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1、10申请公布号CN104059924A43申请公布日20140924CN104059924A21申请号201310092670622申请日20130321C12N15/18200601C12N15/63200601C12N15/877201001C12N5/10200601A01K67/02720060171申请人中国农业大学地址100193北京市海淀区圆明园西路2号72发明人胡晓湘童佳张然李秋艳戴蕴平李宁74专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人王朋飞张庆敏54发明名称一种快速生长型转基因动物的生产方法57摘要本发明提供了一种快速生长型转基因动物的生产方法，其是将含有生长激。
2、素基因的细菌人工染色体转入动物基因组中，并在该转基因动物体内进行表达。本发明是利用BAC自身特点，将含有猪GH基因的BAC作为载体携带猪自身的调控元件使GH基因以较低的拷贝数按照原组织的状态在小鼠体内进行表达，研究结果显示生长激素分泌量无明显过量超标，各项生理指标监测表明小鼠处于正常的状况，从而获得了健康的，生长速度相对较快，体重增加的小鼠家系，该模型的成功建立为培育肉质等特性明显改善的转基因猪新品种研究奠定了良好的基础。51INTCL权利要求书1页说明书7页序列表2页附图5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页序列表2页附图5页10申请公布号CN10405。
3、9924ACN104059924A1/1页21一种快速生长型转基因动物的生产方法，其特征在于，其是将含有生长激素基因的细菌人工染色体转入动物基因组中，并在该转基因动物体内进行表达。2根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生长激素基因为猪生长激素基因。3根据权利要求2所述的方法，其特征在于，含有猪生长激素基因的细菌人工染色体的核苷酸序列在GENBANK上的国际编号为CH242271O11，或与该序列同源性在70以上的核苷酸序列，或在严格条件下，能够与该序列杂交的核苷酸序列。4根据权利要求13任一项所述的方法，其特征在于，其是将含有生长激素基因的细菌人工染色体通过显微注射法、体细胞克隆法或精子。
4、载体法转入动物基因组中。5根据权利要求13任一项所述的方法，其特征在于，所述动物为牛、羊、猪、马、兔、鹿、狗。6含有国际编号CH242271O11核苷酸序列的表达载体。7含有国际编号CH242271O11核苷酸序列的转基因动物细胞。8含有权利要求6所述表达载体的转基因动物细胞。9一种制备克隆胚胎的方法，其以权利要求7或8所述的转基因细胞为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得克隆胚胎。10一种制备转基因家畜的方法，其是将权利要求9所述方法制备的克隆胚胎通过非手术法移入家畜子宫内进行妊娠，获得转基因家畜。权利要求书CN104059924A1/7页3一种快速生长型转基因。
5、动物的生产方法技术领域0001本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种快速生长型转基因动物的生产方法。背景技术0002猪作为一种优质的肉用型家畜，对其瘦肉率、肉质等主要经济性状方面的育种改良一直是研究的热点。从传统育种的角度，通常只能在饲料和生长环境上加以调节控制,但仍受到动物自身的限制。随着人们生活水平的提高和营养观念的转变，对猪的要求不再仅仅是膘肥体重，而是希望对猪肉的蛋白质、脂肪含量、风味、口感等方面进行改进。始于20世纪80年代初的转基因动物技术，是一种通过重组DNA技术,将外源基因导入动物体内,外源性基因稳定整合在染色体基因组上并传给下一代。转基因技术不受有性繁殖的局限，并且使基因能够。
6、在种系关系相距遥远的个体之间流动，其对特定性状的改良、方向更明确、更单一等这些独特性优势将在育种领域发挥不可替代的作用。从当前的发展趋势看,转基因技术对家畜品种改良的研究和应用将成为最活跃、最有实际应用价值的研究方向之一，该技术的发展将为动物育种带来前所未有的革命性变化。0003为了得到生长更加理想的家畜品种，可将一些和动物生长发育相关的基因转入，将使之在肉产量，质量，肥瘦组成方面更符合市场的需求。生长激素（GROWTHHORMONE）是一类广泛存在于多种动物体内的由垂体嗜酸性细胞分泌的一种蛋白质激素，其作用是调控新陈代谢、促进生长发育，而其宏观表现为体重增加、胴体瘦肉率提高等。1982年，美。
7、国科学家首次将大鼠生长激素基因与金属硫蛋白基因启动子拼接成融合基因，导入小鼠受精卵后，获得了转基因“超级鼠”。这一研究的成功为生产转基因大家畜奠定了良好的基础。此后，相继出现转人GH、转猪GH、转大鼠GH和转牛GH基因等外源DNA的转基因猪，绵羊，兔，牛，研究表明它们与非转基因的动物相比，生长速度和饲料转化效率有显著提高，胴体的脂肪率也明显降低，但是常伴随着健康异常的问题，例如关节炎、应激敏感性增加、肝脏与肾脏炎症、胃溃疡、生育能力降低、寿命减短等。研究这些推断异常现象的产生可能是由于转入的生长激素基因连续异位地在不同组织器官中表达，同时体内外源生长激素远超其自身生理水平，自身的反馈机制也被破。
8、坏而引起。0004BAC（细菌人工染色体）是一可容纳约300KB的DNA片段的克隆载体，其遗传稳定性好，嵌合率低，转化率高，易操作，同时它能包括编码区且还包含内含子和调控区，其携带的基因可以和各种酶类、转录因子作用，遵守基因表达和复制的机制，理论上和正常染色体上的基因相似，因此BAC可将复杂的基因和基因家族，包括远程的顺式作用元件转入受体生物基因组中，使转入的基因在一定范围接近原有的组织状态，减少转基因的沉默的可能。发明内容0005本发明的目的是提供一种快速生长型转基因动物的生产方法。0006为了实现本发明目的，本发明的一种快速生长型转基因动物的生产方法，其是将含有生长激素基因的细菌人工染色体。
9、转入动物基因组中，并在该转基因动物体内进行表说明书CN104059924A2/7页4达。优选所述生长激素基因为猪生长激素基因。0007前述的方法，其中含有猪生长激素基因的细菌人工染色体的核苷酸序列在GENBANK上的国际编号为CH242271O11，或与该序列同源性在70以上的核苷酸序列，或在严格条件下，能够与该序列杂交的核苷酸序列。0008前述的方法，其是将含有生长激素基因的细菌人工染色体通过显微注射法、体细胞克隆法或精子载体法等方法转入动物基因组中。0009前述的方法，所述动物为牛、羊、猪、马、兔、鹿、狗等。0010本发明还提供含有国际编号CH242271O11核苷酸序列的表达载体以及含有。
10、该表达载体的转基因动物细胞。0011本发明还提供含有国际编号CH242271O11核苷酸序列的转基因动物细胞。0012本发明还提供一种制备克隆胚胎的方法，其以上述的转基因细胞为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得克隆胚胎。0013本发明进一步提供一种制备转基因家畜的方法，其是将上述方法制备的克隆胚胎通过非手术法移入家畜子宫内进行妊娠，获得转基因家畜。0014本发明是利用BAC自身特点，将含有猪GH基因的BAC作为载体携带猪自身的调控元件使GH基因以较低的拷贝数按照原组织的状态在小鼠体内进行表达，研究结果显示生长激素分泌量无明显过量超标，各项生理指标监测表明小鼠处于。
11、正常的状况，从而获得了健康的，生长速度相对较快，体重增加的小鼠家系，该模型的成功建立为培育肉质等特性明显改善的转基因猪新品种研究奠定了良好的基础。附图说明0015图1是国际编号为CH242271O11的BAC结构示意图。0016图2为PGHBAC经NOTI酶切后的琼脂糖凝胶电泳结果；其中，A是BAC（GENBANK号CU466386）经NOTI酶切后脉冲电泳结果，鉴定其大小约为177KB，B是大量酶切BAC通过脉冲电泳切胶回收目的片段。M1HINDIII，M2MIDRANGEIIPFG，箭头1MARKER179KB，箭头2MARKER9416BP，箭头3线性化的BAC，箭头4BAC载体带。00。
12、17图3为转基因小鼠制备流程如图3所示。0018图4为PCR鉴定转PGHBAC基因小鼠结果。0019图5为SOUTHERNBLOTTING鉴定转基因小鼠及其拷贝数结果；其中，A和B表示F0代小鼠鉴定，C和D表示F1代小鼠，4014BP的条带是基因组上整合的PGHBAC被探针杂交出来的片段，F0代2、15、16、31、35、37、41、44、46、49为阳性，其相应的F1代与原代结果一致；表示PGHBAC为阳性对照；3,10,30表示拷贝数，WT为野生型小鼠对照。0020图6为RTPCR检测MRNA水平上PGH基因在各组织器官中的表达结果；其中A为取F1代13个家系的阳性小鼠的各组织器官提取RN。
13、A，反转录为CDNA进行RTPCR,其中8个完整整合BAC家系的阳性小鼠在垂体中表达了PGH基因；B表示列举其中一家系PGHMRNA水平在各器官中的表达情况，GAPDH为小鼠持家基因，猪垂体CDNA；转基因小鼠CDNA；H心L肝S脾LU肺K肾P垂体M肌肉。0021图7为免疫组化检测PGH在小鼠垂体中的表达结果；其中A表示未加抗体的空白片，B表示非转基因小鼠的垂体片，C和D表示其中两个家系的阳性转基因小鼠垂体片。说明书CN104059924A3/7页50022图8为F049家系的转基因小鼠与非转基因小鼠比较；其中A表示的是F049家系的小鼠从断奶后的第三周开始每七天进行一次体重的称量直至第十周，。
14、平均体重该家系的转基因小鼠相比非转基因的小鼠有明显的增加；B为小鼠年龄在150天时进行外观上的比较，左侧阳性小鼠体重为5555G，右侧为同窝阴性小鼠，体重为4241G；C为F049家系中10周小鼠断颈屠宰后大腿肌肉上的比较，左侧为阳性转基因小鼠，右侧为同窝非转基因小鼠。0023图9为转PGHBAC基因小鼠体重情况。0024图10A和图10B分别为雄性、雌性转PGHBAC基因小鼠器官重量的比较。具体实施方式0025以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。0026以下实施例所使用的载体、试剂及其来源0027含有猪生长激素的BAC国际编号CH242271O11购自美国BAC/PACRES。
15、OURCECENTERATCHILDRENSHOSPITALOAKLANDRESEARCHINSTITUTE。引物合成及序列测定由上海生工完成。实验动物用昆明小白鼠，购自北京实验动物中心。TAQ酶、内切酶均为TAKARA公司产品；BAC纯化及回收试剂盒为QIAGEN公司产品；QPCR试剂盒购自APPLIEDBIOSYSTEM公司；MIDRANGEPFGMARKER购自NEB公司；TRIZOL为TIANGEN公司产品，PCR法DIG引物标记盒和地高辛杂交检测试剂盒购于ROCHE公司；SOUTHERN杂交膜购自于美国AMERSHAMBIOSCIENCES公司；抗猪GH一抗购自ACCURATE公司，。
16、IGG二抗购自中山金桥公司。酶切、PCR扩增等常规分子生物学实验操作步骤详见分子克隆第三版。实施例中所使用的其它技术手段，若未特别指明，均为本领域技术人员所熟知的常规手段。0028实施例1猪生长激素BAC（PGHBAC）纯化和鉴定002911PGHBAC提取和鉴定0030根据GENBANK上的猪生长激素基因（PGH）序列（GENBANK号M17704）和GENBANK上BAC的序列（GENBANK号CU466386）确定PGH基因的5侧翼序列约为75KB，3侧翼序列约为100KB（图1）。0031BAC（国际编号CH242271O11，其结构如图1所示，图中PTARBAC13为载体骨架，BAC。
17、携带了约177KB的猪基因片段，猪生长激素基因位于该BAC的中间，其5和3侧翼序列分别为75KB，100KB，保证了该基因周围含有足够多的调控元件。同时在BAC5、PGH基因、BAC3分别设有引物P51和P52；GH1和GH2；P31和P32检测BAC的完整性）提取参照QIAGEN大提质粒试剂盒说明书进行，用T7和SP6引物进行末端测序比对，同时依据NCBI的序列设计引物对BAC两末端及GH基因进行PCR扩增，引物见表1。0032表1检测转PGHBAC小鼠引物表0033说明书CN104059924A4/7页6003412PGHBAC纯化0035BAC鉴定准确后采用脉冲切胶电洗脱透析回收的方法，。
18、将提取的BAC用NOTI酶切，去掉原核载体部分。回收177KB含有猪生长激素基因的片段，回收片段的琼脂糖凝胶电泳结果见图2A和B。0036具体操作如下0037根据载体的酶切位点选择NOTI酶切3小时，普通电泳检测酶切完全后进行脉冲电泳，以6V/CM,120度角，1201S40S，14小时后，切下需回收DNA条带所在位置的凝胶,1TAE50ML胶平衡05小时（4C）后装入已处理好的透析袋（华美生物工程公司）中,加入适量电泳缓冲液，缓冲液量为刚好没住胶块为宜；赶走气泡将透析袋置于脉冲电泳槽中，使透析袋以及胶块的方向与电泳的方向垂直，凝胶紧贴的一侧靠近负极，脉冲电泳，使DNA样品全部跑出胶块，贴于透。
19、析袋的一侧，透析条件45V/CM,3H,120度角，1230S40S反向电泳30SEC；透析袋取出放入TEPH74的溶液中透析过夜吸出透析袋中的电泳缓冲液于15ML的离心管中；取上清，加入1/25倍体积的5MNACL和2倍体积的无水乙醇，20放置051H沉淀DNA；12,000RPM，4离心20MIN，沉淀DNA；70乙醇洗涤沉淀，真空抽干后回收片段溶于TE溶液（10MMOL/LTRISCLPH74，01MMOL/LEDTA,用MILLIQ水配制），70保存备用。0038取部分回收片段的溶液用紫外分光光度计测定260NM和280NM下的OD比值，并计算浓度,OD260/OD280在18以上，可。
20、用于注射小鼠受精卵。0039实施例2表达猪生长激素的转基因小鼠模型的建立及检测004021显微注射生产转基因小鼠0041转基因小鼠制备流程如图3所示。0042转基因小鼠制备过程参见小鼠胚胎操作实验指南A纳吉等著，2004，科学出版社。用显微注射法生产转基因小鼠，线性比环形整合效率高,因此先把载体酶切成线形才能进行显微注射。将含有基因片段的溶液稀释至终浓度2G/ML，共注射到小鼠受精卵的雄说明书CN104059924A5/7页7原核，然后移植到同期发情的假孕母鼠输卵管中。004322转基因小鼠的PCR检测0044取3周龄转基因小鼠的尾巴组织样，提取DNA。以提取好的基因组为模板，分别在GH基因和。
21、BAC的5和3两端设计引物进行扩增,引物序列及产物大小见表1。以普通小鼠基因组为阴性对照，以载体PGHBAC为阳性对照。扩增条件为94，30SEC；60，30SEC；72，30SEC；35个循环。10琼脂糖电泳观察结果。PCR在F0代50只小鼠中检测出8只整合完整BAC的小鼠，结果见图4，第2、15、16、31、35、41、44和49号小鼠均为整合完整BAC的转基因阳性小鼠，WT表示野生型小鼠，GHBAC为阳性对照。004523转基因小鼠的SOUTHERNBLOTTING检测0046将PCR检测为阳性的F0代转基因小鼠剪尾部组织提取基因组，取20G用AVRII内切酶消化，以AVRII酶切的野生。
22、型小鼠基因组为阴性对照，AVRII酶切的PGHBAC注射载体片段为阳性对照，杂交探针是用DIGPCR法试剂盒标记探针。将样品低压慢速电泳，采用碱转移方法将DNA从琼脂糖转移至尼龙膜，将尼龙膜有DNA的一面朝内,卷成筒状放入杂交管中，加入预杂交液，于42C预杂交3HR，加入经过加热变性的DIG标记的探针,42C杂交1216HR，洗膜后用保鲜膜包好,放进暗盒中,暗室中压上X光片,15分钟后冲洗X光片观察结果。SOUTHERNBLOTTING结果见图5AD，结果表明阳性小鼠SOUTHERNBLOTTING检测结果与PCR检测结果一致。0047实施例3猪生长激素在转基因小鼠体内中的表达分析004831。
23、PGH的表达检测0049采集F0代阳性的后代小鼠（5周龄）的垂体、心、肝、脾、肺、肾、肌肉及普通小鼠的对应器官作为阴性对照。猪垂体为阳性对照。提取RNA后依据GENBANK上的PGHRNA序列（GENBANK号M22761）设计引物进行RTPCR扩增，结果如图6A和B所示，PGH只在第2、15、16、31、35、41、44和49号小鼠垂体中表达，在其它器官组织中未见明显的表达，不存在异位表达的现象。0050取表达PGH的8个阳性家系小鼠的后代垂体，进行常规的石蜡包埋切片免疫组化，采用链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶连结法检测。一抗为单克隆抗体兔抗猪生长激素（ACCURATE，USA）结果见图7AD。
24、。005132PGH在小鼠血清中的检测0052采用针对PGHRIA试剂盒（LINCO）对猪生长激素在转基因小鼠血清中的表达量进行分析。小鼠从断奶后开始每七天进行一次眼底采血，监测7周。1ML血样放置4过夜后，3000RMP离心15分钟，吸取上清，80待统一检测。通过检测结果发现，猪生长激素的表达是按照生理周期进行，呈现脉冲状趋势，并未持续不断地过量表达但最高能达到500NG/ML005333PGH对小鼠体重的分析0054小鼠断奶后3周到第10周进行每7天一次的体重称量，并对其外观特征病变进行观测记录。图8AC记录了其中一阳性49号家系小鼠总体体重生长情况。同时挑取8个家系雌雄阳性和同窝阴性各5。
25、只进行比较，图9为转PGHBAC基因小鼠总体体重情况，选取完整整合BAC的8个家系为目标，雌雄阳性和同窝阴性各5只进行比较，总体水平上转基因相对于非转基因的效果雌性比雄性要强，雌性转基因小鼠增加了177，雄性为467，表明转入PGH基因的小鼠相对于非转基因的小鼠在体重上有了提高。说明书CN104059924A6/7页80055实施例4转猪生长激素基因小鼠的健康状况分析005641PGH转基因小鼠的血液检测0057通过常规血细胞检测和血清生化检测把转基因小鼠与同窝非转基因小鼠进行比较根据测定的指标分析生理上的差异。每个家系分别取雌雄阳性小鼠及其对照3只进行检测，选取白细胞、红细胞、血小板、血红蛋。
26、白为常规血液参数，选取谷丙转氨酶（代表肝脏功能的水平）、尿素氮（代表氨基酸的代谢水平）、肌酐（肾脏功能的水平，空腹血糖（代表碳水化合物的代谢水平）、总胆固醇、甘油三酯（代表脂肪的代谢水平）这些指标为生化参数。通过对比转基因小鼠与同窝非转基因小鼠在检测结果中不存在明显的差异，见表2和表3。0058表2转PGH基因与非转基因小鼠的血常规指标比较00590060表3转PGH基因与非转基因小鼠的血生化指标比较0061006242PGH转基因小鼠组织学检测0063选取10周龄的小鼠各家系雌雄阳性小鼠及其对照3只，通过断颈法处死后，迅速取出器官（心、肝、脾、肺、肾、垂体）进行称量，结果见图10A和B，图中。
27、为10周的小鼠（N40）屠宰后对心、肝、脾、肺、肾的重量比较。从数据分析表明，转入基因后并没有明显的增加器官上的重量，造成异常肥大等特点。然后将各组织放入10的福尔马林中，进行常规石蜡包埋切片，HE染色法观察组织学形态上的变化。通过医学报告结果说明转基因也非转基因小鼠的比较在各组织器官上没有发生明显的病变。器官的称量结果表明转基因与对照组之间重量没有太大的差异，不存在器官异常的增大的现象。0064实施例5猪生长激素转基因猪的制备及表达分析0065转基因家畜制备方法可以采用显微注射法、体细胞克隆法、精子载体法等方法，转基因家畜包括转基因猪、转基因羊、转基因牛等。本发明优选体细胞克隆法制备转基因猪。
28、，但不限于体细胞克隆法，也不限于转基因猪的制备。0066取猪耳组织接种培养出成纤维细胞（参见细胞试验指南），用NOTI酶切将构建成功载体线性化，转染猪成纤维细胞将上述线性化载体DNA稀释到100LDMEM培养基中，然后加入6LROCHEFUGENEHDTRANSFECTIONREAGENT，剧烈震荡混匀，室温诱导15MIN，获得转染复合物；将转染复合物加到待转染细胞的培养皿中，轻轻混匀。转染6H后，更换含10胎牛血清的完全培养基。转染3天后，用500G/ML的G418筛选细胞9天，筛选后增殖细胞，获得阳性细胞克隆群。经G418筛选及以P1和P2为引物PCR鉴定，确定为转基因阳性细胞。0067以。
29、上述转基因阳性细胞为核移植供体细胞，以体外成熟的初情期前母猪卵母细胞为核移植受体细胞，将核移植供体细胞移入去核的卵母细胞，经电融合与激活，构建成克隆说明书CN104059924A7/7页9胚胎，挑选形态优良的克隆胚胎用非手术法移入自然发情的经产母猪子宫内进行妊娠,非手术法胚胎移植步骤为用无巴比妥略作麻醉后，从受体母猪阴道向子宫颈管道插入外径10毫米的粗导管，然后将直径5毫米的细导管插入粗导管内侧，伸入到子宫体或一侧子宫角。将克隆胚胎连同2毫升保存液一起通过细导管移植进去，具体是用干冰产生出来的二氧化碳经过导管将胚胎吹入到子宫内13分钟。胚胎移植后30天B型超声波检测妊娠与否。妊娠期满后对出生的。
30、克隆猪进行PCR和SOUTHERN杂交检测，2头受孕母猪体内，获得6头转基因猪。0068对转基因猪的体重及健康状况进行分析（参照实施例3和4），发现转基因猪增重显著高于对照非转基因猪，而且转基因对猪的健康状况没有显著影响。0069虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。说明书CN104059924A1/2页1000010002序列表CN104059924A102/2页11序列表CN104059924A111/5页12图1图2说明书附图CN104059924A122/5页13图3图4图5说明书附图CN104059924A133/5页14图6图7说明书附图CN104059924A144/5页15图8图9说明书附图CN104059924A155/5页16图10A图10B说明书附图CN104059924A16。