穿心莲内酯三马来酸半酯及其盐和它们的药物组合物 发明的领域：
本发明涉及穿心莲内酯衍生物，制备方法，及含有它们的药物组合物。具体地说，本发明涉及穿心莲内酯三马来酸半酯和穿心莲内酯三马来酸半酯盐及制备方法，和含有它们的药物组合物及其在解热和抗病毒方面的临床应用。
背景技术：
穿心莲Andrographis Paniculata(Burm.f.)Nees是临床广泛应用的清热解毒的植物药，已收入中国药典[2000]一部220页；对其引种栽培、有效成分的化学结构分析及其衍生物制备、制剂工艺及药理临床等已有较多研究，多认为其主要有效成分是二萜内酯类化合物，如穿心莲内酯(Andrographolide)、脱水穿心莲内酯(Dehydroandrographolide)等[药学通报，1982年17卷4期；四川省中药研究所：十三种穿心莲针剂的药理作用]。
为提高临床疗效，一般提取穿心莲内酯后，制备各种水溶性衍生物的注射液，如亚硫酸氢钠加成物、磺酸钠加成物和琥珀酸半酯单钾盐等。其中亚硫酸氢钠加成穿心莲内酯和穿心莲内酯琥珀酸半酯单钾盐(注射用穿琥宁)已收入国家药品标准。但是，上述已知药品在解热效果和水中溶解度均不理想。
发明的目的：
为了克服上述缺陷，本发明提供以下的式(I)和式(II)化合物及其制备方法及含有它们的药物组合物。本发明的另一目的是式(I)和式(II)化合物作为制备解热剂和抗病毒剂的用途。
发明的内容：
本发明提供以下的式(I)和式(II)化合物，它们可以作为解热剂和抗病毒剂的有效成份。
和
注：式(II)化合物中X代表：H、Na、K、Ca、NH4；Y代表：H、Na、K、Ca、NH4；Z代表：H、Na、K、Ca、NH4。
上述制备式(I)和式(II)化合物的方法：
制备式(I)化合物的方法：以穿心莲内酯为原料，在真空度为520～620mmHg，60～200℃、在催化剂作用下与马来酸酐发生酯化反应，回流0.5～10小时，冷却后除真空，加水搅拌至全部固化和析晶疏散为止，抽滤，滤饼常温真空干燥，滤饼加碳酸氢钠水溶液溶解，过滤，滤液调pH至酸性，析出白色沉淀，抽滤、干燥得到穿心莲内酯三马来酸半酯(简称马莲酯)。
制备式(II)化合物的方法：取式(I)化合物，加甲醇使溶解，与不同量的碳酸氢钾(碳酸氢钠、碳酸氢钙、碳酸氢胺)加热回流1～2小时，冷后过滤，真空干燥，分别得马莲酯单盐、马莲酯二盐、马莲酯三盐约3.0g。总收率均为70～80％。
制备式(I)化合物反应方程式：
制备式(II)化合物的反应方程式：
注：制备式(II)化合物的反应方程式中的salt代表碳酸盐、碳酸氢盐。
式(II)化合物中X代表：H、Na、K、Ca、NH4；Y代表：H、Na、K、Ca、NH4；Z代表：H、Na、K、Ca、NH4。
本发明的解热与抗病毒活性地药物组合物，它包括治疗有效量权利要求1定义的式(I)或(II)式化合物作为活性组分和药学上常规的药用载体/或稀释剂。所述治疗有效量为每日100mg静脉点滴3～4日为一个疗程。
本发明还提供式(I)和式(II)化合物用作制备解热消炎剂和抗病毒剂的用途。
本发明制备方法中的原料穿心莲内酯，可以用公知方法从穿心莲提取制备，马来酸酐可以在市场上买到，其中的催化剂可以使用亚硫酸钠等。本发明药物组合物中的使用的药用载体或稀释剂可以是水、pH缓冲液等。以下用具体实施例详细说明本发明式(I)和式(II)化合物的制备方法和本发明化合物的优良效果。
附图说明：图1是穿心莲内酯三马来酸半酯三钠盐质谱图(河南大学)
图2是穿心莲内酯三马来酸半酯三钠盐质谱图(军科院)
实施例
穿心莲内酯三马来酸半酯和穿心莲内酯三马来酸半酯盐
(简称马莲酯和马莲酯盐，下同)的制备
马莲酯的制备：穿心莲内酯2g(0.006mol)，马来酸酐2g(0.041mol)，亚硫酸钠0.2g，置反应瓶中，混匀，安上回流装置和干燥管，开始加热，调节真空度为520～620mmHg，100℃，回镏反应5小时，冷却后抽真空。加40ml水于反应瓶内，充分搅拌至全部固化和析晶疏散为止。抽滤，滤饼常温真空干燥，滤饼加碳酸氢钠水溶液溶解，过滤，滤液调pH至酸性，析出白色沉淀，抽滤、干燥得到穿心莲内酯三马来酸半酯(简称马莲酯)。
马莲酯盐的制备：取马莲酯，加甲醇使溶解，与不同量的碳酸氢钾(碳酸氢钠、碳酸氢钙)加热回流1～2小时，冷后过滤，真空干燥，分别得马莲酯单盐、马莲酯二盐、马莲酯三盐约3.0g。总收率均为70～80％。
理化性质：
马莲酯：微黄色粉末，无臭，味苦。不溶于水，溶于丙酮、氯仿或乙醚。熔点：119～121℃。
马莲酯单盐：类白色粉末状或片状结晶，微溶于水，可溶于2％碳酸钠溶液，不溶于氯仿或乙醚。250℃不熔化，但开始发黄变色并分解。
马莲酯三盐：微黄色粉末，无臭，味苦。易溶于水，略溶于稀乙醇，不溶于氯仿或乙醚。250℃不熔化，但开始发黄变色并分解。
发明的效果：
目前临床常用的穿心莲内酯琥珀酸半酯单钾盐又称穿琥宁，30余年临床的大量研究，证明其有明显的解热、抗炎、促进肾上腺皮质功能及镇静作用，可促进中性粒细胞巨噬细胞的吞噬能力，提高血清中溶菌酶的含量。研究认为，穿心莲内酯化合物以对炎症早期毛细血管通透性增高和渗出、水肿抑制作用为显著，提示穿心莲内酯类化合物是一种新类型的非特异性抗炎药。穿琥宁临床广泛应用于婴幼儿肺炎、病毒性上呼吸道感染、气管炎、流感、钩端螺旋体病及急性细菌性痢疾等，其中以解热效果最为显著。
穿心莲内酯三马来酸半酯和穿心莲内酯三马来酸半酯盐药效学研究表明其解热效果远远高于穿琥宁。
马莲酯的稳定性试验
1、仪器与试剂
仪器 UV-265FW型分光光度计(日本岛津)
试剂 间二硝基苯(上海试剂一厂)，乙醇(北京化工厂)
2、恒温加速试验方法
将样品分别置于97℃、87℃、77℃和67℃的四个恒温箱中，每隔一定时间取样，按下述方法测定含量。
3、测定方法
3.1对照品(穿心莲内酯三马来酸半酯单钾盐，纯度为99％)溶液的配制：
根据样品测定时间取置4℃暗处保存的对照品适量，用稀乙醇溶解成1mg/ml的溶液。
3.2样品(穿心莲内酯三马来酸半酯单钾盐，纯度为99％)溶液的配制：
取在一定温度下加热一定时间的样品约0.1g，精密称定，置100ml容量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀。
3.3测定步骤
分别精密量取样品溶液及对照品溶液各5ml，置10ml容量瓶中，加0.5％间二硝基苯乙醇液2ml与0.2mol NaOH溶液1ml，用稀乙醇定容。放置3分钟，置1cm吸收池中，在485nm处测定吸收度，以对照品溶液含量为100％计算样品含量。结果如下：
97℃时间(h) 0 2 4 6 8 10 12 14含量(％) 99.5 95.6 91.1 87.2 82.8 80.9 77.5 72.5
87℃时间(h) 0 6 12 18 24 30 36 42含量(％) 99.5 95.0 92.6 89.5 84.4 81.9 79.4 75.8
77℃时间(h) 0 12 24 36 48 60 72 84含量(％) 99.5 96.8 94.0 91.8 89.2 86.7 84.5 82.4
67℃时间(h) 0 24 48 72 96 120 144 168含量(％) 99.5 97.6 95.3 92.1 89.7 87.6 85.4 82.9
由以上数据可以求得，K25＝5.328×10-6，t0.9＝2.3年。故有效期可暂定为2年。
马莲酯单钾盐的药效学研究
摘要：目的：考察马莲酯单钾盐的有效剂量及药理作用，为临床应用提供依据。方法：蛋清致大鼠足肿胀、大鼠棉球肉芽肿及二甲苯致小鼠腹膜炎模型观察马莲酯单钾盐的抗炎作用；干酵母致大鼠发热、二硝基苯酚致大鼠发热及内毒素致家兔发热模型观察马莲酯单钾盐的解热作用；试管培养法观察马莲酯单钾盐的抗菌作用。结果：马莲酯单钾盐量效关系明显：300mg/kg及150mg/kg对干酵母和二硝基苯酚所致的大鼠发热及内毒素所致的家兔发热均有良好的解热作用，75mg/kg对三种发热作用均不明显；400mg/kg和200mg/kg对蛋清所致的大鼠足肿胀、大鼠棉球肉芽肿及二甲苯所致的小鼠腹膜炎均有良好抗炎作用，100mg/kg对三种炎症作用均不明显。
马莲酯单钾盐大肠杆的及痢疾杆菌的MIC为2mg/ml对金色葡萄球菌及肺炎球菌的MIC为1mg/ml结论：马莲酯单钾盐有较好的解热及抗炎作用，但其抗菌作用较弱。
马莲酯三钾盐与马莲酯单钾盐药效学试验结果基本一致。关键饲：马莲酯单钾盐 药效学 治疗作用
马莲酯单钾盐是北京医工生物研究所研制的一类新药，经药效学筛选有良好的解热及抗炎作用，本文按新药审批办法要求对马莲酯单钾盐的药效学进行研究，现报告如下：
1材料
1.1药物 马莲酯单钾盐，由河南大学药物所提供，批号：20010701，纯度：92.83％用pH 6.8的磷酸盐缓冲液将药物配成4％溶液，为高剂量；高剂量稀释至2％为中剂量：高剂量稀释至1％为低剂量，每次均新鲜配制。
穿琥宁粉针，中美合资黑龙江制药有限公司，批号：010504
1.2菌株 金色萄球菌，大肠杆菌，肺炎球菌，痢疾杆菌，均由开封市医科所提供。
1.3动物 小鼠，体重22～25g，♂：Wistar大鼠，体重150～200g，♀♂兼用：家兔，2.5～3.0kg，♀♂兼用均由河南省医学实验动物中心提供，合格证号：4109。
1.4试剂 安琪干酵母，湖北安琪干酵母股份有限公司，批号：20010621；内毒素10EU/支，中国生物制品研究所产品；二甲苯，开封化学四厂，批号：20001013；2，4-二硝基苯酚，兰溪市化工试剂厂，批号：20000802；营养琼脂，北京奥特星生物工程分公司产品。
1.5仪器 751-型紫外分光光度仪，上海医疗器械二厂。
1.6试验环境、温度：23±3℃，湿度：55±10％，
自然光照7:00～19:00，自由饮水，定量投食。
2.实验方法
2.1解热作用
2.1.1对干酵母致大鼠发热的影响
实验前2天每日测大鼠体温1次，挑选体温变化在37C～38.℃，且自身体温变化低于0.3℃的大鼠60只，150～180g，♀♂各半，随机分为5组，每组12只。一组ip生理盐水，二组ip穿琥宁注射液150mg/kg，三、四、五组分别ip马莲酯单钾盐注射液300mg/kg、150mg/kg、75mg/kg，各组注射容积均为1ml/100g，给药前2.5h测量体温一次，作为0时基础体温，测温后随即SC20％的新鲜干酵母混悬液1ml/100g，2.5h后给各组相应药物，测量注射干酵母后3h、4h、7h、9h、11h时的体温。(见表1)
2.1.2对内内毒素致家兔发热的影响
实验前2天每日测家兔体温1次，挑选体温在38.0～39.5℃，且自身体温变化小于0.3℃的家兔40只，2.5～3.0kg，♀♂各半，随机分为5组，每组8只，雌雄各半。一组于家兔左耳缘静脉注射生理盐水，二组于家兔左耳缘静脉注射穿琥宁150mg/kg，三、四、五组分别于家兔左耳缘静脉注射马莲酯单钾盐注射液300mg/kg、150mg/kg、75mg/kg，各组注射容积均为6ml/kg。于给药前测量一次体温作0时基础体温，给药后立即于家兔右耳缘静脉注射内毒素200ng/kg容量为1ml/kg，测量给药后1h、2h、3h、4h、6h时的体温。(见表2)
2.1.3对二硝基苯酚致大鼠发热的影响
实验前2天每日测大鼠体温1次，挑选体温变化在37℃～38.5℃，且自身体变化低于0.3℃的大鼠50只，150～180g，♀♂，随机分为5组，每组10只。一组ip生理盐水，二组ip穿琥宁注射液150mg/kg，三、四、五组分别ip马莲酯单钾盐注射液300mg/kg、150mg/kg、75mg/kg，各组注射容积均为1ml/100g。给药前测量体温一次，作为0时基础体温，给药后随即SC 0.15％的新配二硝基苯酚1ml/100g，测量注射给药后1h、2h、3h、4h时的体温。(见表3)
2.2抗炎作用
2.2.1对蛋清致大鼠足肿胀的影响
大鼠60只，180～220g，♀♂各半，随机分为5组，每组12只。一组ip生理盐水，二组ip穿琥宁200mg/kg，三，四，五组分别ip马莲酯单钾盐400mg/kg，200mg/kg，100mg/kg，各组注射容积均为1ml/100g。给药前用记号笔标记大鼠右踝关节浸水边界，排水容积法测量1次致炎前大鼠右足排水容积，给药后立即于大鼠右后脚掌SC新鲜蛋清0.1ml/只。测量给药后1h、2h、3h、5h时的大鼠足排水容积。(见表4)
2.2.2对二甲苯致小鼠腹膜炎的影响
小鼠75只，随机分为5组，每组15只。实验前用剪刀剪去小鼠腹部正中腹部毛约3×3cm2。一组皮下注射生理盐水，二组皮下注射穿琥宁200mg/kg，三、四、五组分别皮下注射马莲酯单钾盐400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg，各组注射容积均为0.1ml/10g。给药后40min，给小鼠尾部静脉注射1％伊文氏兰0.1ml/10g，注射后立即于腹部去毛处滴二甲苯0.1ml/只，20min后处死小鼠，剥离腹部皮肤，将染色处剪下，对染色深度进行积分，然后剪碎染色皮肤，放入试管，加5ml(丙酮∶NS＝7∶3)液，浸泡48h(中间振摇10次)，离心，取上清液于751分光光度计610nm处以空白(丙酮∶NS＝7∶3)液调零测光密度。(见表5)
2.2.3对大鼠棉球肉芽肿的影响
大鼠50只，200～220g，♀♂，随机分为5组，每组10只。一组ip生理盐水，二组ip穿琥宁注射液150mg/kg，三、四、五组分别ip马莲酯单钾盐注射液300mg/kg。150mg/kg、75mg/kg，各组注射容积均为1ml/100g。试验初始，ip 0.25％的戊巴比妥钠1ml/100g麻醉大鼠，剪去上腹部毛，消毒，沿腹中线切开皮肤，将2个50mg重的棉球(预先高压灭菌，每个棉球加1％的青霉素、链霉素各0.1ml)植入两侧腋下，缝合切口，消毒，待大鼠清醒后开始给药，每日1次，连续7d，第8d颈椎脱臼处死大鼠，剥离棉球肉芽组织，置60℃烘箱烘干至恒重，分析天平称重，减去原棉球重量即为肉芽组织重量。(见表6)
2.3.抗菌试验
体外抑菌试验(琼脂试管二倍稀释法)
用pH6.8的灭菌磷酸盐缓冲液将马莲酯单钾盐配成2％注射液，微孔滤膜过滤除菌后作初始浓度，再用灭菌磷酸盐缓冲液减半稀释至1/2、1/4、1/8、1/16、1/32浓度，用注射用生理盐水将穿琥宁粉针配成2％注射液，过滤除菌后作初始浓度，再用生理盐水减半稀释至1/2、1/4、1/8、1/16、1/32浓度，分另吸取1ml于无菌试管内，加入9ml营养琼脂，摇匀，接种细菌后于37℃温箱培养24h观察，以无菌生长试管为最低MIC(每个试管平行3管)(见表7)
3.试验结果
3.1马莲酯单钾盐300mg/kg及150mg/kg对干酵母所致的大鼠发热、二硝基苯酚所致的大鼠发热及内毒素所致的家兔发热均有良好的解热作用，75mg/kg对三种发热作用均不明显。(见表1、表2、表3)3.2马莲酯单钾盐400mg/kg和200mg/kg对蛋清所致的大鼠足肿胀、大鼠棉球肉芽肿及二甲苯所致的小鼠腹膜炎均有良好抗炎作用，100mg/kg对三种炎症作用均不明显。(见表4、表5、表6)
3.3马莲酯单钾盐大肠杆菌及痢疾杆菌的MIC为2mg/ml，对金色葡萄球菌及肺炎球菌的MIC为1mg/ml。(见表7)
4.结论
4.1马莲酯单钾盐有较好的解热及抗炎作用。
4.2马莲酯单钾盐抗菌作用较弱。
4.3.马莲酯三钾盐与马莲酯单钾盐药效学基本一致(试验数据略)。
试验负责者：杜钢军
试验设计者：杜钢军 纪中歧 李明
试验操作者：杜钢军 纪中歧 李明
林海红 邹长松 郭蕊
试验日期：2001年10月～2002年4月
原始资料保存处：北京医工生物研究所
联系人：陈勇敢电话：(0378)5956970
参考文献：
1、陈奇 中药药理研究方法学人民卫生出版社(第2版)1993。
2、王治乔袁伯俊 新药临床前安全性评价与实践军事医学科学出版社1997。
3、张黎莉李国栋李展金青口服液的药效学研究中药药理与临床2000 16(2)：29。
4、罗谋论钟文黄世英赛葵的解热镇痛抗炎作用中草药1980(6)：436。
附表：1～7
表1.马莲酯单钾盐对干酵母所致大鼠发热的影响(n＝12) 组别 剂量 (mg/kg) 体温升高(℃ ±S) 3h 4h 5h 7h 9h 11h NS -- 0.75±0.17 1.17±0.27 1.49±0.33 1.92±0.31 1.58±0.26 1.13±0.27 穿琥宁 150 0.51±0.17* 0.82±0.21** 1.18±0.25** 1.71±0.19 1.56±0.21 0.94±0.27 马莲酯 钾盐 300 0.27±0.12** 0.39±0.14** 0.65±0.12** 1.02±0.17** 1.04±0.16** 0.85±0.18 150 0.47±0.15* 0.73±0.17** 1.03±0.27** 1.38±0.26** 1.42±0.20 1.00±0.24 75 0.69±0.23 1.15±0.23 1.44±0.24 1.78±0.25 1.49±0.22 1.04±0.25
与生理盐水组比较 *P＜0.05 **p＜0.01
表2.马莲酯单钾盐对内毒素所致家兔发热的影响(n＝8) 组别 剂量(mg/kg) 体温升高(℃ ±S) 1h 2h 3h 4h 6h NS -- 1.51±0.19 1.75±0.23 1.71±0.17 1.30±0.17 0.98±0.18 穿琥宁 150 0.65±0.15** 1.08±0.23** 1.45±0.23* 1.15±0.26 1.15±0.26 马莲酯 钾盐 300 0.28±0.14** 0.39±0.13** 0.58±0.18** 0.86±0.17**0.76±0.12* 150 0.54±0.17** 0.65±0.15** 0.92±0.19** 0.95±0.21* 0.80±0.22 75 1.10±0.23** 1.36±0.28* 1.58±0.29 1.29±0.24 0.90±0.17
与生理盐水组比较 *P＜0.05， **P＜0.01
表3.马莲酯单钾盐对二硝基苯酚所致大鼠发热的影响(n＝10) 组别 剂量 (mg/kg) 体温升高(℃ ±S) 1h 2h 3h 4h NS -- 1.18±0.29 1.27±0.32 0.95±0.32 0.33±0.16 穿琥宁 150 0.75±0.28** 0.71±0.17** 0.55±0.16** 0.28±0.10 马莲酯 钾盐 300 0.17±0.14** 0.23±0.16** 0.20±0.14** 0.11±0.12* 150 0.61±0.22** 0.68±0.19** 0.46±0.12** 0.28±0.09 75 1.08±0.25 1.15±0.26 0.76±0.24 0.37±0.14
生理盐水组比较 *P＜0.05， **P＜0.01
表4.马莲酯单钾盐对蛋清所致大鼠足肿胀的影响(n＝12) 组别 剂量(mg/kg) 体温升高(℃ ±S) 1h 2h 3h 5h NS -- 0.73±0.20 0.78±0.13 0.56±0.09 0.35±0.07 穿琥宁 150 0.50±0.11** 0.55±0.07* 0.40±0.06 0.30±0.04 马莲酯 钾盐 300 0.23±0.08** 0.25±0.06** 0.22±0.07** 0.11±0.04* 150 0.51±0.07* 0.51±0.04* 0.41±0.04 0.26±0.06 75 0.74±0.12 0.72±0.13 0.53±0.07 0.33±0.04
与生理盐水组比较 *P＜0.05 **P＜0.01
表5.马莲酯单钾盐对二甲苯所致小鼠腹膜炎的影响(n＝15)
组别 剂量(mg/kg) 吸光度(±S)
生理盐水 ---- 0.881±0.149
穿琥宁 200 0.561±0.0819**
马莲酯单钾盐 400 0.445±0.0758**
200 0.551±0.0918**
100 0.772±0.0968
与生理盐水组比较 *P＜0.05 **P＜0.01
表6.马莲酯单钾盐对大鼠棉球肉芽肿的影响(n＝10)
组别 剂量(mg/kg) 肉芽肿(mg，±S) 抑制率(％)
生理盐水 ------ 0.881±0.149 ---
穿琥宁 200 0.561±0.0819** 33.90**
马莲酯单钾盐 400 0.445±0.0758** 66.34**
200 0.551±0.0918** 40.98**
100 0.772±0.0968 4.39
与生理盐水组比较 *P＜0.05 **P＜0.01、
表7.马莲酯单钾盐对细菌成长的影响
菌株 马莲酯单钾盐 穿琥宁
1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32
金葡菌 - + + + + + - - + + + +
大肠杆菌 - + + + + + - + + + + +
肺炎球菌 - + + + + + - - + + + +
痢话杆菌 - + + + + + - + + + + +
-无细菌生长， +有无细菌生长