4-[4-(2- 金刚烷基氨基甲酰基 )-5- 叔丁基 - 吡唑 -1- 基 ] 苯甲酸 -465 本发明涉及 4-[4-(2- 金刚烷基氨基甲酰基 )-5- 叔丁基 - 吡唑 -1- 基 ] 苯甲酸 ( 药剂 ) 及其药学上可接受的盐和所述药剂的特定晶型 (1 型 )。该药剂具有人 11-β- 羟 类固醇脱氢酶 1 型酶 (11βHSD1) 抑制活性， 因此在包括代谢综合征在内的疾病的治疗中具 有价值， 并且可用于温血动物 ( 例如人 ) 的治疗的方法中。本发明还涉及用于制备所述药 剂的方法、 用于制备所述药剂的晶型 (1 型 ) 的方法、 含有它们的药物组合物及其在制备在 温血动物 ( 例如人 ) 体内抑制 11βHSD1 的药物中的用途。
下式 (I) 表示所述药剂 ：
糖皮质素 ( 人体内为皮质醇， 啮齿动物体内为皮质酮 ) 是反调节激素， 也就是说它 们对抗胰岛素的作用 (Dallman MF， Strack AM， AkanaSF 等， 1993 ； Front Neuroendocrinol 14， 303-347)。它们调节参与糖异生的肝酶的表达， 并通过从脂肪组织释放甘油 ( 提高脂肪 分解 ) 和从肌肉释放氨基酸 ( 降低蛋白质合成和增加蛋白质降解 ) 来增加底物供应。糖 皮质素在前脂肪细胞分化成能够贮存甘油三酯的成熟脂肪细胞中也十分重要 (Bujalska IJ 等， 1999 ； Endocrinology 140， 3188-3196)。这对于 “应激” 诱导的糖皮质素与向心性肥 胖 (central obesity) 有关的疾病也极为关键， 所述向心性肥胖本身是 2 型糖尿病、 高血 压和心血管疾病的重大风险因素 (Bjorntorp P 和 Rosmond R 2000 ； Int.J.Obesity 24， S80-S85)。
现已十分确定的是， 糖皮质素活性不只是受皮质醇分泌的控制， 而且还在组织水 平上受由 11-β 羟类固醇脱氢酶 11βHSD1( 它可激活可的松 ) 和 11βHSD2( 它可钝化皮质 醇 ) 造成的活性皮质醇与无活性可的松的胞内相互转换的控制 (Sandeep TC 和 Walker BR 2001 Trends inEndocrinol & Metab.12， 446-453)。 可能对人十分重要的这一机制最初是 在使用甘珀酸 (carbenoxolone)( 一种同时抑制 11βHSD1 和 11βHSD2 的抗溃疡药 ) 治疗 中得到证实 (Walker BR 等， 1995 ； J.Clin.Endocrinol.Metab.80， 3155-3159)， 该治疗导致 胰岛素敏感性提高， 这就表明 11βHSD1 可以通过降低活性糖皮质素的组织水平， 来充分调 节胰岛素的作用 (Walker BR 等 1995 ； J.Clin.Endocrinol.Metab.80， 3155-3159)。
临床方面， 库欣综合征 (Cushing’ s syndrome) 与皮质醇过量有关， 皮质醇过量
进而又与葡萄糖耐量异常、 向心性肥胖 ( 在脂肪储存中由刺激前脂肪细胞分化所引起 )、 血脂异常和高血压有关。库欣综合征显示多种与代谢综合征十分相似的症状。虽然代 谢综合征一般与过量的循环皮质醇水平无关 (Jessop DS 等， 2001 ； J.Clin.Endocrinol. Metab.86， 4109-4114)， 但是预期组织内异常高的 11βHSD1 活性可能具有相同的效果。研 究表明， 尽管与瘦人对照相比， 胖人体内具有相似或较低的血浆皮质醇水平， 但是皮下脂肪 中的 11βHSD1 活性大为提高 (Rask E 等， 2001 ； J.Clin.Endocrinol.Metab.1418-1421)。 另外， 比起皮下脂肪， 与代谢综合征有关的向心性脂肪表达高得多的 11βHSD1 活性水平 (Bujalska IJ 等， 1997 ； Lancet 349， 1210-1213)。因此在糖皮质素、 11βHSD1 与代谢综合 征之间似乎存在某种关联。
11βHSD1 敲除小鼠显示糖皮质素诱导的糖异生酶活化在响应禁食时减弱， 在响 应应激或肥胖时血浆葡萄糖水平较低 (Kotelevtsev Y 等， 1997 ； Proc.Natl.Acad.Sci USA 94， 14924-14929)， 这就表明抑制 11βHSD1 在降低 2 型糖尿病的血浆葡萄糖和肝葡萄糖排 出量中的作用。另外， 这些小鼠表达抗致动脉粥样硬化脂蛋白谱， 具有低甘油三酯水平、 高 HDL 胆 固 醇 水平和 高脱脂 载脂蛋白 AI 水平 (Morton NM 等， 2001 ； J.Biol.Chem.276， 41293-41300)。这种表型是由脂肪分解代谢酶和 PPARα 的肝脏表达升高所引起的。这再 次表明 11βHSD1 抑制在治疗代谢综合征的血脂异常中的作用。
代 谢 综 合 征 与 11βHSD1 之 间 的 关 系 中 最 令 人 信 服 的 证 据 来 自 对 过 量 表 达 11βHSD1 的转基因小鼠的最新研究 (Masuzaki H 等 2001 ； Science 294， 2166-2170)。当 在脂肪特异性启动子控制下表达时， 11βHSD1 转基因小鼠患有高的脂肪皮质酮水平、 向 心性肥胖、 胰岛素抵抗糖尿病、 高脂血症和饮食过量。最重要的是， 在这些小鼠的脂肪中， 11βHSD1 活性的高水平类似于肥胖对象中所见的水平。肝 11βHSD1 活性和血浆皮质酮水 平正常， 但是皮质酮的肝门静脉水平却提高 3 倍， 一般认为这是在肝脏中进行代谢作用所 引起的。
总 的 来 说， 现 已 清 楚 的 是， 通过仅在脂肪中按类似于胖人的水平过量表达 11βHSD1， 就可以在小鼠中模拟整个代谢综合征。
11βHSD1 组织分布相当广泛， 并与糖皮质素受体的分布重叠。因此， 11βHSD1 抑制可能在多种生理 / 病理作用中对抗糖皮质素的作用。11βHSD1 存在于人骨骼肌中， 而且文献中充分证明了糖皮质素对抗胰岛素对蛋白质更新和葡萄糖代谢的合成代谢作用 (Whorwood CB 等， 2001 ； J.Clin.Endocrinol.Metab.86， 2296-2308)。因此， 骨骼肌必定是 基于 11βHSD1 疗法的重要靶标。
糖皮质素还降低胰岛素分泌， 这就可能加重糖皮质素诱导的胰岛素抵抗作用。胰 岛表达 11βHSD1， 甘珀酸可抑制 11- 去氢皮质酮对胰岛素释放的作用 (Davani B 等， 2000 ； J.Biol.Chem.275， 34841-34844)。因此在治疗糖尿病时， 11βHSD1 抑制剂不仅可在组织水 平上对胰岛素抵抗起作用， 而且本身还可增加胰岛素分泌。
骨骼发育和骨功能也受糖皮质素作用的调节。 11βHSD1 存在于人骨破骨细胞和成 骨细胞中， 用甘珀酸对健康志愿者的治疗显示骨再吸收标记减少， 而骨形成标记则无变化 (Cooper MS 等， 2000 ； Bone 27， 375-381)。骨中 11βHSD1 活性的抑制可以在骨质疏松症的 治疗中作为保护机制起作用。
糖皮质素还可涉及眼病， 例如青光眼。研究表明， 11βHSD1 会影响人的眼内压， 因此预期抑制 11βHSD1 可减轻与青光眼有关的眼内压升高 (Rauz S 等 2001 ； Investigative Opthalmology & Visual Science42， 2037-2042)。
在 11βHSD1 与啮齿动物和人两者的代谢综合征之间似乎存在令人信服的关系。 有证据表明， 特异性抑制 2 型肥胖性糖尿病患者的 11βHSD1 的药物可通过降低肝糖异生来 降低血糖， 减少向心性肥胖， 改善致动脉粥样化脂蛋白表型， 降低血压和减轻胰岛素抵抗。 肌肉中的胰岛素作用将得到提高， 从胰岛 β 细胞分泌的胰岛素也会增加。
目前有关代谢综合征有两个主要的公认定义。
1) 成人治疗小组 (Adult Treatment Panel)(ATP III 2001 JMA) 对代谢综合征的 定义指出， 如果患者出现三种或更多种下列症状， 即为代谢综合征 ：
男性腰围至少 40 英寸 (102cm)， 女性 35 英寸 (88cm) ；
血清甘油三酯水平至少 150mg/dl(1.69mmol/l) ；
男性 HDL 胆固醇水平低于 40mg/dl(1.04mmol/l)， 女性低于 50mg/dl(1.29mmol/ l) ；
血压至少 135/80mm Hg ； 和/或
血糖 ( 血清葡萄糖 ) 至少 110mg/dl(6.1mmol/l)。 2) 世界卫生组织 (WHO) 咨询会议推荐不涉及因果关系的下列定义， 并建议在适当 时可改进的工作定义 ：
患者具有至少一种下列病症 ： 葡萄糖耐量异常、 葡萄糖耐量减低 (IGT) 或糖尿病 和 / 或胰岛素抵抗 ； 伴有两种或更多种下列病症 ：
动脉压升高
血浆甘油三酯升高
向心性肥胖
微白蛋白尿症。
我们发现， 所述药剂或其药学上可接受的盐是有效的 11βHSD1 抑制剂， 因此在代 谢综合征相关疾病的治疗中具有价值。 我们还发现， 本发明的化合物具有改进的性质， 这可 使之成为用作药品的更好侯选药物。
因此， 本发明涉及 4-[4-(2- 金刚烷基氨基甲酰基 )-5- 叔丁基 - 吡唑 -1- 基 ] 苯 甲酸 ；
或其药学上可接受的盐。
本发明化合物的合适的药学上可接受的盐为例如具有足够碱性的本发明化合物 的酸加成盐， 例如与诸如盐酸、 氢溴酸、 硫酸、 磷酸、 三氟乙酸、 柠檬酸或马来酸等无机酸或 有机酸的酸加成盐。另外， 具有足够酸性的本发明化合物的合适的药学上可接受的盐为碱 金属盐 ( 例如钠盐或钾盐 )、 碱土金属盐 ( 例如钙盐或镁盐 )、 铵盐或者与提供生理上可接 受阳离子的有机碱的盐 ( 例如与甲胺、 二甲胺、 三甲胺、 哌啶、 吗啉或三 -(2- 羟乙基 ) 胺的 盐 )。
要了解的是， 本发明包括具有 11βHSD1 抑制活性的所有这样的溶剂化形式。
本发明还涉及所述药剂的化合物的体内可水解酯。 体内可水解的酯是在动物体内 分解产生母体羧酸的酯。
在本发明的一个实施方案中， 提供 4-[4-(2- 金刚烷基氨基甲酰基 )-5- 叔丁
基 - 吡唑 -1- 基 ] 苯甲酸。在一个备选实施方案中， 提供 4-[4-(2- 金刚烷基氨基甲酰 基 )-5- 叔丁基 - 吡唑 -1- 基 ] 苯甲酸的药学上可接受的盐。
本发明的另一个方面提供用于制备所述药剂或其药学上可接受的盐的方法， 所述 方法 ( 其中除非另有说明， 否则可变基团如式 (1) 中定义 ) 包括方法 a) 或方法 b) 中的任 一种 ：
a) 式 (2) 酯的水解 ：
其中 R1 为烷基或芳基 ； 或 b) 将式 (3) 化合物中的 Z 转化成羧基 ：其中 Z 为能够转化成羧酸的官能团 ；
随后， 必要或需要时， 形成其药学上可接受的盐。
上述方法 a) ～方法 b) 的合适条件如下。
方法 a) 可例如使用合适的溶剂 ( 例如甲醇等 )， 根据酯基团 (R1) 的性质在酸性 条件或碱性条件下进行， 但通常可在碱性条件下进行， 例如氢氧化钠水溶液。 通常该反应在 环境温度下进行， 然而一些酯可能需要使用微波或常规加热 ( 例如在介于 30-100℃的温度 下 ) 进行裂解。R1 的合适取值的实例包括甲基、 乙基、 叔丁基、 苯基、 苄基和对甲氧基苄基， 特别甲基或乙基。
方法 b) 的实例是通过采用金属催化的羰基化将芳基卤化物转化成芳基羧酸。这 类方法的实例是本领域已知的， 并且通常在合适碱或碱的组合 ( 例如 DMAP/DIPEA) 的存在 下， 在合适的一氧化碳源 ( 例如六羰钼或气态 CO) 存在时， 使用合适的催化剂或催化剂的组 合 ( 例如 Herrmann 催化剂连同 Fu 盐 )， 在合适的溶剂 ( 例如乙醇 / 二噁烷 ) 中进行。通常 该反应使用微波或常规加热在高温 ( 例如在 100-180℃的温度之间 ) 下进行。本领域技术 人员应当了解的是， 溶剂的选择将取决于所分离的产物的性质， 例如醇溶剂容易使酯分离， 该酯随后在反应物进行后处理 (work up) 时裂解， 得到合适的酸。本领域技术人员还应当 了解的是， 式 (3) 化合物可通过用于描述式 (2) 化合物合成的所有方法得到。
还应当理解的是， 在本文所述的一些反应中， 保护化合物中的任何敏感基团是必 要 / 需要的。其中保护是必要或需要的实例以及合适的保护方法为本领域技术人员所知。 可以根据标准规程使用常用保护基 ( 有关说明参见 T.W.Green， Protective Groups in Organic Synthesis， JohnWiley and Sons， 1991)。 因此， 如果反应物包括例如氨基、 羧基或 羟基等基团， 则有可能需要在本文所述某些反应中对这些基团予以保护。
对于氨基或烷基氨基， 合适保护基为例如酰基， 如乙酰基等烷酰基， 如甲氧羰基、 乙氧羰基或叔丁氧羰基等烷氧羰基， 如苄氧羰基等芳基甲氧羰基， 或如苯甲酰基等芳酰基。 对于上述保护基的脱保护条件必将随保护基的选择而变化。因此， 例如酰基 ( 例如烷酰基 或烷氧羰基或芳酰基 )， 可以例如通过用合适的碱 ( 例如氢氧化锂或氢氧化钠等碱金属氢 氧化物 ) 水解脱去。或者， 如叔丁氧羰基等酰基可以例如通过用合适的酸 ( 例如盐酸、 硫酸 或磷酸或三氟乙酸 ) 处理脱去， 如苄氧羰基等芳基甲氧羰基可以例如通过在催化剂 ( 例如 披钯碳 ) 存在下氢化或通过用路易斯酸 (Lewis acid)( 例如三 ( 三氟乙酸 ) 硼 ) 处理脱去。 对于伯氨基合适的备选保护基为例如邻苯二甲酰基， 其可以通过用烷基胺 ( 例如羟胺 ) 或 用肼处理脱去。
对于羟基的合适保护基为例如酰基， 如乙酰基等烷酰基、 如苯甲酰基等芳酰基或 苄基等芳基甲基。对于以上保护基的脱保护条件必将随保护基的选择而变化。因此， 诸如 烷酰基或芳酰基等酰基可以例如通过用合适的碱 ( 诸如氢氧化锂或氢氧化钠等碱金属氢 氧化物 ) 水解脱去。或者， 如苄基等芳基甲基可以例如经催化剂 ( 例如披钯碳 ) 氢化脱去。
对于羧基的合适保护基团为例如酯化基团， 例如可以通过例如用诸如氢氧化钠等 碱水解脱去的甲基或乙基， 或者可以通过例如用三氟乙酸等有机酸类的酸处理脱去的叔丁 基， 或者可以经催化剂 ( 例如披钯碳 ) 氢化脱去的苄基。
采用化学领域熟知的常规技术， 可以在合成的任何方便的阶段除去保护基团。
本 发 明 的 另 一 个 方 面 涉 及 4-[4-(2- 金 刚 烷 基 氨 基 甲 酰 基 )-5- 叔 丁 基 - 吡 唑 -1- 基 ] 苯甲酸的晶型 (1 型 )， 其 X 射线衍射图在 2θ ＝ 16.8°附近有至少一个特定的 峰值。
2θ(θ) 值使用 CuKa 幅射测量。
本发明提供其 X 射线粉末衍射图在 2θ ＝ 16.8°和 18.5°附近有至少两个特定 峰值的 1 型晶型。
本发明提供其 X 射线粉末衍射图在 2θ ＝ 16.8°、 18.5°和 14.4°附近有特定峰 值的 1 型晶型。
本 发 明 提 供 其 X 射 线 粉 末 衍 射 图 在 2θ ＝ 16.8 °、 18.5 °、 14.4 °、 13.9 ° 和19.8°附近有特定峰值的 1 型晶型。
本 发 明 提 供 其 X 射 线 粉 末 衍 射 图 在 2θ ＝ 16.8 °、 18.5 °、 14.4 °、 13.9 °、 19.8°、 20.1°、 15.8°、 22.6°、 19.4°和 20.4°附近有特定峰值的 1 型晶型。
本发明提供其 X 射线粉末衍射图与如图 1 所示的使用 CuKa 幅射的 X 射线粉末衍 射图基本相同的 1 型晶型。
本发明提供其 X 射线粉末衍射图在 2θ ＝° ±0.5° 2θ 处有至少一个特定峰值 的 1 型晶型。
本发明提供其 X 射线粉末衍射图在 2θ ＝ 16.8° ±0.5° 2θ 处有至少一个特定 峰值的 1 型晶型。
本发明提供其 X 射线粉末衍射图在 2θ ＝ 16.8°和 18.5°处有至少两个特定的 峰值的 1 型晶型， 其中所述值可为 ±0.5° 2θ。
本发明提供其 X 射线粉末衍射图在 2θ ＝ 16.8°、 18.5°和 14.4°处有特定峰值 的 1 型晶型， 其中所述值可为 ±0.5° 2θ。
本 发 明 提 供 其 X 射 线 粉 末 衍 射 图 在 2θ ＝ 16.8 °、 18.5 °、 14.4 °、 13.9 ° 和 19.8°处有特定峰值的 1 型晶型， 其中所述值可为 ±0.5° 2θ。
本 发 明 提 供 其 X 射 线 粉 末 衍 射 图 在 2θ ＝ 16.8 °、 18.5 °、 14.4 °、 13.9 °、 19.8°、 20.1°、 15.8°、 22.6°、 19.4°和 20.4°处有特定峰值的 1 型晶型， 其中所述值可 为 ±0.5° 2θ。
本发明提供其 X 射线粉末衍射图在 2θ ＝ 16.8°处有至少一个特定峰值的 1 型晶 型。
本发明提供其 X 射线粉末衍射图在 2θ ＝ 16.8°和 18.5°处有至少两个特定的 峰值的 1 型晶型。
本发明提供其 X 射线粉末衍射图在 2θ ＝ 16.8°、 18.5°和 14.4°处有特定峰值 的 1 型晶型。
本 发 明 提 供 其 X 射 线 粉 末 衍 射 图 在 2θ ＝ 16.8 °、 18.5 °、 14.4 °、 13.9 ° 和 19.8°处有特定峰值的 1 型晶型。
本 发 明 提 供 其 X 射 线 粉 末 衍 射 图 在 2θ ＝ 16.8 °、 18.5 °、 14.4 °、 13.9 °、 19.8°、 20.1°、 15.8°、 22.6°、 19.4°和 20.4°处有特定峰值的 1 型晶型。
本发明提供如图 1 所示的使用 CuKa 幅射的 X 射线粉末衍射图的 1 型晶型。
表A
4-[4-(2- 金刚烷基氨基甲酰基 )-5- 叔丁基 - 吡唑 -1- 基 ] 苯甲酸 (1 型 ) 的 10 个最明显的 X 射线粉末衍射峰
2θ 角 (2θ) 16.845 18.511强度％ 100.0 65.9相对强度 vs vs9101909621 A CN 101909627说14.408 13.874 19.772 20.105 15.758 22.621 19.400 24.408 36.5 23.8 23.2 18.3 16.4 15.0 14.6 14.5明书vs s s s s s s s7/19 页
vs ＝非常强
s ＝强
DSC 分析表明， 1 型在 308.8℃时开始熔化， 在 310.5℃时达到峰值。DCS 差示热分 析图见图 2。
在表明本发明涉及 1 型晶型时， 结晶度适宜大于约 60％， 更适宜大于约 80％， 优选 大于约 90％， 更优选大于约 95％。结晶度最优选大于约 98％。
所述 1 型提供与图 1 所示 X 射线粉末衍射图基本相同的 X 射线粉末衍射图， 并且 具有表 A 中所列的大致 10 个最主要的峰值 (2θ 角值 )。应当了解的是， X 射线粉末衍射图 的 2θ 值从一台机器到另一台机器或从一个样品到另一样品可能略有不同， 因此所引用的 数值不得解释为是绝对数值。
一般认为， 可以获得具有一个或多个测量误差的 X 射线粉末衍射图， 所述测量误 差取决于测量条件 ( 例如所使用的设备或机器 )。具体地讲， 普遍认为， X 射线粉末衍射图 的强度可随测量条件而上下波动。因此， 应当了解的是， 本发明的 1 型不限于提供与图 1 所 示 X 射线粉末衍射图相同的 X 射线粉末衍射图的晶体， 并且具有与图 1 所示的 X 射线粉末 衍射图基本相同的 X 射线粉末衍射图的任何晶体都落入本发明的范围内。X 射线粉末衍射 领域的技术人员能够判断 X 射线粉末衍射图的基本相同性。
X 射线粉末衍射领域的技术人员应当了解， 峰值的相对强度可能受例如大小超过 30 微米和非单一长径比的晶粒的影响， 这可以影响样品的分析。技术人员还要了解的是， 反射位置可能受样品位于衍射仪中的确切高度和衍射仪零校准的影响。样品表面平坦度 也可能有少部分影响。因此， 所提供的衍射图数据不得视为绝对值 (Jenkins， R 和 Snyder， R.L.‘Introduction to X-Ray Powder Diffractometry’ John Wiley& Sons 1996 ； Bunn， C.W.(1948)， Chemical Crystallography， ClarendonPress， London ； Klug， H.P.& Alexander， L.E.(1974)， X-Ray DiffractionProcedures)。
一 般 来 讲， X 射 线 粉 末 衍 射 图 中 衍 射 角 的 测 量 误 差 约 为 5 ％ 或 更 低， 特别是 ±0.5° 2θ， 当考虑图 1 的 X 射线粉末衍射图时以及当读取表 A 数据时， 应当考虑这一测量
误差度。另外， 应当了解的是， 强度可能随实验条件和样品制备 ( 择优取向 ) 而产生波动。
所采用技术的细节
X 射线粉末衍射
表B
从用固定狭缝测量的衍射图推导相对强度
分析仪器 ： Siemens D5000
将结晶材料样品固定在 Siemens 单硅晶 (single silicon crystal， SSC) 晶片 (wafer mount) 上， 借助显微镜载玻片将样品展开成薄层， 以测定 X 射线粉末衍射图。使样 品以 30 转 / 分钟旋转 ( 以改进计数统计值 )， 用 1.5418 埃波长在 40kV 和 40mA 下操作细长 铜聚集管 (copper long-finefocus tube) 所产生的 X 射线辐照样品。经校准的 X 光源通 过设置为 V20 的自动变化的发散狭缝后， 被反射的辐射被引导通过 2mm 抗散射狭缝和 0.2mm 检测狭缝。按 θ-θ 模式， 在 2° -40° 2θ 范围内， 每增加 0.02° 2θ( 连续扫描模式 ) 便 使样品暴露 1 秒钟。运行时间为 31 分 41 秒。该仪器配备了闪烁计数器作为检测器。通过 用 Diffrac+ 软件运行的 DellOptiplex 686 NT 4.0 工作站进行控制和数据获取。 X 射线粉
*末衍射领域的技术人员应当了解， 峰值的相对强度可能受例如可以影响样品的分析大小超 过 30 微米和非单一长宽比的晶粒的影响。技术人员还要了解的是， 反射位置可能受样品位 于衍射仪中的确切高度和衍射仪零校准的影响。样品表面平坦度也有少部分影响。因此， 所提供的衍射图数据不得视为绝对值。
示差扫描量热法
分析仪器 ： TA Instruments Q1000 DSC
通常将不超过 5mg 的材料装入配备有盖的 40μl 铝锅中， 在 25℃ -325℃的温度范 围内， 以每分钟 10℃的恒定加热速度加热。使用用氮气的吹扫气体， 流速为 100ml/ 分钟。 如上文所述， 药剂具有 11βHSD1 抑制活性。可以应用下列测定评价这些性质。
测定
可 采 用 竞 争 性 均 相 时 间 分 辨 荧 光 测 定 法 (HTRF)(CisBioInternational， R&D， Administration and Europe Office， In VitroTechnologies— HTRF /Bioassays BP 84175， 30204 Bagnols/CèzeCedex， France。皮质醇批量 HTRF 试剂盒 ： 目录号 62CORPEC)， 通过 11βHSD1 氧化还原酶活性测定可的松向成活性类固醇皮质醇的转化。
对 本 文 所 述 化 合 物 的 评 价 采 用 杆 状 病 毒 表 达 的 N 端 带 6-His 标 签 的 全 长 人 11βHSD1 酶 (*1) 进行。使用螯合铜柱， 使该酶从去污剂增溶的细胞裂解物中纯化出来。 11βHSD1 的抑制剂降低可的松向皮质醇转化， 上述测定中信号的增强证实了这一点。
将待测化合物溶于二甲亚砜 (DMSO) 至 10mM， 在含有 1％ DMSO 的测定缓冲液中进
一步稀释成最终测定浓度的 10 倍。然后将稀释后的化合物加到黑色 384 孔板 (Matrix， Hudson NH， USA) 中。
在总体积 20μl 的溶液中进行测定， 该溶液由可的松 (Sigma， Poole， Dorset， UK， 160nM)、 葡 萄 糖 -6- 磷 酸 (Roche Diagnostics， 1mM)、 NADPH(Sigma， Poole， Dorset， 100μM)、 葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶 (RocheDiagnostics， 12.5μg/ml)、 EDTA(Sigma， Poole， Dorset， UK， 1mM)、 测定缓冲液 (K2HPO4/KH2PO4， 100mM)(pH 7.5)、 重组 11βHSD1[ 使用合适 的稀释液以得到可行的测定窗 (assay window)— 合适的稀释液的实例可以是酶母液的 1 ∶ 1000 稀释液 ] 加试验化合物组成。将测定板在 37℃下温育 25 分钟， 之后加入 10μl 0.5mM 甘草亭酸 (glycerrhetinicacid) 加上缀合皮质醇 (conjugated cortisol)(XL665 或 D2) 终止反应。然后加入 10μl 抗皮质醇穴状化合物 (anti-cortisol Cryptate)， 将板密 封后， 在室温下温育 6 小时。使用 Envision 读板仪测定在 665nm 和 620nm 下的荧光， 并计 算出 665nm ∶ 620nm 比率。
然 后， 用 这 些 数 据 计 算 每 种 化 合 物 的 IC50 值 (Origin 7.5， Microcal 软 件， Northampton MA， USA) 和 / 或在 30μM 化合物下的％抑制。 *
1 The Journal of Biological Chemistry， 第 26 卷， 第 25 期， 第 16653-16658 页 得到下列结果 ： 实施例 1IC50 0.008μM。
本发明化合物的口服生物利用度可如下测定 ：
PK 研究中生物利用度的测定
以 25％ HPBCD/ 索楞逊缓冲液 (sorrensons buffer)(pH 5.5) 中的制剂， 按 2mg/ kg(2ml/kg) 静脉内和按 5mg/kg(5ml/kg) 口服给予所述化合物。 采集给药前、 两种途径给药 后 0.25、 0.5、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 8 和 24 小时的血样 (200μl)， 经离心制备血浆。血浆样品如下 进行分析。通过标准 PK 方法应用合适的 PK 软件 (WinNon-Lin)， 计算 PK 参数 ( 清除率、 分 布容积、 生物利用度、 吸收分数等 )。
血浆样品的生物分析法
所述指南用于在研究 DMPK 中所采用的所有 PK 种类的设计化合物在单剂化合物或 盒式给药后进行血浆样品的手工制备。描述了通过开放型存取 (open access)(LC-MS/MS) 或人手方式 (LC-MS) 的分析法。
目录
1. 材料
2. 通用提取方法
3. 使用通用板式设计的示例性样品清单
4. 开放型存取批量提交和系统检查 (Open Access BatchSubmission and System Check)
5. 批量流通 (Batch Pass) 的接受标准
1. 材料
溶剂 ： 甲醇、 乙腈和 DMSO
水： 纯化级或 HPLC 级
1ml 浅的 96 孔板或微量离心管
2ml 深孔 96 孔板加盖
空白 ( 对照 ) 血浆
2. 通用提取方法
用 DMSO 使化合物溶解至 1mg/ml， 如有盐的话， 将盐的因素考虑在内。可以采用 DMSO 母液制备所有校准样品与质控 (QC) 样品 ：
2.i 单一化合物分析
2.i.a 校准样品和 QC 样品的制备 ：
1. 如下制备标准溶液 ：
稀释母液 1,000 500 200 100 50
甲醇体积 0.5 0.75 0.5 0.5 0.5母液体积 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5标准浓度 500 200 100 50 10血浆稀释后浓度 50 20 10 5 12. 将 50μl 空白血浆转移到 1ml 96 孔板 ( 浅孔 ) 的孔中 .
3. 将 5μl 各标准溶液转移到该板其它孔中。
4. 将 50μl 空白血浆加到这些孔的各孔中。
5. 为了产生 QC 样品， 将 3 份 5μl 等分量的 100ng/ml、 1000ng/ml 和 10,000ng/ml 标准溶液加到板中 ( 各浓度 3 个 QC 样品 )。
6. 向这些样品每个中加入 50μl 空白血浆。
7. 将 50μl 各 PK 样品转移到 1ml 96 孔板中。
8. 将 5μl 甲醇 (- 化合物 ) 加到每个 PK 样品中。
9. 通过涡旋混合确保所有剂量的制剂充分混匀。
10. 将预期浓度的静脉 (IV) 制剂和口服 (PO) 制剂在甲醇中稀释至 10μg/ml。 (例 如， 制备预期浓度为 2mg/ml 的制剂可按 1 ∶ 200 稀释得到 10μg/ml 溶液 )。
11. 将 6x50μl 等分量的血浆加到板中。将 5μl 稀释的 IV 制剂加到 3 个孔中， PO 制剂如此重复， 并保留 3 个孔。
12. 通过将 100μl 含有计划相关内标 ( 按 1μg/ml) 的乙腈加到所有校准、 QC、 PK和制剂样品中， 使蛋白质沉淀。
13. 使板涡旋混合后， 在 4,000g 下离心 10 分钟。
14. 将 100μl 上清液转移到 2ml 96 孔板各孔中 ( 参见下列板图 )。注意不可搅 动沉淀。
15. 将约 1.5ml 50 ∶ 50 甲醇∶水加到最后的孔中。
16. 对于 triple quad 系统上的分析 ： 将 400μl 水 (HPLC 级 ) 加到各样品中。轻 轻混合。
17. 将 100μl 100,000ng/ml 各标准溶液的母液加到 2ml 板中后， 加入 900μl 水。 将内标样品加到另一孔中 ( 参见板图 )。它们用于调节化合物 ( 板图表示为调整溶液 )。
18. 对于平台系统 (platform system) 上的分析 ： 将 100μl 水 (HPLC 级 ) 加到各 样品中。轻轻混合。
19. 用制备成 5,000ng/ml 的化合物溶液 ( 将 100μl 50,000ng/ml 标准溶液加到 900μl 水中 )， 用手工调整所有化合物。
2.ii 盒式剂量分析
2.iia 校准和 QC 样品的制备 ：
注意 ： 对于盒式给药法， 稀释 1mg/ml 母液所需要的甲醇量可根据化合物存在的量 进行调节。
1. 将 100μl 各 1mg/ml 所需母液加到小瓶中。
2. 加入所需体积的甲醇得到 1ml 总体积。
3. 进行有关单一化合物分析的所有其它步骤 ( 上述步骤 2-16)。
2.iii 万一 PK 样品超过定量测定上限 (ULOQ)
1. 如上所述制备另一校准曲线和 QC 样品 ( 步骤 1-6)。
2. 转移＜ 50μl( 例如 25μl) 的超过 ULOQ 的 PK 样品。
3. 将足够的对照血浆加到这些样品中， 得到 50μl 的最终血浆体积。记录所做稀 释。
4. 转移 50μl 所有剩余的 PK 样品。
5. 制备所有的制剂样品， 并如上所述提取所有样品 ( 步骤 8-16)。
注意 ： 可以检查用来绘制校准曲线的浓度上限， 然而， 必须留意避免 HPLC 柱或 MS 设备饱和。正是这个原因才建议稀释 PK 样品。
2.iv 灵敏度低的情况 ( 高定量测定下限 ( 高 LLOQ))
注意 ： 当大多数血浆浓度位于定量测定下限之下或者其中 LLOQ 大于 10ng/ml 时， 被视为高 LLOQ。当遇到这些情况的任一种时， 可采用下列方法。
本发明进一步的方面提供药物组合物， 所述药物组合物包含如上文定义的药剂或 其药学上可接受的盐以及药学可接受的稀释剂或载体。
本发明的组合物可以为适于口服用途的形式 ( 例如作为片剂、 锭剂、 硬质或软质 胶囊剂、 水性或油性混悬剂、 乳剂、 可分散的散剂或颗粒剂、 糖浆剂或酏剂 ) ； 适于局部使用 的形式 ( 例如作为乳膏剂、 软膏剂、 凝胶剂、 或者水性或油性溶液剂或混悬剂 ) ； 适于经吸入 法给药的形式 ( 例如作为微细粉剂或液体气雾剂 ) ； 适于经吹入法给药的形式 ( 例如作为 微细粉剂 ) ； 或适于胃肠外给药的形式 ( 例如作为用于静脉内、 皮下、 肌内或肌内给药的无菌水性或油性溶液剂， 或者作为用于直肠给药的栓剂 )。一般而言， 优选适于口服形式的组 合物。
可以通过常规方法， 采用本领域众所周知的常规药用赋形剂， 获得本发明的组合 物。因此， 计划用于口服使用的组合物可以含有例如一种或多种着色剂、 甜味剂、 矫味剂和 / 或防腐剂。
用于片剂剂型的合适的药学上可接受的赋形剂包括例如惰性稀释剂例如乳糖、 碳 酸钠、 磷酸钙或碳酸钙 ； 成粒剂和崩解剂例如玉米淀粉或藻酸 (algenic acid) ； 粘合剂例 如淀粉 ； 润滑剂例如硬脂酸镁、 硬脂酸或滑石粉 ； 防腐剂例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基 苯甲酸丙酯和抗氧化剂例如抗坏血酸。片剂剂型可以不包衣或包衣， 以调节片剂在胃肠道 中的崩解和随后活性成分的吸收， 或者以改进片剂的稳定性和 / 或外观， 在这两种情况下， 采用常规包衣材料和本领域熟知的方法进行。
口服用途的组合物可以是硬质胶囊剂的形式， 其中活性成分与惰性固体稀释剂 ( 例如碳酸钙、 磷酸钙或高岭土 ) 混合， 或者可以是软质胶囊剂的形式， 其中活性成分与水 或油 ( 例如花生油、 液体石蜡或橄榄油 ) 混合。
水性混悬剂一般含有微细粉形式的活性成分以及例如一种或多种以下的成分 ： 悬浮剂， 例如羧甲基纤维素钠、 甲基纤维素、 羟丙基甲基纤维素、 藻酸钠、 聚乙烯吡咯烷酮、 西黄蓍胶和阿拉伯树胶 ； 分散剂或湿润剂， 例如卵磷脂或环氧烷与脂肪酸的缩合产物 ( 例 如聚氧乙烯硬脂酸酯 )， 或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物 ( 例如十七碳乙烯氧基十六 醇 )， 或环氧乙烷与由脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的缩合产物 ( 例如聚氧乙烯山梨醇单油 酸酯 )， 或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物 ( 例如十七碳乙烯氧基十六醇 )， 或环氧乙烷 与由脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的缩合产物 ( 例如聚乙烯山梨醇单油酸酯 )， 或环氧乙烷 与由脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的缩合产物 ( 例如聚乙烯失水山梨醇单油酸酯 )。水性 混悬剂还可含有一种或多种防腐剂 ( 例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸丙酯 )、 抗氧 化剂 ( 例如抗坏血酸 )、 着色剂、 矫味剂和 / 或甜味剂 ( 例如蔗糖、 糖精或阿司帕坦 )。
油性混悬剂可以通过将活性成分悬浮于植物油 ( 例如花生油、 橄榄油、 芝麻油或 椰子油 ) 或矿物油 ( 例如液体石蜡 ) 中制备。油性混悬剂还可含有增稠剂， 例如蜂蜡、 固体 石蜡或鲸蜡醇。还可加入甜味剂 ( 例如上述甜味剂 ) 和矫味剂以提供适口的口服制剂。这 些组合物还可以加入抗氧化剂 ( 例如抗坏血酸 ) 以便保存。
适于通过加入水制备水性混悬剂的可分散粉剂和颗粒剂一般含有活性成分以及 分散剂或湿润剂、 悬浮剂和一种或多种防腐剂。合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂以上面已 提及的那些为例。还可存在其它赋形剂例如甜味剂、 矫味剂和着色剂。
本发明的药物组合物还可以为水包油乳剂的形式。油相可为植物油 ( 例如橄榄油 或花生油 ) 或矿物油 ( 例如液体石蜡 ) 或任何这些油的混合物。合适的乳化剂可为例如天 然存在的树胶 ( 例如阿拉伯树胶或西黄蓍胶 )、 天然存在的磷脂 ( 例如大豆磷脂 )、 卵磷脂、 由脂肪酸和己糖醇酐衍生的酯或偏酯 ( 例如失水山梨醇单油酸酯 ) 和所述偏酯与环氧乙烷 的缩合产物 ( 例如聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯 )。乳剂还可含有甜味剂、 矫味剂和防腐 剂。
糖浆剂和酏剂可用甜味剂 ( 例如甘油、 丙二醇、 山梨醇、 阿司帕坦或蔗糖 ) 配制， 还 可含有缓和剂、 防腐剂、 矫味剂和 / 或着色剂。药物组合物还可为无菌注射用水性混悬剂或油性混悬剂的形式， 可按照已知方法 用一种或多种上面提及的合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制。 无菌注射用制剂还可为无 菌注射用溶液剂或混悬剂以及胃肠外可接受的无毒稀释剂或溶剂， 例如 1， 3- 丁二醇的溶 液。
通过吸入法给药的组合物可以为常规压缩气雾剂的形式， 使得活性成分分散为含 有微细固体的气雾剂或液滴。可以使用常用的气雾剂抛射剂 ( 例如可挥发的氟化烃或烃 类 )， 气雾剂装置适宜设计成使活性成分定量分散。
有关制剂的更多资料， 读者可参阅 Comprehensive MedicinalChemistry， 第 5 卷， 第 25 章， 第 2 节 (Corwin Hansch ； Chairman ofEditorial Board)， Pergamon Press 1990。
与一种或多种赋形剂混合制备单一剂型的活性成分的用量， 必将随待治疗宿主和 具体给药途径而变化。例如， 人用口服制剂一般含有例如 0.5mg-2g 活性成分和与之相混合 的合适常用量的赋形剂， 所述赋形剂的用量可由占总组合物重量的约 5％至约 98％不等。 单位剂型一般含有约 1mg 至约 500mg 的活性成分。有关给药途径和剂量方案的更多资料， 读者可参阅 Comprehensive Medicinal Chemistry， 第 5 卷， 第 25 章， 第 3 节 ( 编委员主席 Corwin Hansch)， Pergamon Press 1990。 我们发现该药剂或其药学上可接受的盐是有效的 11βHSD1 抑制剂， 因此在代谢 综合征相关疾病的治疗中具有价值。
要了解的是， 当本文使用术语 “代谢综合征” 时， 这是指如 1) 和 / 或 2) 中定义的 代谢综合征或者这种综合征的任何其它公认定义。本领域使用的 “代谢综合征” 的同义词 包括 Reaven 综合征、 胰岛素抵抗综合征和 X 综合征。要了解的是， 当本文使用术语 “代谢综 合征” 时， 它还是指 Reaven 综合征、 胰岛素抵抗综合征和 X 综合征。
本发明的一个进一步的方面提供如上文定义的药剂或其药学上可接受的盐， 其用 于预防性或治疗性治疗温血动物 ( 例如人 ) 的方法。
因此， 按照本发明的这个方面， 提供用作药物的该药剂或其药学上可接受的盐。
按照本发明的另一个特征， 提供该药剂或其药学上可接受的盐在制备用于在温血 动物 ( 例如人 ) 体内产生 11βHSD1 抑制作用的药物中的用途。
按照本发明的另一个特征， 提供该药剂或其药学上可接受的盐， 以制备用于在温 血动物 ( 例如人 ) 体内产生 11βHSD1 抑制作用的药物。
当提及 11βHSD1 抑制作用的产生或产生 11βHSD1 抑制作用时， 这适当地是指代 谢综合征的治疗。或者， 当提及 11βHSD1 抑制作用的产生时， 这是指糖尿病、 肥胖症、 高脂 血症、 高血糖症、 高胰岛素血症或高血压的治疗、 特别 2 型糖尿病和肥胖症的治疗。或者， 当 提及 11βHSD1 抑制作用的产生时， 这是指青光眼、 骨质疏松症、 结核病、 痴呆、 认知障碍或 抑郁症的治疗。
或者， 当提及 11βHSD1 抑制作用的产生时， 这是指认知障碍的治疗， 例如通过改 善言语流畅、 言语记忆或逻辑记忆等来改善个体的认知能力， 或者用于轻度认知障碍的 治疗。参见例如 WO03/086410 及其中所包括的参考资料以及 Proceedings of National Academy ofSciences(PNAS)， 2001， 98(8)， 4717-4721。
或 者， 当 提 及 11βHSD1 抑 制 作 用 的 产 生 时， 这 是 指 动 脉 粥 样 硬 化 的 治 疗、 延 迟动脉粥样硬化的发生和 / 或降低动脉粥样硬化的风险 -- 参见例如 J.Experimental
Medicine， 2005， 202(4)， 517-527。
或者， 当提及 11βHSD1 抑制作用的产生时， 这是指阿尔茨海默病和 / 或神经变性 疾病的治疗。
按照本发明这个方面的进一步特征， 提供用于在需要这种治疗的温血动物 ( 例如 人 ) 体内产生 11βHSD1 抑制作用的方法， 所述方法包括给予所述动物有效量的式 (1) 化合 物或其药学上可接受的盐。
除治疗药物的用途外， 该药剂或其药学上的盐还可在体外和体内测试体系的开发 和标准化中用作药理学工具， 用于评价 11βHSD1 抑制剂对实验室动物 ( 例如猫、 狗、 兔、 猴、 大鼠和小鼠 ) 的作用， 作为寻找新型治疗药物的组成部分。
本文所述 11βHSD1 的抑制可以用作单一疗法施用， 或者除本发明的主题化合物 以外， 还可以包括一种或多种其它物质和 / 或治疗。这种联合治疗可以通过同时、 序贯或分 开给予治疗的各个组分来实现。同时治疗可以按单一片剂或按分开的片剂进行。例如， 可 与 11βHSD1 抑制剂、 特别是本发明的 11βHSD1 抑制剂共同给药的药物可包括下列主要的 治疗药类别 ：
1) 胰岛素和胰岛素类似物 ；
2) 胰 岛 素 促 分 泌 素， 包 括 磺 酰 脲 ( 例 如 格 列 本 脲 (glibenclamide)、 格列 吡 嗪 (glipizide))、 膳 食 血 糖 调 节 剂 ( 例 如 瑞 格 列 奈 (repaglinide)、 那格列奈 (nateglinide))、 胰高血糖素样肽 1 激动剂 (GLP1 激动剂 )( 例如艾塞那肽 (exenatide)、 利 拉糖肽 (liraglutide)) 和二肽基肽酶 IV 抑制剂 (DPP-IV 抑制剂 ) ；
3) 胰岛素增敏剂， 包括 PPARγ 激动剂 ( 例如吡格列酮 (pioglitazone) 和罗格列 酮 (rosiglitazone)) ；
4) 抑制肝葡萄糖排出量的药物 ( 例如二甲双胍 (metformin)) ；
5) 设计用来减少从肠中吸收葡萄糖的药物 ( 例如阿卡波糖 (acarbose)) ；
6) 设计用来治疗长期高血糖症的并发症的药物， 例如醛糖还原酶抑制剂 ；
7) 其它抗糖尿病药包括磷酸酪氨酸磷酸酶抑制剂、 葡萄糖 -6- 磷酸酶抑制剂、 胰 高血糖素受体拮抗剂、 葡糖激酶激活剂、 糖原磷酸化酶抑制剂、 果糖 -1， 6- 二磷酸酶抑制 剂、 谷氨酰胺 ： 果糖 -6- 磷酸酰氨基转移酶抑制剂。
8) 抗肥胖症药物 ( 例如西布曲明 (sibutramine) 和奥利司他 (orlistat)) ；
9) 抗 血 脂 异 常 药 物， 例 如 HMG- 辅 酶 A 还 原 酶 抑 制 剂 ( 他 汀 类 (statins)， 例 如 普 伐 他 汀 (pravastatin)) ； PPARα 激 动 剂 ( 贝 特 类 (fibrates)， 例如吉非贝齐 (gemfibrozil)) ； 胆汁酸螯合剂 ( 消胆胺 (cholestyramine)) ； 胆固醇吸收抑制剂 ( 植物甾 烷醇、 合成抑制剂 ) ； 回肠胆汁酸吸收抑制剂 (IBATi) ； 胆固醇酯转移蛋白抑制剂及烟酸和 类似物 ( 烟酸 (niacin) 和缓释剂型 ) ；
10) 抗高血压药， 例如 β 阻滞药 ( 例如阿替洛尔 (atenolol)、 恩特来 (inderal)) ； ACE 抑制剂 ( 例如赖诺普利 (lisinopril)) ； 钙拮抗剂 ( 例如硝苯地平 (nifedipine)) ； 血 管紧张素受体拮抗剂 ( 例如坎地沙坦 (candesartan)) ； α 拮抗剂和利尿药 ( 例如呋塞米 (furosemide)、 苄噻嗪 (benzthiazide)) ；
11) 止血调节剂 ( 例如抗血栓药 )、 血纤蛋白溶解激活剂和抗血小板药 ； 凝血 酶拮抗剂 ； Xa 因 子 抑 制 剂 ； VIIa 因 子 抑 制 剂 ； 抗 血 小 板 药 ( 例 如 阿 司 匹 林、 氯吡格雷(clopidogrel)) ； 抗凝血药 ( 肝素和低分子量类似物、 水蛭素 ) 和华法林 (warfarin) ；
12) 抗炎药， 例如非甾族抗炎药 ( 例如阿司匹林 ) 和甾族抗炎药 ( 例如可的松 ) ； 和
13) 防止葡萄糖被肾再吸收的药物 (SGLT 抑制剂 )。
本发明还涉及有关上述药剂的药物组合物、 组合、 医疗用途和该药剂 (1 型 ) 的治 疗方法。 实施例 现在， 通过下面的实施例对本发明进行说明， 除非另有说明， 否则 ：
(i) 温度以摄氏度 (℃ ) 表示 ； 在室温或环境温度下， 即在 18-25℃的温度范围内 并在惰性气体 ( 例如氩气 ) 气氛中进行操作 ；
(ii) 溶 剂 蒸 发 在 高 达 60 ℃ 的 浴 温 下 用 旋 转 蒸 发 器 减 压 (600-4000Pa ； 4.5-30mmHg) 进行 ；
(iii) 色谱法是指硅胶快速色谱法 ；
(iv) 一般而言， 反应进程用 TLC 跟踪， 反应时间仅用于说明 ；
(v) 所给出的收率仅用于说明目的， 不一定是通过繁复的工艺开发而可获得的收 率； 如需要更多原料则可重复制备 ；
(vi) 当给出的 NMR 数据 (1H) 为主要特征质子的 δ 值形式时， 以相对于四甲基加 硅烷 (TMS) 的百万分之几 (ppm) 给出， 除非另有说明， 否则就用全氘二甲亚砜 (DMSO-d6) 作 溶剂在 300MHz 或 400MHz( 除非另有说明 ) 下进行测定 ； 峰多重性 (peak multiplicity) 如 下所示 ： s， 单峰 ； d， 双峰 ； dd， 双双重峰 ； dt， 双三重峰 ； dm， 双多重峰 ； t， 三重峰， m， 多重峰 ； br， 宽峰 ；
(vii) 化学符号具有其通常的含义 ； 采用 SI 单位和符号 ；
(viii) 溶剂比以体积∶体积 (v/v) 项给出 ；
(ix) 质谱 (MS) 操作中采用 70 电子伏特的电子能， 化学电离 (CI) 模式， 使用直接 暴露探头 ； 其中所述电离通过电子碰撞 (EI)、 快速原子轰击 (FAB) 或电喷雾 (ESP) 实现 ； 给 出了 m/z 值 ； 一般说来， 仅报告指示母体质量的离子 ；
(x) 下文或在上述方法部分使用下列缩写词 ：
Et2O 乙醚
DMF 二甲基甲酰胺
DCM 二氯甲烷
THF 四氢呋喃
DMSO 二甲亚砜
EtOAc 乙酸乙酯
MTBE 甲基叔丁基醚
DSC 示差扫描量热法
实施例 1
4-[4-(2- 金刚烷基氨基甲酰基 )-5- 叔丁基 - 吡唑 -1- 基 ] 苯甲酸
将 2M 氢氧化钠水溶液 (51.7mL， 103.32mmol) 加入含 4-[4-(2- 金刚烷基氨基甲酰 基 )-5- 叔丁基 - 吡唑 -1- 基 ] 苯甲酸甲酯 ( 中间体 1)(4.5g， 10.33mmol) 的甲醇 (100mL) 中。将混合物在 70 ℃下搅拌 1 小时， 然后冷却至环境温度， 减压浓缩后， 用水 (100mL) 稀 释。用 2M HCl 调节反应混合物至 pH 3。反应混合物用 EtOAc(500mL) 萃取后， 依次用水 (2x100mL) 和饱和盐水 (50mL) 洗涤。有机层经 MgSO4 干燥， 过滤后蒸发， 得到浅黄色固 体。固体用 EtOAc(20mL) 洗涤， 经过滤收集后， 真空干燥， 得到 4-[4-(2- 金刚烷基氨基甲酰 基 )-5- 叔丁基 - 吡唑 -1- 基 ] 苯甲酸 (3.89g， 89％ )， 为奶油色结晶固体。
H NMR(400.13MHz， DMSO-d6)δ1.19(9H， s)， 1.49(2H， d)， 1.70-1.96(10H， m)， 2.09(2H ， d) ， 3.98-4.01(1H ， m) ， 7.49-7.53(2H ， m) ， 7.61(1H ， s) ， 8.06-8.09(2H ， m) ， 8.20(1H， d)， 13.30(1H， s)
m/z(ESI+)(M+H)+ ＝ 422
熔点 308.8℃ ( 开始 )
实施例 1 还可如下制备 ：
在 20℃下， 将氢氧化钠水溶液 (2M)(2.5 当量 ) 在 5 分钟内分批加入含 4-[4-(2- 金 刚烷基氨基甲酰基 )-5- 叔丁基 - 吡唑 -1- 基 ] 苯甲酸甲酯 ( 中间体 1)(1.0 当量 ) 的甲醇 (10 体积 ) 搅拌悬浮液 ( 放热 20-27℃ ) 中。将所得悬浮液加热至 70℃ ( 套管温度 )， (间 歇式回流约 60-65℃ ) 达 1 小时 ( 由 LCMS 确定完成 )。使橙色反应混合物冷却至 20℃ ( 溶 液保持轻微混浊 )， 经硅藻土过滤除去少量的固体。然后将滤液倒入法兰瓶 (flangeflask) 中， 加入水 (25 体积 )。 然后， 混合物用 2M HCl( 约 800-850ml) 调节至 pH 3( 变得非常稠 )。 然后将水溶液过滤， 浅黄色固体用水洗涤， 吸干过夜， 用乙腈以及最后用 1 ∶ 1 乙腈 / 乙醚 洗涤后， 在 50℃下真空干燥 72 小时 ( 周末 )， 得到 4-[4-(2- 金刚烷基氨基甲酰基 )-5- 叔 丁基 - 吡唑 -1- 基 ] 苯甲酸 (80％ )， 为固体。
中间体 2 ： 4- 肼基苯甲酸甲酯盐酸盐
1将 含 氯 化 氢 4M 的 二 噁 烷 (100mL， 399.60mmol) 加 入 含 4- 肼 基 苯 甲 酸 (15.2g， 99.90mmol) 的 MeOH(200mL) 中。将所得悬浮液在 90℃下搅拌 5 小时。在冷却至 20℃后， 经过滤收集沉淀， 用 Et2O(100mL) 洗涤后， 真空干燥， 得到氯化 2-(4-( 甲氧羰基 ) 苯基 ) 肼 (16.50g， 82％ )， 为奶油色结晶固体。
m/z(ESI-)(M-H)- ＝ 165 ； HPLC tR ＝ 1.12 分钟。 1
H NMR(400.13MHz， DMSO-d6)δ3.81(3H， s)， 6.99-7.02(2H， m)， 7.86-7.90(2H， m)， 8.98(1H， s)， 10.47(3H， s)
中间体 2 还可如下制备 ：
在氮气氛下， 将氯化氢的甲醇溶液 (4M)(4 当量， 新鲜制备 ) 加入 4- 肼基苯甲酸 (1 当量 ) 的甲醇 (12.6 体积 ) 悬浮液中。
将混合物在回流下搅拌 3 小时， 然后冷却至低于 15 ℃。经过滤收集固体， 用 MTBE(6.5 体积 ) 洗涤后风干， 得到产物， 为固体。
TLC DCM ∶ MeOH， 9 ∶ 1， 产物 Rf0.87
熔点 233.8-234.6℃
中间体 3 ： N-(2- 金刚烷基 )-4， 4- 二甲基 -3- 氧代 - 戊酰胺
将双 ( 三甲基甲硅烷基 ) 氨基锂的 THF(22.84ml， 22.84mmol) 溶液的 1M 溶液加 入 THF(25ml) 中， 在氮气气氛下冷却至 -78℃。在 5 分钟时间内滴加 3， 3- 二甲基 -2- 丁酮 (2.287g， 22.84mmol) 的 THF(25ml) 溶液。将所得溶液在氮气氛、 -78℃下搅拌 15 分钟。在 5 分钟时间内加入 2- 异氰酸基金刚烷 ( 通过 R.Reck 和 C.Jochims Chem.Ber.115(1982)， 第 864 页的方法由 2- 金刚烷基胺盐酸盐制备 )(3.68g， 20.76mmol) 的 THF(20mL) 溶液。将 所得溶液在 -78℃下搅拌 1 小时， 然后使之加热至 20℃达 1 个多小时。将反应混合物倒入 饱和 NH4Cl(150mL) 中， 用 EtOAc(2x100mL) 萃取， 有机层用水 (50mL) 和盐水 (50mL) 洗涤， 经
MgSO4 干燥， 过滤后蒸发， 得到黄色油状物。 粗产物用快速硅胶色谱法纯化， 洗脱梯度 0-50％ EtOAc/ 异己烷。将纯的部分蒸干， 得到 N-(2- 金刚烷基 )-4， 4- 二甲基 -3- 氧代 - 戊酰胺 (4.64g， 81％ )， 为白色固体。 1
H NMR(400.13MHz， DMSO-d6)δ1.08-1.09(9H， m)， 1.50(2H， d)， 1.66-1.89(10H， m)， 1.95-2.00(2H， m)， 3.53(1.4H， s)， 3.80-3.94(1H， m)， 5.30(0.3H， s)， 7.77-7.87(1H， m)， 14.43(0.3H， s)(2 ∶ 1 酮式和烯醇式的混合物 )m/z(ESI+)(M+H)+ ＝ 278
中间体 3 还可如下制备 ：
将氢氧化钠水溶液 (3M)(5 体积 ) 加入 2- 金刚烷基胺盐酸盐 (1 当量 ) 与水 (5 体 积 ) 的搅拌悬浮液中。 将 DCM(5 体积 ) 加入所得稠的悬浮液中， 分离各相。 水溶液用 DCM(4x5 体积 ) 萃取， 使合并的有机物浓缩， 得到游离胺， 为白色固体。
在氮气氛下， 将新戊酰基乙酸乙酯 (1 当量 ) 加入游离胺的二甲苯 (6.5 体积 ) 悬 浮液中， 将混合物在回流下搅拌 6.5 小时。间歇冷却至室温后浓缩至干。残余物依次用甲 苯 (3x1 体积 ) 和己烷 (3x1 体积 ) 清洗。将所得固体在己烷中于 50℃浸渍 5 分钟， 然后冷 却至室温。将白色固体过滤， 用己烷 (2 体积 ) 洗涤后风干。
TLC 己烷∶ EtOAc， 1 ∶ 1， 产物 Rf 0.66
熔点 124.5-125.1℃
中间体 4 ： (2)-N-(2- 金刚烷基 )-2-( 二甲基氨基亚甲基 )-4， 4- 二甲基 -3- 氧 代 - 戊酰胺
在 氮 气 氛 下， 将 N， N- 二 甲 基 甲 酰 胺 二 甲 基 乙 缩 醇 (3.02mL， 22.71mmol) 加 入 N-(2- 金刚烷基 )-4， 4- 二甲基 -3- 氧代 - 戊酰胺 ( 中间体 3)(5.25g， 18.93mmol) 与 1， 4- 二 氧杂环己烷 (50mL) 的搅拌悬浮液中。将所得混合物在 100℃下搅拌 2 小时。将反应混合 物蒸干， 将所得浅奶油色固体真空干燥， 得到 (2)-N-(2- 金刚烷基 )-2-( 二甲基氨基亚甲 基 )-4， 4- 二甲基 -3- 氧代 - 戊酰胺 (5.83g， 93％ )。 1
H NMR(400.13MHz， DMSO-d6)δ1.13(9H， s)， 1.47(2H， d)， 1.69-1.83(10H， m)， 2.03(2H， d)， 2.92(6H， s)， 3.90(1H， d)， 7.24(1H， s)， 7.94(1H， d)
m/z(ESI+)(M+H)+ ＝ 333
中间体 #4 还可如下制备 ：
在氮气氛下， 将 N， N- 二甲基甲酰胺二甲基乙缩醇 (1.2 当量 ) 加入 N-(2- 金刚烷 基 )-4， 4- 二甲基 -3- 氧代 - 戊酰胺 ( 中间体 3)(1 当量 ) 的 1， 4- 二氧杂环己烷 (9.6 体 积 ) 溶液中。将混合物加热回流 5 小时， 然后冷却至室温。真空除去溶剂后， 浅黄色固体直 接用于下一阶段。
TLC 己烷∶ EtOAc， 1 ∶ 1， 产物 Rf 0.94( 杂质 ： Rf 0.06+0.66)
熔点 143.6-147.6℃
中间体 1 ： 4-[4-(2- 金刚烷基氨基甲酰基 )-5- 叔丁基 - 吡唑 -1- 基 ] 苯甲酸甲酯
将 4- 肼 基 苯 甲 酸 甲 酯 盐 酸 盐 ( 中 间 体 2)(3.04g， 15.00mmol) 一 次 性 加 入 含 (2)-N-(2- 金刚烷基 )-2-( 二甲基氨基亚甲基 )-4， 4- 二甲基 -3- 氧代 - 戊酰胺 ( 中间体 4) (4.99g， 15mmol) 的乙醇 (100mL) 中。加入 5 滴乙酸后， 将所得溶液在 80℃下搅拌 2 小时。 反应混合物经浓缩后， 用 EtOAc(500mL) 稀释， 依次用水 (200mL) 和饱和盐水 (200mL) 洗涤。 有机层经 MgSO4 干燥， 过滤后蒸发， 得到粗产物。
粗产物用快速硅胶色谱法纯化， 洗脱梯度 0-50％ EtOAc/ 异己烷。将纯的部分蒸 干， 得到 4-[4-(2- 金刚烷基氨基甲酰基 )-5- 叔丁基 - 吡唑 -1- 基 ] 苯甲酸甲酯 (4.66g， 71.3％ )， 为黄色固体。
H NMR(400.13MHz， DMSO-d6)δ1.19(9H， s)， 1.50(2H， d)， 1.69-1.95(10H， m)， 2.09(2H， d)， 3.91(3H， s)， 3.99(1H， d)， 7.53-7.56(2H， m)， 7.62(1H， s)， 8.09-8.12(2H， m)， 8.20(1H， d)
m/z(ESI+)(M+H)+ ＝ 436
中间体 #1 还可如下制备 ：
在氮气氛下， 依次将氯化 2-(4-( 甲氧羰基 ) 苯基 ) 肼 ( 中间体 2)(1 当量 ) 和乙酸 (0.023 当量 ) 加入 (2Z)-N-(2- 金刚烷基 )-2-( 二甲基氨基 - 亚甲基 )-4， 4- 二甲基 -3- 氧 代 - 戊酰胺 ( 中间体 4)(1 当量 ) 的甲醇 (200 体积 ) 溶液中。 将混合物在回流下搅拌 1.5 小 时， 冷却， 浓缩至低于 3.5 体积， 所得悬浮液用乙酸乙酯 (96 体积 ) 稀释。悬浮液用水 (34.4 体积 ) 洗涤得到的溶液用盐水 (34.4 体积 ) 洗涤， 干燥 (MgSO4) 后浓缩至干。将粗产物在 MTBE(9 体积 ) 中制成浆状物并搅拌 15 分钟。将浅黄色固体过滤， 用 MTBE(11.4 体积 ) 洗涤 后， 在 60℃下真空干燥。
1TLC DCM ∶ MeOH， 9 ∶ 1， 产物 Rf0.86( 痕量杂质 Rf0.68) 熔点 193.6-194.5℃。22