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1、10申请公布号CN104066442A43申请公布日20140924CN104066442A21申请号201380006417222申请日2013012212152159520120123EPA61K38/28200601A61K9/08200601A61K47/0620060171申请人诺瓦利克有限责任公司地址德国海德尔堡72发明人伯恩哈德金特巴斯蒂安泰辛格索尼娅泰辛格迪特尔谢勒克莱夫威尔逊安东尼佩蒂格鲁安妮特休蒂格74专利代理机构上海胜康律师事务所31263代理人李献忠54发明名称基于半氟化烷烃的稳定蛋白质组合物57摘要本发明提供了具有改善的稳定性和保质期的生物活性多肽和蛋白质的新的组合物。
2、。该组合物是基于选自半氟化烷烃的液体赋形剂。这些赋形剂对保护多肽和蛋白质免受降解和/或聚合的影响显著有效。该组合物对例如给药到眼睛中、或通过例如经由皮下或肌内途径等肠外注射的局部给药是有用的。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014072386PCT国际申请的申请数据PCT/EP2013/0511632013012287PCT国际申请的公布数据WO2013/110621EN2013080151INTCL权利要求书1页说明书12页附图5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书12页附图5页10申请公布号CN104066442ACN104066442A1。
3、/1页21一种组合物，其包括生物活性化合物和液体赋形剂，其中所述液体赋形剂包括式RFRH的半氟化烷烃，其中RF是具有4至12个碳原子的直链全氟烃段，并且其中RH是具有4至8个碳原子的直链烷基；并且其中所述生物活性化合物是选自多肽和蛋白质的治疗剂或诊断剂或疫苗并且被掺入所述组合物中以形成分散体或悬浮体。2根据权利要求1所述的组合物，其中所述多肽或所述蛋白质具有至少约1,500DA的分子量，以及特别是具有至少约2000DA的分子量。3根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述生物活性化合物对降解和/或聚合敏感。4根据任何前述权利要求所述的组合物，其中所述生物活性化合物是单个结构域的蛋白质或者两个结构。
4、域的蛋白质。5根据任何前述权利要求所述的组合物，其中所述生物活性化合物是胰岛素。6根据任何前述权利要求所述的组合物，其中所述半氟化烷烃选自F4H5、F4H6、F4H8、F6H4、F6H6、F6H8和F6H10。7根据任何前述权利要求所述的组合物，其基本上不含水。8根据任何前述权利要求用作药物的所述的组合物。9根据权利要求8用作药物的所述组合物，其中所述药物是通过皮下、真皮、肌内或局部注射用于肠外给药的。10根据权利要求8用作药物的所述组合物，其中所述药物是用于局部给药至患者的眼睛、耳朵、肺部、皮肤或鼻子。11一种制备包含选自多肽或蛋白质的生物活性治疗剂或诊断剂或疫苗的组合物的方法，其包括将所述。
5、生物活性多肽或蛋白质掺入包含式RFRH的半氟化烷烃的液体赋形剂中以形成分散体或悬浮体的步骤，其中RF是具有4至12个碳原子的直链全氟烃段，并且其中RH是具有4至8个碳原子的直链烷基。12根据权利要求11所述的方法，其中所述多肽或蛋白质具有至少约1,500DA的分子量，以及特别是具有至少约2000DA的分子量。13根据权利要求11或12所述的方法，其中所述生物活性多肽和蛋白质对降解和/或聚合敏感。14根据权利要求11至13中任何一项所述的方法，其中所述组合物是化学稳定的和/或是物理稳定的。权利要求书CN104066442A1/12页3基于半氟化烷烃的稳定蛋白质组合物技术领域0001本发明属于肽和。
6、蛋白质组合物的领域，特别是对治疗或诊断用途有用的作为多肽或蛋白质的药物制剂的组合物。背景技术0002由于生物技术领域中已经出现的许多新进步和新进展的缘故，最近几年已经出现了将不可治疗的疾病或疑难杂症作为目标的基于肽和蛋白质的新类型的治疗性的生物药剂学。0003然而，由于它们的口服生物利用度低和在体内的总的半衰期短，许多迄今开发的蛋白质和多肽疗法的给药方法已主要被限制在肠外途径。目前获准的人类单克隆抗体快速发展的靶向治疗剂类都需要通过注射给药。例如，首先标明用于治疗类风湿性关节炎的人类单克隆抗体阿达木单抗HUMIRATM，由ABBOTT销售存在于预填充注射器中。只有少数口服、粘膜或吸入治疗性组合。
7、物是目前市售的，其中许多仅包含相对较低分子量的多肽制剂。通过吸入途径给药的较高分子量的蛋白质治疗剂的一个例子是标明为治疗囊肿性纤维化的重组人类脱氧核糖核酸酶I的溶液阿法链道酶PULMOZYMETM，由ROCHE分销。0004蛋白质和多肽的绝对分子大小和复杂性，以及它们的通过破坏它们的结构完整性相对容易损失的活性，对加工、配制和输送这些类型的治疗剂提出了挑战。0005蛋白质的生物活性是由其独一无二的三维结构；其二级结构和三级结构决定。围绕蛋白质的肽链成分之间的诸如氢键、静电作用、范德华力、疏水作用，以及共价键等内部相互作用的特定的和平衡的组合导致了天然状态的折叠的蛋白质的最终结构。这些相互作用的。
8、边际变化可以潜在地对蛋白质的结构完整性有很大的影响。蛋白质的精确的生物功能是基于其与其它相关的大分子和/或小分子的特异性相互作用。因此，如果以任何方式破坏必要的三维特征，则蛋白质将失去特异性并因此失去治疗效果。0006可以通过许多降解途径使天然蛋白质的结构发生损伤。可以通过诸如天然蛋白质单体的自缔合、或部分未折叠的蛋白质缔合成非天然寡聚体之类的非共价键合作用发生聚合。也可以通过诸如交联二硫键的形成和/或交换、肽键水解、脱酰胺、或氧化之类的共价的、不可逆的化学作用发生蛋白质的变质和聚合。这些现象的发生率不仅取决于蛋白质的固有特征，还取决于诸如包括类似冻融周期的相关的应力条件的温度、PH、蛋白质浓。
9、度、离子强度、去稳定的化学添加剂的存在、诸如空穴作用或切应力之类的干燥和机械应力因素等一些物理化学环境条件，所有这些因素都可以对天然折叠结构的蛋白质产生不利的影响。0007蛋白质缔合成这种的通常是高分子量形式的寡聚体，给蛋白质或多肽疗法制剂THERAPEUTICS的制备、运输和长期储存方面造成了严重问题。聚合可能导致活性蛋白质药物的损失，从而导致不可靠的和无效的配药。在液体制剂中，可能是不溶性的聚合体可以沉淀并形成可阻碍流动的大颗粒，这将对肠外施用极为不利。此外，蛋白质聚合体可以表现出毒性并能触发不希望有的免疫原性反应ROSENBERG,AS,AAPSJ,2006,8,E501。因此，说明书C。
10、N104066442A2/12页4选择用于蛋白质或多肽的液体制剂的介质的特性可对制剂的实用性和寿命产生重大影响。0008已知水性环境在大多数情况下对蛋白质的结构和生物活性的维持是重要的，即水分子可以是折叠所必不可少的或者甚至是折叠的驱动力和/或可以在酶的活性中发挥直接作用。另一方面，取决于水相的组合物的性质以及诸如PH和离子强度之类的各种参数，水性介质也可能有不良作用。水可以充当增塑剂或者可以用作反应介质以及可以例如在酰胺键水解断裂中直接作为反应成分。因此，在制定蛋白质疗法制剂的领域中已广泛使用的方法是将蛋白质冷冻干燥冻干或喷雾干燥成固态粉末的形式。在这种情况下，水的去除限制了蛋白质大分子与其。
11、它物质相互作用的构象的灵活性和扩散的移动性，从而减少聚合的可能性。因此，与许多水基制剂相比，干燥状态下的蛋白质的较长期储存基本上是可行的。0009然而，应该指出的是，在冷冻干燥过程本身期间可能很容易发生蛋白质的降解和聚合，并因此为了减少这些作用的发生率，用于开发冷冻干燥过程的时间投入和成本必然很高。也经常添加用作补偿水的氢键合作用的损失的诸如糖类、多元醇等的附加的稳定剂到预冷冻干燥组合物中。尽管这样的赋形剂在冷冻干燥过程中是有用的，但是在干燥状态下随着时间的推移例如经由结晶通过相分离可能对蛋白质的稳定性是有害的。为了得到蛋白质的较长的保质期，也可以根据需要包括其它的冷冻干燥后的稳定赋形剂，从而。
12、增加必定要存在于最终制剂中的组分的数量。0010另外，尽管除去了水，但是干燥状态下的蛋白质组合物也不能避免例如温度、以及诸如脱酰胺或氧化反应之类的其中水不是关键试剂的化学降解反应等外部环境因素的影响。温度升高导致流动性增加并且因此有较大的可能性发生蛋白质内部的反应，因此许多经冷冻干燥的蛋白质仍然需要始终在冷藏条件下储存。另外，为使制剂的PH和等渗更适合于冷冻干燥过程而添加的赋形剂可以不是作为最终干燥状态的蛋白质的稳定剂。水分的引入可能会是一个问题，而且还必须特别注意干燥固体状态的蛋白质的储存装置以及材料。0011此外，之前，水性介质中的经冷冻干燥的蛋白质的重组作为实际施用之前的额外的步骤是必要。
13、的，并且有不当处理/剂量和污染的风险。如果水性介质的PH值、或温度不是最佳的或者适当的再水合的时间太短，则重组步骤本身可能触发蛋白质聚合。因此，也可能需要考虑和适当地研发合适的重组介质的配方。总体而言，从经济角度来看，与液体制剂相比，经冷冻干燥的蛋白质的工艺和配方研发涉及大量的时间、精力和成本WANG,W,INTJPHARM,2000,203,1。0012制定蛋白质疗法制剂的另一种选择是使用有机溶剂作为载体介质。然而，应当注意的是，这些溶剂可能不总是对蛋白质的结构有稳定作用，在某些情况下，反而有相反作用。例如，较高浓度的诸如DMSO或DMF等强极性溶剂和诸如甲醇或乙醇之类的醇类通常通过与内酰胺。
14、氢键竞争可以充当变性剂，该竞争会导致三级结构的丧失；甚至可以导致二级结构的比率改变，可能导致得到非天然结构STEVENSON,CL,CURRPHARMBIOTECH,2000,1,165。因此，这些溶剂可能对蛋白质疗法制剂的长期贮存不理想。类似地，这些类型的溶剂的生理耐受性可能较低，并且需要考虑有关蛋白质的释放和吸收还取决于其在这样的溶剂体系中的溶解性的状态的其它因素。0013在水性介质中的溶液形式的蛋白质治疗制剂往往简单易得。另一方面，使用有机说明书CN104066442A3/12页5溶剂的制剂需要进一步考虑，因为蛋白质在这样的介质中的总的非溶解性或部分溶解性，具体取决于溶剂的极性和蛋白质的。
15、物理性质。疏水性的有机溶剂和无水的经冷冻干燥的蛋白质的组合通常会产生分散体或悬浮体。在这种情况下，在制剂的研发期间，除了蛋白质本身的长期稳定性之外，悬浮体的长期物理稳定性也是重要的考虑因素。虽然已有报道为了肠外应用而使用诸如油和脂类之类的非极性溶剂作为蛋白质或多肽的悬浮载体，但是这些载体在生理温度下在延长的时间期间的稳定性已受到质疑KNEPP,VMETAL,PHARMRES1998,15,1090。此外，这些化合物可能会引起如注射部位疼痛之类的副作用。此外，油和脂类往往强烈地使治疗剂的释放变缓。这可能是实现较长期的持续释放或仓库型注射制剂的有用的特征，但如果期望得到更迅速和即时的生物利用性，则。
16、不是有用的特征。0014已描述了基于聚合物的组合物，例如，已经报道包含作为聚合物成分的聚乙烯基吡咯烷酮以及作为溶剂的乳酸月桂酯或月桂醇的适合与可植入装置结合使用的蛋白质或肽试剂的粘性非水悬浮制剂US7258869和EP1152749。这样的组合物被认为适合于这样的治疗剂的持续释放。0015全氟化合物也已被用作蛋白质、多肽和其它生物活性剂的非水的液体载体。例如，在US6458376中描述了建议用于眼科应用如局部应用的眼药水的组合物，其中包括寡肽和蛋白生长因子的治疗/诊断化合物悬浮于全氟化碳并且存在至少一种表面活性剂。然而，它对能够适于在含有蛋白质或肽治疗化合物的组合物中使用的特定的表面活性剂的选。
17、择的问题保持沉默，并且没有讨论随着时间的推移，这样的特定的化合物在这些制剂中的长期的化学稳定性和物理稳定性。0016EP0939655和US6730328公开了一些热稳定制剂，在这些热稳定制剂中，诸如矿物油、全氟萘烷、甲氧氟烷METHOXYFLUORANE、全氟三丁胺或十四烷之类的非水性的、疏水性的、非反应性的赋形剂中用于含有蛋白质、蛋白质化合物与核酸的悬浮组合物。提出了这些制剂的肠外给药方法、透皮给药方法、粘膜给药方法、口服给药方法和经肠给药方法，以及提出了它们经由可植入装置长期连续给药和输送的用途。然而，没有公开在长时间之后这些悬浮体组合物保持物理稳定的能力，即均匀地分散或再分散的能力。也。
18、尚未证实这些类型的组合物的实际的组织兼容性。0017US2010/0008996中提到作为输送活性物质到患者的肺膜/肺部区域的载体的SFAS的吸入或滴注使用。更具体地说，该文献教导在SFAS中表现出的足够的溶解性以及其具有101NM范围内的分子尺寸的活性物质的胶束胶体溶液，以便促进穿过肺膜运输至血流。它公开了被描述为对吸入或滴注有用的小分子药物的基于SFA的组合物布洛芬、生育酚、视黄醇棕榈酸酯、5氟尿嘧啶、溴己新、奥司他韦、和氨溴索。与此相反，它并没有公开诸如蛋白质之类的为较大分子的活性物质的任何具体组合物，也没有公开不溶于SFAS的活性物质的任何具体组合物。0018WO2011/073134。
19、类似地公开了包括环孢素一种在半氟化烷烃中分子量为120261的环状多肽的任选地在诸如乙醇之类的共溶剂的存在下的溶液。同时也提到悬浮体和乳液作为任选的替代物，但是没有具体公开这种类型的组合物。0019KOCIOK等GRAEFESARCHCLINEXPOPHTHALMOL2005,243,345358探讨了巨噬细胞的穿过细胞膜附着物的活性是否可由一定水泡尺寸的乳化液滴填塞支撑。为此目的，说明书CN104066442A4/12页6他们通过挤压半氟化烷烃使其穿过聚碳酸酯过滤膜进入PBS溶液中制备在水连续相中的F6H8的乳化液滴称为单层水泡。为了确定人血清白蛋白HSA是否对血嗜中性粒细胞的活化有影响，通。
20、过将HSA包含到水性的PBS溶液中使一些液滴包被有HSA。0020本发明的目的是引入克服与目前已知的制剂相关的局限性和缺点的新的蛋白质或多肽组合物。发明内容0021在第一方面中，本发明提供了在包含式RFRH的半氟化烷烃的液体赋形剂中的生物活性多肽或蛋白质的新的组合物，其中RF是具有4至12个碳原子的直链全氟烃段，并且其中RH是具有4至8个碳原子的直链烷基。0022生物活性多肽或蛋白质优选具有至少约1,500DA的分子量，特别是具有至少约2000DA的分子量，并且被掺入到组合物中，以形成分散体或悬浮体。多肽或蛋白质优选是治疗剂或诊断剂或疫苗。0023生物活性化合物优选是对降解和/或聚合敏感的多肽。
21、或蛋白质。本发明人已经发现相比于其它有机溶剂，使用半氟化烷烃提供了诸如胰岛素之类的蛋白质的更稳定的分散体或悬浮体。结合起来，也已确定，半氟化烷烃对这种化合物具有显著的稳定作用，并且诸如胰岛素之类的敏感的蛋白质甚至可以经受显著升高的温度而不会通过聚合和/或降解损失生物活性。0024特别有用的半氟化烷烃是选自根据如本文下面所定义的F4H5、F4H6、F4H8、F6H4、F6H6、F6H8和F6H10。这些半氟化烷烃有良好的组织耐受性，能够溶解在药物组合物中可能需要的大范围的其它赋形剂，并且可能由于它们固有的两亲性而与多肽和蛋白质形成药学有利的分散体或悬浮体。0025在一个方面中，本发明的蛋白质或多。
22、肽组合物在室温下，甚至在高温例如，约37，或生理温度下是化学稳定和物理稳定的，因此保留了蛋白质或肽试剂的生物活性以及有微不足道的治疗剂的聚合。在进一步的方面，本发明中的蛋白质或多肽悬浮体组合物在高温例如，约37，或生理温度保存后也保持单分散和/或可以很容易再分散。0026此外，本发明提供了这种组合物的医疗用途以及稳定对降解和/或聚合敏感的多肽或蛋白质的方法，该方法包括将多肽或蛋白质掺入包括如上所定义的半氟化烷烃的液体赋形剂中。具体实施方式0027在第一方面中，本发明提供了包含生物活性化合物和液体赋形剂的组合物。生物活性化合物选自属于多肽和蛋白质的治疗剂或诊断剂或疫苗。优选地，多肽或蛋白质具有至。
23、少约1,500DA的分子量，特别是具有至少约2000DA的分子量。液体赋形剂包括式RFRH的半氟化烷烃，其中RF是具有4至12个碳原子的直链全氟烃段，并且其中RH是具有4至8个碳原子的直链烷基。此外，将生物活性化合物掺入组合物中以形成分散体或悬浮体；即，生物活性化合物分散或悬浮在液体赋形剂中。0028从医药角度来看，半氟化烷烃是非常有利的赋形剂首先，它们基本上是无毒的，即，各种类型的人体和动物组织在局部给药或注射后的良好的耐受性。其次，它们是化学惰说明书CN104066442A5/12页7性的，并且没有表现出与药物制剂中活性成分或非活性成分之间的有害的相互作用。第三，可能由于它们固有的两亲性的。
24、程度，它们能溶解大范围的化合物，例如小分子的活性成分或许多常见的在药物制剂中有用的赋形剂。第四，当掺入不溶于或只是很少溶于半氟化烷烃如许多多肽和蛋白质的化合物时，它们形成具有非常有用的物理或药学性质的分散体或悬浮体，即，很少或往往不形成固体的、非分散的沉积物。0029本发明人发现，在半氟化烷烃中的蛋白质分散体和悬浮体令人惊奇地稳定。它们保持良好的分散性和均匀性，并且如果发生浮动或沉积时，它通常会缓慢地发生，留下足够的时间使患者或护理人员在摇晃容纳该制剂的容器例如小瓶之后撤回剂量。没有观察到大的很难再分散的聚合体的形成，并且在浮动或沉积之后，通过轻轻摇晃很容易使蛋白质颗粒再分散而无显著的损失，并。
25、且似乎在很大程度上保留其原始颗粒尺寸分布。0030与此形成鲜明对比的是诸如全氟化碳之类的其它化学惰性液体赋形剂，全氟化碳在US5,518,731和US6,458,376中已被提议作为药物的赋形剂。本发明人已经发现，当诸如全氟辛烷或全氟萘烷之类的全氟化合物或如辛烷等其它有机溶剂被用作液体赋形剂时，悬浮体往往显著地更不稳定，即它们通过分散相的浮动或通过它的沉积非常迅速地分离，具体取决于分散相与连续相的相对密度。这伴随着颗粒聚合体的快速形成，该颗粒聚合体可能是致密的并且很难再分散。即使快速浮动或沉积没有使得精确和可重复的剂量给药变得不可能，也会使得其非常具有挑战性。例如，如果可注射或眼用悬浮体在振摇。
26、后沉淀很快，则满装容器例如，小瓶中的首次剂量给药在振摇时没有立即撤回的情况下将含有数量比预期数量少的药物颗粒，除非保持容器倒置，这这种情况下，将分配数量比预期数量多的药物颗粒。如果每单位体积撤回的药物剂量在开始时是低的，则当相同的容器几乎是空的并且分配最后的剂量时，每单位体积撤回的药物剂量将会太高，并且反之亦然。0031此外，在全氟化载体或类似辛烷等其它有机溶剂中的蛋白质的大的和很难再分散的聚合体的形成可能导致诸如那些用于皮下注射的细注射针头的堵塞。大颗粒有引起体内不良反应的危险，特别是炎症性突起INFLAMMATIONPROCESSES。0032还观察到，悬浮在全氟化合物或辛烷中的颗粒往往粘。
27、附到用于撤回剂量的玻璃小瓶容器和/或针头注射器的壁上。这也将导致干扰剂量的精确。0033基于SFA的悬浮体的有利性质导致优秀的药品质量和性能特点。对患者和/或健康护理提供者的便利水平大大提高。更重要的是，相比于其它类型的药物悬浮体，大大提高了剂量给药的准确性即给药的精度和再现性。这将带来更可靠的治疗效果并且减少了由过量给药带来的不良反应的风险。0034同时，半氟化烷烃对多肽和蛋白质有显著的稳定作用。它们基本上防止或抑制蛋白质聚合并且显著地减少化学降解。事实上，已发现，一些敏感的蛋白质稳定到当掺入到半氟化烷烃中时可以将它们暴露在诸如50的高温下而无生物活性的损失的程度。本发明的主要优点是由用作液。
28、体赋形剂的半氟化烷烃存在于组合物中所带来的。半氟化烷烃是氢原子的一些已被氟取代的直链或支链烷烃。在本发明中使用的半氟化烷烃SFAS中，存在一个线性非氟化的烃段和一个线性全氟化烃段。因此，这些化合物遵循通式FCF2NCH2MH。根据本发明，N选自4至12的范围，以及M选自4至8的范围。0035经常用于SFA的命名法将全氟化烃段命名为RF并且将非氟化段命名为RH。替代地，该化合物可以分别地被称为FNHM和FNHM，其中F表示全氟化烃段，H表示非氟化段。再说明书CN104066442A6/12页8次，M定义各个段的碳原子的数目。例如，F3H3用于全氟丙基丙烷。此外，这种类型的命名法通常用于具有直链段。
29、的化合物。因此，除非另有说明，否则应当认为F3H3是指1全氟丙基丙烷，而不是指2全氟丙基丙烷、1全氟异丙基丙烷、2全氟异丙基丙烷。0036在本发明的背景中有用的SFA也在EPA965334、EPA965329和EPA2110126中有描述，该文件的公开内容并入本文。0037优选的SFA特别包括化合物F4H5、F4H6、F4H8、F6H4、F6H6、F6H8和F6H10。实施本发明特别优选的是F4H5、F4H6、F6H6和F6H8。在另一个特别优选的实施方式中，本发明的组合物包含F6H8。0038任选地，组合物可以包含一个以上的SFA。例如，为了实现诸如一定的密度或粘度之类的特定的目标性能，组合。
30、SFA可能是有用的。如果使用SFA的混合物，则该混合物进一步优选包含F4H5、F4H6、F6H4、F6H6、F6H8和F6H10中的至少一种，以及特别是包含F4H5、F4H6、F6H6和F6H8中的一种。在另一个实施方式中，所述混合物包含选自F4H5、F4H6、F6H4、F6H6、F6H8和F6H10中的至少两个成员，以及特别是选自F4H5、F6H6和F6H8中的至少两个成员。0039液体SFA在化学上和生理上是惰性的、无色的和稳定的。它们通常的密度范围为11至17G/CM3，以及它们的表面张力可以低至19MN/M。RFRH类型的SFA是不溶于水但也有些两亲性，亲脂性的增加与非氟化段的尺寸增大。
31、相关联。0040RFRH类型的液体SFA商业上用于展开和重新应用视网膜，用于作为玻璃体替代物的长期填塞物HMEINERTETAL,EUROPEANJOURNALOFOPHTHALMOLOGY,VOL103,PP189197,2000，和用作玻璃体视网膜手术后残余硅油的洗出溶液。在实验上，它们也被用作血液替代物HMEINERTETAL,BIOMATERIALS,ARTICIALCELLS,ANDIMMOBILIZATIONBIOTECHNOLOGY,VOL215,PP58395,1993。这些应用已经证实了SFA为生理耐受性良好的化合物。在另一方面，截至今日SFA没有被用作已批准的药品中的赋形剂。
32、。0041本发明的组合物包含选自多肽或蛋白质的生物活性化合物。多肽和蛋白质代表通过肽键相互连接的氨基酸单元的聚合物。由于通常用于区分多肽和蛋白质的大小边界有些随意，这些分子的两种表达方式本发明的上下文中不应被理解为相互排斥的多肽也可以称为蛋白质，反之亦然。通常，术语“多肽”仅指单个聚合物链，而表达方式“蛋白质”还可以指通过非共价键彼此连接的两个或多个多肽链。优选地，根据本发明的生物活性化合物应该具有至少约1,500DA的分子量，特别是具有至少约2000DA的分子量。0042如上面更详细描述的，多肽和蛋白质的生物活性不仅依赖于它们的主要化学结构，即它们的氨基酸序列，而且还依赖于其二级和三级结构，。
33、也常常依赖于它们的四级结构。通常，多肽或蛋白质对降解的敏感性还涉及到它的二级结构、三级结构或甚至四级结构。将会从本发明获益的多肽和蛋白质都包括化学性质不稳定的化合物，如容易水解的化合物，以及具有迅速失去其二级或更高的结构和/或变性的倾向的化合物。特别是，组合物包含对降解和/或聚合敏感的多肽或蛋白质。0043这种敏感性通常意味着相应的化合物不能在常见的水性介质中被配制成液体制剂例如，准备通过注射使用，即使在掺入稳定赋形剂例如缓冲剂等的情况下也如此，以及不能在正常条件下储存。因此，为了得到可接受的保质期通常为至少2年，敏感的化合物的药物制剂在储存期间或者必须被冷藏，或者它们必须以干燥形式提供，在使。
34、用前说明书CN104066442A7/12页9从它们的干燥形式重新配制。特别是，“敏感”意味着相应的化合物当被配制在优化的水性赋形剂中时，于正常条件下在少于1年的储存时间内就失去至少约5的生物活性。0044在优选的实施方式中，多肽或蛋白质是治疗性或诊断性化合物或疫苗。如本文所用，治疗性化合物是对防止疾病或病症、减轻疾病或病症的任何症状、改善任何疾病或病症、推迟疾病或病症的发展或类似的情况有用的化合物。诊断性化合物是对确定生物体的状态有用的或者对诊断疾病、病症、症状或患者的表型有用的。治疗性化合物必须对患者施用，而诊断剂则根据具体情况可在体内或体外使用。为免生疑问，将治疗性化合物或诊断性化合物并。
35、入治疗或诊断有效量的本发明的组合物中。0045本发明人还发现，半氟化烷烃对化学或生物活性的稳定效果是非常显著的，前提为生物活性化合物是在这类治疗剂和诊断剂的分子大小的低至中档范围内的多肽或蛋白质。在一个具体的实施方式中，生物活性剂的分子量范围为从约2,000至约100,000DA。在进一步的实施方式中，该分子量范围为从约1,000至约60,000DA。在进一步的实施方式中，该分子量范围分别为从约2,000至约60,000DA，或从约5,000至约50,000DA。另一方面，使用诸如血清白蛋白大约67KDA，或甚至超过10万DA的蛋白质之类的相对大的分子大小的多肽和蛋白质也容易获得分散体或悬浮体。
36、的物理稳定性和/或容易再分散的益处。在另一个具体实施方式中，生物活性剂是单个结构域的蛋白质或两个结构域的蛋白质。这是基于本发明人的发现，即半氟化烷烃的稳定效果在与这种仅有一个结构域的蛋白质或者有两个结构域的蛋白质结合时也是非常显著的。如本文所用，蛋白质结构域是氨基酸序列的部分，该部分形成能在某种程度上独立于蛋白质链的其余部分发展、发挥功能以及存在的紧密的、三维的结构。然而，结构域在长度方面可能显著不同，在大多数情况下，它们包含的氨基酸单体从约25个至约500个。0046任选地，生物活性剂可以是酶、激素、或生长因子或结构蛋白质。组合物可包括治疗性荷尔蒙，其用于代替或补充患者体内缺乏的天然激素。组。
37、合物可以进一步任选地包括一个以上的生物活性多肽或蛋白质。0047在进一步任选的实施方式中，生物活性剂可以是重组的蛋白质或者可以是来自天然衍生的源的蛋白质或者是合成的肽。蛋白质还可以是天然和/或内源性蛋白质的蛋白质缀合物或类似物。0048根据进一步的实施方式，组合物包括作为生物活性剂的胰岛素，特别是重组人胰岛素。令人惊奇地发现，分散在半氟化烷烃中的胰岛素是极其稳定的，并且甚至当储存在例如在约50之类的显著升高的温度时也不聚合。0049如所提到的，将多肽或蛋白质掺入组合物中以形成分散体或悬浮体。换句话说，多肽或蛋白质分散或悬浮在液体载体中。在将蛋白质分散于液体载体中时是否悬浮液取决于，例如，蛋白质。
38、的性质、蛋白质在载体中的浓度以及所选择的一种或多种SFA。0050如本文所用，可以将悬浮体定义为一种类型的分散体，即具有至少一个连续或连贯的相和分散在连续相中的至少一个不连续或内部的相的系统。在悬浮体中，分散相是固态。对实施本发明有用的悬浮体至少在生理温度下是液体，这意味着连续相是液体。通常，悬浮体在室温下也是液体。除了悬浮体，术语分散体应理解为包括胶体系统，在该胶体系统中，蛋白质和多肽均匀分散在液相中。在一些实施方式中，多肽或蛋白质也至少部分是溶剂化的。说明书CN104066442A8/12页100051在一个具体实施方式中，组合物仅仅包含生物活性多肽或蛋白质和一种或多种SFAS，即该组合物。
39、由如上所定义的生物活性多肽或蛋白质和一种或多种SFAS组成。0052与现有技术中已知的一些其它的悬浮体相比，本发明的制剂的物理稳定性不需要表面活性剂，或仅需要少量的表面活性剂。这是显著的优点，因为表面活性剂特别是当通过皮下或肌内注射或通过滴注到眼睛中给药时具有相当大的刺激性和局部毒性。根据优选的实施方式之一，本发明的组合物基本上不含表面活性剂。在另一个实施方式中，如果掺入一种或一种以上的表面活性剂，则表面活性剂或各种表面活性剂的总量分别不超过约10WT，特别是不超过约5WT，或者优选地不超过约2WT。在进一步优选的实施方式中，表面活性剂或各种表面活性剂的总量分别不超过约1WT，或者不超过约05。
40、WT。在此背景下，本文描述的SFA尽管由于它们的包括以不同程度的亲脂性为特征的氟化和非氟化的烷基或亚烷基基团的化学结构而具有两亲性，但是不应被理解为落入表面活性剂的范围内。0053不存在或仅少量存在的表面活性剂包括非离子型、阳离子型、阴离子型和两性离子型表面活性剂，如在各种类型的药物组合物中常用作赋形剂，例如用作润湿剂、乳化剂、分散剂、增溶剂及类似物的表面活性剂。被认为潜在有用的表面活性剂的实施例包括四丁酚醛，诸如PLURONICF68LF或LUTROLF68、PLURONICLG2LF和PLURONICL62D之类的泊洛沙姆，诸如聚山梨酯20和聚山梨酯80之类的聚山梨醇酯，聚氧乙烯蓖麻油衍生。
41、物，脱水山梨醇酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、卵磷脂、纯化的或合成的磷脂、及其两种或多种的混合物。0054例如，为了改变该液体赋形剂的诸如粘度之类的性质，本发明的组合物可以任选地包括非氟化的有机液体。这样的其它液体可以是选自甘油酯油、液体蜡、和液体石蜡的油，或者是表现出高度生物相容性的有机溶剂，或者是一种以上的液体赋形剂的混合物。0055可以与一种或多种SFA结合使用的可能有用的油性赋形剂的实施例包括甘油三酯油即，大豆油、橄榄油、芝麻油、棉子油、蓖麻油、甜杏仁油、矿物油即，凡士林和液体石蜡、中链甘油三酯MCT、油脂肪酸、肉豆蔻酸异丙酯、油脂肪醇、山梨糖醇脂肪酸酯类、油性蔗糖酯、或任何眼睛生理上耐受的其它。
42、油性物质。0056可能有用的有机溶剂的实施例包括甘油、丙二醇、聚乙二醇和乙醇。共溶剂的浓度相对于SFA或SFA混合物的浓度应优选为低浓度。如果使用诸如乙醇之类的有机溶剂，则可推荐保持乙醇的含量低于约5WT。更优选地，乙醇的含量为从约01至约2WT，以及最优选不超过约1WT。0057当然，组合物根据需要或效用可以包含另外的药物赋形剂。可能有用的赋形剂包括酸、碱、抗氧化剂、稳定剂、增效剂、着色剂、增稠剂、和在特定的情况下需要的防腐剂。然而，一般来说，本发明提供了配制微生物学上稳定的非水性组合物的方法。这是缘于SFA通常不容易产生微生物污染的事实。因此，可以配制不含防腐剂的将要填充在多用容器中的组合。
43、物。许多患者对不含防腐剂的组合物具有较好的耐受性，并且使最终产品的成本降低。0058本发明的液体悬浮体可以通过常规的方法来制备。原则上，包含活性成分的固体颗粒可以分散在含有SFA的液态赋形剂中。替代地，在受控条件下通过添加通常是有机的活性成分的溶液以及，任选地，一种或多种固体赋形剂到基于SFA的赋形剂中可以使颗粒原位沉淀。0059可以在颗粒与液体赋形剂结合之前或者之后调整分散相的粒径。在优选的实施方说明书CN104066442A109/12页11式之一中，提供了已经具有适当所选粒径的活性成分的颗粒。可以通过晶体工程直接从相应的化合物的合成来获得具有这种所选粒径的粉末，或者在合成后使用诸如球磨机。
44、、锤磨机、辊磨机、胶体磨、喷射磨或类似磨机之类的标准设备通过常规的研磨或制粉获得具有这种所选粒径的粉末。如果制备悬浮体后将要减小粒径，则可以使用超声以及各种类型的匀浆器，诸如胶体磨、高压均化器等。0060根据本发明的悬浮体的优秀的物理性质使得这些组合物对患者的眼睛、耳朵、鼻子或肺部的局部给药或通过注射不经肠道的给药特别有用。优选的注射方式包括经皮、皮下、肌内和局部注射。最优选的注射方式是皮下和肌肉给药途径。0061下面以本发明的一些主要方面说明的实施例将使进一步的实施方式变得明显。实施例实施例1胰凝乳蛋白酶原A的稳定0062从蛋白质的储备溶液制备30小瓶经冷冻干燥的胰凝乳蛋白酶原ACHY的等分。
45、试样。向10个等分试样中的每一个加入25ML磷酸钾缓冲液PPB，50MM，PH80，向另10个等份试样中的每一个加入25MLF6H8。剩下的10小瓶作为对照。用氮气吹扫这些小瓶，轻轻摇晃并于50下储存。在预定的间隔时间，取出这些小瓶，提取它们的内含物并通过圆二色性和酶测定法进行分析。0063结果发现，储存在缓冲液中的样品的酶活性在1天的储存时间过后显著降低。可以观察到聚合。与此相反，SFA样品在几个星期之后保留大量的酶活性。事实上，储存在F6H8中的CHY的生物活性与对照小瓶中样品的生物活性是非常相似的。表1示出了每个测试样品中测得的以单位/ML表示的酶活性。0064就圆二色性的结果来看，储存。
46、在F6H8中的CHY的样品总是与对照样品高度相似，而储存在PPS中的CHY的样品显示出表明明显变性的显著变化。表10065向25MG的牛胰岛素的等分试样或者加入25MLF6H8或者加入25ML高度稀释的盐酸水溶液004M并轻轻摇晃。分别用氮气或氧气吹扫这些样品，然后于37或50下储存。在预定的间隔时间，取出这些小瓶，提取它们的内含物并通过圆二色性和HPLC进行分析。实施例2牛胰岛素的稳定0066结果发现，不论是否已经用氮气或氧气吹扫过样品，当储存在盐酸水溶液中时胰岛素高度不稳定，但是当储存在F6H8中时胰岛素在两个温度水平下基本上都稳定。两种分说明书CN104066442A1110/12页12。
47、析方法都证实了这个结果。HPLC分析法的结果回收胰岛素的百分含量列于表2储存在37下和表3储存在50下。表2表3实施例3人胰岛素悬浮体的物理稳定性和再分散性0067在本系列实验中，评价了人胰岛素HI悬浮体在SFA中和在其它非水液体中的物理稳定性和再分散性。如所提到的，物理稳定性的程度，特别是再分散性的程度是决定例如可注射或局部给药的药物组合物的悬浮体介质的适用性的重要标准。0068通过测量总时间为24小时的各种时间间隔下在350NM处的透光率以光度测定方式PHOTOMETRICALLY测定人胰岛素HI在F6H8中的悬浮体的浊度的保留时间、在全氟萘烷PFD中的悬浮体的浊度的保留时间、在全氟辛烷P。
48、FO中的悬浮体的浊度的保留时间、和在辛烷OCT中的悬浮体的浊度的保留时间图1。0069将人胰岛素SIGMA，12643以091MG/ML的浓度悬浮于每份液体中。使悬浮体涡动VORTEX3秒钟，然后在冰浴上超声处理5分钟。紧接在超声处理后，将悬浮体通过吸液管转移至3ML的具塞石英比色皿中。使用UV分光光度计测量每份悬浮体在总时间为16小时的各时间间隔下在350NM处的透光率。然后使用设定在10RPM和45度角的试管旋转器LABINCO将悬浮体再分散15分钟。再分散之后，测定经过另外8小时时间段的透光率。将针对在PH为16的004MHCL中的091MG/ML的人胰岛素溶液在350NM处测得的透光率。
49、数据归一化。0070结果观察到，悬浮在F6H8中的人胰岛素发生相分离的速度显著较慢图1。与在全氟化溶剂和辛烷中的样品相比，在F6H8中的人胰岛素悬浮体的较好的稳定性是显而易见的，在较高浊度水平这与较低的透光率值的百分比相关保持较长时间。与此相反，如由透光率的尖锐迅速增加所证明的，在全氟化溶剂和烃类溶剂辛烷中的悬浮体则迅速失去说明书CN104066442A1211/12页13浊度并且显示相分离例如，通过浮动或沉积。在这些溶剂的样品池中可以明显地观察到非均匀性，即使在最初形成的悬浮体中也如此，随着时间的推移，至液体空气界面的进一步沉积和/或浮动迅速变得明显。0071在16小时的静置时间之后，再分散的在F6H8中的人胰岛素悬浮体也恢复到与最初形成悬浮体时的浊度水平大致相同的浊度水平。与此相反，全氟萘烷、全氟辛烷和辛烷悬浮体再分散后不能恢复到相同的浊度水平。因此，蛋白质只有在SFA中的悬浮体，而不是在PFD、PFO和OCT中的悬浮体表现出了用于药物用途的足够的物理性质。实施例4胰凝乳蛋白酶悬浮体的物理稳定性和再分散性0072通过测量总时间为24小时的各种时间间隔下在350NM处的透光率以光度测定方式测定胰凝乳蛋白酶CHY在F6H8中的悬浮体的浊度的保留时间、在全氟萘烷PFD中的悬浮体的浊度的保留时间、在全氟辛烷PFO中的悬浮体的浊度的保。