝物的理想微观结构；未反应V-PDMS-V的存在被表示在接枝物的附近。
【0178】由于在凝胶点之前共聚合作用停止，所以产物是可溶的，并且在干燥后，可以再溶于各种溶剂(甲苯、氯仿、四氢呋喃等)。要强调的是，虽然填充物含有大约25％的MA-PDMS-MA，但是接枝物不包含凝胶，因为主链的分子量是由引发剂(AIBN)浓度控制的。相对高的引发剂浓度降低分子量，而较低的引发剂浓度导致相对较高的分子量。取决于分子量和总的组成，产物是无色坚硬的或蜡状的，并且是不透明或光学上清晰的物质。
【0179】接枝物的分子量强烈地影响靶共网状物的特性。在一个实施方式中，低分子量接枝物导致最终共网状物中许多悬垂的PDMAAm链末端；所述悬垂的末端增加了水溶胀，并且因此令人期望地增加了水扩散，然而，由于降低了交联密度，它们削弱了共网状物。
【0180】图16示出了用不同的AIBN浓度制备的三种代表性接枝物的GPC迹线。所述迹线暗示了高分子量的有些不均匀的产物，鉴于三聚作用的复杂性，这不令人惊讶。用降低的AIBN浓度，使接枝物的主要洗脱峰的位置移动到较低的洗脱体积。在一个实施方式中，只有当接枝物的平均臂数在2至5的范围内时，可以形成高分子量的可溶接枝物。如果臂数小于2，那么网状物不能形成，并且如果臂数大于5，那么接枝物含有凝胶。由于PDMS分支的分子量在所有填充物中相同(17,000克/摩尔)，所以PDMAAm的分子量需要降低以将臂数保持在期望的范围内。
表1：填充物^a和总接枝物组合物