新颖的免疫调制性化合物 【发明领域】
本发明涉及免疫调制性化合物、包含所述化合物的药物组合物、所述化合物的用途以及受益于免疫调制的医学病症的治疗方法，其中将所述化合物给药。
【发明背景】
免疫系统具有在免疫应答期间和之后通过各种调节性机理控制淋巴细胞活化与失活之间的内环境稳定的能力。其中有特异性抑制和/或关闭免疫应答的机理。因而，当抗原被MHC分子呈递给T细胞受体时，T细胞仅在另外的辅助刺激性信号的存在下才变得适当活化的。在没有辅助信号的存在下，不存在淋巴细胞的活化，要么诱发功能性失活的状态，也称无变应性或耐受性，要么T细胞因编程性细胞死亡而被特定地删去。
一种这样的辅助刺激信号牵涉CD80对专门的抗原呈递细胞与CD28对T细胞的相互作用，这已被证明是完全的T细胞活化所必需的(Lenschow等人(1996)Annu.Rev.Immunol.，14，233-258)。
现有技术
在US 4,312,870中，公开了化合物A是若干神经活性化合物之一，但是没有任何生物学数据。A.Carotti在Bioorganic & MedicinalChemistry 6(1998)389-399中描述了一些相关的化合物，从涉及这些化合物的数据可以明显看出，羧酸取代基大大减少生物活性，这是根据对CNS苯并二氮杂受体的亲合性所测量的。
EP 0354693A1(Boots)公开了一般结构B的免疫调制性化合物，但是不包括其中R7和/或R8是COOH或者含有COOH基团的结构。
类似地，EP 0354694A1(Boots)公开了一般结构C的免疫调制性化合物，但是没有描述其中R6和/或R7是COOH或者含有COOH基团的结构。
而且，WO 91/11448(Boots)公开了一般结构D地免疫调制性化合物，但是不存在其中R7和/或R8和R8’是COOH或者含有COOH基团的结构。
发明概述
本发明在第一方面涉及新颖的通式(I)化合物或其药学上可接受的盐：
其中X代表一条键或选自取代或未取代的C1-3-烷基、NH-C(O)-C1-3-烷基、NH-C(O)-CH2-O-CH2或C(O)-NH-(氨基酸残基)的基团；
Y代表NR4、O或S；
R1代表H、卤素、CF3、低级烷基或低级烷氧基；
R2和R4独立地代表H或低级烷基；和
R3代表H、卤素、低级烷基或低级烷氧基，
其中卤素是F、Cl或Br；
其中低级烷基代表饱和或不饱和的、直链、支链或环状烷基，具有1-6个碳原子；和
其中低级烷氧基代表饱和或不饱和的、直链、支链或环状烷氧基，具有1-6个碳原子，
其条件是当X是一条键、Y是NH和R3是H时，R2不是H。
在一种优选的化合物发明实施方式中，X是一条键，在另一种优选的实施方式中，Y是NH。
在进一步的实施方式中，化合物选自包含下列化合物的组：{[3-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯基氨甲酰基]甲氧基}乙酸，
N-[4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯基]琥珀酰胺酸，
4-[4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯基氨甲酰基]丁酸，
{[4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯基氨甲酰基]甲氧基}乙酸，
4-[4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯基氨甲酰基]-2-苯基丁酸，
N-[3-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯基]琥珀酰胺酸，
2-{[4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯基氨甲酰基]甲基}苯甲酸，
2-氯-4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸，
4-(6，8-二甲基-3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸，
4-(8-甲氧基-6-甲基-3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸，
4-(6，8-二甲氧基-3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸，
4-(7，9-二甲氧基-3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸，
4-(6-甲基-3-氧代-8-三氟甲基-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸，
4-(7，9-二氯-3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸，
[4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯基]丙酸，
[4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯基]乙酸，
4-(4-甲基-3-氧代-3H-苯并吡喃并[4，3-c]吡唑-2-基)苯甲酸，
4-(3-氧代-3H-苯并噻喃并(thiochromeno)[4，3-c]吡唑-2-基)苯甲酸，
4-(5-甲基-3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸，
2-[4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酰氨基]-3-苯基丙酸，和
2-[4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酰氨基]-2-乙酸。
在另一种实施方式中，所述化合物是CD80拮抗剂，能够抑制CD80与CD28之间的相互作用。
本发明在第二方面涉及用作药物的如上所述的化合物。
在一种优选的实施方式中，所述化合物用作药物，治疗医学病症，选自包含类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、气喘、移植术、系统性红斑狼疮和牛皮癣的组。
本发明在第三方面涉及用作前体药物的如上所述的化合物，优选为酯的形式。
本发明在第四方面涉及药物组合物，包含所述化合物作为活性成分，以及药学上可接受的助剂、稀释剂或载体。
在一种优选的实施方式中，所述药物组合物用于治疗医学病症，选自包含类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、气喘、移植术、系统性红斑狼疮和牛皮癣的组。
本发明在第五方面涉及通式(I)化合物或其药学上可接受的盐制造药物的用途，
其中X代表一条键或选自取代或未取代的C1-3-烷基、NH-C(O)-C1-3-烷基、NH-C(O)-CH2-O-CH2或C(O)-NH-(氨基酸残基)的基团；
Y代表NR4、O或S；
R1代表H、卤素、CF3、低级烷基或低级烷氧基；
R2和R4独立地代表H或低级烷基；和
R3代表H、卤素、低级烷基或低级烷氧基，
其中卤素是F、Cl或Br；
其中低级烷基代表饱和或不饱和的、直链、支链或环状烷基，具有1-6个碳原子；和
其中低级烷氧基代表饱和或不饱和的、直链、支链或环状烷氧基，具有1-6个碳原子，
该药物用于治疗受益于免疫调制的医学病症。
在一种实施方式中，所述医学病症选自包含类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、气喘、移植术、系统性红斑狼疮和牛皮癣的组。
本发明在第六方面涉及治疗受益于免疫调制的医学病症的方法，包含给以治疗有效量的通式(I)化合物或其药学上可接受的盐：
其中X代表一条键或选自取代或未取代的C1-3-烷基、NH-C(O)-C1-3-烷基、NH-C(O)-CH2-O-CH2或C(O)-NH-(氨基酸残基)的基团；
Y代表NR4、O或S；
R1代表H、卤素、CF3、低级烷基或低级烷氧基；
R2和R4独立地代表H或低级烷基；和
R3代表H、卤素、低级烷基或低级烷氧基，
其中卤素是F、Cl或Br；
其中低级烷基代表饱和或不饱和的、直链、支链或环状烷基，具有1-6个碳原子；和
其中低级烷氧基代表饱和或不饱和的、直链、支链或环状烷氧基，具有1-6个碳原子。
在一种实施方式中，所述医学病症选自包含类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、气喘、移植术、系统性红斑狼疮和牛皮癣的组。
在另一种实施方式中，所述每天治疗有效量在0.001-10mg/kg体重的范围内，优选在0.1-5mg/kg体重的范围内。
发明的详细说明
本发明涉及杂环化合物、包含它们的药物组合物和所述化合物用于临床治疗受益于免疫调制的医学病症的方法与用途，例如类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、气喘、移植术、系统性红斑狼疮和牛皮癣。更确切地，本发明涉及这样的杂环化合物，它们是CD80拮抗剂，能够抑制CD80与CD28之间的相互作用。
按照本发明，已经发现通式I化合物是CD80拮抗剂。通式I化合物抑制CD80与CD28之间的相互作用。通式I化合物的CD80拮抗性质已经在表面胞质基因共振(BIAcore)实验中得到确认。
优选的是，通式I中的X是一条键，在这样的情况下，其他取代基会提高活性，例如相邻的间一氯。
本发明的化合物可以是酸的形式，但是也可以是药学上可接受的盐的形式。
本发明的化合物也可以是前体药物的形式，尤其是与适当的醇所生成的酯。前体药物能够提高药动学和/或溶解度性质。
由于式I化合物是能够干扰CD80-CD28相互作用的CD80拮抗剂，它们可用于治疗炎性病症和自体免疫疾病，例如类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、气喘、移植术、系统性红斑狼疮和牛皮癣。
优选地，按照通常的给药途径，并且配制成通常的药物组合物，其中包含有效量的活性成分和适合的药学上可接受的载体，将有效量的式I化合物对需要这类治疗的患者给药。这类组合物可以采取多种剂型，例如制成口服给药的溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、胶囊剂与粉剂、肠胃外给药的无菌溶液剂、直肠给药的栓剂或适合的局部制剂。关于适合的药物制剂的选择与制备的常规工艺例如描述在“Pharmaceuticals-The Science of Dosage Form Design”，M.B.Aulton，Churchill Livingstone，1988中。
适合用在任意上述病症治疗中的每日剂量在0.001mg/kg至10mg/kg体重的范围内，尤其是在0.01mg/kg至5mg/kg体重的范围内，这依赖于所要治疗的具体病症、具体患者的年龄与体重和具体患者对药物治疗的反应。精确的个体剂量以及每日剂量将在医师的指导下，取决于标准的医学原理。
可以向制剂加入各种增强药物的稳定性或给药容易程度的添加剂。药物组合物还可以含有除一种或多种通式I化合物以外的另外的治疗上有用的物质。
下列非限制性实验部分进一步阐述本发明。
实验部分
通式I化合物可以通过下述方法制备。上述现有技术所引用的专利文献也包括有用的合成方法。
因而，其中Y＝N且X是烷基链的通式I化合物可以如下列反应所示加以制备：
原料可借助已知方法而得(L.Savini等人，Bioorganic &Medicinal Chemistry 6(1998)389-399)，与肼衍生物的反应是这样进行的，在适合的溶剂中加热，例如正丁醇。在酸于反应条件下被酯化的情况下，水解作用仍得到酸。肼衍生物的制备是遵照文献方法完成的(Hunsberger等人，J.Org.Chem. 21(1956)394，395，396；Harden F.A.等人，J.Med.Chem.34(1991)2892-8)。
其中R4是低级烷基的化合物可以通过随后的烷基化作用而得。如果烷基化作用导致酯的生成，那么通过水解作用容易得到对应的酸。
其中Y＝O且X是烷基链的通式I化合物可以按照各种文献方法制备(Ghosh C.K.等人，Synthesis(1978)779-781；Frogett J.A.等人，J.Chem.Research(S)(1997)30-31)。当R2＝Me时，一种合成途径如下所述。随后水解氰基，生成对应的酸。
其中Y＝S且X是烷基链的通式I化合物可以利用文献所述方法(Donelly M.X.D.等人，J.Chem.Soc.Perkin Trans.1(1993)1729-1735；Lombardino J.G.等人，J.Med.Chem.24(1981)830-834)，如下所示制备。通过在空气中搅拌，完成最后的氧化作用。
其中X是一条键的化合物也可以从对应的氰化物衍生物得到，氨基酸衍生物是通过酸与适当的氨基酸的缩合作用而制备的。
其中X是NH-C(O)-(烷基)-和NH-C(O)-CH2-O-CH2-的化合物可以通过硝基的还原作用(L.Savini等人，Bioorganic & MedicinalChemistry 6(1998)389-399)和随后与适当的酸酐的酰化作用加以制备。
实施例
下列实施例意在阐述发明，而不是限制其范围。化合物是利用Beilstein的Autonom 2.1命名的。NMR光谱是在Bruker ARX 400仪器上记录的。芳族区中的偶合常数主要被表示为单峰(s)、双峰(d)、三重峰(t)，以反映NMR光谱的外观。
实施例1
{[3-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯基氨甲酰基]甲氧基}乙酸
向2-(3-氨基苯基)-2，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-3-酮(0.050g，0.18mmol)的DMF(0.8ml)悬液加入二甘醇酸酐(0.025g，0.22mmol)和4-二甲氨基吡啶(0.007g，0.05mmol)。将澄清的溶液在室温下搅拌，在反应期间有产物沉淀出来。3小时后，向混合物加入水。收集沉淀，用水洗涤，干燥，得到{[3-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯基氨甲酰基]甲氧基}乙酸(0.064g)： 1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.8(1H，bs)，10.02(1H，s)，8.69(1H，s)，8.37(1H，s)，8.18(1H，d)，7.95(1H，d)，7.62-7.70(2H，m)，7.49-7.55(2H，m)，7.33(1H，t)，4.19(2H，s)，4.17(2H，s)；ESI MS m/z 393(M+H+)
利用基本上相同的方法，制备下列化合物：N-[4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯基]琥珀酰胺酸
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ 9.98(1H，s)，8.67(1H，s)，8.18(1H，d)，8.08(2H，d)，7.58-7.70(4H，m)，7.51(1H，t)，2.47-2.57(4H，m)；ESI MS m/z 377(M+H+).
4-[4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯基氨甲酰基]丁酸
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.89(1H，s)，8.67(1H，s)，8.18(1H，d)，8.08(2H，d)，7.60-7.69(4H，m)，7.51(1H，t)，2.33(2H，t)，2.25(2H，t)，1.75-1.83(2H，m)；ESI MSm/z 391(M+H+).{[4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯基氨甲酰基]甲氧基)乙酸
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.76(1H，bs)，9.86(1H，s)，8.68(1H，d)，8.19(1H，d)，8.11(2H，d)，7.61-7.69(4H，m)，7.52(1H，t)，4.19(2H，s)，4.15(2H，s)；ESI MS m/z393(M+H+)。
4-[4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯基氨甲酰基]-2-苯基丁酸
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)(含有一些3-苯基区域异构体)
δ9.86(1H，s)，8.67(1H，s)，8.18(1H，d)，8.07(2H，d)，7.58-7.69(4H，m)，7.51(1H，t)，7.20-7.38(5H，m)，3.55(1H，t)，2.10-2.30(3H，m)，1.90-2.02(1H，m)；ESI MS m/2 467(M+H+)。
N-[3-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯基]琥珀酰胺酸
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.05(1H，s)，8.68(1H，s)，8.31(1H，s)，8.17(1H，d)，7.90(1H，d)，7.62-7.70(2H，m)，7.48-7.55(2H，m)，7.30(1H，t)，2.49-2.57(4H，m)；ESI MS m/z 377(M+H+)。
2-{[4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯基氨甲酰基]甲基)苯甲酸
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.11(1H，s)，8.67(1H，s)，8.18(1H，d)，8.08(2H，d)，7.85(1H，d)，7.59-7.69(4H，m)，7.46-7.54(2H，m)，7.35(2H，t)，4.07(2H，s)；ESI MSm/z 439(M+H+)。
实施例2
4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸
在密封的试管内，将4-氯喹啉-3-羧酸乙酯(11.8mg，0.5mmol)与4-肼基苯甲酸(7.6mg，0.5mmol)的正丁醇(0.5ml)溶液在115℃下搅拌过夜。冷却至50-70℃后，加入庚烷(1.0ml)，进一步冷却至室温使产物结晶。除去溶剂，将产物用庚烷洗涤，在真空下干燥，得到4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸(13mg)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.9(1H，s)，8.77(1H，d)，8.38(2H，d)，8.25(1H，d)，8.03(2H，d)，7.65-7.77(2H，m)，7.58(1H，t)。
利用基本上相同的方法，制备下列化合物：3-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.87(1H，bs)，8.78(1H，s)，8.72(1H，d)，8.46(1H，d)，8.23(1H，d)，7.63-7.72(3H，m)，7.51-7.56(2H，m)；ESI MS m/z 306(M+H+)。
2-氯-4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸
该反应中，使用2-氯-4-肼基苯甲酸的盐酸盐，因此还向混合物加入Et3N(2eq)。 1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.00(1H，bs)，8.76(1H，d)，8.44(1H，s)，8.22-8.28(2H，m)，7.94(1H，d)，7.65-7.74(2H，m)，7.55(1H，t)； ESI MS m/z 340(M+H+)。
4-(6-甲基-3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.1(1H，s)，8.52(1H，d)，8.38(2H，d)，8.12(1H，d)，8.03(2H，d)，7.56(1H，d)，7.48(1H，t)，2.58(3H，s)。
4-(8-甲基-3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.9(1H，s)，8.73(1H，d)，8.39(2H，d)，8.06(1H，s)，8.03(2H，d)，7.64(1H，d)，7.53(1H，d)，2.50(3H，s，DMSO讯号)。
4-(6，8-二甲基-3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.48(1H，s)，8.38(2H，d)，8.03(2H，d)，7.92(1H，s)，7.40(1H，s)，2.57(3H，s)，2.45(3H，s)。
4-(8-叔丁基-3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.9(1H，s)，8.75(1H，d)，8.40(2H，d)，8.17(1H，s)，8.03(2H，d)，7.81(1H，d)，7.69(1H，d)，1.40(9H，s)。
4-(8-甲氧基-6-甲基-3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.3(1H，s)，8.45(1H，d)，8.41(2H，d)，8.03(2H，d)，7.49(1H，d)，7.21(1H，d)，3.93(3H，s)，2.57(3H，s)。
4-(8-甲氧基-3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.9(1H，s)，8.71(1H，d)，8.41(2H，d)，8.03(2H，d)，7.70(1H，d)，7.61(1H，d)，7.32(1H，dd)，3.94(3H，s)。
4-(6，8-二甲氧基-3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.40(2H，d)，8.31(1H，s)，8.03(2H，d)，7.18(1H，d)，6.93(1H，d)，4.03(3H，s)，3.95(3H，s)。
4-(7，9-二甲氧基-3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.6(s，1H)，8.61(1H，s)，8.36(2H，d)，8.01(2H，d)，6.79(1H，d)，6.69(1H，d)，4.00(3H，s)，3.87(3H，s)。
4-(3-氧代-8-三氟甲基-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.1(1H，s)，8.85(1H，d)，8.38(2H，d)，8.10(1H，s)，8.03(2H，d)，7.87(1H，d)，7.73(1H，d).
4-(6-氟-3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.0(1H，s)，8.58(1H，s)，8.37(2H，d)，8.06(1H，d)，8.04(2H，d)，7.54-7.66(2H，m)。
4-(6-氯-3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.47(1H，s)，8.36(2H，d)，8.24(1H，d)，8.04(2H，d)，7.88(1H，d)，7.57(1H，t).
4-(8-氯-3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.0(1H，s)，8.82(1H，d)，8.38(2H，d)，8.20(1H，s)，8.03(2H，d)，7.76(2H，s)。
4-(7，9-二氯-3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.0(s，1H)，8.81(1H，s)，8.36(2H，d)，8.04(2H，d)，7.78(1H，d)，7.71(1H，d).
实施例3
[4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯基]丙酸
将4-氯喹啉-3-羧酸乙酯(0.050g，0.21mmol)与3-(4-肼基苯基)丙酸(0.046g，0.25mmol)的2-丙醇(3ml)悬液在84℃油浴中加热10小时。收集沉淀，用2-丙醇洗涤，干燥，得到产物的2-丙基酯(0.031g)：
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.8(1H，bs)，8.66(1H，d)，8.18(1H，d)，8.07(2H，d)，7.60-7.72(2H，m)，7.52(1H，t)，7.26(2H，d)，4.85(1H，m)，2.82(2H，t)，2.55(2H，t)，1.12(6H，d)。
将酯(0.019g)溶于EtOH(0.8ml)与1M NaOH(0.4ml)，进行水解。90分钟后，混合物用2M HCl酸化，收集沉淀，用水洗涤，干燥，得到[4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯基]丙酸(0.016g)： 1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.66(1H，s)，8.18(1H，d)，8.07(2H，d)，8.61-8.69(2H，m)，7.51(1H，t)，7.26(2H，d)，2.81(2H，t)，2.52(2H，t)；ESI MS m/z 334(M+H+)。
利用基本上相同的方法，制备下列化合物：
[4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯基]乙酸正丁基酯
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.8(1H，bs)，8.68(1H，d)，8.18(1H，d)，8.13(2H，d)，7.61-7-72(2H，m)，7.53(1H，t)，7.30(2H，d)，4.02(2H，t)，3.63(2H，s)，1.52(2H，m)，1.28(2H，m)，0.83(3H，t)；和
[4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯基]乙酸
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.67(1H，s)，8.19(1H，d)，8.11(2H，d)，7.61-7.69(2H，m)，7.52(1H，t)，7.29(2H，d)，3.54(2H，s)；ESI MS m/z 320(M+H+)。
实施例4
3-(4-肼基苯基)丙酸
在0℃下，将3-(4-氨基苯基)丙酸(0.50g，3.0mmol)的浓盐酸(3.5ml)悬液用亚硝酸钠(0.21g，3.0mmol)的H2O(1.7ml)溶液处理。将反应物搅拌45分钟，然后在0℃下滴加氯化亚锡(1.26g，6.7mmol)的浓盐酸(1.5ml)溶液。将反应物在室温下搅拌1小时。收集沉淀，干燥，得到盐酸盐(0.54g)。将该盐(0.100g)溶于少量水，用1M NaOH调至碱性。过滤除去固形物，滤液用酸性酸酸化，得到沉淀。收集固体，用水洗涤，干燥，得到3-(4-肼基苯基)丙酸(0.050g)：
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ6.90(2H，d)，6.64(2H，d)，2.63(2H，t)，2.39(2H，t).
利用基本上相同的方法，制备下列化合物：
2-氯-4-肼基苯甲酸盐酸盐
该反应中，收集盐酸盐，从乙醇中重结晶纯化：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.97(1H，bs)，7.76(1H，d)，7.03(1H，s)，6.88(1H，d)。
实施例5
4-[3-(2-羟基苯基)-5-氧代-4，5-二氢吡唑-1-基]苄腈
将4-羟基香豆素(0.71g，4.4mmol)与4-氰基苯肼(0.88g，6.6mmol)的无水甲苯悬液在125℃油浴中加热。在反应期间缓慢蒸馏甲苯，分离水。除去总计30ml甲苯。3小时后，使溶液冷却，过滤沉淀，用甲苯洗涤，干燥。将粗产物溶于CH2Cl2。过滤除去固形物，然后将溶液用2M HCl洗涤。将有机相干燥，过滤，蒸发溶剂，得到4-[3-(2-羟基苯基)-5-氧代-4，5-二氢吡唑-1-基]苄腈(0.44g)：
1HNMR(400MHz，CDCl3)δ9.86(1H，s)，8.01(2H，d)，7.73(2H，d)，7.41(1H，t)，7.23-7.26(1H，m)，7.08(1H，d)，6.98(1H，t)，3.99(2H，s)。
实施例6
4-(4-甲基-3-氧代-3H-苯并吡喃并[4，3-c]吡唑-2-基)苄腈
将4-[3-(2-羟基苯基)-5-氧代-4，5-二氢吡唑-1-基]苄腈(0.25g，0.9mmol)与原乙酸三乙酯(1.6ml)的混合物在120℃油浴中加热15分钟。冷却后，过滤沉淀，用乙醚洗涤，干燥，得到4-(4-甲基-3-氧代-3H-苯并吡喃并[4，3-c]吡唑-2-基)苄腈(0.22g)：
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.35(2H，d)，8.18(1H，d)，7.70(2H，d)，7.58-7.62(1H，m)，7.47-7.51(2H，m)，2.84(3H，s)；ESI MS m/z 302(M+H+)。
实施例7
4-(4-甲基-3-氧代-3H-苯并吡喃并[4，3-c]吡唑-2-基)苯甲酸
将4-(4-甲基-3-氧代-3H-苯并吡喃并[4，3-c]吡唑-2-基)苄腈(0.030g，0.10mmol)、乙酸(0.4ml)、H2SO4(0.4ml)与水(0.4ml)的混合物在100℃油浴中加热19小时。冷却后，加入水，收集沉淀，用水洗涤，干燥，得到4-(4-甲基-3-氧代-3H-苯并吡喃并[4，3-c]吡唑-2-基)苯甲酸(0.029g)： 1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.21(2H，d)，8.13(1H，d)，8.01(2H，d)，7.67-7.75(2H，m)，7.54-7.58(1H，m)，2.78(3H，s)；ESIMS m/z 321(M+H+)。
利用基本上相同的方法，制备下述化合物：4-(3-氧代-3H-苯并噻喃并[4，3-c]吡唑-2-基)苯甲酸
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.29(1H，s)，8.44(1H，d)，8.24(2H，d)，8.03(2H，d)，7.98(1H，d)，7.67-7.76(2H，m)；ESI MS m/z 323(M+H+)。
实施例8
4-氧代苯并二氢噻喃-3-羧酸甲基酯
在N2气氛下，将溶于无水THF(7ml)的LHMDS(1.12g，6.7mmol)冷却至-78℃。在20分钟内滴加苯并二氢噻喃-4-酮(1.00g，6.1mmol)的无水THF(20ml)溶液。另外60分钟后，在5分钟内滴加氰基甲酸甲酯(0.62g，7.3mmol)的无水THF(1.5ml)溶液，然后将悬液在-78℃下搅拌80分钟。将悬液倒入10％NH4Cl中，用乙醚萃取。将有机相用水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，蒸发溶剂。粗产物经过硅胶色谱纯化(庚烷-乙酸乙酯10∶1)，得到4-氧代苯并二氢噻喃-3-羧酸甲基酯(0.65g)：
1H NMR(400MHz，CDCl3；烯醇互变异构体) δ12.64(1H，s)，7.83(1H，d)，7.25-7.29(2H，m)，7.16-7.20(1H，m)，3.84(3H，s)，3.71(2H，s)。
实施例9
4-(3-氧代-1，4-二氢-3H-苯并噻喃并[4，3-c]吡唑-2-基)苄腈
在N2气氛下，将4-氧代苯并二氢噻喃-3-羧酸甲基酯(0.200g，0.90mmol)、4-氰基苯肼(0.132g，0.99mmol)与少量新戊酸-起在118℃油浴中加热。1小时后，将混合物冷却至室温，然后用乙醚研制。过滤沉淀，干燥，得到4-(3-氧代-1，4-二氢-3H-苯并噻喃并[4，3-c]吡唑-2-基)苄腈(0.233g)： 1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.06(2H，d)，7.92(2H，d)，7.80-7.83(1H，m)，7.30-7.33(1H，m)，7.18-7.25(2H，m)，3.91(2H，s).
实施例10
4-(3-氧代-3H-苯并噻喃并[4，3-c]吡唑-2-基)苄腈
将4-(3-氧代-1，4-二氢-3H-苯并噻喃并[4，3-c]吡唑-2-基)苄腈(0.100g，0.33mmol)的DMSO(2ml)溶液在室温下剧烈搅拌，用空气冲洗溶液。48小时后，过滤沉淀，用甲苯洗涤，干燥。粗产物经过甲苯重结晶纯化，得到4-(3-氧代-3H-苯并噻喃并[4，3-c]吡唑-2-基)苄腈(0.036g)： 1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.65(1H，s)，8.53(1H，d)，8.38(2H，d)，7.72(2H，d)，7.66(2H，t)，7.58-7.62(1H，m)；ESI MS m/z 304(M+H+).
实施例11
4-(5-甲基-3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸
在N2气氛下，向NaH(55％)(0.017g，0.39mmol)的DMF(0.5ml)悬浮液中分小批量加入4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸(0.050g，0.16mmol)的DMF(1ml)悬浮液。将反应物在室温下搅拌。1小时后，加入MeI(0.053g，0.38mmol)。另外24小时后，加入水，过滤除去固形物(主要由酯产物组成)。将滤液用2M HCl酸化。收集沉淀，用水洗涤，干燥，得到4-(5-甲基-3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸(0.018g)。其中含有大约10％酯产物：
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.89(1H，s)，8.34(2H，d)，8.29(1H，d)，7.99(2H，d)，7.85(1H，d)，7.76(1H，t)，7.62(1H，t)，4.00(3H，s)；ESI MS m/z 320(M+H+)。
实施例12
2-[4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酰氨基]-3-苯基丙酸
将4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸(30mg，0.1mmol)溶于DMF(0.5ml)，加入18mg(0.1mmol)羰基二咪唑(90％纯)，将混合物搅拌4小时。将苯丙氨酸(33mg，0.2mmol)溶于H2O(0.5ml)与三乙胺(0.05ml)，加入到活化的酸中。将该反应混合物在75℃下加热2小时。冷却后，调至酸性，用H2O稀释5x。过滤沉淀，用H2O洗涤，在真空下干燥。经过快速色谱纯化，用EtOAc/MeOH(7∶3)洗脱，得到少量2-[4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酰氨基]-3-苯基丙酸。该物质含有大约10％原料。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ 8.7(1H，s)，8.31(2H，d)，8.21(1H，d)，7.82(2H，d)，7.70(1H，d)，7.62(1H，t)，7.50(1H，t)，7.2-7.3(4H，m)，7.17(1H，t)，4.50(1H，m)，3.1-3.2(2H，m)。
利用基本上相同的方法，制备下述化合物：
2-[4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酰氨基]-2-乙酸
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.7(1H，s)，8.36(2H，d)，8.22(1H，d)，7.92(2H，d)，7.70(1H，d)，7.63(1H，t)，7.51(1H，t)，3.85(2H，d).
实施例13
时间分辨荧光竞争测定方案：CD28-CD80相互作用试剂供应商Eu标记的抗兔抗体(αR-Eu)Wallac Oy，Turku，Finland兔抗小鼠IgG，Fc片段特异性(RαmIg(Fc))Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.人CD28-，小鼠IgG1(Fc)(CD28-mFc)Active Biotech Research AB人CD80-小鼠C215 Fab(C215Fab-hCD80)Active Biotech Research AB小鼠C215FabActive Biotech Research AB生物素轭合的山羊抗小鼠IgGκ轻链(GαMκ-biot)Southern Biotechnology Ass.Inc.链霉抗生物素-别藻蓝蛋白(SA-APC)Wallac Oy，Turku，Finland
测定缓冲液
50mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.05％Tween 20，pH7.8，含有0.1％BSA(w/v)，使用前加入。
样本制备
将所要测试抑制效果的物质从20mM储液浓度(DMSO)连续在测定缓冲液中稀释至制备浓度200、100、50和25μM。小孔中的最终浓度分别为100、50、25和12.5μM。本测定法中耐受的最大最终DMSO浓度为0.5％。酌情调节稀释液系列，扩充测量IC50。
对照
将CTLA4-hIg(Fc)稀释至工作浓度20nM和2nM，得到小孔中的最终浓度为10nM和1nM。在这些浓度下(10nM和1nM)，观察到大约90％和30％的抑制水平。
试剂混合物的制备
对于1个平板：
向含有1.1ml测定缓冲液的试管加入下列试剂：试剂体积/1.1ml测定缓冲液制备浓度小孔中的最终浓度αR-Eu4.2μl，取自0.528mg/ml2μg/ml1μg/mlRαmFc2.8μl，取自2.4mg/ml6μg/ml3μg/mlCD28-mFc2.6μl，取自0.4mg/ml0.95μg/ml(10nM)0.48μg/ml(5nM)Gαmκ-生物素8.8μl，取自0.5mg/ml4μg/ml2μg/mlSA-APC15.4μl，取自1mg/ml16μg/ml8μg/ml
CD80FabC215混合物
将900μl上述试剂混合物转移至新的试管。按照20nM的制备浓度加入CD80FabC215(也就是4.3μl，取自0.4mg/ml储备溶液)。小孔中的最终浓度为10nM。
FabC215混合物
向其余200μl试剂混合物加入C215Fab作为非特异性结合(NSB)的对照。从0.36mg/ml储备溶液取0.5μl，得到制备浓度为20nM，小孔中的最终浓度为10nM。
吸移
利用单通道电子吸移管，将含有C215Fab的试剂混合物转移至黑色半区96孔微量滴定板的第12列、第E-H行(4个孔)，每孔10μl。利用单通道电子吸移管，将含有CD80FabC2 15的试剂混合物转移至平板上的其他孔，每孔10μl。
BO：将测定缓冲液吸移至第12列、第A-D行含有CD80FabC215的小孔(4个孔)，每孔10μl。
NSB：将测定缓冲液吸移至第12列、第E-H行含有C215Fab的小孔(4个孔)，每孔10μl。
将20nM和2nM(最终浓度10nM和1nM)的CTLA4-hIg(Fc)吸移至11E-F和11G-H小孔，每孔10μl，-式两份。
样本稀释液系列：其余小孔，每孔10μl，一式两份。
培育
将平板盖上塑料盖，在暗处培育：最初在室温下(RTS)在摇动平台上培育1小时，在+4℃下静态培育过夜，最后在RTS下培育1小时，然后读数。
测量
在Victor 1420多标记计数器上测量平板，利用LANCE方案(#2)测量双波长下的发射，来自APC(665nm)和铕(Europium)(615nm)。第一次测量：激发波长340nm，发射波长665nm，延迟50μs，窗口时间200μs。第二次测量：激发波长340nm，发射波长615nm，延迟50μs，窗口时间200μs。
计算
测定荧光信号比1000*665nm/615nm，由此计算抑制百分比。绘制logit b图(Logit b＝LN(％结合/(100％-％结合)，对Log浓度作图)，由此计算IC50。
进行至少两次测定，目的是得到两个相当的化合物IC50值。
结果
得到下列代表性结果：
4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸
IC50＝0.48μM
2-氯-4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸
IC50＝0.27μM
3-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酸
IC50＝0.88μM
N-[4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯基]琥珀酰胺酸
IC50＝0.6μM
[4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯基]丙酸
IC50＝1.6μM
2-[4-(3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯甲酰氨基]-2-乙酸
IC50＝3.9μM
4-(3-氧代-3H-苯并噻喃[4，3-c]吡唑-2-基)苯甲酸
IC50＝13.5μM