一类具有毒杀松材线虫活性的化合物及其应用 技术领域：
本发明涉及一类具有毒杀松材线虫活性的化合物及其应用，属生物农药技术领域。
背景技术：
松树的松材线虫病是由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus(Steiner &Buhrer)Nickle)寄生在松属树种(Pinus sp.)体内取食营养而导致树木迅速死亡的一种的特大毁灭性病害，属国际重要检疫对象，列为森林病虫害之首，被称为“无烟的森林火灾”。该病自1905年发现、1934年被报道以来，现已广泛分布于日本、美国、韩国、加拿大、墨西哥、希腊、葡萄牙和中国等。日本每年用于该病的防治费用占森林病虫害防治费用的93.6％，占林业总投资的20％，但每年因该病损失木材仍然达100万m3左右。我国于1982年发现该病以来，现已扩展到江苏、浙江、安徽、广东、山东、湖北、上海、香港和台湾等地，发生面积已超过7.3×10hm2，死亡松树2×107株，造成林业经济、森林生态上的巨大损失和自然景观的严重破坏，并对我国广大适生区的松林构成严重威胁。80年代以来，对松材线虫的防治方法主要有：
1.施用能够杀死松材线虫的传播媒介虫——松墨天牛(Monochamusalternatus)的杀虫剂杀螟松(MEP)、倍硫磷(MPP)、甲氨甲酸萘酯(NAC)等。这种防治方法的特点是一种依靠杀死传病媒介来保护松树的被动防治方法，它并不能有效地控制病情的大发生，并对地面植被有相当程度的化学药品污染。
2.直接向树体内注入杀线虫剂(mesulfenphos，tartalicacid)来防治松材线虫。这种方法只适用于保护珍贵树木，而且效果不理想，并且对人畜毒性大。
目前防治松材线虫病的方法主要以喷洒杀虫剂控制松墨天牛为主，但由于松墨天牛成虫期长，抗药性强，防治效果很不理想。至今尚没有研究出能实际应用的杀松材线虫地高效低毒专用农药，也未见有兼治松材线虫和松墨天牛的药剂或方法的研究报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一类来源于淡水真菌的具有毒杀松材线虫活性的化合物及其应用。
本发明的生产菌株为粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)Gr87菌株，该菌株已于2002年10月9日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.0807
本发明的一类具有毒杀松材线虫活性的化合物是从生产菌株的发酵培养物中提取分离得到6种结构相似的化合物，其中化合物1和2为新化合物，该6种化合物的结构如下列式1-6所示(以下分别简称为化合物1-6)：
1 R1＝OH R2＝CH3 x＝3
2 R1＝OH R2＝CH3 x＝4
3 R1＝H R2＝CH3 x＝2
4 R1＝OH R2＝CH3 x＝2
5 R1＝OH R2＝CH2CH3 x＝2
6 R1＝OH R2＝CH(OH)CH3 x＝2
本发明的活性化合物1-6的物化常数、氢谱数据和碳谱数据分别见表1、表2和表3。
表1.化合物1-6的物化常数123456分子量C30H28N6O6S5C30H28N6O6S6C30H28N6O5S4C30H28N6O6S4C31H30N6O6S4C31H30N6O7S4FAB-MS729761680697711727[α]D(CHCl3 orpyridine)[α]D18.0+553.6°(c0.004532g/mL inpyridine)[α]D18.0+555.8°(c0.004365g/mLin pyridine)[α]D18.2+548.9°(c0.004668g/mLin pyridine)α]D22+727.5°(c 0.1 inCHCl3)α]D22+688.2(c 0.1 in CHCl3)α]D22+768.9(c 0.1 inCHCl3)UV(MeOHor pyridine)261.3，255.6，250.1，202.4261.2，255.6，250.2，202.4299.0，261.4，255.6，250.0，202.4240，303241，305242，301IR(KBr)3441，1664，1608，1557，1490，1480，7533430，1678，1611，1552，1483，1470，7493451，1676，1484，1379，1095，7483446，1669，1580，1483，7503390，2923，1690，1668，1610，1469，1349，1302，1247，1203，1093，1065，7563412，2924，1684，1674，1608，1469，1351，1303，1247，1094，1068，765
表2.化合物1-6的1HNMR(吡啶) C 1 2 3 4 5 6 5a 5.72s 6.08s 5.82s 5.78s 5.77s 5.79s 7 6.67d(7.8) 6.65d(7.8) 6.58m 6.70d(7.8) 6.72d(7.8) 6.70d(7.8) 8 7.12t (7.5，7.8) 7.05t (7.5，7.8) 6.98m 7.12t (7.5，7.8) 7.15t (7.5，7.8) 7.10t (7.5，7.8) 9 6.77t(7.5) 6.61m 6.66m 6.79t(7.5) 6.79t(7.5) 6.80t(7.5) 10 8.34(7.5) 8.37d(7.5) 6.98m 8.28d(7.5) 8.27d(7.5) 8.28d(7.5) 11 6.27s 6.38s 6.93s 6.26s 6.26s 6.29s 12 2.79s 2.86s 2.89s 2.83s 2.88s 2.82s 13 1.77s 1.73s 1.97s 1.75s 1.81s 1.74s 5a＇ 5.78s 5.85s 6.95s 5.78s 5.77s 5.86s 7′ 6.72d(7.8) 6.69d(7.8) 6.58m 6.70d(7.8) 6.72d(7.8) 6.68d(7.8) 8′ 7.09t (7.7) 6.93t (7.7) 6.98m 7.12t (7.5，7.8) 7.15t (7.5，7.8) 7.07t (7.5，7.8) 9′ 6.69(7.5) 6.61m 6.66m 6.79t(7.5) 6.79t(7.5) 6.80t(7.5) 10′ 8.17(7.6) 8.12(7.7) 6.98m 8.28d(7.5) 8.27d(7.5) 8.31d(7.5) 11′ 6.39s 6.08s 3.33brs(15.0) 5.03brs(15.0) 6.26s 6.24s 6.33s 12′ 3.01s 2.87s 2.87s 2.83s 2.88s 2.82s 13′ 1.57s 1.61s 1.92s 1.75s 2.12m 4.99q 14′ 1.25t(7.4) 1.52d(6.2)
表3.化合物1-6的C13NMR(吡啶) C 1 2 4 3 5 6 1 166.3s 166.1s 166.1s 166.6s 166.3s 166.1s 3 74.1s 74.0s 74.3s 74.6s 74.5s 74.3s 4 162.3s 162.2s 162.3s 162.7s 162.6s 162.3s 5a 83.6d 83.4d 83.3d 83.3d 83.5d 83.3d 6a 150.8s 150.9s 150.9s 150.6s 151.0s 150.9s 7 110.5d， 110.3d 110.3d 109.0d 110.5d 110.3d 8 130.9d 130.0d 130.1d 129.9d 130.3d 130.1d 9 119.5d 119.4d 119.4d 118.3d 119.5d 119.3d 10 128.8d 128.6d 128.6d 129.3d 128.7d 128.6d 10a 130.9s 130.8s 130.8s 129.6s 130.9s 130.8s 10b 67.4s 67.5s 67.5s 65.6s 67.6s 67.5s 11 82.6d， 82.8d 82.8d 81.3d 83.0d 82.8d 11a 78.5s， 78.8s 78.5s 77.7s 78.7s 78.5s 12 26.9q 27.2q 26.9q 27.2q 27.2q 26.9q 13 17.5q 17.5q 17.6q 18.3q 17.8q 17.6q 1 168.6s 167.4s 166.1s 165.5s 167.2s 167.4s 3′ 72.5s 75.3s 74.3s 74.7s 74.5s 74.3s 4′ 164.9s 164.5s 162.3s 162.5s 161.8s 162.1s 5a＇ 82.0d 84.2d 83.3d 82.0d 83.6d 83.5d 6a′ 153.8s 151.6s 150.9s 150.8s 150.1s 150.8s 7′ 110.6d 110.7d 110.3d 109.2d 110.5d 110.3d 8′ 130.1d 128.8d 130.1d 129.9d 130.3d 130.1d 9′ 118.8d 119.0d 119.4d 118.2d 119.7d 119.5d 10′ 129.7d 129.1d 128.6d 129.3 128.8d 128.7d 10a′ 128.2s 131.1s 130.8s 131.1s 130.9s 130.9s 10b′ 65.51s 67.5s 61.3s 67.6s 67.5s 11′ 85.6d 82.8d 45.8t 83.0d 82.8d 11a＇ 86.6d 78.5s 74.9s 79.1s 78.5s 12′ 27.9q 28.6q 26.9q 26.9q 28.2q 29.2q 13′ 21.2q 23.2q 17.6q 17.7 25.1t 67.2d 14′ 9.9q 20.0q
本发明的活性化合物在液体浸泡法的抗线虫活性测试中，在处理时间为36小时、浓度为1.0mg/mL时，化合物1-6对松材线虫的致死率分别为62.4％、63.5％、54.2％、53.4％、44.6％和49.7％，而化合物4和1的混合溶液及化合物1-6的甲醇粗提物在同样的测试条件和测试浓度下对松材线虫的致死率为75.4％和93.2％。可见化合物1-6均能有效地毒杀松材线虫，可单独或组合用于制备农药制剂；同时活性化合物的粗提物或不同比例的混合物对松材线虫的毒杀活性高于单体化合物的事实说明这类化合物对松材线虫具有协同的毒杀作用。
因此，本发明的化合物可作为制备农药杀线剂应用。
具体实施方式：
实施例1：化合物1-6的分离制备
a.真菌粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)Gr87的种子培养：
PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，酵母提取物1.0g，甘油6.0g，琼脂17g，水1000mL，制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，28℃培养5天；
b.真菌粉红粘帚霉的固体发酵培养：
麦子培养基(制备过程为：将麦子浸于自来水中48h，然后洗净，沥干清水，分别装入500cm的三角瓶中，用棉布包扎瓶口15psi下灭菌两次，每次40min)。
将斜面培养好的菌株挑入固体发酵培养基，于室温25℃静置培养30天；
c.将上述培养好的粉红粘帚霉的菌丝体冻干，再用任选地的有机溶剂(例如甲醇、乙醇、丙醇，乙酸乙酯，四氢呋喃，乙腈)冷浸提取4次，将浓缩的粗提物吸收在固体吸收材料(例如粉碎的天然材料，如高岭土、粘土、滑石，石英等；或粉碎的合成材料，如微粒状硅胶，氧化铝等)上，在硅胶柱中进行色谱分离，干法上样，以氯仿/丙酮＝0-50％为洗脱剂梯度洗脱。
d.收集1％-10％的氯仿/丙酮洗脱液，减压浓缩。
e.将上述浓缩液再次在硅胶柱中进行色谱分离，干法上样，以石油醚/丙酮＝10-80％为洗脱剂梯度洗脱。
f.收集TLC板上硫酸显色为橙黄色的20-30％的石油醚/丙酮洗脱液，浓缩得褚黄色结晶，即为结构式所示的混合物。再经Sephedex-LH20和HPLC层析多次分离，即可获得化合物1-6。
实施例2：
采用液体浸入法检测本发明化合物的单体及混合物抗线虫活性的试验。
1、试验用药剂：
将试验用样品先溶于少量有机试剂DMSO，再加入一定浓度的吐温水溶液分别制备如表4所示浓度的样品测试溶液。在该溶液中，DMSO的终浓度＜3％、吐温的终浓度＜5‰。另将相同浓度的DMSO溶解于含有0.5％(V/V)的吐温-20的水溶液作为对照。
2.松材线虫的培养与制备
松材线虫B.xylophilus的培养方法：将灰葡萄孢(Botrytis cinerea)接入PDA平板，在25℃下培养至长满平板，接入一块带有B.xylophilus的培养基，在25℃下培养至菌丝消失，线虫长满平板。
使用时将载有线虫的培养基挑出，放到线虫分离器中，用无菌水将线虫洗出后，离心浓缩，制备成线虫悬液(每毫升500条左右)。
3.试验方法
将本发明化合物稀释为400ppm、200ppm、100ppm浓度供试药液，将药液2ml置于直径为5cm的培养皿中，再加入活线虫20ul(约300条)线虫的悬液，轻轻混匀后将培养皿放置于25℃的培养箱中。分别于12，24和48小时检查计算线虫的死亡率。并在双目显微镜下观察，观察线虫体壁变化情况。
鉴定线虫死亡的方法为：在处理平板中加入1-5滴5％NaCl溶液，2分钟后观察，死虫僵直，活虫则卷曲或扭动。
死亡率％＝死线虫数/总线虫数×100
以未加样品的测试溶液为对照，整个实验重复三次，取三次平均值计算出平均死亡率。
4.试验结果
表4.测试样品对松材线虫的毒杀活性结果样品测试号样品测试浓 度不同处理时间(小时)内的致死率(％)122436化合物11.0mg/mL0.8mg/mL0.5mg/mL00053.227.815.662.442.121.3化合物21.0mg/mL0.8mg/mL0.5mg/mL00057.832.121.363.534.727.8化合物31.0mg/mL0.8mg/mL0.5mg/mL00048.530.619.654.234.825.4化合物41.0mg/mL0.8mg/mL0.5mg/mL00046.736.527.953.434.530.1化合物4和化合物11.0mg/mL0.8mg/mL0.5mg/mL00070.452.839.175.454.942.3化合物51.0mg/mL0.8mg/mL0.5mg/mL00036.729.419.444.633.721.6化合物61.0mg/mL0.8mg/mL0.5mg/mL00046.232.822.649.744.528.7甲醇提取物1mg/mL0.5mg/mL64.552.388.557.493.260.21％-10％的氯仿/丙酮浓缩物1mg/mL0.5mg/mL58.732.480.652.085.457.620-30％的石油醚/丙酮浓缩物1mg/mL0.5mg/mL54.225.973.135.880.344.2对照3.23.84.1
结果表明：本发明的化合物1-6对松材线虫都有较好的毒杀作用，可用于制备农药杀线剂用；同时活性化合物的粗提物或不同比例的混合物对松材线虫的毒杀活性高于单体化合物的事实说明这类化合物对松材线虫具有协同的毒杀作用。