一种治疗或预防过敏性疾病的有效成分.pdf

《一种治疗或预防过敏性疾病的有效成分.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种治疗或预防过敏性疾病的有效成分.pdf（51页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、10申请公布号CN104056259A43申请公布日20140924CN104056259A21申请号201410112862322申请日2014032410211034420130322TW10311073320140321TWA61K38/44200601A61K35/74200601A23L1/29200601A61P37/08200601A61P11/06200601A61P17/0020060171申请人东宇生物科技股份有限公司地址中国台湾台南市72发明人苏伟志陈湘陵黄浚宪吴小俐李光智蔡佩瑜曾群富74专利代理机构北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司11139代理人孙皓晨54发明名称一。

2、种治疗或预防过敏性疾病的有效成分57摘要本发明公开了一种治疗或预防过敏性疾病的有效成分，其中该有效成分为甘油醛3磷酸脱氢酶G3PDH。此外，本发明还提供了甘油醛3磷酸脱氢酶在制备治疗或预防过敏性疾病的药剂中的用途，以及在制备治疗或预防气喘或异位性皮肤炎的药剂中的用途。30优先权数据51INTCL权利要求书1页说明书18页序列表4页附图27页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书18页序列表4页附图27页10申请公布号CN104056259ACN104056259A1/1页21甘油醛3磷酸脱氢酶（GLYCERALDEHYDE3PHOSPHATEDEHYDROGENA。

3、SE，G3PDH）或其具相同功能的变异体或片段在制备降低个体过敏反应的药剂中的用途。2甘油醛3磷酸脱氢酶或其具相同功能的变异体或片段在制备治疗或预防过敏性疾病的药剂中的用途。3如权利要求2所述的用途，其中该过敏性疾病为气喘。4如权利要求2所述的用途，其中该过敏性疾病为异位性皮肤炎。5如权利要求1或2所述的用途，其中该甘油醛3磷酸脱氢酶具有如SEQIDNO1所示的氨基酸序列。6如权利要求1或2所述的用途，其中该甘油醛3磷酸脱氢酶是选自由加氏乳酸杆菌（LACTOBACILLUSGASSERI）PMA0005菌株及其萃取物、区分物、次区分物或有效成分所组成的群组；其中该PMA0005菌株保藏在中国典。

4、型培养物保藏中心，其菌种保藏编号为CCTCCNOM207039。7如权利要求6所述的用途，其中该萃取物为溶菌酶分解该PMA0005菌株菌体后再以硫酸铵沉淀胞质蛋白质而获得。8如权利要求7的所述用途，其中该萃取物为以浓度为大于0且小于等于25或浓度为5075的硫酸铵沉淀胞质蛋白质而获得。9如权利要求6所述的用途，其中该区分物为溶菌酶分解该PMA0005菌株菌体后再以硫酸铵沉淀胞质蛋白质而获得萃取物后，其再经离子交换层析（IONEXCHANGECHROMATOGRAPHY）分离而得。10如权利要求9所述的用途，其中该区分物为选自由IE12、IE13、IE32及IE33所组成的群组。11如权利要求6。

5、所述的用途，其中该次区分物为溶菌酶分解该PMA0005菌株菌体后再以硫酸铵沉淀胞质蛋白质而获得的萃取物，其再经离子交换层析分离获得区分物后，再以胶体过滤层析法（GELFILTRATIONCHROMATOGRAPHY）分离而得。12如权利要求11所述的用途，其中该次区分物为IE33G1。13如权利要求12所述的用途，其中该次区分物为IE33G1的有效成分为甘油醛3磷酸脱氢酶。14如权利要求6所述的用途，其中该PMA0005菌株的萃取物、区分物及次区分物可与生理上可接受的赋形剂或稀释剂制成一医药组合物或食品组合物。15如权利要求1或2所述的用途，其中该甘油醛3磷酸脱氢酶或其具相同功能的变异体或片段。

6、可与生理上可接受的赋形剂或稀释剂制成一医药组合物或食品组合物。16一种加氏乳酸杆菌（LACTOBACILLUSGASSERI）PMA0005菌株在制备治疗或预防异位性皮肤炎的药剂中的用途，其中该PMA0005菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，其菌种保藏编号为CCTCCNOM207039。权利要求书CN104056259A1/18页3一种治疗或预防过敏性疾病的有效成分技术领域0001本发明涉及一种抗过敏活性物质的用途，具体而言，该包含该抗过敏活性物质的组合物可用于制备预防或治疗过敏性疾病的药剂，尤其是气喘或异位性皮肤炎。背景技术0002过敏性疾病，例如过敏性湿疹、荨麻疹、反复发作的过敏性鼻炎、过。

7、敏性气喘及异位性皮肤炎，在台湾及其他已开发国家已成为严重的社会问题，广为人知的卫生假说为婴幼儿接触免疫刺激病原体的机会愈少，愈容易引发过敏相关疾病的产生。相关研究指出，过敏性疾病发生时，人体内的免疫反应会使TH1细胞数量下降，连续产生多种细胞激素促使免疫反应朝向TH2途径，形成体液免疫反应，例如IGE的产生及嗜伊红血球过多等，经由刺激TH1型免疫反应以调节、平衡过敏所引发TH2型免疫反应，将可达到改善过敏体质的效果。0003但针对气喘的治疗，目前仍以药物治疗为主如类固醇和抑制肥大细胞释放发炎物质的药物、气管扩张剂和免疫疗法等。然而，包括抗发炎药物和气管扩张剂在内的药物治疗仍无法真正的改变过敏免。

8、疫反应，仅为一种治标的方法。0004于异位性皮肤炎治疗上,目前为局部涂抹类固醇TOPICALCORTICOSTEROIDS,TCSLOWENBERGETAL,2008或是局部免疫抑制剂TOPICALCALCINEURININHIBITORS,TCIHULTSCHETAL,2005KIMETAL,2010为最快速有效的方式。但是，仍有一些副作用的疑虑如长期使用类固醇会有皮肤萎缩、皮肤色素改变、皮肤出现血丝、甚至造成像妊娠纹般的扩张纹，且类固醇于人体吸收后可能影响贺尔蒙分泌。而免疫抑制剂也会造成皮肤灼热与刺激感等的副作用。因此，异位性皮肤炎的治疗仍需以有效改善皮肤发炎反应并且没有副作用为目标。00。

9、05另一方面，减敏疗法虽能改变过敏免疫体质，但是通常需要较长的一段时间，且有时会出现一些副作用，并非所有的病人都能够使用。0006因此，仍需开发具抗过敏活性的活性成分，以刺激免疫细胞、调节TH1/TH2免疫反应为作用机制。发明内容0007本发明基于发现甘油醛3磷酸脱氢酶（GLYCERALDEHYDE3PHOSPHATEDEHYDROGENASE，G3PDH）具有抗过敏活性，可降低个体过敏反应，因而可开发为治疗或预防过敏性疾病的药剂，进一步验证其亦可开发为治疗或预防气喘或异位性皮肤炎的药剂。0008因此，本发明一方面提供一种甘油醛3磷酸脱氢酶（GLYCERALDEHYDE3PHOSPHATEDE。

10、HYDROGENASE，G3PDH）或其具相同功能的变异体或片段在制备降低个体过敏反应的药剂中的用途。0009在一方面，本发明提供一种甘油醛3磷酸脱氢酶或其具相同功能的变异体或片段在制备治疗或预防过敏性疾病的药剂中的用途。其中该过敏性疾病可为气喘或异位性皮说明书CN104056259A2/18页4肤炎。0010另一方面，本发明所提供的甘油醛3磷酸脱氢酶具有SEQIDNO1所示的氨基酸序列。0011此外，本发明所提供的甘油醛3磷酸脱氢酶是选自由加氏乳酸杆菌（LACTOBACILLUSGASSERI）PMA0005菌株简称PMA0005菌株及其萃取物、区分物、次区分物或有效成分所组成的群组；其中该。

11、PMA0005菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，其菌种保藏编号为CCTCCNOM207039。该PMA0005菌株已于2007年1月5日申请专利，并记载在台湾专利第I356680号中。0012在一方面。本发明所提供的PMA0005菌株的萃取物、区分物及次区分物可与生理上可接受的赋形剂或稀释剂制成一医药组合物或食品组合物。0013在另一方面,本发明所提供的甘油醛3磷酸脱氢酶或其具相同功能的变异体或片段可与生理上可接受的赋形剂或稀释剂制成一医药组合物或食品组合物。0014除此之外,本发明提供一种加氏乳酸杆菌（LACTOBACILLUSGASSERI）PMA0005菌株在制备治疗或预防异位性皮肤炎的。

12、药剂中的用途，其中该PMA0005菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，其菌种保藏编号为CCTCCNOM207039。0015根据本发明的实施例，该PMA0005菌株的萃取物为溶菌酶分解该PMA0005菌株菌体后再以硫酸铵沉淀胞质蛋白质而获得。在本发明一具体实施例中，该萃取物为以浓度为大于0且小于等于25（W/W）或浓度为5075（W/W）的硫酸铵沉淀胞质蛋白质而获得，其萃取物编号分别为AS_025或AS_5075。0016根据本发明的实施例，该PMA0005菌株萃取物的区分物为溶菌酶分解该PMA0005菌株菌体后再以硫酸铵沉淀胞质蛋白质而获得萃取物后，其再经离子交换层析（IONEXCHANGEC。

13、HROMATOGRAPHY）分离而得。在本发明一具体实施例中，该区分物编号分别为IE12、IE13、IE32及IE33。0017根据本发明另一实施例，该PMA0005菌株萃取物的次区分物为溶菌酶分解该PMA0005菌株菌体后再以硫酸铵沉淀胞质蛋白质而获得的萃取物，其再经离子交换层析分离获得区分物后，再以胶体过滤层析法分离而得。在本发明一具体实施例中，该次区分物IE33G1的有效成分为甘油醛3磷酸脱氢酶。0018本发明的各种具体实施例于下文详述。本发明的其他特征将可由下文有关该等各种具体实施例的详细叙述、图式及申请专利范围而清楚呈现。附图说明0019在本发明中所呈现的较佳具体实施例图式为阐述本发。

14、明为目的。应被理解的是,本发明并不局限于所示的较佳具体实施例。数据以平均值SD表示。其中P005、P001、P0001,成对T检定PAIREDTTEST。0020图1A1C显示该PMA0005菌株的萃取物经离子交换层析进一步分离活性物质的结果；图1A为离子交换层析的条件设定；图1B为萃取物AS_025所分离出3个区分物（FRACTIONS）；及图1C为萃取物AS_5075所分离出3个区分物；0021图2A2E显示将区分物IE12、IE13、IE32和IE33利用胶体过滤层析进一步分离活性物质的结果；图2A为胶体过滤层析的条件设定；图2B为区分物IE12所分离出说明书CN104056259A3/。

15、18页51个次区分物（SUBFRACTION）IE12G1；图2C为IE13所分离出2个次区分物IE13G1和IE13G2；图2D为IE32所分离出3个次区分物IE32G1、IE32G2和IE32G3；及图2E为IE33所分离出5个次区分物IE33G1、IE33G2、IE33G3、IE33G4和IE33G5；0022图3为在给予小鼠萃取物AS_5075（尘螨致敏AS）及次区分物IE33G1（尘螨致敏IE）后，以甲基胆碱诱发气管收缩并测量小鼠呼吸道阻力的结果，其中呼吸道阻力是以PENH表示；0023图4A4C为尘螨致敏小鼠的肺部组织变化评估，显示投予萃取物AS_5075和次区分物IE33G1可显。

16、着降低肺脏的发炎与细胞浸润现象；图4A为肺部细胞冲洗液的细胞计数结果；图4B为肺部细胞冲洗液的细胞分类；及图4C为肺部细胞冲洗液中胸腺活化调节趋化因子（THYMUSANDACTIVATIONREGULATEDCHEMOKINE,TARC）浓度，其中尘螨致敏AS组投予萃取物AS_5075；尘螨致敏IE组投予次区分物IE33G1；0024图5为尘螨致敏小鼠的肺部组织HE染色结果，发现经投予萃取物AS_5075和次区分物IE33G1分别可有效地降低小鼠气管壁增厚及改善免疫细胞大量浸润等现象；其中对照组为正常小鼠；尘螨致敏组以以尘螨致敏；而尘螨致敏AS组投予萃取物AS_5075；尘螨致敏IE组则投予次。

17、区分物IE33G1；0025图6A6D为剂量107CFU或109CFU的PMA0005口服治疗异位性皮肤炎小鼠的生理特征。图6A为小鼠皮肤外观；图6B为CUTOMETER580测量皮肤含水量的结果；图6C为CUTOMETER580所测量的PH值；及图6D为利用TEWAMETERTM210仪器测量表皮水分经皮肤蒸发量TRANSEPIDERMALWATERLOSS,TEWL的结果；0026图7A7D为IE33G1或PBS以腹腔INTRAPERITONEAL,IP注射治疗以尘螨DERP或卵白蛋白OVALBUMIN,OVA致敏的异位性皮肤炎小鼠生理特征；图7A为小鼠皮肤外观；图7B为以CUTOMETE。

18、R580测量皮肤含水量的结果；图7C为CUTOMETER580所测量的PH值；及图7D为利用TEWAMETERTM210仪器测量表皮水分经皮肤蒸发量TRANSEPIDERMALWATERLOSS,TEWL的结果；0027图8A8C为剂量107CFU或109CFU的PMA0005口服治疗异位性皮肤炎小鼠后其皮肤厚度及嗜酸性粒细胞浸润结果。图8A为致敏皮肤位置的苏木精伊红染色HEMATOXYLINEOSINSTAIN,HESTAIN切片结果；图8B为以HE染色切片所测量的皮肤厚度；及图8C为每切片视图的嗜酸性粒细胞数目；0028图9A9C为IE33G1或PBS以腹腔IP注射治疗以尘螨DERP或卵白。

19、蛋白OVA致敏的异位性皮肤炎小鼠其皮肤厚度及嗜酸性粒细胞浸润结果。图9A为致敏皮肤位置的苏木精伊红染色HESTAIN切片结果；图9B为由HE染色切片所测量的皮肤厚度；及图9C为每切片视图的嗜酸性粒细胞数目；0029图10为剂量107CFU或109CFU的PMA0005口服治疗异位性皮肤炎小鼠后其胸腺基质淋巴细胞生成素THYMICSTROMALLYMPHOPOIETIN,TSLP的表达结果；0030图11A11B为剂量107CFU或109CFU鹅PMA0005口服治疗异位性皮肤炎小鼠后其兰格罕细胞LANGERHANSCELLS的数目变化。图11A为致敏皮肤位置染色切片结果；图11B为每切片视图于。

20、表皮层或真皮层的兰格罕细胞细胞数目；0031图12为IE33G1或PBS以腹腔IP注射治疗以尘螨DERP或卵白蛋白OVA致敏的异位性皮肤炎小鼠其TSLP表达结果；说明书CN104056259A4/18页60032图13A13B为IE33G1或PBS以腹腔IP注射治疗以尘螨DERP或卵白蛋白OVA致敏的异位性皮肤炎小鼠其兰格罕细胞LANGERHANSCELLS的数目变化。图13A为致敏皮肤位置染色切片结果；图13B为每切片视图于表皮层或真皮层的兰格罕细胞细胞数目；0033图14A14B为剂量107CFU或109CFU的PMA0005口服治疗异位性皮肤炎小鼠后其总IGE图14A及OVA特异性IGE。

21、图14B的变化。0034图15A15B为IE33G1或PBS以腹腔IP注射治疗以尘螨DERP或卵白蛋白OVA致敏的异位性皮肤炎小鼠其总IGE图15A及OVA特异性IGE图15B的变化；0035图16为剂量107CFU或109CFU的PMA0005口服治疗异位性皮肤炎小鼠其以白血球凝集素LEUCOAGGLUTININ,PHAL或不同浓度OVA刺激脾脏细胞后,该脾脏细胞的增生能力变化结果；0036图17A17B为IE33G1或PBS以腹腔IP注射治疗以尘螨DERP或卵白蛋白OVA致敏的异位性皮肤炎小鼠其以PHAL、不同浓度OVA图17A或DERP图17B刺激脾脏细胞后,该脾脏细胞的增生能力变化结果。

22、；0037图18A18C为剂量107CFU或109CFU的PMA0005口服治疗异位性皮肤炎小鼠其以PHAL、不同浓度OVA刺激脾脏细胞后,其细胞激素IFNINTERFERON图18A、IL17图18B及IL10图18C的变化结果；0038图19A19C为IE33G1或PBS以腹腔IP注射治疗以尘螨DERP或卵白蛋白OVA致敏的异位性皮肤炎小鼠其以PHAL、不同浓度DERP或OVA刺激脾脏细胞后,其细胞激素IFN图19A、IL17图19B及IL10图19C的变化结果。0039图20为剂量107CFU或109CFU的PMA0005口服治疗异位性皮肤炎小鼠其IL17表达情形的染色切片结果；0040。

23、图21为IE33G1或PBS以腹腔IP注射治疗以尘螨DERP或卵白蛋白OVA致敏的异位性皮肤炎小鼠其IL17表达情形的染色切片结果；0041图22为次区分物IE33G1的蛋白质二维电泳分析结果。编号1编号5为甘油醛3磷酸脱氢酶；编号6为果糖二磷酸醛缩酶；0042图23以考马斯蓝染色及使用抗组胺酸（HISTIDINE）抗体进行WESTERNBLOT分析鉴定G3PDH重组蛋白质；其中M蛋白质分子标记；1次区分物IE33G1；2G3PDHHIS重组蛋白；0043图24为G3PDH重组蛋白刺激小鼠树突细胞产生细胞激素IL12（IL12P40）以评估对于免疫调节的功效的结果；其中以添加脂多醣（LIPOP。

24、OLYSACCHARIDE，LPS）或PHA为正对照组，仅有细胞而未额外添加刺激物组为对照组；0044图25为G3PDH重组蛋白刺激小鼠脾脏细胞产生细胞激素INTERFERON（IFN）以评估对于免疫调节的功效的结果；其中以添加LPS或PHA为正对照组，仅有细胞而未额外添加刺激物组为对照组。具体实施方式0045除非另有定义，此处所始有使用的技术及科学名词具有与本发明所属技术领域技术人员一般所了解的相同含义。此处所使用，如有矛盾的情形，以本文件（包括定义）为准。说明书CN104056259A5/18页70046本文所使用的一一词，如未特别指明，是指该冠词的文法上受词为一个或一个以上（即至少为一个。

25、）。例如一成份是指一成份或多于一成份。0047本文所使用的过敏性疾病一词，是指过敏原、过敏原特异性的免疫球蛋白EIGE以及肥大细胞等的共同作用所引发的疾病。首先是过敏原与附在肥大细胞固定区（FRAGMENTCONSTANT,FC）受体的免疫球蛋白E结合后，促使肥胖细胞进行去颗粒作用。而由颗粒释出一些介质如组织胺，白三烯素及趋化因子等，这些介质进而造成血管的通透性增加及气管的收缩而导致症状，同时也会吸引一些其他的细胞如中性白血球，嗜伊红性白血球等，导致相当程度的发炎反应，造成更进一步皮肤、黏膜组织或是血管的慢性发炎。过敏疾病包括但不限于异位性皮肤炎、过敏性鼻炎与气喘、以及一些特定的食物与昆虫叮咬。

26、引起的过敏。这些疾病会导致相当程度的发炎反应，造成皮肤、黏膜组织或是血管的慢性发炎。0048本文所使用的气喘一词，是指因吸入具有诱发性的过敏原引起无法控制的气道过度反应，并伴随呼吸道结构的改变，包括但不限于上皮的增生、黏膜组织的变形、呼吸道平滑肌的增生、以及细胞外基质的增生。0049本文所使用的异位性皮肤炎一词,是指一种皮肤炎的形式,其为一种复发性但不具有传染性的皮肤发炎及皮肤搔痒症状,包括但不限于神经性皮肤炎、内源性湿疹、屈部湿疹及婴儿湿疹。0050本文所使用的具相同功能的变异体一词，是指一使用例如重组基因技术而得，藉由一或若干个氨基酸插入、缺失或取代不同于已知蛋白质氨基酸序列但不影响其功能。

27、的多肽。例如，氨基酸取代是以另一具有相似结构及/或化学性质的氨基酸置换一氨基酸的结果（意即保守氨基酸置换）。而保守氨基酸取代可基于涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性及/或两亲性质的相似性而进行。氨基酸插入或氨基酸缺失则较佳在约1至20个氨基酸范围内，更佳为1至10个氨基酸。允许的变化可通过使用重组基因技术在多肽分子中系统地使氨基酸插入、缺失或取代及鉴定所得重组变异体的活性及功能实验而找出具相同功能的变异体。本文所使用的具相同功能的片段一词，是指已知蛋白质或具相同功能变异体中提供相同功能的部位的氨基酸片段。例如，抗原决定部位的氨基酸序列。0051本文所使用的可接受一词，是指该载剂必需与。

28、组合物的活性成分兼容（较佳为能稳定该活性成分）且对被治疗个体无害。0052本文所使用的有效量一词，是指相较于未接受此量的对应个体，药物或药剂的用量造成所欲的药理或生理上的结果，或疾病、异常或副作用的治疗、治愈、预防、或改善，或减少疾病或异常的发生。服用的有效量或有效剂量可根据所使用的特定有效成分、服用模式、年龄、体型、以及所欲治疗个体的条件而改变。药剂的精确服用量则系依医师的判断进行投药且依个体差异而异。0053根据本发明，发现甘油醛3磷酸脱氢酶（GLYCERALDEHYDE3PHOSPHATEDEHYDROGENASE,G3PDH）具有非可预期的抗过敏活性。在本发明一具体实施例中，针对甘油醛。

29、3磷酸脱氢酶（G3PDH）进行小鼠树突细胞共培养实验，显示G3PDH可有效诱发小鼠树突细胞表达IL12及刺激脾脏细胞表达IFN，显示其具有刺激免疫细胞、调节免疫反应的功效。因此，本发明提供甘油醛3磷酸脱氢酶或其具相同功能的变异体或片段在制备降低个体过敏反应的药剂中的用途。说明书CN104056259A6/18页80054因此，本发明提供甘油醛3磷酸脱氢酶或其具相同功能的变异体或片段在制备降低过敏性疾病以及气喘或异位性皮肤炎的药剂中的用途。0055本发明的一实施例中，甘油醛3磷酸脱氢酶具有如SEQIDNO1所示的氨基酸序列。但本发明所使用的甘油醛3磷酸脱氢酶当包含不同来源以及制程的甘油醛3磷酸脱。

30、氢酶，或其具相同功能的变异体或片段。0056根据本发明，以甘油醛3磷酸脱氢酶（G3PDH）为活性成分可进一步与生理上可接受的赋形剂或稀释剂制成一医药组合物，或一食品组合物。0057根据本发明，包含以甘油醛3磷酸脱氢酶为活性成分的组合物、萃取物、区分物、次区分物（SUBFRACTION）亦可用于制备治疗或预防气喘或异位性皮肤炎药剂。0058根据本发明，该甘油醛3磷酸脱氢酶是分离自加氏乳酸杆菌（LACTOBACILLUSGASSERI）PMA0005菌株，该PMA0005菌株由东宇生物科技股份有限公司开发，于2007年4月6日寄存于中国典型培养物保藏中心，寄存编号CCTCCNOM207039。并于。

31、2007年1月5日申请专利并于2012年1月21日取得台湾专利第I356680号。但于该已获准的专利中并未曾公开其具有预防或治疗过敏性气喘或异位性皮肤炎的功效，亦未公开其有效成分。0059根据本发明，该PMA0005菌株的萃取物可经由本技术领域所熟知的标准方法，例如利用溶菌酶分解菌体并以硫酸铵沉淀胞质蛋白质而获得。在本发明的一具体实施例中，是将该PMA0005菌株以溶菌酶处理而释出细胞质内容物，接续以浓度递增的硫酸铵沉淀蛋白质以获得不同硫酸铵浓度的萃取物，根据不同的硫酸铵浓度可获得4个不同蛋白质萃取物，分别命名为AS_025、AS_2550、AS_5075、AS_75100。将此4种蛋白质萃取。

32、物与小鼠树突细胞共同培养，发现AS_025和AS_5075具有诱发小鼠树突细胞产生高于对照组（仅有细胞）3倍以上的IL12表达量，显示其具有刺激免疫细胞、调节免疫反应的功效；进而将AS_5075经腹腔注射投予小鼠，可显着降低尘螨致敏小鼠呼吸道阻力，并显着抑制肺脏的细胞浸润与发炎现象。因此证实该PMA0005菌株的萃取物具有预防或治疗过敏性气喘的功效。0060根据本发明，该PMA0005菌株的区分物（FRACTION），可经由本技术领域所熟知的标准方法，自上述方法所获的萃取物，接续经离子交换层析（IONEXCHANGECHROMATOGRAPHY）分离而得。在本发明的一具体实施例中，进一步将萃取。

33、物AS_025和AS_5075利用HITRAPTMDEAEFF管柱以离子交换层析法分离活性物质。经由离子交换层析法，AS_025可以分离出3个区分物IE11、IE12和IE13；AS_5075可以分离出3个区分物IE31、IE32和IE33。将此6种蛋白质区分物与小鼠树突细胞共同培养，发现该等区分物可诱发小鼠树突细胞产生高于对照组（仅有细胞）IL12表达量，显示其具有刺激免疫细胞、调节免疫反应的功效。其中IE12、IE13、IE32和IE33的IL12表达量更高于对照组3倍以上。0061根据本发明，该PMA0005菌株的次区分物（SUBFRACTION），可经由本技术领域所熟知的标准方法，自上。

34、述方法所获的区分物以胶体过滤层析法（GELFILTRATIONCHROMATOGRAPHY）的方式进行更进一步的分离活性物质而得。在本发明的一具体实施例中，进一步将区分物IE12、IE13、IE32和IE33利用SEPHACRYLTMS300HR管柱给以胶体过滤层析分离，IE12可以分离出1个次区分物（SUBFRACTION）IE12G1；IE13可以分离出2个次区分物IE13G1和IE13G2；IE32可以分离出3个次区分物IE32G1、IE32G2和说明书CN104056259A7/18页9IE32G3；IE33可以分离出5个次区分物IE33G1、IE33G2、IE33G3、IE33G4和。

35、IE33G5。将此11种蛋白质次区分物与小鼠树突细胞共同培养，发现次区分物可诱发小鼠树突细胞产生高于对照组（仅有细胞）的IL12表达量，显示其具有刺激免疫细胞、调节免疫反应的功效，尤以IE33G1的IL12表达量较对照组高出约73倍以上为最佳；其中将IE33G1经腹腔注射投予小鼠，可显着降低尘螨致敏小鼠呼吸道阻力，并显着抑制肺脏的细胞浸润与发炎现象，证实本发明的次区分物具有降低过敏反应，特别是预防或治疗过敏性气喘的功效。此外，在OVA或是DERP经皮致敏的小鼠以腹腔注射IE33G1后，显着减缓皮肤发炎现象，亦证明本发明次区分物具有降低预防或治疗异位性皮肤炎的功效。0062本发明该PMA0005。

36、菌株的萃取物、区分物及次区分物可进一步与生理上可接受的赋形剂或稀释剂制成一医药组合物，或一食品组合物。因其具有刺激免疫细胞IL12表达的功效，可降低尘螨致敏小鼠的呼吸道阻力及抑制肺脏的细胞浸润与发炎现象；亦可刺激抑制发炎的IL10细胞激素,以降低经OVA或是DERP经皮致敏所造成的皮肤发炎反应，故可用于治疗或预防过敏性气喘或异位性皮肤炎。另外，该PMA0005菌株本身亦具有治疗或预防异位性皮肤炎的功效。0063根据本发明，可依本领域技术人员熟知或标准的方法，依需要选用适当的饮食用材料制成口服药物、食品或饮品。该食品或饮品包括但不限于乳品、发酵乳制品、饮料、运动饮料、营养添加物或保健食品、糖果或。

37、是胶质。0064一些适当赋形剂的实施例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、褐藻酸盐、黄蓍树胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯啶酮、纤维素、灭菌水、糖浆和甲基纤维素其中一种或几种。该组合物可另外包括润滑剂，湿润剂，乳化剂，悬浮剂，保存剂，甜味剂或调味剂其中一种或几种，其中润滑剂包括滑石粉、硬脂酸镁或矿物油其中一种或几种；保存剂包括羟基苯甲酸甲酯或丙酯其中一种或几种。0065本发明进一步以下列实施例说明，其是提供示范的目的而非用以限制本发明。0066实施例1PMA0005菌株的制备0067加氏乳酸杆菌PMA0005菌株以MRS培养基于37培养24小时，挑选单一菌落。

38、于5ML的无菌培养基（表1）于37培养20小时。第3天以无菌方式制作种子罐，取出菌液以50倍稀释于培养基中以37培养16小时。第4天将100ML菌液接种于含有35公升培养基的桌上型微处理控制发酵槽（型号MAJORSCIENCE,MSF1）中进行发酵，于37、PH60条件下培养55小时。当发酵结束后，取出发酵菌液并使用高速离心机去除上清液留下菌泥，计数菌数达到109CFU。0068表10069品名英文名称添加比例葡萄糖GLUCOSE2酵母抽出物YEASTEXTRACT3牛肉蛋白胨MEATPEPTONES2；编号195183说明书CN104056259A8/18页10磷酸氢二钾DIPOTASSIU。

39、MPHOSPHATE02硫酸镁MAGNESIUMSULFATE0005硫酸锰MANGANESESULFATE0001醋酸钠SODIUMACETATE01柠檬酸铵TRIAMMONIUMCITRATE005碳酸钙CALCIUMCARBONATE01TWEEN80TWEEN80010070实施例2PMA0005菌株萃取物的制备0071将实施例1制备的PMA0005菌株菌泥以PBS清洗3次，以50MMTRISHCL（PH80）均匀悬浮菌液并加入1溶菌酶（LYSOZYME），冰上静置反应2小时以释出细胞质内容物。溶菌酶反应后置于超高速离心机于4以22,500G离心30分钟，分成上清液（CYTOSOLIC。

40、FRACTION）及沉淀物（CELLWALLFRACTION）两部分。将上清液置于冰浴并缓缓加入硫酸铵粉末至所需浓度（大于0且小于等于25（W/W）；达到目标浓度后，继续搅拌10分钟并以22,500G于4离心30分钟，以适量体积的50MMTRISHCL（PH80）回收沉淀的蛋白质，同时将离心后上清液继续以硫酸铵进行沈淀。重复以浓度为2550（W/W）、5075（W/W）及75100（W/W）硫酸铵进行沉淀，获得4种浓度的蛋白质萃取物，分别命名为AS_025、AS_2550、AS_5075、AS_75100。使用透析膜（分子量6,0008,000），将收集到的4种蛋白质萃取物置于5公升的50MM。

41、TRISHCL（PH80）于4透析24小时，透析结束后使用高速离心机以4转速22,500G离心30分钟，收集上清液，并测量蛋白质浓度。0072实施例3小鼠树突细胞的分离及介白素12（IL12）测定0073牺牲小鼠取得腿骨并清除肌肉组织，以针筒注入510ML培养基将细胞冲出，将细胞悬浮液于4以1,500RPM离心10分钟，去除上清液。加入1ML红血球溶离缓冲液1分钟以去除红血球，随后加入9MLPBS于4以1,500RPM离心10分钟沉淀细胞。去除上清液，以PBS清洗2次后将细胞悬浮于培养基中，加入IL4（1L/ML）及GMCSF（15L/ML）共同培养促使细胞分化成树状细胞。培养8天后收集细胞并。

42、调整细胞浓度为4106/ML。将树状细胞与待测物共同培养48小时，收取细胞培养的上清液。利用酵素免疫分析法（ELISA）侦测上清液中IL12P40的含量。0074将此4种蛋白质萃取物（10G）与小鼠树突细胞共同培养，经由ELISA测量小鼠树突细胞的细胞激素IL12（IL12P40）分泌量以评估免疫调节功效。实验结果显示，AS_025、AS_2550、AS_5075、AS_75100分别刺激小鼠树突细胞产生54462PG/ML、31590PG/ML、59727PG/ML和15980PG/ML的IL12（表2），其中AS_025和AS_5075可诱发小鼠树突细胞表达IL12高于对照组（仅有细胞）3。

43、倍以上。0075表20076说明书CN104056259A109/18页110077实施例4PMA0005菌株区分物的制备及活性测试0078将实施例2所得经硫酸铵沉淀后的蛋白，经由离子交换树脂管柱层析系统（BIOLOGICDUOFLOWCHROMATOGRAPHYSYSTEM,BIORAD）初步分离活性物质。使用的离子交换树脂管柱为DEAEFF（HITRAPTM,GEHEALTHCARE）。进行蛋白质层析前，以2倍以上管柱体积的缓冲液A（50MMTRISHCL,PH85）充满离子交换管柱进行平衡，随后注入蛋白质样本，以6倍以上管柱体积的缓冲液A进行纯化，同时启动分划收集器收集流出物，每1ML收。

44、集1管。收集30ML后。利用缓冲液B（50MMTRISHCLPH85，1MNACL）提升盐度梯度冲提蛋白质，最后再以100的缓冲液B洗出残余蛋白质。其中AS_025的蛋白质萃取物可分离出IE11、IE12、IE13三种区分物（FRACTION）；AS_5075的蛋白质萃取物可分离出IE31、IE32、IE33三种区分物。0079进一步将萃取物AS_025和AS_5075以离子交换层析法（IONEXCHANGECHROMATOGRAPHY）分离活性物质（图1A）。经由离子交换层析，AS_025可以分离出3个区分物（FRACTION），分别为IE11、IE12和IE13（图1B）；AS_5075可。

45、以分离出3个区分物IE31、IE32和IE33（图1C）。0080将此6个区分物经由测量小鼠树突细胞的IL12（IL12P40）分泌量以评估免疫调节功效。实验结果显示显示IE11、IE12、IE13、IE31、IE32和IE33分别刺激小鼠树突细胞产生IL12达4276PG/ML、113585PG/ML、12132PG/ML、25887PG/ML、109841PG/ML和185039PG/ML（表3），其中IE12、IE13、IE32和IE33可诱发小鼠树突细胞表达IL12高于对照组（仅有细胞）3倍以上。0081表30082说明书CN104056259A1110/18页120083实施例5PM。

46、A0005菌株次区分物的制备及活性测试0084经实施例4离子交换树脂管柱层析分离所获得的区分物IE12、IE13、IE32、IE33再以胶体过滤管柱层析分离（SEPHACRYLTMS300HRCOLUMN,AMERSHAMBIOSCIENCE）。进行前，管柱与操作机器先以2倍以上管柱体积的缓冲液（50MMTRISHCL,PH95,50MMNACL）进行平衡。取样本以针筒注入管柱，样本体积约为胶体体积的3以下，再注入样本后以预定流速约05ML/MIN进行，收集所得的样本进行蛋白质定量及活性分析。0085将区分物IE12、IE13、IE32和IE33利用胶体过滤层析（GELFILTRATIONCH。

47、ROMATOGRAPHY）（图2A）进行更进一步的分离活性物质。经由胶体过滤层析法，IE12可以分离出1个次区分物（SUBFRACTION）IE12G1（图2B）；IE13可以分离出2个次区分物IE13G1和IE13G2（图2C）；IE32可以分离出3个次区分物IE32G1、IE32G2和IE32G3（图2D）；IE33可以分离出5个次区分物IE33G1、IE33G2、IE33G3、IE33G4和IE33G5（图2E）。0086将此11个经由胶体过滤层析纯化所获得的次区分物经由测量小鼠树突细胞的细胞激素IL12（IL12P40）分泌量以评估免疫调节功效。实验结果显示IE12G1、IE13G1、。

48、IE13G2、IE32G1、IE32G2、IE32G3、IE33G1、IE33G2、IE33G3、IE33G4和IE33G5分别刺激小鼠树突细胞产生1765PG/ML、55963PG/ML、32775PG/ML、81338PG/ML、39875PG/ML、23450PG/ML、149363PG/ML、21513PG/ML、20363PG/ML、22738PG/ML、24550PG/ML的IL12（表4），其中IE33G1可诱发小鼠树突细胞IL12的表达，高于对照组（仅有细胞）73倍以上。0087表40088说明书CN104056259A1211/18页130089实施例6PMA0005菌株的有。

49、效成分可降低小鼠的过敏性气喘0090材料与方法00911以尘螨致敏的小鼠模型的制备0092将家尘螨萃取物（DERPEXTRACT）和氢氧化铝混合均匀以腹腔注射方式致敏小鼠，每次注射时间间隔1周，共注射3次。第3次注射后1周，于气管内接种过敏原诱发反应。小鼠秤重后进行麻醉，以镊子夹出小鼠的舌头，再以微量注射器于喉咙滴进50L的家尘螨抗原溶液（05MG/ML）。等待小鼠发出呛鼻声后松开镊子，放掉舌头，小鼠保持直立状态1分钟后，并以光照致恢复清醒。00932支气管肺泡冲洗液的收集及白血球分类0094以1ML低温无菌生理食盐水经由针头慢慢注入肺部致整个肺完全膨胀再回抽，如此反复三次后，将冲洗液置于冰上暂存。重复此冲洗步骤，将收集到的肺泡冲洗液（2次共约18ML），以1,200RPM、4离心10分钟。收集上清液保存于70冰箱。将沉淀的细胞经伊红Y（EOSINY）染色并计算细胞数目。取50100L支气管肺泡冲洗液，以CYTOSPIN离心机制作细胞抹片，进行刘氏染色（LIUSSTAIN）并以油镜观察白血球及计数。00953组织切片染色0096已固定的组织切片首先脱腊并复水（REHYDRATE），浸于蒸馏水后，以05过碘酸反应15分钟，以自来水冲洗5分钟，再次浸于蒸馏水后，用希夫氏（SCHIFFS。