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1、10申请公布号CN104059127A43申请公布日20140924CN104059127A21申请号201410235929222申请日20140529C07K7/06200601C07K7/08200601C07K1/36200601C07K1/34200601C07K1/30200601C12P21/06200601A23L1/29200601A61K38/08200601A61K38/10200601A61P9/1220060171申请人无限极（中国）有限公司地址529156广东省江门市新会区会城镇七堡工贸城北区三号72发明人曹庸马忠华赵力超宁德山刘飞邹士玉王燕戴伟杰郭斌74专利代理机。
2、构广州知友专利商标代理有限公司44104代理人李海波54发明名称一种天然高活性降血压肽及其制备方法和应用57摘要本发明公开了一种天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO2所示，该降血压肽成分和结构明确，降血压活性好；还公开了上述天然高活性降血压肽的制备方法，该制备方法工艺简洁，成本低，可规范化产品质量，最后还公开了上述天然活性降血压多肽在制备具有降血压功效的药物或食品中的应用。51INTCL权利要求书1页说明书11页序列表1页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权。
3、利要求书1页说明书11页序列表1页附图3页10申请公布号CN104059127ACN104059127A1/1页21一种天然高活性降血压肽，其特征是含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。2根据权利要求1所述的天然高活性降血压肽，其特征是所述P16降血压肽和P18降血压肽二者的质量份比为001999999001。3根据权利要求2所述的天然高活性降血压肽，其特征是所述P16降血压肽与P18降血压肽二者的质量份比为30707030。4根据权利要求3所述的天然高活性降血压肽，其特征是所述P16降血压肽。
4、与P18降血压肽二者的质量份比为40606040。5权利要求14任一项所述的天然高活性降血压肽的制备方法，其特征是含以下步骤1取酪蛋白，加水溶解，得酪蛋白水溶液；2在酪蛋白水溶液中加入复合蛋白酶进行酶解，所述复合蛋白酶的添加量为酪蛋白总质量的0102，所述复合蛋白酶为胰蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和菠萝蛋白酶中的四种，酶解温度为4050，酶解时间为12H，PH值为7090，酶解后进行灭酶处理，得灭酶液；3调节灭酶液PH值为4050，使灭酶液中未酶解的大分子蛋白沉淀，除去大分子蛋白沉淀，得到含有P16降血压肽和P18降血压肽的清液；4将含有P16降血压肽和P18降血压肽的清液采。
5、用截留分子量为2000DA的超滤膜过滤，得到分子量小于2000DA的降血压多肽溶液，经干燥处理，得到含有P16降血压肽和P18降血压肽的天然高活性降血压肽。6根据权利要求5所述的天然高活性降血压肽的制备方法，其特征是步骤1中水的用量占酪蛋白总质量的34倍，溶解时的温度为4050。7根据权利要求5所述的天然高活性降血压肽的制备方法，其特征是步骤2中所述胰蛋白酶的用量占所述复合蛋白酶总质量的1050，所述无花果蛋白酶的用量占所述复合蛋白酶总质量的1050，所述木瓜蛋白酶的用量占所述复合蛋白酶总质量的1050，所述胰凝乳蛋白酶的用量占所述复合蛋白酶总质量的1050，所述菠萝蛋白酶的用量占所述复合蛋白。
6、酶总质量的1050；步骤2中灭酶处理时温度为8090，时间为2030MIN。8根据权利要求5所述的天然高活性降血压肽的制备方法，其特征是步骤3中采用过滤或离心处理除去大分子蛋白沉淀；步骤4中所述的干燥采用冷冻干燥、喷雾干燥或真空干燥；步骤4中得到含有P16降血压肽和P18降血压肽的天然高活性降血压肽中P16降血压肽和P18降血压肽的质量百分含量高于40。9权利要求1中所述的天然高活性降血压肽在制备具有降血压作用的药物中的应用。10权利要求1中所述的天然高活性降血压肽在制备具有降血压作用的食品中的应用。权利要求书CN104059127A1/11页3一种天然高活性降血压肽及其制备方法和应用技术领域。
7、0001本发明多肽技术领域，具体涉及一种天然高活性降血压肽及其制备方法和应用。背景技术0002降血压肽是一类具有ACE抑制活性的多肽物质，通常由蛋白酶在温和条件下水解蛋白质而获得，食用安全性高，只对高血压患者起到降压作用，对血压正常者无降压作用。高血压是一种常见的心血管疾病，它不仅患病率高，而且常引起严重的心、脑、肾等其他疾病，是脑卒中、冠心病、心力衰竭和肾脏疾病主要的危险因素。据卫生部、科技部、国家统计局2004年10月统计，我国18岁及以上居民高血压发病率达188，患病人数16亿多，比1991年增加7000多万人，并每年还在以300万人的速度递增。目前化学合成的降压药物，如赖诺普利LISI。
8、NOPRIL，培哚普利PERINDOPRIL，虽然治疗高血压的效果非常明显，但是长期服用易引起皮疹、蛋白尿等不良反应。因此，研究开发高效安全的降血压药物已经成为国内外科学家积极探索的课题。而降血压肽通常由蛋白酶在温和条件下水解蛋白质而获得，食用安全性高。所以研究开发天然、安全的降血压肽具有重要的意义。0003中国专利公开的一种酪蛋白降血压肽的制备方法申请公布号CN102296100A，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶分步酶解酪蛋白、经过灭酶，离心、干燥后得到降血压肽初品，再经过大孔吸附脂和萄聚糖凝胶层析得到具有ACE抑制活性的酪蛋白降血压肽。但没有指明特定的降血压肽成分和结构，也没有验证最。
9、终得到的产品是否具有降血压活性。0004中国专利公开的牦牛乳酪蛋白降血压肽的制备方法申请公布号CN102787155A，涉及一种利用牦牛乳酪蛋白为原料制备降血压肽的方法，主要通过胰蛋白酶水解、灭酶、沉淀酪蛋白、超滤、纯滤、喷雾干燥等工艺制备了ACE抑制活性高的降血压肽混合样品。但也未对降血压活性最高的降血压肽成分进行结构鉴定，不能规范化产品质量。发明内容0005本发明的目的在于提供一种天然活性降血压肽，该降血压肽成分和结构明确，降血压活性好。0006本发明的目的还在于提供上述天然活性降血压肽的制备方法，该制备方法工艺简洁，可规范化产品质量。0007本发明的最后一个目的在于提供上述天然活性降血压。
10、多肽在制备具有降血压功效的药物或食品中的应用。0008本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的一种天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。0009本发明通过HPLCMS/ESI测得P16降血压肽和P18降血压肽的分子量，经EDMAN反应测P16降血压肽和P18两个降血压肽的氨基酸序列，其中P16降血压肽的氨基酸序列为G说明书CN104059127A2/11页4PFPIIVGLYPROPHEPROILEILEVAL，分子量为7412DA，属于酪蛋白203209的片段CNF2。
11、03209，在浓度为1MG/ML时，对ACE酶的抑制率可高达5383，其中P18降血压肽具有FFVAPFPEVFGKNH2PHEPHEVALALAPROPHEPROGLUVALPHEGLYLYS的氨基酸序列，分子量为13851DA，属于S1酪蛋白2334的片段S1CNF2334，在浓度为1MG/ML时，对ACE酶的抑制率可高达7000。0010其中本发明中P16降血压肽与P18降血压肽二者的质量份比优选为001999999001，优选的P16降血压肽与P18降血压肽二者的质量份比为10909010，更进一步优选的，P16降血压肽与P18降血压肽二者的质量份比为30707030，较佳的，P16降。
12、血压肽与P18降血压肽二者的质量份比为40606040。0011其中P16降血压肽与P18降血压肽可以一起被制备出来，也可以分别制备获得，比如P16降血压肽单体可以通过以下方法制备获得00121取酪蛋白，加水溶解后，得酪蛋白的水溶液；00132在酪蛋白的水溶液中加入胰蛋白酶进行酶解，胰蛋白酶的加入量占酪蛋白总质量的0102，酶解温度为4050，酶解时间为12H，PH值为7090，酶解后进行灭酶处理，得灭酶液；00143调节PH值为4050使灭酶液中未酶解的大分子进行蛋白沉淀，并除去未酶解的大分子蛋白沉淀，得含有降血压肽的清液；00154将含有降血压肽的清液采用HPLC进行反相硅胶纯化，收集含目。
13、标物的洗脱液，将洗脱液浓缩干燥后，即获得降血压肽。0016在P16降血压肽单体的制备方法中0017步骤1中所述水的用量为酪蛋白总质量的46倍，溶解温度为4060。0018步骤2中灭酶时的温度为8090，灭酶时间为2030MIN。0019步骤3中采用过滤或离心方式除去未酶解的大分子蛋白质沉淀，离心时离心机转速为30005000R/MIN，离心时间为2030MIN。0020步骤4HPLC采用LC8A岛津高效液相色谱仪，色谱柱为HW0121，色谱条件为流速8ML/MIN，检测波长214NM，进样量2ML，流动相A泵超纯水，含体积百分含量为01的TFA，B泵乙腈，B泵初始浓度为25，洗脱方式，二元梯度。
14、洗脱，洗脱梯度00160MIN，2536，6001MIN80MIN，36，800190MIN，9090，9001100MIN，9025。0021其中P18降血压肽单体的具体制备方法具体可以参阅文献MARUYAMAS,SUZUKIHPEPTIDEINHIBITOROFANGIOTENSINICONVERTINGENZYMEINTHETRYPTICHYDROLYSATEOFCASEINJAGRICULTURALBIOLOGICALCHEMISTRY,1982,46513931394。0022P16降血压肽与P18降血压肽也可以采用下面的方法同时制备获得。0023本发明的第二个目的是通过如下技术方案。
15、来实现的上述天然高活性降血压肽的一种优选的制备方法，含以下步骤00241取酪蛋白，加水溶解，得酪蛋白水溶液；00252在酪蛋白水溶液中加入复合蛋白酶进行酶解，所述复合蛋白酶的添加量为酪蛋白总质量的0102，所述复合蛋白酶为胰蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和菠萝蛋白酶中的两种以上，酶解温度为4050，酶解时间为12H，PH值为说明书CN104059127A3/11页57090，酶解后进行灭酶处理，得灭酶液；00263调节灭酶液PH值为4050，使灭酶液中未酶解的大分子蛋白沉淀，除去大分子蛋白沉淀，得到含有P16降血压肽和P18降血压肽的清液；00274将含有P16降血压肽和P18。
16、降血压肽的清液采用截留分子量为2000DA的超滤膜过滤，得到分子量小于2000DA的降血压多肽溶液，经干燥处理，得到含有P16降血压肽和P18降血压肽的天然高活性降血压肽。0028在上述制备方法中0029本发明步骤1中水的用量优选占酪蛋白总质量的34倍，溶解时的温度优选为4050。0030本发明步骤2中所述胰蛋白酶的用量优选占所述复合蛋白酶总质量的1050，所述无花果蛋白酶的用量优选占所述复合蛋白酶总质量的1050，所述木瓜蛋白酶的用量优选占所述复合蛋白酶总质量的1050，所述胰凝乳蛋白酶的用量优选占所述复合蛋白酶总质量的1050，所述菠萝蛋白酶的用量优选占所述复合蛋白酶总质量的1050。00。
17、31采用2种以上的尤其是四种蛋白酶同时酶解酪蛋白时，可以得到更多的小分子蛋白。0032本发明步骤2中灭酶处理时温度优选为8090，时间优选为2030MIN。0033本发明步骤3中优选采用过滤或离心处理除去大分子蛋白沉淀。0034本发明步骤4中所述的干燥可以采用冷冻干燥、喷雾干燥或真空干燥等，但并不仅限于这几种。0035本发明步骤4中得到含有P16降血压肽和P18降血压肽的天然高活性降血压肽中P16降血压肽和P18降血压肽的质量百分含量高于40。0036采用上述方法获得的含有P16降血压肽和P18降血压肽的天然高活性降血压肽，其纯度高，溶解性好，流动性好，颜色为纯白色，对ACE酶的抑制活性高，成。
18、本低。0037本发明的最后一个目的是通过如下技术方案来实现的上述的天然高活性降血压肽在制备具有降血压作用的药物或食品中的应用。0038本发明利用复合蛋白酶分步水解酪蛋白，利用调等电点、过滤等脱大分子蛋白，利用膜过滤得到分子量小于2000DA的小分子多肽，多肽中P16降血压肽和P18降血压肽的含量总和大于40，经具体实施例中的试验发现，在浓度为1MG/ML时，对ACE酶的抑制率大于53，因此可以用于制备具有降血压作用的药物。0039本发明具有如下优点00401本发明中的天然高活性降血压肽，其成分和结构明确，分子量主要在5001500DA之间，颜色为纯白色，其溶解性好，流动性好，纯度高；00412。
19、本发明中天然高活性降血压肽的制备方法，含酶解、灭酶、沉淀蛋白、膜过滤、干燥等工序，其工艺简单，可批量化生产；00423本发明制备获得的天然高活性降血压肽，其能有效地抑制ACE酶的活性，其中P16降血压肽和P18降血压肽的质量百分含量的总和大于40，对ACE酶的抑制率大于53，该天然高活性降血压肽具有巨大的实用价值和经济效益，提高了产品附加值，能促进降血压肽产品的升级。说明书CN104059127A4/11页6附图说明0043图1是本发明实施例111中P16降血压肽和P18降血压肽含量之和40的天然高活性降血压肽的高效液相色谱图；0044图2是本发明实施例111中P16降血压肽的高效液相色谱图；。
20、0045图3是本发明实施例111中P18降血压肽高效液相色谱图；0046图4是本发明实施例111中P16降血压肽质谱图；0047图5是本发明实施例111中P18降血压肽质谱图。具体实施方式0048下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。0049实施例10050本实施例提供的天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。0051该天然高活性降血压肽的制备方法，含以下步骤00521向反应釜中加纯水750L，开搅拌200RPM，向反应釜中缓慢投入酪蛋白恒天然进。
21、口酪蛋白，仅为列举，并不仅限于此250KG，在50条件下搅拌溶解；00532加入复合蛋白酶进行酶解，酶解条件为加入胰蛋白酶无花果蛋白酶木瓜蛋白酶胰凝乳蛋白酶4321质量比的复合蛋白酶，加酶量为酪蛋白总质量的02，反应温度为50，反应时间为2H，PH值为90；00543将温度调节至90，保温30MIN，进行灭酶；00554调PH值50，过滤除去未酶解的大分子蛋白沉淀，得到含有P16降血压肽和P18降血压肽的清液；00565将得到含有P16降血压肽和P18降血压肽的清液利用超滤膜截留分子量为2000DA分离出降血压肽，得到小于2000DA的降血压多肽溶液；00576干燥，经过真空干燥，将得到产物干。
22、燥成粉，得到含有P16降血压肽和P18降血压肽的天然高活性降血压肽；00587测定分子量和氨基酸序列0059将得到的含有P16降血压肽和P18降血压肽的天然高活性降血压肽的产品进液相，判断保留时间，具体色谱图如图13中所示。0060通过HPLCMS/ESI测得P16、P18的分子量，EDMAN反应测两个活性肽的氨基酸序列，其中P16降血压肽的HPLCMS/ESI如图4中所示，P18降血压肽的HPLCMS/ESI如图5中所示，P16降血压肽的序列为GPFPIIVGLYPROPHEPROILEILEVAL，分子量为7412DA，属于酪蛋白203209的片段CNF203209，P18降血压肽具有FF。
23、VAPFPEVFGKNH2PHEPHEVALALAPROPHEPROGLUVALPHEGLYLYS的序列，分子量为13851DA，属于S1酪蛋白2334的片段S1CNF2334。00618ACE血管紧张素转化酶抑制活性测定马尿酸法0062A反应液的制备说明书CN104059127A5/11页70063在样品管中加入10L浓度为02U/ML的ACE溶液和10L的样品溶液本实施例中制备的降血压肽，配成1MG/ML溶液，按表1增加，于37下保温5MIN，加入50L浓度为65MMOLL1的HHL溶液，混匀后在37下保温60MIN，再加85L浓度为10MOL/L的盐酸溶液静置5MIN终止反应，具体操作步。
24、骤如表1所示。0064表1ACE抑制活性马尿酸检测法反应液制备步骤006500660067B色谱条件00681色谱柱DIAMONSILC18200MM46MM，5M00692流动相与色谱条件乙腈超纯水2575含01V/VTFA，流速1ML/MIN；检测波长228NM；进样量20L。0070C结果计算00710072式中0073RACEI样品对ACE的抑制率，0074A对照管中马尿酸的峰面积，0075B样品管中马尿酸的峰面积，0076A0空白管中马尿酸的峰面积。0077在上述条件下，得到降血压肽175KG，降血压肽中P16降血压肽和P18降血压肽含量总和为4396，在浓度为1MG/ML时，ACE。
25、抑制率为554，分子量为500DA1500DA，溶解性好、20质量百分含量降血压肽的乙醇溶液澄清透明，可用作制备具有降血压作用的药物或食品。0078实施例20079本实施例提供的天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中说明书CN104059127A6/11页8P16降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。0080该天然高活性降血压肽的制备方法，含以下步骤00811向反应釜中加纯水1000L，开搅拌200RPM，向反应釜中缓慢投入酪蛋白250KG，在45条件下搅拌溶解；00822加入复合蛋白酶进行酶解，酶解条件为胰蛋白酶木。
26、瓜蛋白酶胰凝乳蛋白酶菠萝蛋白酶10502341的复合蛋白酶，加酶量为酪蛋白总质量的01，反应温度45，反应时间15H，PH80；00833将温度调节至80，保温30MIN，进行灭菌；00844调PH值46，过滤除去未酶解的大分子蛋白沉淀，得到含有P16降血压肽和P18降血压肽的清液；00855将含有P16降血压肽和P18降血压肽的清液利用超滤膜截留分子量为2000DA分离出降血压肽，得到截留分子量小于2000DA的降血压肽溶液；00866干燥，对降血压肽溶液进行喷雾干燥，得到天然高活性降血压肽成品；00877测定分子量和氨基酸序列0088将得到的含有P16降血压肽和P18降血压肽的天然高活性降。
27、血压肽的产品进液相，判断保留时间，具体色谱图如图13中所示。0089通过HPLCMS/ESI测得P16、P18的分子量，EDMAN反应测两个活性肽的氨基酸序列，其中P16降血压肽的HPLCMS/ESI如图4中所示，P18降血压肽的HPLCMS/ESI如图5中所示，P16降血压肽的序列为GPFPIIVGLYPROPHEPROILEILEVAL，分子量为7412DA，属于酪蛋白203209的片段CNF203209，P18降血压肽具有FFVAPFPEVFGKNH2PHEPHEVALALAPROPHEPROGLUVALPHEGLYLYS的序列，分子量为13851DA，属于S1酪蛋白2334的片段S1C。
28、NF2334。00908ACE血管紧张素转化酶抑制活性测定马尿酸法0091测试方法同实施例1，得到降血压肽193KG，P16降血压肽和P18降血压肽质量百分含量总和为4632，在浓度为1MG/ML时，ACE抑制率为5784，分子量为500DA1500DA，溶解性好、20降血压肽的乙醇溶液澄清透明，可用作制备具有降血压作用的药物或食品。0092实施例30093本实施例提供的天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。0094该天然高活性降血压肽的制备方法，含以下步骤00951向反应。
29、釜中加纯水900L，开搅拌200RPM，向反应釜中缓慢投入酪蛋白250KG，在40条件下搅拌溶解；00962加入复合蛋白酶进行酶解，酶解条件为无花果蛋白酶木瓜蛋白酶胰凝乳蛋白酶菠萝蛋白酶4132的复合蛋白酶，加酶量为酪蛋白总质量的02，反应温度为40，反应时间为1H，PH为70；00973将温度调节至85，保温25MIN，进行灭菌；说明书CN104059127A7/11页900984调PH值40，离心除去未酶解的大分子蛋白沉淀，得到含有P16降血压肽和P18降血压肽的清液；00995将含有P16降血压肽和P18降血压肽的清液利用超滤膜截留分子量2000DA分离出降血压肽，得到截留分子量小于20。
30、00DA的降血压多肽溶液；01006干燥，对上清液进行喷雾干燥，得到的降血压肽成品；01017测定分子量和氨基酸序列0102将得到的含有P16降血压肽和P18降血压肽的天然高活性降血压肽的产品进液相，判断保留时间，具体色谱图如图13中所示。0103通过HPLCMS/ESI测得P16、P18的分子量，EDMAN反应测两个活性肽的氨基酸序列，其中P16降血压肽的HPLCMS/ESI如图4中所示，P18降血压肽的HPLCMS/ESI如图5中所示，P16降血压肽的序列为GPFPIIVGLYPROPHEPROILEILEVAL，分子量为7412DA，属于酪蛋白203209的片段CNF203209，P18。
31、降血压肽具有FFVAPFPEVFGKNH2PHEPHEVALALAPROPHEPROGLUVALPHEGLYLYS的序列，分子量为13851DA，属于S1酪蛋白2334的片段S1CNF2334。01048ACE血管紧张素转化酶抑制活性测定马尿酸法0105测试方法同实施例1，得到降血压肽159KG，P16降血压肽和P18降血压肽含量总和为4169，在浓度为1MG/ML时，ACE抑制率为5429，分子量为500DA2000DA，溶解性好、20降血压肽的乙醇溶液澄清透明，可用作制备具有降血压作用的药物或食品。0106实施例40107本实施例提供的天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽。
32、，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。0108该天然高活性降血压肽的制备方法，含以下步骤01091向反应釜中加纯水800L，开搅拌200RPM，向反应釜中缓慢投入酪蛋白250KG，在48条件下搅拌溶解；01102加入复合蛋白酶进行酶解，酶解条件为无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶55的复合蛋白酶，加酶量为酪蛋白总质量的015，反应温度为42，反应时间为18H，PH为72；01113将温度调节至88，保温22MIN，进行灭菌；01124调PH值43，离心除去未酶解的大分子蛋白沉淀，得到含有P16降血压肽和P18降血压肽的清液；01135将。
33、含有P16降血压肽和P18降血压肽的清液利用超滤膜截留分子量2000DA分离出降血压肽，得到截留分子量小于2000DA的降血压多肽溶液；01146干燥，对上清液进行喷雾干燥，得到的降血压肽成品；01157测定分子量和氨基酸序列0116将得到的含有P16降血压肽和P18降血压肽的天然高活性降血压肽的产品进液相，判断保留时间，具体色谱图如图13中所示。0117通过HPLCMS/ESI测得P16、P18的分子量，EDMAN反应测两个活性肽的氨基酸序列，其中P16降血压肽的HPLCMS/ESI如图4中所示，P18降血压肽的HPLCMS/ESI如说明书CN104059127A8/11页10图5中所示，P。
34、16降血压肽的序列为GPFPIIVGLYPROPHEPROILEILEVAL，分子量为7412DA，属于酪蛋白203209的片段CNF203209，P18降血压肽具有FFVAPFPEVFGKNH2PHEPHEVALALAPROPHEPROGLUVALPHEGLYLYS的序列，分子量为13851DA，属于S1酪蛋白2334的片段S1CNF2334。01188ACE血管紧张素转化酶抑制活性测定马尿酸法0119测试方法同实施例1，得到降血压肽159KG，P16降血压肽和P18降血压肽含量总和为4169，在浓度为1MG/ML时，ACE抑制率为545，分子量为500DA2000DA，溶解性好、20降血压。
35、肽的乙醇溶液澄清透明，可用作制备具有降血压作用的药物或食品。0120本发明上述实施例所制得的降血压肽中，P16降血压肽和P18降血压肽含量之和40，对ACE酶的抑制率大于53，流动性好、20质量百分含量降血压肽的乙醇溶液澄清透明，颜色为纯白色粉末，制备的乳源性降血压肽的分子量主要在5001500DA之间，有利于人体吸收，是一种成本低，工艺简单的制备方法，适合工业化生产，可用作制备具有降血压作用的药物或食品。0121实施例50122本实施例提供的天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO。
36、2所示，其中P16降血压肽和P18降血压肽二者的质量比为35。其中P16降血压肽通过以下方法制备获得01231向烧杯中加纯水600ML，开搅拌200RPM，向烧杯中缓慢投入酪蛋白100G，在50条件下搅拌溶解；01242加入胰蛋白酶进行酶解，酶解条件为加酶量为酪蛋白质量的02，反应温度50，反应时间2H，PH90；01253将温度调节至90，保温20MIN，进行灭酶；01264调PH值50，5000R/MIN离心20MIN，除去未酶解的大分子蛋白沉淀；01275反相硅胶纯化，洗脱液再进行反相硅胶纯化，HPLC系统LC8A岛津制备高效液相色谱仪；色谱柱HW0121；色谱条件流速8ML/MIN；检。
37、测波长214NM；进样量2ML；流动相A泵超纯水含01V/VTFA，B泵乙腈，B泵初始浓度为25；洗脱方式二元梯度洗脱；洗脱梯度001MIN60MIN，2536；6001MIN80MIN，36；8001MIN90MIN，9090；9001MIN100MIN，9025。重复进样，收集P16洗脱峰，收集过程同实施例1；01286将高活性降血压肽洗脱液离心后，收集上清液，真空浓缩，冷冻干燥，得到P16降血压肽单体；01297降血压肽的鉴定0130根据图4中的液质联用测定P16分子量，再到上海中科新生命生物科技有限公司做EDMAN降解，测定P16一级结构，再与酪蛋白的氨基酸排列比对验证可知，本发明中获。
38、得的降血压肽P16的氨基酸序列为GPFPIIVGLYPROPHEPROILEILEVAL，具体如SEQIDNO1中所示。0131其中P18降血压肽单体的具体制备方法具体可以参阅文献MARUYAMAS,SUZUKIHPEPTIDEINHIBITOROFANGIOTENSINICONVERTINGENZYMEINTHETRYPTICHYDROLYSATE说明书CN104059127A109/11页11OFCASEINJAGRICULTURALBIOLOGICALCHEMISTRY,1982,46513931394中公开的制备方法，获得的降血压肽P18的氨基酸序列为FFVAPFPEVFGKNH2PH。
39、EPHEVALALAPROPHEPROGLUVALPHEGLYLYS的序列，具体如SEQIDNO2中所示。0132实施例60133本实施例提供的天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO2所示，其中P16降血压肽和P18降血压肽二者的质量比为999001。其中P16降血压肽通过以下方法制备获得01341向烧杯中加纯水4000ML，开搅拌200RPM，向烧杯中缓慢投入酪蛋白恒天然食品级进口酪蛋白，仅为列举，并不仅限于此1KG，在40条件下搅拌溶解，得酪蛋白的水溶液；01352在酪蛋白的水。
40、溶液中加入胰蛋白酶进行酶解，酶解条件为加酶量为酪蛋白总质量的01，反应温度40，反应时间1H，PH70；01363将温度调节至80，保温30MIN，进行灭菌；01374调PH值40，3000R/MIN离心30MIN，除去未酶解的大分子蛋白沉淀，得含有高活性降血压肽的清液；01385反相硅胶纯化，将含有高活性降血压肽的清液再进行反相硅胶纯化，HPLC系统LC8A岛津制备高效液相色谱仪；色谱柱HW0121；色谱条件流速8ML/MIN；检测波长214NM；进样量2ML；流动相A泵超纯水含01V/VTFA，三氟乙酸，B泵乙腈，B泵初始浓度为25；洗脱方式二元梯度洗脱；洗脱梯度001MIN60MIN，2。
41、536；6001MIN80MIN，36；8001MIN90MIN，9090；9001MIN100MIN，9025，重复进样，收集高活性降血压肽命名为P16降血压肽洗脱液，P16单峰液相图谱的保留时间如图12中所示；01396将高活性降血压肽洗脱液离心后，收集上清液，真空浓缩，冷冻干燥，得到P16降血压肽单体；01407降血压肽的鉴定0141根据4中的液质联用测定P16分子量，再到上海中科新生命生物科技有限公司做EDMAN降解，测定P16一级结构，再与酪蛋白的氨基酸排列比对验证可知，本发明中获得的降血压肽的氨基酸序列为GPFPIIVGLYPROPHEPROILEILEVAL，具体如SEQIDNO。
42、1中所示。0142其中P18降血压肽单体的具体制备方法具体可以参阅文献MARUYAMAS,SUZUKIHPEPTIDEINHIBITOROFANGIOTENSINICONVERTINGENZYMEINTHETRYPTICHYDROLYSATEOFCASEINJAGRICULTURALBIOLOGICALCHEMISTRY,1982,46513931394中公开的制备方法，获得的降血压肽P18的氨基酸序列为FFVAPFPEVFGKNH2PHEPHEVALALAPROPHEPROGLUVALPHEGLYLYS的序列，具体如SEQIDNO2中所示。0143实施例70144本实施例提供的天然高活性降血。
43、压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO2所示，其中P16降血压肽和P18降血压肽二者的质量比为001999。其中P16降血压肽通说明书CN104059127A1110/11页12过以下方法制备获得01451取酪蛋白，加水溶解后，得酪蛋白的水溶液，其中水的用量为酪蛋白总质量的5倍，溶解温度为50；01462在酪蛋白的水溶液中加入胰蛋白酶进行酶解，胰蛋白酶的加入量占酪蛋白总质量的015，酶解温度为45，酶解时间为15H，PH值为80，酶解后进行灭酶处理，灭酶时的温度为85，灭酶时间为25MIN，得灭。
44、酶液；01473调节PH值为45使灭酶液中未酶解的大分子进行蛋白沉淀，采用过滤方式除去未酶解的大分子蛋白沉淀，得含有高活性降血压肽的清液；01484将含有高活性降血压肽的清液采用HPLC进行反相硅胶纯化，HPLC系统LC8A岛津制备高效液相色谱仪；色谱柱HW0121；色谱条件流速8ML/MIN；检测波长214NM；进样量2ML；流动相A泵超纯水含01V/VTFA，B泵乙腈，B泵初始浓度为25；洗脱方式二元梯度洗脱；洗脱梯度001MIN60MIN，2536；6001MIN80MIN，36；8001MIN90MIN，9090；9001MIN100MIN，9025。重复进样，收集P16洗脱峰，收集过。
45、程同实施例1；01495将高活性降血压肽洗脱液离心后，收集上清液，真空浓缩，冷冻干燥，得到P16降血压肽单体。01506降血压肽的鉴定0151根据图4中的液质联用测定P16分子量，再到上海中科新生命生物科技有限公司做EDMAN降解，测定P16一级结构，再与酪蛋白的氨基酸排列比对验证可知，本发明中获得的降血压肽的氨基酸序列为GPFPIIVGLYPROPHEPROILEILEVAL，具体如SEQIDNO1中所示。0152其中P18降血压肽单体的具体制备方法具体可以参阅文献MARUYAMAS,SUZUKIHPEPTIDEINHIBITOROFANGIOTENSINICONVERTINGENZYMEI。
46、NTHETRYPTICHYDROLYSATEOFCASEINJAGRICULTURALBIOLOGICALCHEMISTRY,1982,46513931394中公开的制备方法，获得的降血压肽P18的氨基酸序列为FFVAPFPEVFGKNH2PHEPHEVALALAPROPHEPROGLUVALPHEGLYLYS的序列，具体如SEQIDNO2中所示。0153实施例80154本实施例提供的天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO2所示，其中P16降血压肽和P18降血压肽二者的质量比为40。
47、60。其中P16降血压肽和P18降血压肽的制备方法同实施例4。0155实施例90156本实施例提供的天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO2所示，其中P16降血压肽和P18降血压肽二者的质量比为8020。其中P16降血压肽和P18降血压肽的制备方法同实施例5。0157实施例100158本实施例提供的天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO2说明书CN104059127A1。
48、211/11页13所示，其中P16降血压肽和P18降血压肽二者的质量比为5050。其中P16降血压肽和P18降血压肽的制备方法同实施例6。0159实施例110160本实施例提供的天然高活性降血压肽，含有P16降血压肽和P18降血压肽，其中P16降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO1所示，P18降血压肽的氨基酸序列如SEQIDNO2所示，其中P16降血压肽和P18降血压肽二者的质量比为6040。其中P16降血压肽和P18降血压肽的制备方法同实施例6。0161上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。说明书CN104059127A131/1页140001序列表CN104059127A141/3页15图1图2说明书附图CN104059127A152/3页16图3图4说明书附图CN104059127A163/3页17图5说明书附图CN104059127A17。