抗肿瘤类似物 本发明涉及海鞘素衍生物、特别是海鞘素736(ET-736)、包含它们的药用组合物以及它们作为抗肿瘤化合物的用途。
【发明背景】
海鞘素是从海洋被囊动物Ecteinascidia turbinata分离的非常有效的抗肿瘤药。在以前的专利和科学文献已经报道了几种海鞘素。
参见例如：
美国专利5.256.663介绍了包含从热带海洋无脊椎动物Ecteinascidia turbinata提取的物质的药用组合物，所述物质在该专利中称为海鞘素，并且介绍了这样的组合物用作哺乳动物的抗菌、抗病毒和/或抗肿瘤药。
美国专利5.089.273介绍了介绍了从热带海洋无脊椎动物Ecteinascidia turbinata提取的物质的新药用组合物，所述物质在该专利中称为海鞘素729、743、745、759A、759B和770。这些化合物用作哺乳动物的抗菌和/或抗肿瘤药。
美国专利5.149.804介绍了从加勒比海被囊动物Ecteinascidiaturbinata分离地海鞘素722和736(Et′s 722和736)以及它们的结构。Et′s 722和736在体内以非常低的浓度保护小鼠治疗P388淋巴瘤、B16黑素瘤和Lewis肺癌。
美国专利5.478.932介绍了从加勒比海被囊动物Ecteinascidiaturbinata分离的海鞘素，该化合物提供体内保护治疗P388淋巴瘤、B16黑素瘤、M5076卵巢肉瘤、Lewis肺癌以及LX-1人肺癌和MX-1人乳腺癌的异种移植物。
美国专利5.654.426介绍了从加勒比海被囊动物Ecteinascidiaturbinata分离的几种海鞘素，这些化合物提供体内保护治疗P388淋巴瘤、B16黑素瘤、M5076卵巢肉瘤、Lewis肺癌以及LX-1人肺癌和MX-1人乳腺癌的异种移植物。
美国专利5.721.362介绍了生成海鞘素化合物的合成方法以及相关结构。
美国专利6.124.292介绍了系列新的海鞘素样化合物。
WO 0177115、WO 0187894和WO 0187895介绍了新合成的海鞘素系列化合物、它们的合成方法以及生物学特性。
还可参见：Corey，E.J.，J.Am.Chem.Soc.，1996，118 pp.9202-9203；Rinehart等，Journal of Natural Products，1990，“BioactiveCompounds from Aquatic and Terrestrial Sources”，vol.53，pp.771-792；Rinehart等，Pure and Appl.Chem.，1990，“Biologically activenatural products”，vol 62，pp.1277-1280；Rinehart等，J.Org.Chem.，1990，“Ecteinascidins 729，743，745，759A，759B，and 770：potentAntitumour Agents from the Caribbean Tunicate Ecteinascidiaturninata”，vol.55，pp.4512-4515；Wright等，J.Org.Chem.，1990，“Antitumour Tetrahydroisoquinoline Alkaloids from the Colonialascidian Ecteinascidia turbinata”，vol.55，pp.4508-4512；Sakai等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992，“Additional anitumor ecteinascidinsfrom a Caribbean tunicate：Crystal structures and activities in vivo”，vol.89，11456-11460；Science 1994，“Chemical Prospectors Scour the Seasfor Promising Drugs”，vol.266，pp.1324；Koenig，K.E.，“AsymmetricSynthesis”，ed.Morrison，Academic Press，Inc.，Orlando，FL，vol.5，1985，p.71；Barton等，J.Chem Soc.Perkin Trans.，1，1982，“Synthesisand Properties of a Series of Sterically Hindered Guanidine bases”，pp.2085；Fukuyama等，J.Am.Chem.Soc.，1982，“Stereocontrolled TotalSynthesis of(+)-Saframycin B”，vol.104，pp.4957；Fukuyama等，J.Am.Chem.Soc.，1990，“Total Synthesis of(+)-Saframycin A”，vol.112，p.3712；Saito等，J.Org.Chem.，1989，“Synthesis of Saframycins.Preparation of a Key tricyclic Lactam Intermediate to Saframycin A”，vol.54，5391；Still等，J.Org.Chem.，1978，“Rapid ChromatographicTechnique for Preparative Separations with Moderate Resolution”，vol.43p.2923；Kofron，W.G.；Baclawski，L.M.，J.Org.Chem.，1976，vol.41，1879；Guan等，J.Biomolec.Struc.& Dynam.，vol.10，pp.793-817(1993)；Shamma等，“Carbon-13 NMR Shift Assignments of Aminesand Alkaloids”，p.206(1979)；Lown等，Biochemistry，21，419-428(1982)；Zmijewski等，Chem.Biol.Interactiohs，52，361-375(1985)；Ito，CRC Crit.Rev.Anal.Chem.，17，65-143(1986)；Rinehart等，“Topicsin Pharmaceutical Sciences 1989”，pp.613-626，D.D.Breimer，D.J.A.Cromwelin，K.K.Midha，Eds.，Amsterdam Medical Press B.V.，Noordwijk，The Netherlands(1989)；Rinehart等，“Biological MassSpectrometry”，233-258 eds.Burlingame等，ElsevierAmsterdam(1990)；Guan等，Jour.Biomolec.Struct.& Dynam.，vol.10pp.793-817(1993)；Nakagawa等，J.Amer.Chem.Soc.，111：2721-2722(1989)；Lichter等，“Food and Drugs from the Sea Proceedings”(1972)，Marine Technology Society，Washington，D.C.1973，117-127；Sakai等，J.Amer.Chem.Soc.1996，118，9017；Garcia-Rocha等，Brit.J.Cancer，1996，73：875-883；pommier等，Biochemistry，1996，35：13303-13309；
在2000年，报道了用天然双(四氢异喹啉)生物碱(例如可从不同肉汤培养基获得的番红霉素和番红菌素抗生素)生成海鞘素化合物以及相关结构例如phthalascidin的半合成方法；参见Manzanares等，Org.Lett.，2000，“Synthesis of Ecteinascidin ET-743 and Phthalascidin Pt-650from Cyanosafracin B”，Vol.2，No 16，pp.2545-2548；国际专利申请WO 00 69862。
海鞘素736是由Rinehart首先发现，其特征是四氢-β-咔啉单元替代了从天然来源分离的海鞘素化合物中常见的四氢异喹林单元；参见例如Sakai等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992，“Additionalantitumor ecteinascidins from a Caribbean tunicate：Crystal Structures andactivities in vivo”，vol.89，11456-11460。
WO 9209607要求保护海鞘素736以及海鞘素722(氢替代了海鞘素736中环C和环D的共有氮原子的甲基)和O-甲基海鞘素736(甲氧基替代了海鞘素736环C的羟基)。
尽管在化疗临床应用中获得了积极的效果，但是在寻找海鞘素化合物领域仍然需要开发针对肿瘤具有最佳的细胞毒性和选择性特征以及降低系统毒性和改善药动学特性的新化合物。
发明概述
本发明涉及以下通式的化合物
I：
或Ia
其中取代基R1、R2、R3、R4和R5各自独立选自以下基团：H、OH、OR′、SH、SR′、SOR′、SO2R′、C(＝O)R′、C(＝O)OR′、NO2、NH2、NHR′、N(R′)2、NHC(O)R′、CN、卤素、＝O、取代或未取代的C1-C18烷基、取代或未取代的C2-C18烯基、取代或未取代的C2-C18炔基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环基；
其中X独立选自OR＇、CN、(＝O)或H；
其中各个R′独立选自以下基团：H、OH、NO2、NH2、SH、CN、卤素、＝O、C(＝O)H、C(＝O)CH3、CO2H、取代或未取代的C1-C18烷基、取代或未取代的C2-C18烯基、取代或未取代的C2-C18炔基、取代或未取代的芳基；
其中m为0、1或2；
其中n为0、1、2、3或4。
本发明还涉及海鞘素736(其中R1、R3、R4、R5＝H，R2＝CH3CO-和X＝OH)和通式I或Ia相关化合物的合成方法。
另一方面，本发明涉及包含式I化合物的药用组合物。
另一方面，本发明涉及通式I或Ia化合物治疗癌症的用途。
本发明提供一组式I或Ia的化合物，其中：
R1为氢、羟基、卤素、烷基、烷氧基或芳烷基；
R2和R3独立选自氢、R′、C＝OR′或COOR′，其中R′为任选取代的烷基或烯基，任选取代基团选自卤基；氨基，包括衍生自氨基酸的氨基；芳基或杂环基；
R4为氢、烷基或C(＝O)OR′，其中R′为烯基；
R5为氢或烷基；
X为氢、羟基、氰基或酮基；
m为0或1；
n为0或1。
本发明化合物中合适的卤素取代基包括F、Cl、Br和I。
烷基优选具有1-24个碳原子。一组更优选的烷基具有1至约12个碳原子、更优选1至约8个碳原子、更优选1至约6个碳原子、最优选1-4个碳原子。另一组更优选的烷基具有12至约24个碳原子、更优选12至约18个碳原子、最优选13、15或17个碳原子。本发明化合物中特别优选的烷基为甲基、乙基和丙基(包括异丙基)。尽管环状基团将包含至少三个环碳单元，但是除非另有说明，否则本文使用的术语烷基是指环状和非环状基团。
本发明化合物中优选的烯基和炔基具有一个或多个不饱和键和2至约12个碳原子、更优选2至约8个碳原子、更优选2至约6个碳原子、最优选1-4个碳原子。尽管通常更优选直链或支链非环状基团，但是本文使用的术语烯基和炔基是指环状和非环状基团。
本发明化合物中优选的烷氧基具有一个或多个氧键和1至约12个碳原子、更优选1至约8个碳原子、更优选1至约6个碳原子、最优选1-4个碳原子。
本发明化合物中优选的烷硫基具有一个或多个硫醚键和1至约12个碳原子、更优选1至约8个碳原子、更优选1至约6个碳原子。特别优选1-4个碳原子的烷硫基。
本发明化合物中优选的烷基亚磺酰基包括含有一个或多个亚砜基(SO)和1至约12个碳原子、更优选1至约8个碳原子、更优选1至约6个碳原子的烷基亚磺酰基。特别优选1-4个碳原子的烷基亚磺酰基。
本发明化合物中优选的烷基磺酰基包括含有一个或多个砜基(SO2)和1至约12个碳原子、更优选1至约8个碳原子、更优选1至约6个碳原子的烷基磺酰基。特别优选1-4个碳原子的烷基磺酰基。
优选的氨基烷基包括含有一个或多个伯、仲和/或叔氨基以及1至约12个碳原子、更优选1至约8个碳原子、更优选1至约6个碳原子、最优选1-4个碳原子的氨基烷基。通常仲氨基和叔氨基比伯氨基更优选。
合适的杂环基包括杂芳族基和杂脂环基。本发明化合物中合适的杂芳族基包含1、2或3个选自N、O或S的杂原子，包括例如香豆素基(包括8-香豆素基)、喹啉基(包括8-喹啉基)、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、咪唑基、吲哚基、苯并呋喃基和苯并噻唑基。本发明化合物中合适的杂脂环基包含1、2或3个选自N、O或S的杂原子，包括例如四氢呋喃基、四氢吡喃基、哌啶基、吗啉代和吡咯烷基(pyrrolindinyl)。
本发明化合物中合适的碳环芳基包括单环和多环化合物，包括含单独和/或稠合芳基的多环化合物。典型的碳环芳基含有1-3个单独环或稠合环以及6至约18个碳环原子。特别优选的碳环芳基包括包括苯基，包括取代的苯基例如2-取代的苯基、3-取代的苯基、2，3-取代的苯基、2，5-取代的苯基、2，3，5-取代的苯基和2，4，5-取代的苯基，包括一个或多个苯基取代基为吸电子基团(例如卤素、氰基、硝基、链烷酰基、亚磺酰基、磺酰基等)的苯基；萘基，包括1-萘基和2-萘基；联苯基；菲基；蒽基。
在本发明化合物中涉及取代的R′基团时是指指定部分(通常是烷基或烯基)可以在一个或多个有效位置上被一个或多个例如以下的适当基团取代：卤素，例如氟、氯、溴和碘；氰基；羟基；硝基；叠氮基；链烷酰基，例如C1-C6链烷酰基(例如酰基)等；甲酰胺基；烷基，包括1至约12个碳原子或1至约6个碳原子的烷基，更优选1-3个碳原子的烷基；烯基和炔基，包括含有一个或多个不饱和键以及2至约12个碳原子或2至约6个碳原子的烯基和炔基；烷氧基，包括含有一个或多个氧键以及1至约12个碳原子或1至约6个碳原子的烷氧基；芳氧基，例如苯氧基；烷硫基，包括含一个或多个硫醚键以及1至约12个碳原子或1至约6个碳原子的烷硫基；烷基亚磺酰基，包括含有一个或多个亚磺酰基键以及1至约12个碳原子或1至约6个碳原子的烷基亚磺酰基；烷基磺酰基，包括含有一个或多个磺酰基键以及1至约12个碳原子或1至约6个碳原子的烷基磺酰基；氨基烷基，例如含有一个或多个氮原子以及1至约12个碳原子或1至约6个碳原子的氨基烷基；含6个或6个以上碳原子的碳环芳基，特别是苯基(例如R为取代或未取代的联苯基)；芳烷基，例如苄基；杂环基，包括杂脂环基和杂芳族基，尤其是包含5-10个环原子，其中1-4个为杂原子的杂环基，更优选含5或6个环原子和1或2个杂原子或者含10个环原子和1-3个杂原子的杂环基。
优选的R′存在于式R′、COR′或OCOR′基团中，并且优选的R′包括在一个或多个有效位置上被一个或多个例如卤素(例如氟、氯、溴和碘，尤其是ω-氯或全氟)的合适基团取代的烷基或烯基；氨基烷基，例如含有一个或多个氮原子以及1至约12个碳原子或1至约6个碳原子的氨基烷基，尤其包括氨基酸，特别是甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、天门冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸，又尤其是这样的氨基酸的受保护形式；含6个或6个以上碳原子的碳环芳基，特别是苯基；芳烷基，例如苄基；杂环基，包括杂脂环基和杂芳族基，尤其是包含5-10个环原子，其中1-4个为杂原子的杂环基，更优选含5或6个环原子和1或2个杂原子或者含10个环原子和1-3个杂原子的杂环基，杂环基任选被一个或多个可用于R′的取代基取代，尤其任选被氨基(例如二甲基氨基)或酮基取代。
非穷举性说明，本发明优选化合物具有一种或多种以下定义：
R1为氢；羟基；卤素，尤其是F；烷氧基(烷基为1-7个碳原子)，尤其是C1-C3烷基和苄氧基，最特别的是甲氧基和苄氧基。特别优选为H、OH或OMe；
R2为H；乙酰基；烷基-CO(烷基可达25个碳原子，例如17、19或21个碳原子，优选为奇数个碳原子(对应于偶数个碳原子的脂肪羧酸)，否则含较少碳原子，例如1-7个)，尤其是CH3-(CH2)n-CO-，其中n为例如1、2、4、6、12、14或16；卤代烷基-CO-，尤其是三氟甲基羰基、七氟丁酰基羰基或3-氯丙酰基；芳基烷基-CO-；芳基烯基-CO-，尤其是肉桂酰基-CO-；烷基-O-CO-，尤其是叔丁基-O-CO-或烯基-O-CO-，尤其是烯丙基-O-CO-或乙烯基-O-CO。
R3优选为H；烯基，尤其是烯丙基；烷基-CO(烷基可达25个碳原子，例如17、19或21个碳原子，优选为奇数个碳原子(对应于偶数个碳原子的脂肪羧酸)，否则含较少碳原子，例如1-6个)，尤其是CH3-(CH2)n-CO-，其中n为例如1、2、4、6、12、14或16；烷基-O-CO-，尤其是叔丁基-O-CO-；烯基-O-CO-，尤其是烯丙基-O-CO-或乙烯基-O-CO。
R4优选为氢；烷基(烷基为1-6个碳原子)，尤其是C1-C3烷基；烯基，尤其是烯丙基、烯基-O-CO-(尤其是乙烯基-O-CO)；R4最优选氢；
R5为氢或烷基(烷基为1-6个碳原子)，R5最优选H或Me；
X为H、-CN或-OH，最优选-OH或-CN；
m为0或1；
n为0或1。
R1不为氢的化合物是一组优选的化合物。参见例如化合物27-36。这些化合物具有更高的活性、更宽的治疗窗以及改善的药动学特性。优选的取代基为甲氧基、甲基、羟基、苄氧基、氟。
R3为酯或醚的化合物是其中的优选化合物。通常，它们具有改善的毒物学特性，因此具有更宽的治疗窗。在这些化合物中，最优选在R3位置为酯或碳酸酯、特别是碳酸酯的化合物。含大基团(长链脂族残基或芳族残基)的酯得到更好的效果。在碳酸酯中，叔丁氧基羰基(tBOC)和乙烯氧基羰基(VOC)为在这些位置的最优选取代基。
R5不为氢的化合物是另一组优选的化合物。参见例如化合物37-44。这些化合物将会有更低的活性(细胞毒性)，但是毒性更低并且药动学特性更好。R5不为氢时产生一个手性中心，发现不同的非对映异构体具有不同的活性。
R2为酯或醚的化合物也是优选化合物。通常，它们具有改善的毒物学特性，因此具有更宽的治疗窗。在这些化合物中，最优选在R2位置为酯或碳酸酯、特别是碳酸酯的化合物。含大基团(长链脂族残基或芳族残基)的酯得到更好的效果。在碳酸酯中，叔丁氧基羰基(tBOC)和乙烯氧基羰基(VOC)为在这些位置的最优选取代基。
有的化合物具有更好的ADME特性(吸收-分布-代谢-排泄)，这些特性为药动学的很好指标。
如上所述，本发明化合物，优选具有大体积取代基团的化合物，具有较宽的治疗窗，苯酚与不同酸和碳酸酯的酯化导致药学特性的总体增强：显著降低肝细胞毒性，并且由于这些衍生不具有细胞色素抑制作用，而且具有更高的代谢稳定性，所以还具有良好的药物-药物相互作用特征。
已经制备了多种活性抗肿瘤化合物，相信根据本发明公开内容可以制备更多的化合物。
这些化合物的抗肿瘤活性包括白血病、肺癌、结肠癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肉瘤和黑素瘤。
本发明另一特别优选的实施方案为用作抗癌药物的药用组合物以及其制备方法，所述组合物包含一种或多种本发明化合物作为活性成分。
药用组合物的实例包括含合适成分的任何固体(片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂等)或液体(溶液剂、混悬剂或乳剂)，可口服、局部给药或胃肠外给药。
本发明化合物或组合物的给药方式可以为任何合适的方法，例如静脉输注、口服制剂、腹膜内制剂和静脉制剂。
本发明化合物和组合物可以与其它药物一起使用以提供联合治疗。其它药物可以构成同一组合物的一部分，或者以单独的组合物提供用于在相同或不同的时间给药。具体的其它药物没有特别限制，合适的候选药物包括：
a)具有抗有丝分裂效果的药物，特别是靶向细胞骨架组分的药物，包括微管调节剂例如紫杉烷类(例如泰素、紫杉醇、泰素帝、多西他赛)、鬼臼毒素或长春花属生物碱(长春新碱、长春花碱)；
b)抗代谢物，例如5-氟尿嘧啶、阿糖孢苷、吉西他滨、嘌呤类似物(例如喷司他丁)、甲氨蝶呤；
c)烷基化剂，例如氮芥(例如环磷酰胺或异环磷酰胺)
d)靶向DNA的药物，例如蒽环霉素(antracycline)、亚德里亚霉素、阿霉素、盐酸表柔比星制剂或表柔比星；
e)靶向拓扑异构酶的药物例如依托泊苷；
f)激素以及激素的激动剂或拮抗剂，例如雌激素、抗雌激素(他莫昔芬和相关化合物)和雄激素、氟他胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林、环丙孕酮(cyprotrone)或奥曲肽；
g)靶向肿瘤细胞中信号传导的药物，包括抗体衍生物，例如曲妥单抗；
h)烷基化药，例如铂药物(顺铂、卡铂、奥沙利铂、铂尔定)或亚硝基脲；
i)有效影响肿瘤转移的药物，例如基质金属蛋白酶抑制剂；
j)基因疗法和反义药物；
k)抗体疗法；
l)海洋来源的其它生物活性药物，尤其是didemnin例如aplidine；
m)类固醇类似物，特别是地塞米松；
n)抗炎药物，特别是地塞米松；
o)止吐药，特别是地塞米松。
本发明另一优选实施方案是在以下详述的本发明化合物的合成中间体。
最后，本发明包括本文所述的合成方法。
优选实施方案的详细说明
本发明的一组优选化合物包括具有一个或多个以下取代基的本发明化合物：
R1为氢；羟基；卤素，尤其是F；烷氧基，尤其是甲氧基；或芳烷基，尤其是苄基。
R2为H；
烷基，更优选1-6个碳原子的烷基；
C(＝O)R′，其中R′为烷基，更优选1-24个碳原子的烷基、尤其是1-8或12-18碳原子的烷基；卤代烷基，更优选1-4个碳原子的ω-卤代烷基或全氟烷基，尤其是ω-氯乙基或全氟甲基、全氟乙基或全氟丙基；杂环基烷基，更优选具有ω-杂环取代基的1-6个碳原子的烷基，所述ω-杂环取代基适当含有5-10个环原子和1-4个杂原子，包括含3个杂原子的稠合杂脂环基，例如生物素；氨基烷基，更优选含ω-氨基的1-6个碳原子、尤其是2个碳原子的烷基，所述ω-氨基任选被例如烷氧基羰基(例如(CH3)3C-O-C＝O-)或其它保护基团保护；
芳基烯基，尤其是肉桂酰基；烯基，尤其是乙烯基或烯丙基；芳烷基，例如苄基；或
C(＝O)OR′，其中R′为烷基，更优选1-6个碳原子的烷基，尤其是支链烷基；烯基，更优选烯丙基；
R3为H；
烷基，更优选1-6个碳原子的烷基；
(C＝O)R′，其中R′为烷氧基，尤其是含1-6个碳原子的烷基的烷氧基；烷基，更优选1-24个碳原子的烷基，更优选1-8或12-18碳原子的烷基；卤代烷基，更优选1-4个碳原子的全氟烷基，尤其是全氟甲基、全氟乙基或全氟丙基；芳基烯基，尤其是肉桂酰基；杂环基烷基，更优选具有ω-杂环取代基的1-6个碳原子的烷基，所述ω-杂环取代基适当含有5-12个环原子和1-4个杂原子，包括含3个环原子的稠合杂环基，例如生物素；杂环基烷基，优选其中烷基含有1个碳原子，更优选含有5-10个环原子和1-4个环原子的杂脂环基甲基，尤其是含1-4个杂原子的稠合杂环基，例如二甲基氨基香豆素或香豆素；烯基，尤其是烯丙基；芳烷基，例如苄基；
(C＝O)OR′，其中R′为烷基，更优选1-6个碳原子的烷基；烯基，尤其是乙烯基或烯丙基；芳烷基，例如苄基；
R4为氢；烷基，更优选1-6个碳原子的烷基；(C＝O)OR′，其中R′为烯基，尤其是乙烯基；
R5为氢或烷基；
X为氢、羟基、氰基或酮基；
m为0或1；
n为0或1。
在本发明相关方面，化合物具有一个或多个以下特征：
R2不为乙酰基。它优选具有至少4、5或6个碳原子，例如达到18或24个碳原子。合适的取代基包括酯COR′，其中R′为通常含有一个或多个取代基的烷基、烯基。优选烷基、取代的烷基、烯基和芳基烯基，含有包括芳基、杂环基的适当取代基。R2的其它定义包括衍生自氨基酸(任选保护的氨基酸)的式COR′酯。
R3不为氢。优选为R′、COR′或COOR′，其中R′为有一定体积的取代基。这样的大体积取代基包括这样的基团：含支链的基团、不饱和基团或环状基团(包括芳族基团)。因此，优选支链烷基、环烷基、支链烯基、芳基、杂芳族基和相关基团包含在取代基R3的结构内。优选R3的总碳原子数为2-24个、更优选6-18个。通常R3为结构式COR′、R′或COOR′的酯、醚或碳酸酯。
R5不为氢。优选为R′、COR′或COOR′，其中R′为有一定体积的取代基。这样的大体积取代基包括这样的基团：含支链的基团、不饱和基团或环状基团(包括芳族基团)。因此，优选支链烷基、环烷基、支链烯基、芳基、杂芳族基和相关基团包含在取代基R5的结构内。优选R5的总碳原子数为2-24个、更优选6-18个。通常R4为结构式COR′、R′或COOR′的酯、醚或碳酸酯。
氨基和其它取代基的保护基团实例在WO 0069862给出，将该文献直接结合到本文。
本申请要求英国专利申请的优先权。我们将本申请中没有说明而在英国的优先权申请中说明的任何公开内容通过引用结合到本申请。
此外，通过引用WO 0069862、WO 0177115、WO 0187894和WO 0187895中对应于本申请取代基的阐述直接结合到本文。在这些以前的申请中对特定取代基的任何定义可以用于本发明化合物的取代基。
此外，我们不要求以前申请(包括WO 9209607)中公开的任何化合物的权利，并且直接放弃这样的化合物。通过引用将以前的各个申请直接结合本文用于可能是必须的任何放弃说明。
国际专利申请WO 0069862公开了化合物36(一种在氰基番红菌素B转化为海鞘素743过程中的中间体)。
这种半合成的中间体用作合成海鞘素736的初始原料，海鞘素736是具有有效抗肿瘤治疗活性的天然海鞘素家族的又一成员。
以下反应流程介绍制备海鞘素736和在四氢-β-咔啉单元和位置18(-OR4)具有不同取代基的相关化合物的优选方法。
流程1
如流程1的示例性描述，中间体36可以分两步转化为ET-736(或取代的衍生物)。
第一步是从化合物36制备本发明优选的I型化合物，将其与相应的伯胺或仲胺反应引入四氢-β-咔啉单元。
第二步是与硝酸银在ACN/H2O中反应将CN基团转化为OH基团。
也可能用优选的化合物I通过酰化或烷基化反应获得具有不同取代基(-OR4，18位以及＝NR5)的新衍生物。在所有上述情况下，初始原料中的R1和R2为氢原子。用相同的中间体并通过与烯丙基溴的烷基化反应或者通过与氯甲酸乙烯酯的酰化反应，可以获得N和O烯丙基化的衍生物以及N和O乙烯基化的衍生物。所有这些化合物通过与硝酸银反应获得其中CN基团转化为OH基团的终产物。
熟练技术人员很容易理解，此处介绍的反应流程可以如下修改：通过使用许多取代的伯胺生产一系列取代的海鞘素736衍生物，因此，这样产生的化合物也被认为是本发明的一部分。
特别地，可以变化反应条件以适合在四氢-β-咔啉单元中各取代基团的其它组合。
以下反应流程介绍制备海鞘素694和在5位及18位(-OR6和-OR7)具有不同取代基的相关化合物的优选方法。
流程2
在流程2中，在碱性条件下C-5的乙酰基的水解使得制备出在此位置具有羟基的中间体。用此化合物通过与酸酐、酰基氯或羧酸的酰化反应，制备单-O取代以及单和二-O取代(在C-5和C-18)的新衍生物。将CN基团转化为OH的反应在典型条件(硝酸银的CH3CN/H2O溶液)下进行。在另一方面，可以用Et-736通过在KOH/MeOH存在下进行C-5的乙酰基水解获得Et-694。
熟练技术人员很容易理解，此处介绍的反应流程可以如下修改：通过使用许多取代的伯胺生产一系列取代的海鞘素736-CN衍生物，因此，这样产生的化合物也被认为是本发明的一部分。
特别地，可以变化反应条件以适合在四氢-β-咔啉单元以及C-5和C-18位上取代基团的其它组合。
本发明将根据以下帮助理解的实施例进一步说明，但是它们不应该解释为对本发明的限制。
实验部分
流程1
方法1.-在氩气氛、室温下，1当量初始原料的乙酸(5.33 E-5M)溶液中加入3.5当量色胺。搅拌反应混合物24h，然后蒸发乙酸。加入碳酸氢钠饱和水溶液，用二氯甲烷萃取混合物，用硫酸钠干燥有机层。快速色谱法处理获得纯净化合物。
方法2.-在氩气氛、室温下，1当量化合物1的二氯甲烷(0.032M)溶液中加入2当量Et3N、2当量丁酰氯或Boc酸酐(3当量)或氯甲酸乙烯酯。TLC监测反应，用饱和碳酸氢钠水溶液猝灭，用二氯甲烷萃取，有机层用硫酸钠干燥。快速色谱法处理获得纯净化合物。
方法3.-在氩气氛、室温下，1当量化合物1的DMF(0.032M)溶液中加入3当量Cs2CO3和3当量烯丙基溴。TLC监测反应，用饱和碳酸氢钠水溶液猝灭，用二氯甲烷萃取，有机层用硫酸钠干燥。快速色谱法处理获得两种纯净化合物的混合物：化合物24(ET-736-CN-All)和化合物25(ET-736-CN-diAll)。
方法4.-1当量初始原料的CH3CN/H2O 3∶2(0.009M)溶液中加入30当量AgNO3。在24h后，反应物用1∶1盐水和碳酸氢钠的饱和溶液混合物猝灭，搅拌10min，用二氯甲烷稀释、萃取。有机层用硫酸钠干燥。色谱法处理获得纯净化合物。
方法1：
化合物1：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.74(s，1H)；7.38(d，1H)；7.25(d，1H)；7.08(t，1H)；7.00(t，1H)；6.66(s，1H)；6.22(d，1H)；6.02(d，1H)；5.79(s，1H)；5.08(d，1H)；4.55(s，1H)；4.32(s，1H)；4.27(d，1H)；4.21(s，1H)；4.19(d，1H)；3.81(s，3H)；3.44-3.40(m，2H)；3.18-2.78(m，4H)；2.71-2.51(m，3H)；2.37(s，3H)；2.26(s，3H)；2.21(s，3H)；2.06(s，3H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ171.7，168.9，148.2，145.9，143.2，141.3，140.5，135.7，130.8，130.6，129.5，127.0，122.2，120.9，120.8，119.5，118.6，118.4，113.8，111.1，110.5，102.2，62.5，61.5，60.8，60.5，59.7，55.9，54.8，42.1，41.7，40.0，39.5，29.9，24.0，21.7，20.8，16.1，9.9.
ESI-MS m/z：计算值C41H41N5O8S：763.3实测值(M+H+)：764.2.
化合物2：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.64(s，1H)；7.12(d，1H)；6.81(d，1H)；6.73(dd，1H)；6.65(s，1H)；6.19(s，1H)；6.00(s，1H)；5.79(s，1H)；5.0(d，1H)；4.54(s，1H)；4.30(s，1H)；4.27(d，1H)；4.20(s，1H)；4.18(d，1H)；3.80(s，3H)；3.78(s，3H)；3.43-3.40(m，2H)；3.18-2.77(m，4H)；2.66-2.49(m，3H)；2.37(s，3H)；2.34-2.20(m，1H)；2.26(s，3H)；2.21(s，3H)；2.05(s，3H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ171.4，168.6，153.7，148.0，145.6，142.9，141.0，140.2，131.1，130.6，130.5，129.2，127.0，120.6，120.5，118.2，113.6，111.9，111.6，110.0，102.0，100.3，62.3，61.2，60.5，60.2，59.4，55.7，54.6，54.5，41.8，41.4，39.7，39.2，31.5，29.6，23.8，22.6，21.5，20.5，15.8，14.4，9.7.ESI-MS m/z：计算值C42H43N5O9S：793.3实测值(M+H+)：794.7.
化合物3：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.85(s，1H)；7.45-7.36(m，5H)；7.01(t，1H)；6.91(t，1H)；6.65-6.63(m，2H)；5.87(s，1H)；5.77(s，1H)；5.63(s，1H)；5.13(s，2H)；5.05(d，1H)；4.53(s，1H)；4.27-4.19(m，4H)；3.80(s，3H)；3.46-3.39(m 2H)；3.06-2.79(m，4H)；2.68-2.50(m 2H)；2.42-2.20(m，1H)；2.36(s，3H)；2.27(s，3H)；2.20(s，3H)；2.03(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C48H47N5O9S：869.3实测值(M+H+)：870.3.
化合物4：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.36(s，1H)；7.44-7.25(m 5H)；7.13(d，1H)；6.91(d，1H)；6.82(dd，1H)；6.65(s，1H)；6.21(d，1H)；6.01(d，1H)；5.80(s，1H)；5.08(d，1H)；5.03(s，2H)；4.55(s，1H)；4.31(s，1H)；4.27(d，1H)；4.20-4.10(m，3H)；3.81(s，3H)；.3.44-3.40(m 2H)；3.18-2.77(m，4H)；2.60-2.46(m，2H)；2.37(s，3H)；2.35-2.19(m，1H)；2.26(s，3H)；2.21(s，3H)；2.06(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C48H47N5O9S：869.3实测值(M+H+)：870.3.
化合物5：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.63(s，1H)；7.15-7.11(m，2H)；6.91(dd，1H)；6.65(s，1H)；6.21(d，1H)；6.01(s，1H)；5.78(s，1H)；5.07(d，1H)；4.54(s，1H)；4.31(s，1H)；4.27(d，1H)；4.21-4.16(m，2H)；3.81(s，3H)；3.44-3.40(m，2H)；3.17-2.77(m，4H)；2.66-2.46(m，3H)；2.31(s，6H)；2.26(s，3H)；2.21(s，3H)；2.06(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C42H43N5O8S：777.3实测值(M+Na+)：800.7.
化合物6：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.66(s，1H)；6.95(d，1H)；6.64(s，2H)；6.56(dd，1H)；6.15(s，1H)；5.97(s，1H)；5.81(s，1H)；5.06(d，1H)；4.53(s，1H)；4.29(s，1H)；4.26(d，1H)；4.19(s，1H)；4.17(d，1H)；3.80(s，3H)；4.41-3.39(m，2H)；3.12-2.73(m，4H)；2.55-2.27(m，3H)；2.36(s，3H)；2.25(s，3H)；2.20(s，3H)；2.04(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C41H41N5O9S：779.3实测值(M+H+)：780.3.
化合物7：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.75(s，1H)；7.26(dd，1H)；6.93(dd，1H)；6.76(ddd，1H)；6.65(s，1H)；6.22(d，1H)；6.01(d，1H)；5.79(s，1H)；5.08(d，1H)；4.55(s，1H)；4.31(s，1H)；4.25(d，1H)；4.20(s，1H)；4.18(dd，1H)；3.80(s，3H)；3.43-3.40(m，2H)；3.18-2.77(m，4H)；2.64-2.50(m，3H)；2.36(s，3H)；2.26(s，3H)；2.21(s，3H)；2.06(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C41H40FN5O8S：781.3实测值(M+H+)：782.3.
化合物8：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ6.93(d，1H)；6.80(s，1H)；6.73(s，1H)；6.67(dd，1H)；6.46(s，1H)；6.20(s，1H)；6.06(s，1H)；5.72(s，1H)；4.96(d，1H)；4.45(s，1H)；4.37(d，1H)；4.25(d，1H)；4.05-4.01(m，2H)；3.79(s，3H)；3.63(d，1H)；3.39(d，1H)；3.03-3.91(m，2H)；2.76-2.34(m，5H)；3.30(s，3H)；2.28(s，3H)；2.21(s，3H)；2.18(s，3H)；2.04(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C42H43N5O9S：793.3实测值(M+H+)：794.3.
化合物9：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.63(s，1H)；7.24(d，1H)；6.75(d，1H)；6.66(dd，1H)；6.65(s，1H)；6.20(s，1H)；6.00(s，1H)；5.79(s，1H)；5.07(d，1H)；4.54(s，1H)；4.31(s，1H)；4.27(d，1H)；4.20(d，1H)；4.17(dd，1H)；3.80(s，3H)；3.71(s，3H)；3.43-3.40(m，2H)；3.16-2.78(m，4H)；2.64-2.49(m，3H)；2.36(s，3H)；2.25(s，·3H)；2.21(s，3H)；2.06(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C42H43N5O9S：793.3实测值(M+H+)：794.3.
化合物10：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.76(s，1H)；7.14(dd，1H)；7.00(dd，1H)；6.81(ddd，1H)；6.65(s，1H)；6.21(d，1H)；6.00(d，1H)；5.79(s，1H)；5.07(d，1H)；4.55(s，1H)；4.31(s，1H)；4.27(dd，1H)；4.20(d，1H)；4.18(dd，1H)；3.80(s，3H)；3.44-3.40(m，2H)；3.16-2.77(m，4H)；2.64-2.44(m，3H)；2.37(s，3H)；2.26(s，·3H)；2.21(s，3H)；2.05(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C41H40FN5O8S：781.3实测值(M+H+)：782.1.
化合物11：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.48(s，1H)；7.22(d，1H)；6.96-6.88(m，2H)；6.65(s，1H)；6.15(d，1H)；6.04(d，1H)；5.78(s，1H)；5.09(d，1H)；4.55(s，1H)；4.34(s，1H)；4.28-4.20(m，3H)；3.81(s，3H)；3.48(d，1H)；3.42(d，1H)；3.12-2.78(m，4H)；2.69-2.43(m，3H)；2.37(s，3H)；2.36(s，3H)；2.28(s，·3H)；2.21(s，3H)；2.06(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C42H43N5O8S：777.3实测值(M+H+)：778.3
化合物12(第一种异构体)：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.68(s，1H)；7.05(d，1H)；6.63-6.57(m，3H)；6.22(d，1H)；6.02(d，1H)；5.73(s，1H)；5.12(d，1H)；4.58(s，1H)；4.36(s，1H)；4.34-4.22(m，3H)；3.80(s，3H)；3.47-3.42(m，2H)；3.05-2.86(m，2H)；2.67-2.35(m，2H)；2.32-2.05(m，3H)；2.31(s，3H)；2.28(s，3H)；2.15(s，3H)；2.03(s，3H)；1.07(d，3H).
ESI-MS m/z：计算值C42H43N5O9S：793.2实测值(M+H+)：794.2.
化合物13(第二种异构体)：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.54(s，1H)；7.08(d，1H)；6.73(d，1H)；6.63(dd，1H)；6.57(s，1H)；6.20(d，1H)；6.00(d，1H)；5.74(s，1H)；5.02(d，1H)；4.60(s，1H)；4.33(s，1H)；4.27(d，1H)；4.22(d，1H)；4.12(dd，1H)；3.80(s，3H)；3.44-3.32(m，3H)；3.05-2.89(m，2H)；2.49-2.03(m，4H)；2.32(s，3H)；2.24(s，3H)；2.18(s，·3H)；2.07(s，3H)；1.21(d，3H).
ESI-MS m/z：计算值C42H43N5O9S：793.2实测值(M+H+)：794.2.
化合物14(第一种异构体)：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.98(s，1H)；7.40(dd，1H)；6.18(t，1H)；7.04(t，1H)；6.82(s，1H)；6.16(d，1H)；6.01(d，1H)；5.74(s，1H)；4.95(d，1H)；4.64(s，1H)；4.40(s，1H)；4.30-4.24(m，3H)；3.62(s，3H)；3.56(d，1H)；3.50(d，1H)；3.12-2.89(m，4H)；2.75-2.51(m，3H)；2.43(s，3H)；2.38-2.30(m，2H)；2.26(s，3H)；2.19(s，3H)；2.08(s，3H)；2.00(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C42H43N5O8S：777.2实测值(M+H+)：778.2.
化合物15(第二种异构体)：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.36(d，1H)；7.15-7.06(m，2H)；7.01(ddd，1H)；6.93(s，1H)；6.47(s，1H)；6.22(d，1H)；6.09(d，1H)；5.72(s，1H)；4.97(d，1H)；4.46(s，1H)；4.40(d，1H)；4.26(dd，1H)；4.03(dd，1H)；4.02(s，1H)；3.80(s，3H)；3.63(d，1H)；3.39(d，1H)；3.00-2.92(m，2H)；277-2.54(m，4H)；2.30(s，3H)；2.26-2.25(m，2H)；2.23(s，6H)；2.19(s，3H)；2.05(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C42H43N5O8S：777.2实测值(M+H+)：778.2.
化合物16(第一种异构体)：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.82(s，1H)；7.14(dd，1H)；6.96(dd，1H)；6.82(ddd，1H)；6.61(s，1H)；6.23(d，1H)；6.02(d，1H)；5.72(s，1H)；5.12(d，1H)；4.59(s，1H)；4.37(s，1H)；4.32-4.25(m，3H)；3.80(s，3H)；3.48-3.43(m，2H)；3.05-2.86(m，4H)；2.78-2.70(m，1H)；2.60-2.34(m，3H)；2.31(s，3H)；2.27(s，3H)；2.16(s，3H)；2.03(s，3H)；1.12(d，3H).
ESI-MS m/z：计算值C42H42FN5O8S：795.3实测值(M+H+)：796.2.
化合物17(第二种异构体)：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.65(s，1H)；7.18(dd，1H)；6.99(dd，1H)；6.83(ddd，1H)；6.58(s，1H)；6.22(d，1H)；6.01(d，1H)；5.74(s，1H)；5.03(d，1H)；4.61(s，1H)；4.34(s，1H)；4.27(d，1H)；4.22(d，1H)；4.14-4.10(m，1H)；3.80(s，3H)；3.44(d，2H)；3.38-3.30(m，1H)；3.06-2.99(m，2H)；2.50(dd，1H)；2.43(d，1H)；2.32(s，3H)；2.24(s，3H)；2.18(s，3H)；2.16-2.11(m，2H)；2.08(s，3H)；1.20(d，3H).
ESI-MS m/z：计算值C42H42FN5O8S：795.3实测值(M+H+)：796.2.
化合物18(第一种异构体)：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.83(s，1H)；7.34(d，1H)；7.24(d，1H)；7.09(ddd，1H)；7.00(ddd，1H)；6.62(s，1H)；6.24(d，1H)；6.03(d，1H)；5.73(s，1H)；5.13(d，1H)；4.59(s，1H)；4.38(s，1H)；4.33-4.27(m，3H)；3.80(s，3H)；3.48-3.43(m，2H)；3.06-2.87(m，2H)；2.78-2.72(m，1H)；2.61-2.24(m，4H)；2.32(s，3H)；2.27(s，·3H)；2.16(s，3H)；2.03(s，3H)；1.13(d，3H).
ESI-MS m/z：计算值C42H43N5O8S：777.2实测值(M+H+)：778.2.
化合物19(第二种异构体)：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.66(s，1H)；7.37(d，1H)；7.28(d，1H)；7.10(ddd，1H)；7.00(ddd，1H)；6.58(s，1H)；6.24(d，1H)；6.02(d，1H)；5.75(s，1H)；5.03(d，1H)；4.61(s，1H)；4.35(s，1H)；4.28(dd，1H)；4.23(d，1H)；4.15-4.08(m，1H)；3.81(s，3H)；3.44(d，2H)；3.38-3.32(m，1H)；3.07-2.90(m，2H)；2.58(dd，1H)；2.45(d，1H)；2.33(s，3H)；2.27-2.12(m，2H)；2.24(s，·3H)；2.19(s，3H)；2.08(s，3H)；1.20(d，3H).
ESI-MS m/z：计算值C42H43N5O8S：777.2实测值(M+H+)：778.2.
方法2：
化合物20：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.70(s，1H)；7.38(d，1H)；7.25(d，1H)；7.10(ddd，1H)；7.02(ddd，1H)；7.01(s，1H)；6.24(d，1H)；6.03(d，1H)；5.09(d，1H)；4.44(s，1H)；4.33(s，1H)；4.22-4.18(m，2H) 3.81(d，1H)；3.77(s，3H)；3.48-3.44(m，2H)；3.19-2.81(m，4H)；2.70-2.48(m，3H)；2.62(t，2H)；2.37(s，3H)；2.34-2.15(m，2H)；2.29(s，·3H)；2.18(s，3H)；2.04(s，3H)；1.95-1.82(m，2H)；1.10(t，3H).
ESI-MS m/z：计算值C45H47N5O9S：833.3实测值(M+H+)：834.2.
化合物21：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.70(s，1H)；7.38(d，1H)；7.24(d，1H)；7.09(ddd，1H)；7.00(ddd，1H)；6.99(s，1H)；6.22(d，1H)；6.02(d，1H)；5.08(d，1H)；4.48(s，1H)；4.32(s，1H)；4.25-4.21(m，2H)；3.81(s，3H)；3.46-3.44(m，2H)；3.18-2.79(m，4H)；2.72-2.43(m，3H)；2.36(s，3H)；2.31(s，·3H)；2.20(s，3H)；2.08(s，3H)；1.54(s，9H).
ESI-MS m/z：计算值C46H49N5O10S：863.3实测值(M+H+)：864.2.
化合物22：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.70(s，1H)；7.38(d，1H)；7.26-6.99(m，5H)；6.24(d，1H)；6.03(d，1H)；5.09(d，1H)；5.00(dd，1H)；4.71(dd，1H)；4.48(s，1H)；4.33(s，1H)；4.24-4.21(m，2H) 3.95(d，1H)；3.81(s，3H)；3.48-3.45(m，2H)；3.18-2.81(m，4H)；2.72-2.45(m，3H)；2.38(s，3H)；2.34(s，·3H)；2.30-2.11(m，2H)；2.20(s，3H)；2.08(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C44H43N5O10S：833.3实测值(M+H+)：834.2.
化合物23：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.38(d，1H)；7.20-7.13(m，3H)；7.07-6.98(m，2H)；6.88(s，1H)；6.66(s，1H)；6.18(d，1H)；6.12(d，1H)；4.95(dd，1H)；4.79(d，1H)；4.78(dd，1H)；4.68(dd，1H)；4.46(dd，1H)；4.40(d，1H)；4.34-4.18(m，3H)；3.97(d，1H)；3.89(d，1H)；3.85(s，3H)；3.61(d，1H)；3.41(d，1H)；3.17-2.98(m，3H)；2.76-2.42(m，4H)；2.37(s，3H)；2.32(s，3H)；2.18(s，3H)；2.13(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C47H45N5O12S：903.2实测值(M+Na+)：926.1
方法3：
化合物24：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.71(s，1H)；7.38(d，1H)；7.24(d，1H)；7.09(ddd，1H)；7.00(ddd，1H)；6.86(s，1H)；6.22(d，1H)；6.16-6.04(m，1H)；6.02(d，1H)；5.47(dd，1H)；5.26(dd，1H)；5.09(d，1H)；4.83(dd，1H)；4.52(s，1H)；4.36 (dd，1H)；4.32(s，1H)；4.24-4.19(m，3H)；3.84(s，3H)；3.45-3.41(m，2H)；3.18-2.79(m，4H)；2.73-2.47(m，3H)；2.33(s，3H)；2.31-2.26(m，1H)；2.24(s，3H)；2.21(s，3H)；2.06(s，3H)；2.03(d，1H).
ESI-MS m/z：计算值C44H45N5O8S：803.3实测值(M+H+)：804.3
化合物25：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.39(d，1H)；7.25-7.23(m，1H)；7.09-6.98(m，3H)；6.80(s，1H)；6.14-6.00(m，1H)；6.10(d，1H)；6.02(d，1H)；5.60-5.40(m，1H)；5.45(dd，1H)；5.25(dd，1H)；5.02-4.95(m，2H)；4.81(dd，1H)；4.73-4.62(m，1H)；4.55(s，1H)；4.37-4.16(m，6H)；3.84(s，3H)；3.51(d，1H)；3.45-3.38(m，2H)；3.05-2.89(m，3H)；2.70-2.50(m，3H)；2.33-2.16(m，2H)；2.31(s，3H)；2.23(s，·3H)；2.21(s，3H)；2.03(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C47H49N5O8S：843.3实测值(M+H+)：844.2
方法4：
化合物26：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.70(s，1H)；7.38(d，1H)；7.24(d，1H)；7.08(t，1H)；7.00(t，1H)；6.67(s，1H)；6.20(d，1H)；5.99(d，1H)；5.74(s，1H)；5.20(d，1H)；4.82(s，1H)；4.347-4.38(m，3H)；4.16-4.10(m，2H)；3.81(s，3H)；3.49(d，1H)；3.22-3.13(m，2H)；3.00(d，1H)；2.88-2.79(m，2H)；2.71-2.52(m，3H)；2.37(s，3H)；2.28-2.24(m，1H)；2.25(s，3H)；2.19(s，3H)；2.05(s，3H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ171.4，168.7，147.8，145.4，142.8，141.0，140.6，135.4，131.2，130.9，129.0，126.8，121.8，121.3，120.9，119.1，118.3，118.1，115.5，112.8，110.8，110.1，101.7，81.9，62.3，61.8，60.2，57.6，57.4，55.8，54.9，42.1，41.2，39.7，39.2，31.5，23.5，22.6，21.5，20.5，15.8，14.0，9.6.
ESI-MS m/z：计算值C40H42N4O9S：754.3实测值(M-H2O+H+)：737.2.
化合物27：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.59(s，1H)；7.13(d，1H)；6.81(s，1H)；6.73(dd，1H)；6.67(s，1H)；6.19(d，1H)；5.99(d，1H)；5.74(s，1H)；5.19(d，1H)；4.82(s，1H)；4.49-4.47(m，2H)；4.16-4.09(m，2H)；3.81(s，3H)；3.79(s，3H)；3.50-3.45(m，2H)；3.24-3.13(m，2H)；3.02(d，1H)；2.88-2.79(m，2H)；2.67-2.48(m，3H)；2.37(s，3H)；2.30-2.24(m，1H)；2.25(s，3H)；2.19(s，3H)；2.04(s，3H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ171.6，154.0，148.1，145.6，143.1，141.3，140.9，131.9，131.4，130.8，129.3，127.4，121.5，121.2，115.7，113.1，112.1，111.8，110.1，102.0，100.6，82.1，62.6，62.0，60.5，57.9，57.6，56.1，56.0，55.2，42.4，41.5，40.0，39.4，31.8，29.9，23.8，22.8，21.8，20.8，16.0，14.6，9.9.
ESI-MS m/z：计算值C40H42N4O9S：784.4实测值(M-H2O+H+)：767.2.
化合物28：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.81(s，1H)；7.43-7.36(m，5H)；7.01(d，1H)；6.91(t，1H)；6.66(s，1H)；6.63(d，1H)；5.84(s，1H)；5.75(s，1H)；5.60(s，1H)；5.20-5.09(m，3H)；4.78(s，1H)；4.49(d，1H)；4.44(s，1H)；4.16(s，1H)；4.14-4.12(m，1H)；3.81(s，3H)；3.52(d，1H)；3.47(s，2H)；3.22-2.80(m，5H)；2.68-2.51(m，2H)；2.36(s，3H)；2.39-2.21(m，1H)；2.27(s，3H)；2.18(s，3H)；2.02(s，3H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ171.4，148.0，145.6，145.2，143.1，141.1，140.8，137.3，131.6，130.7，129.3，128.8，128.5，128.2，128.0，126.2，121.4，121.3，119.8，118.1，115.5，113.0，111.8，111.0，103.8，101.8，82.1，70.6，62.9，61.9，60.5，58.0，57.7，56.1，55.1，42.3，41.5，40.0，39.5，29.9，23.9，22.0，20.7，16.0，9.8.
ESI-MS m/z：计算值C47H48N4O10S：860.3实测值(M-H2O+H+)：843.3
化合物29：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.59(s，1H)；7.44-7.25(m，5H)；7.13(d，1H)；6.91(s，1H)；6.82(d，1H)；6.66(s，1H)；6.19(s，1H)；5.98(s，1H)；5.75(s，1H)；5.19(d，1H)；5.03(s，2H)；4.82(s，1H)；4.49-4.47(m，2H)；4.17-4.09(m，2H)；3.81(s，3H)；3.49-3.47(m，2H)；3.24-2.80(m，5H)；2.64-2.50(m，3H)；2.37(s，3H)；2.25(s，3H)；2.19(s，3H)；2.05(s，3H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ171.4，168.6，153.2，148.1，145.7，143.1，141.3，140.9，137.9，131.0，129.7，128.6，127.9，127.8，127.4，121.2，115.7，112.8，111.8，110.2，102.3，102.0，82.1，71.1，62.5，62.0，60.5，58.0，57.6，56.1，55.2，42.4，41.5，40.0，39.4，32.1，29.9，29.5，23.8，22.9，21.8，20.8，16.0，14.6，9.9.
ESI-MS m/z：计算值C47H48N4O10S：860.3实测值(M-H2O+H+)：843.3
化合物30：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.61(s，1H)；7.16-7.11(m，2H)；6.91(d，1H)；6.67(s，1H)；6.20(d，1H)；5.99(d，1H)；5.75(s，1H)；5.20(d，1H)；4.82(s，1H)；4.49(d，1H)；4.35(s，1H)；4.16(d，2H)；4.11(dd，1H)；3.81(s，3H)；3.48(s，1H)；3.23-2.79(m，5H)；2.67-2.47(m，3H)；2.37(s，6H)；2.25(s，3H)；2.19(s，3H)；2.05(s，3H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ174.5，171.6，168.9，148.1，145.6，143.1，141.3，140.9，134.0，131.2，128.6，127.3，123.6，121.5，121.2，118.3，115.7，109.9，102.0，82.1，62.6，62.0，60.5，57.9，57.7，56.1，56.2，42.4，41.5，40.0，39.4，29.9，23.8，21.7，21.6，20.8，16.0，9.9.
ESI-MS m/z：计算值C41H44N4O9S：768.3实测值(M-H2O+H+)：751.3.
化合物31：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.60(s，1H)；7.00(d，1H)；6.69(d，1H)；6.66(s，1H)；6.69(dd，1H)；6.16(s，1H)；5.96(s，1H)；5.78(s，1H)；5.19(d，1H)；4.82(s，1H)；4.49(d，1H)；4.46(s，1H)；4.17(d，1H)；4.10(d，1H)；3.81(s，3H)；3.72-3.59(m，2H)；3.64(d，2H)；3.50(d，1H)；3.23-2.76(m，4H)；2.55-2.29(m，3H)；2.37(s，3H)；2.25(s，3H)；2.19(s，3H)；2.03(s，3H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ171.3，166.9，149.2，147.9，145.4，142.9，141.0，140.7，131.2，130.7，127.5，121.2，120.9，115.5，111.5，103.1，101.8，81.9，62.3，61.8，60.3，57.7，57.4，55.8，54.9，42.1，41.2，39.6，39.1，29.6，23.5，22.6，21.4，20.5，15.8，14.1，9.6.
ESI-MS m/z：计算值C40H42N4O10S：770.3实测值(M-H2O+H+)：753.3.
化合物32：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.72(s，1H)；7.27(dd，1H)；6.94(dd，1H)；6.76(ddd，1H)；6.66(s，1H)；6.20(s，1H)；5.99(s，1H)；5.75(s，1H)；5.19(d，1H)；4.83(s，1H)；4.49(d，1H)；4.16-4.09(m，2H)；3.81(s，3H)；3.50-3.48(m，1H)；3.48(s，1H)；3.22-2.79(m，5H)；2.65-2.51(m，3H)；2.37(s，3H)；2.25(s，3H)；2.19(s，3H)；2.05(s，3H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ171.5，169.0，148.1，145.7，143.1，141.3，140.9，131.5，129.3，123.7，121.5，121.1，119.3，119.1，118.3，115.7，110.4，108.2，107.8，102.0，97.8，97.5，82.1，62.4，62.1，60.5，57.9，57.6，56.1，55.1，42.4，41.5，39.9，39.4，29.9，23.8，21.7，20.8，16.0，9.9.
ESI-MS m/z：计算值C40H41FN4O9S：772.3实测值(M-H2O+H+)：755.3.
化合物33：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ6.85(d，1H)；6.80(s，1H)；6.71-6.64(m，2H)；6.48(s，1H)；6.18(s，1H)；6.02(s，1H)；5.74(s，1H)；5.03(d，1H)；4.88(d，1H)；4.39(d，1H)；4.36(s，1H)；4.16(d，1H)；3.98(ddm 1H)；3.80(s，3H)；3.71(d，1H)；3.48(s，1H)；3.22(d，1H)；2.93-2.83(m，2H)；2.73-2.39(m，4H)；2.29(s，3H)；2.28-2.05(m，1H)；2.26(s，3H)；2.22(s，3H)；2.18(s，3H)；2.03(s，3H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ168.9，149.3，147.6，145.5，142.7，141.6，140.7，131.3，131.1，129.3，126.9，121.2，115.7，111.9，111.0，110.7，103.1，102.0，83.4，69.8，63.7，60.2，58.5，57.7，55.1，54.7，59.5，43.1，41.4，40.6，35.0，29.6，24.6，22.6，21.1，20.2，15.5，9.7.
ESI-MS m/z：计算值C41H44N4O10S：784.3实测值(M-H2O+H+)：767.3.
化合物34：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.58(s，1H)；7.23(d，1H)；6.76(d，1H)；6.67(dd，1H)；6.66(s，1H)；6.19(d，1H)；5.98(d，1H)；5.74(s，1H)；5.20(d，1H)；4.82(s，1H)；4.49(d，1H)；4.47(s，1H)；4.16(d，1H)；4.10(dd，1H)；3.81(s，3H)；3.78(s，3H)；3.51-3.47(m，1H)；3.22-2.80(m，5H)；2.65-2.50(m，3H)；2.36(s，3H)；2.25(s，3H)；2.19(s，3H)；2.05(s，3H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ171.7，168.9，156.5，148.1，145.6，143.1，141.3，140.9，136.5，131.5，129.8，129.3，121.6，121.5，121.2，119.2，115.8，113.1，110.3，109.3，102.2，94.9，82.2，62.5，62.0，60.5，57.9，57.7，56.1，55.8，55.2，42.3，41.5，40.0，39.5，29.9，23.8，21.8，20.8，16.0，9.9.
ESI-MS m/z：计算值C41H44N4O10S：784.3实测值(M-H2O+H+)：767.3.
化合物35：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.73(s，1H)；7.15(dd，1H)；7.00(dd，1H)；6.81(ddd，1H)；6.67(s，1H)；6.20(d，1H)；5.99(d，1H)；5.76(s，1H)；5.19(d，1H)；4.83(s，1H)；4.49(d，2H)；4.17(d，1H)；4.12(dd，1H)；3.81(s，3H)；3.65-3.64(m，1H)；3.50(d，1H)；3.24-2.12(m，2H)；3.00(d，1H)；2.89-2.80(m，2H)；2.66-2.45(m，3H)；2.37(s，3H)；2.25(s，3H)；2.20(s，3H)；2.05(s，3H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ171.4，169.0，159.4，156.3，148.1，145.7，143.1，141.3，140.9，138.0，132.2，129.4，127.4，127.3，121.4，121.4，121.2，118.2，115.7，113.1，111.8，111.7，110.4，110.1，103.7，103.4，102.0，82.1，62.5，62.1，60.5，57.9，57.6，56.1，55.1，42.3，41.4，39.9，39.4，29.9，23.8，21.7，20.8，16.0，9.9.
ESI-MS m/z：计算值C40H41FN4O9S：772.2实测值(M-H2O+H+)：755.2.
化合物36：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.47(s，1H)；7.22(d，1H)；6.95-6.87(m，2H)；6.66(s，1H)；6.13(d，1H)；6.01(d，1H)；5.76(s，1H)；5.20(d，1H)；4.84(s，1H)；4.49(d，1H)；4.46(s，1H)；4.18-4.14(m，2H)；3.81(s，3H)；3.54(d，1H)；3.48(s，1H)；3.22(d，1H)；3.20-2.80(m，4H)；2.70-2.42(m，3H)；2.36(s，6H)；2.27(s，3H)；2.18(s，3H)；2.05(s，3H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ171.3，169.0，148.0，145.6，143.1，141.4，140.9，135.3，131.5，131.1，130.7，129.4，126.6，122.8，121.8，121.3，119.9，119.6，118.1，116.3，115.8，102.0，82.1，62.1，60.5，58.0，57.8，56.1，55.1，42.4，41.5，40.1，39.6，29.9，23.9，21.9，20.7，16.6，16.0，9.9.
ESI-MS m/z：计算值C41H44N4O9S：768.2实测值(M-H2O+H+)：751.2.
化合物37(第一种异构体)：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.70(s，1H)；7.06(d，1H)；6.67-6.61(m，3H)；6.20(d，1H)；5.98(d，1H)；5.70(s，1H)；5.20(d，1H)；4.86(s，1H)；4.53(d，1H)；4.48(s，1H)；4.18(s，1H)；3.80(s，3H)；3.72-3.54(m，4H)；3.24-3.22(m，1H)；3.01-2.56(m，5H)；2.31(s，3H)；2.27(s，3H)；2.15(s，3H)；2.02(s.3H)；1.10(d，3H).
ESI-MS m/z：计算值C41H44N4O10S：784.3实测值(M-H2O+H+)：767.3.
化合物38(第二种异构体)：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.51(s，1H)；7.10(d，1H)；6.75(d，1H)；6.64(dd，1H)；6.59(s，1H)；6.19(d，1H)；5.97(d，1H)；5.71(s，1H)；5.15(d，1H)；4.84(s，1H)；4.53-4.50(m，2H)；4.16(s，1H)；4.04(dd，1H)；3.80(s，3H)；3.65-3.63(m，1H)；3.51-3.49(m，1H)；3.40-2.36(m，1H)；3.24-3.21(m，1H)；3.03-2.84(m，2H)；2.50-2.41(m，2H)；2.32(s，3H)；2.23(s，3H)；2.16(s，3H)；2.06(s，3H)；1.20(d，3H).
ESI-MS m/z：计算值C41H44N4O10S：784.3实测值(M-H2O+H+)：767.3.
化合物39(第一种异构体)：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.09(s，1H)；7.41(d，1H)；7.17(t，1H)；7.03(t，1H)；6.87(d，1H)；6.83(s，1H)；6.13(d，1H)；5.98(d，1H)；5.69(s，1H)；5.02(d，1H)；4.88(s，1H)；4.55-4.16(m，4H)；3.64-3.56(m，1H)；3.61(s，3H)；3.31-3.29(m，1H)；3.22-2.80(m，3H)；2.68-2.46(m，3H)；2.41(s，3H)；2.27(s，3H)；2.20(s，3H)；2.07(s，3H)；1.99(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C41H44N4O9S：768.2实测值(M-H2O+H+)：751.2.
化合物40(第二种异构体)：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.36(d，1H)；7.12-7.05(m，2H)；7.00(ddd，1H)；6.92(s，1H)；6.48(s，1H)；6.20(d，1H)；6.06(d，1H)；5.70(s，1H)；5.04(d，1H)；4.88(s，1H)；4.39-4.36(m，1H)；4.15(d，1H)；3.98(dd，1H)；3.80(s，3H)；3.72-3.64(m，2H)；3.21(d，1H)；2.95-2.84(m，2H)；2.73-2.55(m，4H)；2.29(s，3H)；2.26(s，3H)；2.23(s，3H)；2.18(s，3H)；2.03(s，3H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ169.1，167.5，147.9，145.7，142.9，141.9，140.9，136.0，131.6，129.4，126.5，122.5，122.1，121.5，119.5，118.7，116.0，111.5，110.6，102.2，83.7，63.9，60.4，58.8，57.9，55.4，54.9，49.7，43.4，41.7，40.8，32.1，29.5，24.9，22.9，21.5，20.5，15.8，14.3，9.9.
ESI-MS m/z：计算值C41H44N4O9S：768.2实测值(M-H2O+H+)：751.2.
化合物41(第一种异构体)：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.84(s，1H)；7.13(dd，1H)；6.96(dd，1H)；6.81(ddd，1H)；6.62(s，1H)；6.20(d，1H)；5.99(d，1H)；5.70(s，1H)；5.19(d，1H)；4.86(s，1H)；4.52(d，1H)；4.50(s，1H)；4.16(d，1H)；3.80(s，3H)；3.53(d，1H)；3.49-3.48(m，1H)；3.23(d，1H)；3.00-2.71(m，3H)；2.62-2.41(m，2H)；2.31(s，3H)；2.27(s，3H)；2.14(s，3H)；2.02(s，3H)；1.13(d，3H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ170.5，168.9，159.4，156.2，147.6，145.8，143.0，141.2，133.2，132.2，131.7，131.1，129.2，129.0，127.3，121.7，115.6，111.7，111.6，110.3，109.9，103.7，103.4，102.0，81.8，64.0，62.0，60.5，58.0，56.1，55.3，44.0，42.4，41.5，38.1，32.1，29.5，24.0，22.9，21.7，20.7，16.2，14.3，9.9.
ESI-MS m/z：计算值C41H43FN4O9S：786.2实测值(M-H2O+H+)：769.3.
化合物42(第二种异构体)：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.62(s，1H)；7.18(dd，1H)；6.99(dd，1H)；6.82(ddd，1H)；6.59(s，1H)；6.20(d，1H)；5.98(d，1H)；5.71(s，1H)；5.15(d，1H)；4.85(s，1H)；4.52(s，1H)；4.50(d，1H)；4.16(d，1H)；4.05(dd，1H)；3.80(s，3H)；3.50-3.48(m，1H)；3.42-3.36(m，1H)；3.23(d，1H)；3.00-2.81(m，2H)；2.50(dd，1H)；2.44(d，1H)；2.32(s，3H)；2.24(s，3H)；2.16(s，3H)；2.07(s，3H)；1.23(d，3H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ171.9，168.7，156.2，147.8，145.6，143.3，141.8，140.9，132.7，131.4，131.1，129.4，129.0，121.8，121.4，115.8，113.1，111.9，111.8，110.4，110.0，103.7，103.4，102.0，81.9，63.4，61.8，60.6，58.0，56.2，55.2，46.6，42.3，41.5，41.0，32.1，29.5，23.9，22.9，21.9，20.7，16.1，14.3，9.9.
ESI-MS m/z：计算值C41H43FN4O9S：786.2实测值(M-H2O+H+)：769.3.
化合物43(第一种异构体)：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.85(s，1H)；7.33(d，1H)；7.23(d，1H)；7.07(t，1H)；6.99(t，1H)；6.63(s，1H)；6.22(d，1H)；6.00(d，1H)；5.70(s，1H)；5.20(d，1H)；4.86(s，1H)；4.52(d，1H)；4.48(s，1H)；4.16(d，1H)；3.80(s，3H)；3.53(d，1H)；3.22(d，1H)；3.01-2.73(m，3H)；2.62-2.48(m，2H)；2.39-2.17(m，1H)；2.31(s，3H)；2.27(s，3H)；2.14(s，3H)；2.02(s，3H)；1.14(d，3H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ170.6，168.8，147.6，145.7，143.0，141.2，135.7，131.8，131.3，129.2，127.0，122.0，121.8，121.7，119.3，118.5，115.6，111.0，110.2，102.0，81.8，64.0，61.9，60.5，58.1，58.0，56.1，55.3，44.0，42.4，41.5，38.1，32.1，29.5，24.0，22.9，21.8，20.7，16.2，14.3，9.9.
ESI-MS m/z：计算值C41H44N4O9S：768.2实测值(M-H2O+H+)：751.3.
化合物44(第二种异构体)：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.62(s，1H)；7.36(d，1H)；7.27(d，1H)；7.09(t，1H)；7.00(t，1H)；6.59(s，1H)；6.21(d，1H)；5.98(d，1H)；5.71(s，1H)；5.15(d，1H)；4.84(s，1H)；4.51(d，2H)；4.17-4.16(m，1H)；4.05(dd，1H)；3.80(s，3H)；3.49-3.48(m，1H)；3.42-3.38(m，1H)；3.24-3.22(m，1H)；3.03-2.81(m，2H)；2.57(dd，1H)；2.46(d，1H)；2.32(s，3H)；2.24(s，3H)；2.17-2.12(m，1H)；2.16(s，3H)；2.07(s，3H)；1.23(d，3H).
ESI-MS m/z：计算值C41H44N4O9S：768.2实测值(M-H2O+H+)：751.3.
化合物45：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.69(s，1H)；7.38(d，1H)；7.24(d，1H)；7.09(ddd，1H)；7.03(s，1H)；7.00(ddd，1H)；6.22(d，1H)；6.00(d，1H)；5.20(d，1H)；4.83(s，1H)；4.50(s，1H)；4.38(s，1H)；4.33(s，1H)；4.12(dd，1H)；3.77(s，3H)；3.68-3.66(m，1H)；3.51-3.49(m，1H)；3.24-2.85(m，4H)；2.70-2.49(m，2H)；2.62(t，2H)；2.37(s，3H)；2.28(s，3H)；2.15(s，3H)；2.06(s，3H)；1.94-1.83(m，2H)；1.10(t，3H).
ESI-MS m/z：计算值C44H48N4O10S：824.3实测值(M-H2O+H+)：807.2.
化合物46：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ.67(s，1H)；7.38(d，1H)；7.24(d，1H)；7.09(ddd，1H)；7.00(ddd，1H)；7.00(s，1H)；6.21(d，1H)；6.00(d，1H)；5.20(d，1H)；4.83(s，1H)；4.51(d，1H)；4.39(s，1H)；4.15(d，1H)；3.81(s，3H)；3.52(d，1H)；3.26(d，1H)；3.19-3.11(m，1H)；3.06-2.81(m，3H)；2.72-2.44(m，3H)；2.36(s，3H)；2.31(s，3H)；2.17(s，3H)；2.03(s，3H)；1.54(s，9H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ171.5，169.2，151.4，148.2，145.7，144.4，141.3，140.9，135.7，131.4，131.1，130.9，127.4，127.1，124.4，122.1，121.5，119.4，118.7，115.6，111.1，102.0，83.3，81.8，62.8，61.9，60.2，57.8，56.3，56.1，42.3，41.5，39.8，39.4，29.9，27.8，23.6，21.7，20.5，16.0，14.3，9.9.
ESI-MS m/z：计算值C45H50N4O11S：854.3实测值(M-H2O+H+)：837.2.
化合物47：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.68(s，1H)；7.38(d，1H)；7.24(d，1H)；7.19(dd，1H)；7.10(ddd，1H)；7.06(s，1H)；7.00(ddd，1H)；6.21(d，1H)；6.01(d，1H)；5.20(d，1H)；5.00(dd，1H)；4.83(s，1H)；4.70(dd，1H)；4.51(s，1H)；4.40(d，1H)；4.15(dd，1H)；3.83(dd，1H)；3.82(s，3H)；3.53(d，1H)；3.28-3.03(m，3H)；2.94-2.83(m，2H)；2.72-2.46(m，3H)；2.38(s，3H)；2.33(s，3H)；2.17(s，3H)；2.07(s，3H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ171.5，169.0，150.8，148.0，145.8，144.0，143.1，141.3，140.9，135.7，130.8，128.2，127.1，122.2，120.0，119.5，118.7，115.5，113.3，111.1，110.5，102.1，98.7，81.9，62.8，62.0，60.5，57.7，56.2，56.0，42.3，41.8，39.9，39.5，32.1，29.5，23.7，21.8，20.5，16.0，14.3，9.9.
ESI-MS m/z：计算值C43H44N4O11S：824.2实测值(M-H2O+H+)：807.2.
化合物48：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.70(s，1H)；7.37(d，1H)；7.24(d，1H)；7.08(ddd，1H)；7.00(ddd，1H)；6.87(s，1H)；6.20(d，1H)；6.17-6.05(m，1H)；5.99(d，1H)；5.47(dd，1H)；5.25(dd，1H)；5.21(d，1H)；4.82(s，1H)；4.81(dd，1H)；4.50(d，1H)；4.44(s，1H)；4.36(dd，1H)；4.13(dd，1H)；4.11(s，1H)；3.84(s，3H)；3.51(d，1H)；3.24-3.00(m，3H)；2.89-2.80(m，2H)；2.73-2.48(m，3H)；2.33(s，3H)；2.31-2.26(m，1H)；2.23(s，3H)；2.19(s，3H)；2.05(s，3H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ 171.3，168.6，150.5，148.6，145.3，140.9，140.6，135.5，134.6，131.0，130.7，126.7，124.7，121.7，121.3，119.0，118.3，116.2，118.4，110.8，109.9，101.7，81.6，72.6，62.4，61.6，59.3，57.6，57.5，55.9，55.1，42.0，41.3，39.4，39.0，29.2，23.5，22.5，21.4，20.3，15.7，14.0，9.
ESI-MS m/z：计算值C43H46N4O9S：794.3实测值(M-H2O+H+)：777.2.
化合物49：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.60(s，1H)；7.42-7.39(m，2H)；7.09-7.00(m，2H)；6.81(s，1H)；6.16-6.04(m，2H)；6.07(s，1H)；5.99(s，1H)；5.52-5.43(m，2H)；5.24(d，1H)；5.11(d，1H)；4.96(d，1H)；4.80-4.32(m，6H)；4.13-4.10(m，2H)；3.81(s，3H)；3.58-3.56(m，1H)；3.46-3.40(m，1H)；3.24-3.20(m，1H)；2.99-2.87(m，2H)；2.67-2.53(m，2H)；2.31(s，3H)；2.23(s，3H)；2.19(s，3H)；2.02(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C46H50N4O9S：834.3实测值(M-H2O+H+)：817.2.
流程2
ET-736-CN的THF/H2O 3∶1(0.027M)溶液中加入15当量KOH。在室温下搅拌反应混合物5h。此后，反应物用氯化钠的饱和水溶液猝灭，用二氯甲烷萃取。有机层用硫酸钠干燥。色谱法处理获得纯净化合物50。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.59 (s，1H)；7.40(d，1H)；7.25(d，1H)；7.11(ddd，1H)；7.02(ddd，1H)；6.67(s，1H)；6.16(d，1H)；5.93(d，1H)；5.90(s，1H)；5.62(s，1H)；5.06(d，1H)；4.46(d，1H)；4.36(s，1H)；4.31(dd，1H)；4.19(d，1H)；4.12(dd，1H)；3.82(s，3H)；3.55(d，1H)；3.42(d，1H)；3.20-2.80(m，4H)；2.69-2.53(m，3H)；2.38(s，3H)；2.21(s，3H)；2.18(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C39H39N5O7S：721.3实测值(M+H+)：722.2.
Et-694的衍生物：
方法5：在氩气氛、室温下，1当量ET-694-CN、化合物50的二氯甲烷(0.032M)溶液中加入2当量吡啶和2当量酰基氯、氯甲酸酯或酸酐。TLC监测反应，用饱和碳酸氢钠水溶液猝灭，用二氯甲烷萃取，有机层用硫酸钠干燥。快速色谱法处理获得纯净化合物。
化合物51：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.65(s，1H)；7.40(d，1H)；7.26(d，1H)；7.12(s，1H)；7.11(ddd，1H)；7.04(ddd，1H)；6.30(d，1H)；6.19(d，1H)；5.10(d，1H)；4.40-4.30(m，2H)；4.23-4.16(m，1H)；3.76(s，3H)；3.50-3.44(m，2H)；3.19-3.13(m，2H)；3.03-2.83(m，2H)；2.66-2.47(m，3H)；2.40(s，3H)；3.36-2.22(m，2H)；2.16(s，3H)；2.07(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C43H38F7N5O8S：917.2实测值(M+H+)：918.1.
化合物52：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.72(d，1H)，7.38(d，1H)，7.26(d，1H)，7.10(t，1H).7.00(t，1H)，6.65(s，1H)，6.24(d，1H)，6.02(d，1H)，5.74(s，1H)，5.08(d，1H)，4.54(broad s，1H)，4.33(s，1H)，4.27(d，1H)，4.21(s，1H)，4.20(d，1H)，3.80(s，3H)，3.43(m，2H)，3.20-2.81(m，4H)，2.64-2.58(m，3H)，2.53(t，2H)，2.37(s，3H)，2.26(m，1H)，2.21(s，3H)，2.05(s，3H)，1.74(sext，2H)，1.01(t，3H).
ESI-MS m/z：计算值C43H45N5O8S：791.3实测值(M+H+)：792.2.
化合物53：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.71(s，1H)，7.39(d，1H)，7.26(d，1H)，7.11(t，1H)，7.02(t，1H)，6.66(s，1H)，6.26(s，1H)，6.04(s，1H)，5.80(s，1H)，5.09(d，1H)，4.52(broad s，1H)，4.34(s，1H)，4.27(d，1H)，4.22(d，1H)，4.20(m，1H)，3.82(s，3H)，3.79(m，2H)，3.42(m，2H)，3.16(m，1H)，3.07-2.81(m，5H)，2.64-2.50(m，3H)，2.37(s，3H)，2.25(m，1H)，2.21(s，3H)，2.08(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C42H42ClN5O8S：811.2实测值(M+H+)：812.2.
化合物54：此产物用4当量肉桂酰氯和4当量吡啶获得。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.83(d，1H)，7.75(s，1H)，7.58(m，2H)，7.46(m，3H)，7.39(d，1H)，7.27(d，1H)，7.11(t，1H)，7.02(t，1H)，6.61(s，1H)，6.58(d，1H)，6.26(s，1H)，6.05(s，1H)，5.52(s，1H)，5.09(d，1H)，4.60(broad s，1H)，4.37(s，1H)，4.27(d，1H)，4.25(s，1H)，4.23(m，1H)，3.47(s，3H)，3.45(m，2H)，3.15(m，1H)，3.04(d，1H)，2.96(m，1H)，2.84(m，1H)，2.70-2.53(m，3H)，2.33(m，1H)，2.29(s，3H)，2.21(s，3H)，2.12(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C48H45N5O8S：851.3实测值(M+H+)：852.2.
化合物55：此产物用6当量氯甲酸烯丙酯和6当量吡啶获得。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.74(s，1H)， 7.39(d，1H)，7.25(d，1H)，7.10(t，1H)，7.01(t，1H)，6.65(s，1H)，6.25(s，1H)，6.03(s，1H)，5.90(ddd，1H)，5.78(s，1H)，5.37(d，1H)，5.24(d，1H)，5.08(d，1H)，4.61(m，3H)，4.32(s，1H)，4.28(d，1H)，4.22(s，1H)，4.20(d，1H)，3.80(s，3H)，3.42(m，2H)，3.18(m，1H)，3.09-2.81(m，3H)，2.59(m，3H)，2.37(s，3H)，2.26(m，1H)，2.21(s，3H)，2.12(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C43H43N5O9S：805.3实测值(M+H+)：806.3
化合物56：此产物用3当量三氟醋酸酐和3当量吡啶获得。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.66(s，1H)，7.40(d，1H)，7.26(d，1H)，7.11(t，1H)，7.02(t，1H)，6.65(s，1H)，6.31(d，1H)，6.08(d，1H)，5.74(s，1H)，5.11(d，1H)，4.55(s，1H)，4.36(s，1H)，4.28(d，1H)，4.25(s，1H)，4.23(d，1H)，3.79(s，3H)，3.46(m，2H)，3.15(m，1H)，3.09-2.46(m，6H)，2.36(s，3H)，2.23(s，3H)，2.20(m，1H)，2.01(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C41H38F3N5O8S：817.2实测值(M+H+)：818.2
化合物57：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.74(s，1H)，7.40(d，1H)，7.27(d，1H)，7.11(t，1H)，7.02(t，1H)，6.65(s，1H)，6.23(s，1H)，6.02(s，1H)，5.74(s，1H)，5.09(d，1H)，4.66(s，1H)，4.32-4.21(m，4H)，3.81(s，3H)，3.40(m，2H)，3.21-2.86(m，3H)，2.80(m，1H)，2.64(m，3H)，2.37(s，3H)，2.29(m，1H)，2.21(s，3H)，2.11(s，3H)，1.45(s，9H).
ESI-MS m/z：计算值C44H47N5O9S：821.3实测值(M+H+)：822.0.
化合物58：1H-NMR(300MHz， CDCl3)：δ7.72(s，1H)，7.39(d，1H)，7.26(d，1H)；7.11(t，1H)，7.02(t，1H)，6.99(s，1H)，6.24(s，1H)，6.03(s，1H)，5.09(d，1H)，4.61(s，1H)，4.30(s，1H)，4.20(m，2H)，3.98(s，1H)，3.83(s，3H)，3.45(m，2H)，3.21-2.90(m，3H)，2.80(m，1H)，2.59(s，3H)，2.36(s，3H)，2.31(m，1H)，2.20(s，3H)，2.12(s，3H)，1.54(s，9H)，1.45(s，9H).
ESI-MS m/z：计算值C49H55N5O11S：921.4实测值(M+H+)：922.3.
C-5的单Boc衍生物用6当量Boc酸酐和6当量吡啶获得。在这些条件下，将痕量C-5和C-18的diBoc衍生物分离为第二种产物。当反应中用TEA作为碱时，后一化合物可以作为主要产物获得。
化合物59：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.71(s，1H)，7.39(d，1H)，7.26(d，1H)，7.10(t，1H)，7.04(t，1H)，6.95(dd，1H)，6.65(s，1H)，6.26(s，1H)，6.04(s，1H)，5.78(s，1H)，5.09(d，1H)，4.99(dd，1H)，4.63(s，1H)，4.60(dd，1H)，4.33(s，1H)，4.29(d，1H)，4.22(s，1H)，4.21(d，1H)，3.78(s，3H)，3.42(m，2H)，3.21-2.79(m，4H)，2.63(m，3H)，2.37(s，3H)，2.27(m，1H)，2.22(s，3H)，2.13(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C42H41N5O9S：791.3实测值(M+H+)：792.1
化合物60：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.70(s，1H)，7.40(d，1H)，7.26(d，1H)，7.18(dd，1H)，7.11(t，1H)，7.05(s，1H)，7.02(t，1H)，6.97(dd，1H)，6.27(s，1H)，6.05(s，1H)，5.10(d，1H)，5.09-5.00(m，1H)，5.05(s，1H)，4.72(dd，1H)，4.60(dd，1H)，4.56(s，1H)，4.33(s，1H)，4.22(m，2H)，3.97(d，1H)，3.78(s，3H)，3.46(m，2H)，3.18(m，1H)，3.11(d，1H)，2.97(dd，1H)，2.85(m，1H)，2.71-2.51(m，3H)，2.37(s，3H)，2.32(m，1H)，2.21(s，3H)，2.16(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C45H43N5O11S：861.3实测值(M+H+)：862.7.
方法6：在氩气氛、室温下，1当量ET-694-CN、化合物50的二氯甲烷(0.032M)溶液中加入2当量酸、2当量EDC.HCl和2当量DMAP。TLC监测反应，用饱和碳酸氢钠水溶液猝灭，用二氯甲烷萃取，有机层用硫酸钠干燥。快速色谱法处理获得纯净化合物。
化合物61：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.70(s，1H)，7.39(d，1H)，7.26(d，1H)，7.11(t，1H)，7.00(t，1H)，6.65(s，1H)，6.23(s，1H)，6.03(s，1H)，5.72(s，1H)，5.09(d，1H)，4.57(broad s，1H)，4.33(s，1H)，4.26(d，1H)，4.21(s，1H)，4.19(d，1H)，3.80(s，3H)，3.44(m，2H)，3.16(m，1H)，3.03(d，1H)，3.00-2.89(m，2H)，2.68-2.52(m，3H)，2.54(t，2H)，2.37(s，3H)，2.31(m，1H)，2.21(s，3H)，2.04(s，3H)，1.65(m，2H)，1.29(m，8H)，0.87(m，3H).
ESI-MS m/z：计算值C47H53N5O8S：847.4实测值(M+H+)：848.3.
方法4.-1当量初始原料的CH3CN/H2O 3∶2(0.009M)溶液中加入30当量AgNO3。在24h后，反应物用1∶1盐水和碳酸氢钠的饱和溶液混合物猝灭，搅拌10min，用二氯甲烷稀释、萃取。有机层用硫酸钠干燥。色谱法处理获得纯净化合物。
化合物62：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.65(s，1H)；7.40(d，1H)；7.25(d，1H)；7.10(ddd，1H)；7.01(ddd，1H)；6.66(s，1H)；6.27(d，1H)；6.04(d，1H)；5.69(s，1H)；5.23(d，1H)；4.85(s，1H)；4.51(d，1H)；4.47(s，1H)；4.19(s，1H)；4.15(dd，1H)；3.78(s，3H)；3.52-3.50(m，1H)；3.26-3.14(m，2H)；3.04-2.80(m，3H)；2.72-2.47(m，3H)；2.36(s，3H)；2.20(s，3H)；2.05(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C42H39F7N4O9S：908.3实测值(M+H+)：909.2.
化合物63：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.71(d，1H)，7.38(d，1H)，7.26(d，1H)，7.09(t，1H)，7.03(t，1H)，6.67(s，1H)，6.21(d，1H)，5.99(d，1H)，5.71(broad s，1H)，5.18(d，1H)，4.83(s，1H)，4.50(d，1H)，4.46(broad s，1H)，4.17(d，1H)，4.12(d，1H)，3.81(s，3H)，3.51 (d，1H)，3.24-3.18(m，2H)，3.00(d，1H)，2.85(m，2H)，2.70-2.50(m，5H)，2.37(s，3H)，2.27(m，1H)，2.19(s，3H)，2.04(s，3H)，1.74(sext，2H)，1.01(t，3H).
ESI-MS m/z：计算值C42H46N4O9S：782.3实测值(M+H+)：783.2.
化合物64：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.71(s，1H)，7.39(d，1H)，7.25(d，1H)，7.10(t，1H)，7.01(t，1H)，6.66(s，1H)，6.22(s，1H)，6.00(s，1H)，5.90(ddd，1H)，5.74(broad s，1H)，5.37(d，1H)，5.22(t，1H)，4.83(s，1H)，4.59(m，2H)，4.49(s，1H)，4.29(dd，1H)，4.15(m，2H)，3.80(s，3H)，3.65(m，1H)，3.51(m，2H)，3.18(m，1H)，3.09-2.81(m，3H)，2.59(m，3H)，2.37(s，3H)，2.26(m，1H)，2.21(s，3H)，2.12(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C42H44N4O10S：796.3实测值(M+H+)：797.0
化合物65：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.74(s，1H)，7.40(d，1H)，7.27(d，1H)，7.11(t，1H)，7.02(t，1H)，6.65(s，1H)，6.23(s，1H)，6.02(s，1H)，5.74(broad s，1H)，5.20(d，1H)，4.82(s，1H)，4.58(s，1H)，4.49(m，1H)，4.13(m，2H)，3.81(s，3H)，3.49(m，1H)，3.21(m，2H)，3.02(d，1H)，2.80(m，3H)，2.64(m，2H)，2.37(s，3H)，2.29(m，1H)，2.21(s，3H)，2.11(s，3H)，1.45(s，9H).
ESI-MS m/z：计算值C43H48N4O10S：812.3实测值(M+H+)：813.0.
化合物66：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.71(s，1H)，7.39(d，1H)，7.26(d，1H)；7.11(t，1H)，7.02(t，1H)，6.99(s，1H)，6.21(s，1H)，6.00(s，1H)，5.19(d，1H)，4.80(s，1H)，4.51(m，2H)，4.16(m，2H)，3.83(s，3H)，3.54(m，1H)，3.28-3.04(m，3H)，2.92-2.78(m，2H)，2.59(m，3H)，2.36(s，3H)，2.31(m，1H)，2.18(s，3H)，2.11(s，3H)，1.54(s，9H)，1.45(s，9H).
ESI-MS m/z：计算值C48H56N4O12S：912.4实测值(M+H+)：913.1.
化合物67：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.70(s，1H)，7.39(d，1H)，7.26(d，1H)，7.10(t，1H)，7.01(t，1H)，6.95(dd，1H)，6.66(s，1H)，6.24(s，1H)，6.01(s，1H)，5.75(s，1H)，5.21(d，1H)，4.99(dd，1H)，4.84(s，1H)，4.58(dd，1H)，4.55(s，1H)，4.51(s，1H)，4.20(s，1H)，4.15(d，1H)，3.78(s，3H)，3.49(m，1H)，3.21(m，2H)，3.00(d，1H)，2.86(m，2H)，2.59(m，3H)，2.37(s，3H)，2.27(m，1H)，2.20(s，3H)，2.12(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C41H42N4O10S：782.3实测值(M+H+)：783.1
化合物68：1H-NMR(300MHz，CDCl3)：7.67(s，1H)，7.39(d，1H)，7.24(d，1H)，7.17(dd，1H)，7.10(t，1H)，7.05(s，1H)，7.02(t，1H)，6.97(dd，1H)，6.24(s，1H)，6.02(s，1H)，5.21(d，1H)，5.06(dd，1H)，5.01(dd，1H)，4.83(s，1H)；4.72(dd，1H)，4.60(dd，1H)，4.51(s，1H)，4.48(s，1H)，4.15(dd，1H)，3.86(d，1H)，3.78(s，3H)，3.54(d，1H)，3.28-3.18(m，2H)，3.07(d，1H)，2.94-2.84(m，2H)，2.67-2.52(m，3H)，2.37(s，3H)，2.32(m，1H)，2.18(s，3H)，2.14(s，3H).
ESI-MS m/z：计算值C44H44N4O12S：852.3实测值(M+H+)：853.5
抗肿瘤筛选的生物测定
这些分析的最后将通过将细胞与受试化合物连续接触中断“体外”肿瘤细胞培养物的生长。
细胞系
命名 N°ATCC 物种 组织 特征
P-388 CCL-46 小鼠 腹水液体 淋巴瘤
K-562 CCL-243 人 白血病 红白血病(胸膜渗漏)
A-549 CCL-185 人 肺 肺癌“NSCL”
SK-MEL-28 HTB-72 人 黑素瘤 恶性黑素瘤
HT-29 HTB-38 人 结肠 结肠腺癌
LoVo CCL-229 人 结肠 结肠腺癌
LoVo-Dox 人 结肠 结肠腺癌(MDR)
SW620 CCL-228 人 结肠 结肠腺癌(淋巴结转移)
DU-145 HTB-81 人 前列腺 前列腺癌，
没有雄激素受体
LNCaP CRL-1740 人 前列腺 前列腺癌，有雄激素受体
SK-BR-3 HTB-30 人 乳房 乳腺癌，
Her2/neu+，(胸膜渗漏)
MCF-7 HTB-22 人 乳房 乳腺癌，(胸膜渗漏)
MDA-MB- HTB-26 人 乳房 乳腺癌，
231 Her2/neu+，(胸膜渗漏)
IGROV-1 人 卵巢 卵巢腺癌
IGROV-ET 人 卵巢 卵巢腺癌，特征为ET-743
抵抗细胞
SK-OV-3 HTB-77 人 卵巢 卵巢腺癌(恶性腹水)
OVCAR-3 HTB-161 人 卵巢 卵巢腺癌
HeLa CCL-2 人 子宫颈 子宫颈类上皮癌
HeLa-APL CCL-3 人 子宫颈 子宫颈类上皮癌，
特征为aplidine抵抗细胞
A-498 HTB-44 人 肾 肾癌
PANC-1 CRL-1469 人 胰腺 胰腺类上皮癌
HMEC1 人 内皮
比色测定细胞生长抑制作用
使用磺基碱性蕊香红B(SRB)反应的比色类型测定已经用作定量检测细胞生长和存活力[按照Philip Skehan等介绍的技术进行，(1990)，New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer drugscreening，J.Natl.Cancer Inst.，82：1107-1112]。
此检测类型使用9mm直径的96孔细胞培养微板(Faircloth，1988；Mosmann，1983)。大部分细胞系衍生自人的不同癌症类型，从American Type Culture Collection(ATCC)获得。
细胞维持在RPMI 1640 10％ FBS，其中补充0.1g/l青霉素和0.1g/l硫酸链霉素，然后在37℃、5％CO2和98％湿度下温育。对于各实验，用胰蛋白酶从已伸展但未汇合的培养物中收获细胞，在平板接种前重新悬浮于新鲜培养基中。
以5×103细胞/孔将细胞接种到96孔微滴定板的195μl等分量培养基，允许它们在没有药物的培养基中生长18小时以附着到板表面。然后，将溶于DMSO/EtOH/PBS(0.5∶0.5∶99)浓度范围为10-10-8μg/ml的5μl等分量样品加入。在接触48h后，抗癌效果用SRB法检测：加入50μl冷50％(wt/vol)三氯乙酸(TCA)固定细胞，在4℃温育60min。将板用去离子水洗涤，然后干燥。将100μl SRB溶液(0.4％wt/vol在1％乙酸中)加入各微滴定孔，在室温下温育10min。用1％乙酸洗涤除去未结合的SRB。风干板，用Tris缓冲液溶解结合染剂。在490nm一种波长用自动分光光度板阅读器读取光学密度。
计算一式三孔数据的平均+/-SD值。细胞反应的某些参数可以被计算：GI＝生长抑制作用，TGI＝总的生长抑制作用(细胞生长抑制作用)和LC＝杀死细胞作用(细胞毒素作用)。
所得结果可以预测某种药物潜在的癌症治疗作用。对于这种技术，选择GI50值小于10μg/ml的化合物用于进一步的研究。GI50数据不仅可预测某种药物是否为细胞生长抑制剂，而且可以预测它是否具有潜在减小肿瘤的作用。
活性数据(摩尔)化合物1A549IC501.31E-09HT291.31E-09化合物2化合物3化合物4化合物5化合物6化合物7A549GI506.30E-10 6.30E-09 6.30E-053.45E-07 3.45E-06 5.75E-052.30E-06 6.90E-06 1.15E-051.29E-08 1.29E-07 1.29E-055.13E-09 5.13E-08 1.28E-057.67E-07 1.28E-07 1.28E-06TGILC50HT29GI501.26E-09 1.26E-09 6.30E-052.30E-07 2.30E-07 5.75E-052.30E-06 2.30E-06 1.15E-051.29E-08 1.29E-08 5.14E-065.13E-09 5.13E-09 5.13E-066.39E-08 6.39E-08 1.28E-06TGILC50H-MEC-1GI50TGILC50化合物8化合物9化合物10化合物11化合物12化合物13A549GI502.52E-09 1.01E-08 1.26E-052.52E-08 1.01E-07 8.82E-063.91E-08 1.28E-07 1.28E-051.89E-08 5.00E-08 1.29E-077.28E-09 8.35E-08 1.26E-056.31E-09 6.79E-08 1.26E-05TGILC50HT29GI502.52E-09 2.52E-09 5.04E-063.78E-07 3.78E-07 1.26E-054.03E-08 1.28E-05 1.28E-053.09E-08 1.29E-07 1.29E-051.37E-08 1.26E-07 1.26E-053.33E-07 1.26E-06 1.26E-05TGILC50H-MEC-1GI50TGILC50化合物15化合物16化合物17化合物18化合物19化合物20A549GI504.78E-09 1.31E-08 1.27E-063.67E-08 1.28E-07 4.44E-065.39E-09 4.41E-08 6.67E-066.77E-09 1.29E-07 1.29E-053.27E-09 1.29E-08 1.29E-053.30E-07 1.20E-06 6.77E-06TGILC50HT29GI504.16E-09 1.31E-084.28E-08 1.28E-072.22E-08 1.28E-085.62E-09 1.29E-074.45E-09 1.29E-075.96E-07 1.20E-05TGILC501.31E-051.28E-051.28E-051.29E-051.29E-051.20E-05H-MEC-1GI50TGILC50化合物21化合物22化合物23化合物24化合物25化合物50A549GI507.58E-07 6.99E-06 1.16E-053.93E-08 1.20E-07 1.20E-051.18E-07 1.26E-06 1.11E-051.24E-05 1.24E-05 1.24E-051.18E-05 1.18E-05 1.18E-054.16E-07 6.93E-07 1.39E-06TGILC50HT29GI501.18E-06 1.16E-05 1.16E-051.20E-07 5.70E-06 1.20E-052.47E-07 1.11E-05 1.11E-051.24E-05 1.24E-05 1.24E-051.18E-05 1.18E-05 1.18E-056.93E-07 6.93E-07 6.93E-06TGILC50H-MEC-1GI50TGILC50化合物52化合物53化合物54化合物55化合物56化合物58A549GI504.70E-08 1.26E-07 9.43E-042.61E-07 7.84E-07 1.22E-051.10E-07 3.53E-07 1.10E-064.95E-08 3.11E-07 1.10E-059.30E-09 2.36E-07 3.79E-068.91E-08 1.34E-06 1.08E-05TGILC50HT29GI507.93E-08 1.26E-05 1.26E-053.09E-07 1.23E-06 1.23E-051.30E-07 5.41E-07 3.37E-068.20E-08 1.24E-06 1.24E-054.74E-08 1.22E-05 1.22E-052.30E-07 1.08E-05 1.08E-05TGILC50H-MEC-1GI503.47E-07 6.95E-09 1.26E-081.32E-07 1.23E-05 1.23E-055.48E-10 1.13E-09 6.68E-094.17E-09 9.65E-09 3.78E-071.02E-08 1.08E-05 1.08E-05TGILC50化合物59化合物61化合物63化合物64化合物65化合物66A549GI502.66E-09 2.26E-06 4.98E-061.18E-05 1.18E-05 1.18E-053.12E-09 9.53E-09 3.03E-061.64E-09 6.83E-09 1.10E-072.05E-09 6.30E-09 4.79E-082.09E-08 5.75E-08 3.76E-07TGILC50HT29GI503.80E-09 1.84E-08 1.26E-051.18E-05 1.18E-05 1.18E-053.88E-09 1.28E-08 1.28E-051.91E-09 1.25E-08 1.25E-058.56E-10 2.05E-08 1.23E-052.80E-08 1.13E-07 1.10E-05TGILC50H-MEC-1 GI504.00E-09 1.26E-081，1.26E-05 3.94E-07 8.05E-07 3.40E-06 2.72E-09 1.28E-0811.28E-05 3.10E-10 1.25E-08 1.25E-05 6.13E-10 4.35E-08 1.23E-05 2.07E-08 8.04E-08 1.10E-05TGILC50化合物67A549GI504.55E-10 2.86E-09 1.28E-07TGILC50HT29GI501.90E-09 1.28E-07 1.28E-05TGILC50H-MEC-1GI505.21E-10 1.28E-07 1.28E-05TGILC50化合物14化合物26化合物27化合物28化合物29化合物30A549GI502.64E-07 8.25E-07 6.86E-062.65E-09 3.97E-09 1.32E-082.55E-10 8.92E-10 6.37E-093.48E-09 4.65E-08 3.48E-082.32E-08 3.48E-08 9.29E-083.90E-11 2.60E-10 1.04E-09TGILC50HT29GI504.18E-07 1.59E-06 1.29E-053.97E-09 7.95E-09 1.32E-082.55E-10 7.64E-10 1.15E-091.16E-08 6.97E-08 1.05E-072.32E-08 6.97E-08 1.05E-071.04E-10 3.90E-10 1.04E-09TGILC50SW-620GI502.65E-09 7.95E-09 7.95E-082.55E-10 6.37E-10 1.15E-096.97E-09 2.32E-08 9.29E-082.32E-08 6.97E-08 1.05E-072.60E-11 3.90E-10 1.30E-09TGILC50MEL-28GI501.98E-07 5.19E-07 2.37E-062.65E-09 5.30E-09 1.06E-082.55E-10 6.37E-10 1.27E-092.32E-08 3.48E-08 8.13E-082.32E-08 3.48E-08 8.13E-082.60E-11 1.30E-10 6.50E-10TGILC50OVCARGI50TGILC50A498GI502.65E-09 6.62E-09 2.65E-082.55E-10 5.10E-10 1.27E-093.48E-09 1.16E-08 5.81E-083.48E-09 1.16E-08 1.16E-071.30E-10 5.20E-10 2.60E-09TGILC50DU145GI509.46E-08 1.39E-06 1.29E-052.65E-09 3.97E-09 1.06E-082.55E-11 8.92E-11 3.82E-092.32E-09 3.48E-09 9.29E-092.32E-08 3.48E-08 9.29E-081.30E-11 3.90E-11 1.30E-10TGILC50MCFGI502.65E-09 5.30E-09 1.19E-082.55E-10 1.27E-09 1.15E-085.81E-09 2.32E-08 1.16E-072.32E-08 3.48E-08 1.16E-072.60E-10 3.90E-10 2.60E-09TGILC50MB231GI502.65E-09 5.30E-092.55E-10 6.37E-093.48E-09 9.29E-092.32E-08 4.65E-082.60E-12 1.30E-10TGILC501.32E-081.27E-081.16E-071.16E-073.90E-09H-MEC-1GI50TGILC50LNCAPGI506.12E-08 1.77E-07 5.35E-07TGILC50SK-OV3GI50TGILC50IGROVGI502.26E-07 7.44E-07 5.14E-06TGILC50IGROV-ETGI505.69E-07 1.30E-06 1.29E-05TGILC50SK-BR3GI502.17E-07 5.37E-07 1.62E-06TGILC50K562GI504.47E-08 1.74E-07 1.29E-06TGILC50PANC-1GI502.76E-07 8.25E-07 1.29E-05TGILC50LOVOGI501.41E-07 3.93E-07 1.10E-06TGILC50LOVO-DOXGI505.84E-07 3.84E-06 1.29E-05TGILC50HELAGI501.14E-07 3.10E-07 8.10E-07TGILC50HELA-APLGI502.43E-07 4.88E-07 9.80E-07TGILC50化合物31化合物32化合物33化合物34化合物35化合物36A549GI502.59E-09 5.19E-093.88E-09 2.59E-083.82E-10 1.27E-095.10E-09 2.55E-083.03E-09 7.65E-092.84E-08 5.07E-08TGILC503.89E-089.06E-085.10E-098.92E-084.09E-069.09E-08HT29GI503.89E-09 7.78E-09 1.30E-087.76E-09 2.59E-08 1.03E-072.55E-10 7.64E-10 1.15E-097.64E-09 2.54E-09 1.15E-084.19E-09 1.32E-08 1.29E-056.18E-08 1.87E-07 1.30E-05TGILC50SW-620GI502.59E-09 3.89E-09 1.17E-085.17E-09 2.59E-08 1.29E-072.55E-10 1.15E-09 1.02E-081.02E-08 3.82E-08 1.02E-07TGILC50MEL-28GI502.59E-09 3.89E-09 1.04E-082.59E-09 1.03E-08 2.59E-082.55E-10 6.37E-10 1.15E-093.82E-09 1.27E-08 6.37E-082.78E-09 7.16E-09 4.70E-082.16E-09 5.23E-09 1.26E-08TGILC50OVCARGI50TGILC50A498GI502.59E-09 6.49E-09 1.30E-082.59E-09 9.06E-09 5.17E-082.55E-10 5.10E-10 1.27E-093.82E-09 1.27E-08 6.37E-08TGILC50DU145GI501.30E-09 3.89E-09 9.08E-091.29E-09 2.59E-09 3.88E-093.82E-10 8.92E-10 3.82E-092.55E-09 3.82E-09 1.02E-083.83E-09 1.20E-08 1.29E-055.41E-09 9.39E-09 1.30E-05TGILC50MCFGI502.59E-09 5.19E-09 1.17E-089.06E-09 2.59E-08 1.29E-071.02E-09 2.55E-09 1.15E-085.10E-09 2.55E-08 1.27E-07TGILC50MB231GI501.30E-09 5.19E-09 1.30E-08 2.59E-09 9.06E-09 9.06E-082.55E-10 1.27E-09 1.27E-083.82E-09 1.02E-08 1.27E-07TGILC50H-MEC-1GI502.60E-09 3.04E-08 1.29E-058.43E-08 7.83E-07 1.30E-05TGILC50LNCAPGI508.16E-10 2.50E-09 7.48E-096.14E-09 9.48E-09 2.51E-08TGILC50SK-OV3GI504.37E-09 1.46E-08 1.29E-055.07E-08 2.05E-07 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1.07E-08TGILC50IGROV-ETGI503.76E-08 1.19E-07 1.27E-051.57E-08 6.59E-08 6.51E-068.25E-08 4.04E-06 1.30E-052.42E-09 8.66E-09 4.80E-063.14E-09 2.00E-08 3.86E-064.32E-08 9.42E-08 1.27E-05TGILC50SK-BR3GI502.96E-09 6.80E-09 1.41E-071.07E-09 3.38E-09 9.54E-094.99E-08 1.10E-07 9.44E-072.56E-09 6.50E-09 2.80E-082.33E-09 6.86E-09 3.63E-086.63E-09 2.44E-08 8.73E-08TGILC50K562GI504.92E-10 1.36E-09 1.27E-084.22E-10 8.18E-10 3.15E-092.51E-08 4.46E-08 7.92E-088.43E-10 6.87E-09 8.00E-081.10E-10 2.19E-09 5.57E-094.77E-09 9.15E-09 2.81E-06TGILC50PANC-1GI503.12E-09 1.18E-08 3.02E-063.22E-09 8.37E-09 4.28E-076.01E-08 9.22E-07 1.30E-052.82E-09 7.17E-09 1.28E-071.08E-08 4.89E-08 5.06E-071.69E-08 8.25E-08 1.27E-05TGILC50LOVOGI502.92E-09 8.97E-09 1.27E-053.55E-09 1.03E-08 1.27E-053.21E-08 6.22E-08 1.20E-072.51E-095.98E-09 2.38E-084.42E-09 2.44E-08 4.10E-071.35E-08 4.37E-08 1.27E-07TGILC50LOVO-DOXGI506.17E-08 4.10E-07 1.27E-055.53E-08 8.42E-07 1.27E-052.34E-07 9.94E-07 1.30E-053.04E-08 9.12E-08 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1.17E-06 1.17E-056.78E-09 1.50E-07 1.21E-055.70E-07 1.26E-05 1.26E-05TGILC50LNCAPGI502.02E-09 3.76E-09 7.00E-094.30E-09 8.84E-09 3.11E-083.83E-09 1.21E-08 4.82E-081.17E-10 3.25E-09 1.75E-082.65E-09 5.08E-09 9.76E-092.16E-07 4.28E-07 8.45E-07TGILC50SK-OV3GI503.39E-09 7.17E-09 1.30E-083.75E-08 1.31E-07 1.30E-054.06E-08 1.24E-07 1.21E-053.06E-08 2.00E-06 1.17E+058.98E-09 2.88E-07 1.21E-055.50E-07 1.12E-06 1.26E-05TGILC50IGROVGI502.73E-09 5.20E-09 9.88E-094.29E-09 1.22E-08 9.30E-084.35E-08 9.49E-08 2.24E-062.32E-08 5.40E-08 1.92E-071.06E-08 4.07E-08 9.09E-074.21E-07 8.32E-07 5.62E-06TGILC50IGROV-ETGI509.10E-09 2.35E-08 1.30E-052.85E-08 7.06E-08 1.30E-072.33E-07 2.56E-06 1.21E-054.95E-08 1.29E-07 7.35E-066.97E-08 3.61E-06 1.21E-058.76E-07 1.26E-05 1.26E-05TGILC50SK-BR3GI503.77E-09 8.65E-09 4.11E-081.27E-08 4.27E-08 1.77E-076.68E-08 2.50E-07 1.21E-061.63E-08 5.84E-08 4.12E-077.56E-09 3.47E-08 6.93E-076.11E-07 1.69E-06 1.15E-05TGILC50K562GI502.51E-09 4.88E-09 9.49E-093.94E-09 9.38E-09 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毒性数据
毒性通过以下文献报道的方法评价：Toxicology in Vitro，15(2001)571-577，J.Luber Narod等：“Evaluation of the use of in vitromethodologies as tools for screening new compounds for potential in vivotoxicity”。
方法
为了评价各种药物对正常细胞的细胞毒性，使用96孔板，在板上以5000细胞/孔的密度接种(除了FDC-P1以外，它以12,000细胞/孔接种)正常细胞系(ATCC，表1)，所述细胞系按照ATCC的指导维持：AML-12，正常小鼠肝细胞；NRK-52E，正常大鼠肾细胞；L8，正常大鼠骨胳肌细胞；FDC-P1，正常小鼠骨髓干细胞；H9c2(2-1)，正常大鼠心肌细胞。加入受试药物前让各板中细胞静置过夜。此外，原生神经元培养物用胚胎(第e-17天)的完整脑(前脑和脑干)和脊髓按照既有方法(Federoff and Richardson，1997)制备。
以不同浓度(1×10-10-0.01mg/ml终浓度)向每个孔(100μl培养基)中加入10μl溶于培养基的药物，在37℃、5％CO2下进一步温育过夜。在24h后进行检测。所有实验重复至少三次，并且以一式二份检测。
1.MTS检测(CellTiter 96AQueous)根据制造商(Promega)的说明书(针对所有细胞类型)进行。细胞存活力(线粒体活性)通过甲底物的酶法转化确定。 化合物n° 肝 心脏 脊髓 骨骼 肾 26 1.06E-06 6.43E-07 1.03E-07 3.71E-08 4.60E-08 27 1.48E-08 9.93E-08 1.75E-08 1.54E-08 1.01E-08 28 1.42E-07 1.84E-07 2.00E-07 1.45E-07 8.37E-08 29 1.59E-08 7.22E-08 1.79E-08 3.29E-07 1.94E-08 30 2.72E-07 5.06E-07 7.58E-09 2.51E-08 4.19E-09 31 1.89E-08 6.65E-08 3.18E-08 1.35E-08 4.27E-08 32 6.00E-07 2.42E-07 5.25E-07 1.51E-08 1.45E-07 33 1.05E-08 1.27E-06 1.92E-08 1.41E-08 7.78E-09 34 2.55E-06 4.96E-07 1.15E-05 1.48E-08 2.74E-07 35 4.88E-08 1.93E-08 4.08E-08 3.07E-08 3.42E-08 36 3.19E-07 8.86E-07 2.05E-07 2.71E-08 3.56E-07 37 5.46E-09 1.74E-08 4.59E-09 2.22E-08 2.92E-08 38 1.39E-10 2.96E-09 9.66E-11 1.29E-08 9.85E-08 39 1.14E-06 NT 4.10E-07 4.58E-07 9.88E-05 40 3.86E-08 NT 4.08E-08 2.11E-07 2.95E-08 41 6.30E-08 3.49E-08 1.39E-07 2.39E-07 1.89E-08 42 1.86E-07 1.42E-07 6.41E-08 3.37E-08 1.12E-09 43 7.57E-08 9.42E-08 6.23E-08 1.60E-07 4.38E-08 44 4.33E-07 5.20E-06 1.21E-07 4.02E-08 4.15E-07 46 5.01E-08 3.51E-08 1.17E-07 2.16E-07 4.01E-08 47 3.04E-08 7.36E-08 6.76E-08 2.57E-08 3.15E-08
体外评价化合物的ADME-TOX特征
分配系数(log D)
化合物的分配系数提供其亲水亲油平衡的热力学度量。亲油性是一种影响化合物的药动学和药效学特性的主要结构因素。在水或缓冲液与1-辛醇间的分配系数是最广泛运用的化合物亲油性的量度。
分配系数的测量是基于微型化摇瓶法进行评价。缓冲液(Dulbecco氏PBS，pH7.40)用作水相。将受试化合物以100μM的浓度溶于DMSO。在辛醇-缓冲液分配后的最终DMSO浓度(1％)非常底以避免分配偏差。在相平衡60分钟后，缓冲相中化合物含量用光电二极管阵列检测器通过HPLC检测。从总的化合物含量减去缓冲液中化合物含量得到辛醇相中化合物含量，总的化合物含量用校正样品确定。
Log D计算为辛醇相中化合物含量除以缓冲相中化合物含量后的Log10。log D微测定的有效范围为约-0.5至+4.5。
体外肠吸收检测
肠上皮渗透性是确定候选药物在人的吸收速率和程度以及最终生物利用度的重要指标。Caco-2渗透性测定可快速判断膜渗透性，由此帮助进行化合物的吸收潜能排序。
Caco-2细胞系为在培养物中分化并且类似人小肠上皮内衬的人结肠腺癌细胞系。它已经被广泛用作新化合物的药物运输和渗透性筛选的体外肠上皮模型。
在顶端至基底外侧(A至B)方向穿过细胞单层(Caco-2的TC-7亚克隆)检测表观渗透系数(Papp)，所述细胞单层在聚碳酸酯滤膜上培养。测试50μM的化合物，最终DMSO浓度为1％。样品通过HPLC-MS或HPLC-MS/MS分析。
将受试化合物加入顶端侧，在温育2小时后，根据受试化合物在基底外侧出现的速率确定Papp。在每个检测中测试作为对照的两种化合物心得安(高渗透性)和雷尼替丁(渗透性差)。此检测结果可以用于化合物的吸收潜能排序。Papp等于或大于20×10-6cm/s的化合物被认为是可能具有高渗透性并且很可能“没有渗透性限制”。Papp小于5×10-6cm/s的化合物被认为渗透性很差并且很可能“渗透性有限”。Papp大于5×10-6但小于20×10-6cm/s的化合物被认为具有中等渗透性。
新陈代谢
肝代谢是药动学特性的主要决定因素，快速第一遍代谢是低生物利用度的主要原因。汇集的肝微粒体和重组物细胞色素P450′s用于代谢评价新发现化合物、前导化合物和新药用化合物。代谢筛选研究结果用于以下目的：
●检测化合物产生代谢的最初速率
●调查药物代谢的主要途径
●预测体内药动学特性
●研究药物-药物相互作用的可能性
用包括微粒体酶和胞质酶活性的人肝S9匀浆确定代谢稳定性。受试化合物以1μM浓度稀释于甲醇(0.625％)和乙腈(0.625％)，在人肝汇集物(蛋白质＝1mg/mL)中于37℃温育60分钟。通过HPLC-MS/MS确定对应于所有被分析物(代谢产物)的峰面积。记录峰面积，确定被分析物峰面积与各被分析物内标的峰面积的比。前体化合物在60分钟后保留量与在时间为0时的保留量的比(百分数表示)报告为代谢稳定性。值越高说明代谢稳定性越高。
抑制细胞色素P450(CYP450)
细胞色素P450是一组主要位于肝的相关酶，参与药物的代谢。药物对这些CYP的抑制作用与药物-药物相互作用和毒性有关。
CYP3A4是成人中发现的CYP3A酶的最常见形式，并且是涉及大多数药物作用的形式。CYP2D6使超过25％的临床用药代谢。
对于CYP2D6抑制作用检测，一式两份测试10μM的化合物，其中甲醇和乙腈的终浓度为0.25％，并且存在浓度为1.5μM的萤光底物AMMC(3-[2-N，N-二乙基-N-甲基铵]乙基)-7-甲氧基-4-甲基香豆素)。用酶在37℃温育450分钟后，分光荧光法检测AMMC在AHMC(3-[2-N，N-二乙基-N-甲基铵]乙基)-7-羟基-4-甲基香豆素)中的转化。
对于CYP3A4抑制检测，一式两份测试10μM的化合物，其中甲醇和乙腈的终浓度为0.25％，并且存在萤光底物BFC(50μM)。用酶在37℃温育30分钟后，分光荧光法检测BFC(7-苄氧基-4-三氟甲基香豆素)在HFC(7-羟基-4-三氟甲基香豆素)中的转化。
对于这两种检测，从合适温育时间后检测的荧光强度减去在t＝0检测的荧光强度。通过对比包含受试化合物的温育物的荧光性与包含相同溶剂溶媒的对照样品的荧光性计算信噪比。计算对照活性的百分数，报告为抑制百分数。
体外安全评价.细胞存活力
用原生人肝细胞(HEPG2)体外研究化合物的毒性潜能。一式两份测试30μM的化合物，其中最终DMSO浓度为1％。在37℃温育24h后，通过将氧化性alarmarBlue(刃天青)转化为还原性alarmarBlue(试卤灵)检测细胞存活力。氯丙嗪用作对照化合物。结果表达为对照值的抑制百分数。
研究ADME-TOX的结果 相对峰面积 溶解度 log D 渗透性 化合物 主要峰(色谱纯度) Dulbecco氏 PBS pH7.4 正辛醇- Dulbecco氏 PBS pH7.4 A至BTC 7细胞 (％) (μM) Papp(10-6 cm/s) 31 97.4 18.28 3.61 ＜0.32 35 99.0 ＜1est ＞5.0 PD 26(ET-736) 62.9 ＜1est ＞5.0 PD 27 84.9 2.99 ＞5.0 ＜1.18 34 98.6 17.65 ＞5.0 5.00 33 82.6 68.94 3.50 7.77 28 88.8 ＜1est ＞4.6 ND 29 97.5 1.59 ＞4.9 ND 30 100.0 2.24 ＞4.9 ND 32 92.8 14.28 ＞4.3 PD 36 98.4 26.03 ＞4.4 PD 43 96.0 5.85 ＞4.5 ND 44 97.4 20.69 ＞4.9 PD 41 92.9 ＜1est ＞4.5 ND 42 96.8 10.37 ＞4.8 PD 46 95.9 1.37 ＞5.0 PD 47 87.4 ＜1est ＞5.0 PD 人肝S9 代谢 细胞 化合物 稳定性 CYP2D6 CYP3A4 存活力 (％保留) (％抑制作用) (％抑制作用) (％抑制作用) 31 17 - 84 22 35 4 - 24 23 26(ET-736) 3 12 45 - 27 7 13 53 - 34 24 28 80 45 33 10 28 84 32 28 33 34 79 17 29 9 27 55 29 30 6 - 25 - 32 9 12 83 39 36 2 15 78 33 43 3 - 15 - 44 4 16 72 73 41 7 16 22 16 42 5 19 78 67 46 7 16 60 33 47 5 10 38 18