吡唑并 [1， 5-a] 嘧啶酮衍生物及其药物组合物以及其用途 技术领域 本发明涉及化合物以及含有该化合物的药物组合物和其医药用途， 具体地说是有 关吡唑并嘧啶酮类衍生物及其药物组合物和其在作为 KCNQ 钾离子通道开放剂中的应用。
背景技术 KCNQ 钾通道是钾通道家族中的一个重要分支。目前， 已知有许多类型的 KCNQ 钾 通道存在于多种类型的细胞上。按其结构特性主要分为 5 大类， 即 KCNQ1、 KCNQ2、 KCNQ3、 KCNQ4、 KCNQ5。其中 KCNQ1( 又称 KVLQT)， 主要分布于心脏， KCNQ2-5 主要分布于中枢及外周 神经系统、 内耳 (KCNQ4)、 肌肉组织 (KCNQ5) 等。 研究证实 KCNQ1 与 KCNE1 共同编码组成心肌 上的延迟整流钾离子通道 (IKs)， 该通道的突变可以引起遗传性 QT 间期延长综合症 (LQT1， Sanguinetti MC， Ann N YAcad Sci.1999 ； 868 ： 406-13) ； KCNQ4 基因编码耳蜗外毛细胞和 前庭器官 1 型毛细胞中和钾通道相关的分子， 该基因的突变可导致遗传性耳聋 ； KCNQ2 和 KCNQ3 通道共表达产生的电流是神经元 M 型钾电流的分子基础， M 通道在调节神经细胞兴奋 性方面发挥重要作用， KCNQ2/Q3 基因突变导致的 M 通道功能改变可导致良性家族性新生儿 惊厥症 (BFNCs) 等神经系统疾病 (Maljevic S et al.， J Physiol.2008586(7) ： 1791-801)。 KCNQ2/3 通道的开放剂可降低神经元兴奋性， 因此可用于治疗与过度神经元兴奋相关的疾 病， 如惊厥、 癫痫和神经性疼痛等。
EP554543 的 专 利 中 公 开 了 一 种 KCNQ 开 放 剂 瑞 替 加 滨 (D-23129 ； N-(2- 氨 基 -4-(4- 氟苄基氨基 )- 苯基 ) 氨基甲酸乙酯 )。其在体内、 体外具有强抗惊厥特性 ； 具有 降低癫痫发作发病率的效力 (Bialer et al.， Epilepsy Research 2002， 52， 31-71)。神经 性疼痛的动物模型实验提示 KCNQ 通道开放剂可用于治疗疼痛性疾病 (Blackburn-Munro et al.， European Journal of Pharmacology 2003， 450， 109-116)。 此外， KCNQ2-5 通道 RNA 在 三叉神经节、 背根神经节和三叉神经尾状核的表达意味着这些通道开放剂还可能影响偏头 痛的感觉过程 (Goldstein et al.， Society for Neuroscience Abstracts 2003， 53， 8)。 也 有报道瑞替加滨在某些焦虑样行为动物模型中具有活性 (Korsgaard et al.， J Pharmacol Exp Ther.2005 ； 314(1) ： 282-92)。 同时也有研究者在与焦虑行为和情绪行为 ( 如双相精神 障碍 ) 有关的脑区海马和杏仁核中发现了 KCNQ2、 KCNQ3 亚基的 mRNA， 由此提示 KCNQ 开放 剂可用于治疗焦虑症和双相性神经障碍。另有研究还发现 KCNQ 通道开放剂可有效治疗中 风 (Jensen BS.， CNS Drug Review 2002， 8(4) ： 353-60)， 还可有效用于涉及大脑奖赏系统 的兴奋性过度疾病如可卡因滥用、 尼古丁戒断症状和乙醇戒断症状 (Hansen et al.， Eur J Pharmacol.2007 ； 570 ： 77-88)。
综上所述， KCNQ 钾通道不仅参与机体许多重要的生理功能的调节， 而且在一些疾 病中还具有重要作用。由此， 研制开发更多可以作为 KCNQ 钾通道开放剂应用的新颖化合 物， 可以为临床用药提供更多的选择。
发明内容 本发明的目的就是提供一种作为 KCNQ 钾通道有效开放剂的新颖化合物， 同时提 供一种以该化合物为活性成分的药物组合物以及该化合物及其药物组合物的用途。
本发明所提供一种作为 KCNQ 钾通道开放剂的新颖化合物是具有以下通式 I 的吡 唑并 [1， 5-a] 嘧啶酮衍生物 ：
其中 ： R 选自烷基、 芳基、 取代芳基， 杂环以及取代杂环， 或者 -COOR5 ； R1 选自氢、 卤素、 烷基、 卤代烷基、 芳基及取代芳基 ； R2 选 自 卤 素、 烷 基、 取 代 烷 基， 芳 基 及 取 代 芳 基， 杂 环 及 取 代 杂 环， 或者 -CH2R4 ；X 可以是 O、 NH， n 可以为 0 ～ 6 的自然数，
R3 选自氢、 卤素、 芳基及取代芳基 ；
R4 选自脂肪酸或者环状亚胺 ；
R5 选自 1 ～ 4 个碳链的烷基。
术语定义 ：
烷基——指具有 1 ～ 6 个碳原子的支链或无支链的烷基。包括但不限于甲基、 乙 基、 丙 -1- 基、 丙 -2- 基、 2- 甲基 - 丙 -1- 基、 2- 甲基 - 丙 -2- 基、 丁 -1- 基、 丁 -2- 基、 3- 甲 基 - 丁 -1- 基、 3- 甲基 - 丁 -2- 基、 戊 -1- 基、 戊 -2- 基、 戊 -3- 基、 己 -1- 基、 己 -2- 基。
取代烷基——指在上述烷基定义基础上， 进行卤代、 羟基等取代。如三氟甲基、 三 氯甲基， 以及单卤甲基。
芳基——指选自苯基和萘基的单环或双环芳族系。
取代芳基——指独立选自以下的取代基取代的芳基， 如甲氧苯基， 卤代苯基 ；
卤素——是指氟， 氯， 溴或碘。
卤代烷基——指独立选自氟、 氯、 溴、 碘取代基取代的烷基。其可以是单卤代或者 二卤代及三卤代烷， 如三卤代甲基代表三氟甲基或者三氯甲基。
杂环——含有 N、 O、 S 原子的环状化合物， 如吡啶、 嘧啶、 吡唑、 呋喃、 吲哚、 噻吩等。
取代的芳基或者取代杂环是指母环可以被一个或者多个取代基如被 0， 1， 2， 3， 或 者 4 个取代基取代。所述的取代基可以一个或多个独立选自下面的取代基 ： 卤素、 单卤代 物、 三氯代物、 C1-6 烷基氧基， 卤代 C1-6 烷基氧基、 硝基、 磺酰胺基。
本发明化合物中的 R1 优选自卤代烷基。更为优选的是三卤代烷基 ；
所说的碳链优选 1-4 碳原子直连或支链。
“本发明化合物” 是指本发明所述实施方案中的任意一种式 I 化合物。
本发明优选的化合物之一 ： 为通式 I， R 选自甲酸乙酯取代基， R1 选自卤代烷基， R2 选自苯基或取代苯基。
本发明优选的化合物之二 ： 为通式 I， R 选自苯基或取代苯基， R1 选自卤代烷基， R2 选自苯基或取代苯基。
本发明优选的化合物之三 ： 为通式 I， R 选自萘基或取代萘基， R1 选自卤代烷基， R2 选自苯基或取代苯基。
本发明优选的化合物之四 ： 为通式 I， R 选自噻吩， R1 选自卤代烷基， R2 选自苯基或 取代苯基。
本发明优选的化合物之五 ： 为通式 I， R 选自噻吩， R1 选自卤代烷基， R2 选自烷基或 取代烷基。
本发明优选的化合物之六 ： 为通式 I， R 选自萘基或取代萘基， R1 选自三卤代烷基， R2 选自苯基或取代苯基。
本发明优选的化合物之七 ： 为通式 I， R 选自噻吩， R1 选自卤代烷基， R2 选自本发明优选的化合物之八 ： 为通式 I， R 选自噻吩， R1 选自卤代烷基， R2 选自吡啶或 取代吡啶。
依据以上表述， 本发明人例举了 120 种含有通式 I 的具体化合物 ( 详见表 1)， 用于 对上述通式 I 及其取代基作更为详尽的解释。但其并非是本发明化合物的穷尽。
表1：
本发明更为优选的化合物是如下所列的具体化合物 ： 2- 三氟甲基 -3- 苯基 -5- 氯甲基吡唑 [1， 5-a] 嘧啶 -7(4H)- 酮 ； 2- 三 氟 甲 基 -3- 苯 基 -5-(2， 6- 二 氯 -5- 氟 嘧 啶 -3- 基 ) 吡 唑 [1， 5-a] 嘧啶 -7(4H)- 酮 ) ；
2- 三氟甲基 -3-( 萘 -1- 基 )-5- 氯甲基吡唑 [1， 5] 嘧啶 -7(4H)- 酮 ；
3-( 萘 -1- 基 )-2， 5- 二 ( 三氟甲基 ) 吡唑 [1， 5] 嘧啶 -7(4H)- 酮 ；
2- 三氟甲基 -3- 苯基 -5-( 哌啶 -1- 基甲基 ) 吡唑 [1， 5-a] 嘧啶 -7(4H)- 酮
发明化合物可以以游离碱或盐的形式存在。游离碱在应用时， 可选择生理上允许 的无机酸 ( 如盐酸、 硫酸、 氢溴酸、 氢碘酸、 磷酸 )、 有机酸 ( 如乙酸、 丙酸、 柠檬酸、 马来酸、 苹 果酸、 酒石酸、 甲磺酸 ) 成盐。
本发明的第二个目的是提供一种以上述发明化合物为活性成分， 同时含有一种或 多种药学上可以接受的载体或稀释剂的药物组合物。
本发明所指药学上可以接受的载体或稀释剂， 可选自药物制剂中常用的赋形剂、 辅料或溶剂。 如乳糖、 蔗糖、 糊精、 滑石粉、 明胶、 琼脂、 果胶、 阿拉伯树胶、 硬脂酸镁、 硬脂酸、 纤维素的低级烷基醚、 玉米淀粉、 马铃薯淀粉、 树胶、 糖浆、 花生油、 橄榄油、 磷脂、 脂肪酸、 脂 肪酸胺、 单硬脂酸甘油脂或二硬脂酸甘油脂、 着色剂、 矫味剂、 防腐剂、 水、 乙醇、 丙醇、 生理 盐水、 葡萄糖溶液等等。
本发明化合物以及药物组合物制备成 KCNQ 钾通道开放剂， 同时也可 制备用于抗癫痫的各种形式的药物制剂 ；
制备用于抗焦虑的各种形式的药物制剂 ；
制备镇痛的各种形式的药物制剂。
具体的制备方法可按照制剂常规进行。 如可以本发明化合物作为活性成份， 与水、 蔗糖、 山梨醇糖、 果糖等制备成口服液体制剂 ； 也可以乳糖、 葡萄糖、 蔗糖、 甘露醇糖等为赋 形剂， 以淀粉等为崩解剂， 以硬脂酸、 滑石粉等为润滑剂， 明胶、 聚乙烯醇为结合剂制备成片 剂或胶囊剂 ； 还可与生理盐水、 葡萄糖溶液或盐水与葡萄糖组成的混合载体制备成注射液。 还可制成无菌粉针剂以及各种缓释剂、 混悬剂、 乳剂等等。
本发明所提供的抗癫痫药物制剂， 可用于预防、 抑制、 缓解和治疗惊厥、 癫痫发作、 癫痫持续状态、 癫痫综合症。
本发明所提供的抗焦虑药物制剂， 可用于预防、 抑制、 缓解和治疗因各种原因引起 或诱发法焦虑症。如各种惊恐障碍、 强迫性障碍、 医学病症引起的焦虑障碍、 物质诱发的焦 虑障碍、 分离性焦虑障碍、 适应性障碍、 行为焦虑、 疑病症等等。
本发明所提供的镇痛的药物制剂， 可用于预防、 抑制、 缓解和治疗各种神经性疼痛 和偏头痛性。
用本发明化合物制成药剂后， 可经口服或非口服给药。 给药量可因药物剂型、 给药 频率、 给药方式、 病程、 患者个体差异以及健康状况不同而各有不同。对成年人来说， 每天 50 ～ 500mg 比较合适。医师可依据临床的实际情况进行必要的调整。
本发明所述的化合物， 经毒理学试验， 尚未获得对人体有明显毒性作用的提示。
附图说明
图 1 是制备本发明化合物中间体的流程图。 图 2、 图 3 是制备本发明化合物的流程图。 图 4 是本发明化合物原子吸收 Rb+ 流出量测定光谱图。图 5 是本发明化合物激活 KCNQ2/3 通道的电流图。
本发明化合物的合成方法
本发明化合物可以按照常规的化合物合成方法合成。
本发明在此提供一种更为具体的合成方法， 即通过以下流程 ( 详见图 1、 图 2 或图 1、 图 3) 获得， 流程中所示 R、 R1、 R2 的定义与通式 I 中的定义相同。
(1) 合成本发明化合物的中间体 ( 如通式 (e) 所示化合物 ) ：
将金属钠加入无水乙醇， 溶解后趁热加入通式为 (a) 的和通式为 (b) 的化合物， 进 行回流反应， 反应生成物在硫酸肼、 碳酸二甲酯的作用下反应生成通式为 (e) 的吡唑类衍 生物。流程详见图 1。
在本流程中生成的通式为 (e) 的吡唑类衍生物， 是本发明化合物的重要中间体。
(2) 合成目标化合物 ：
将通式为 (e) 的吡唑类衍生物加入通式 (f) 所代表的化合物， 以冰醋酸为溶剂， 回 流反应 4 小时， 则得到通式 (I) 所述的目标化合物。
(3) 合成目标化合物 ： 将通式为 e 的吡唑类衍生物， 加入卤代乙酰乙酸乙酯 ( 例如 4- 氯乙酰乙酸乙酯 )， 冰醋酸中回流反应 4 小时， 得到通式为 (i) 的化合物， 然后以通式为 (i) 的化合物为原料进行三条路线反应。 路线之一 ： 通式为 (i) 的化合物通过盖布瑞尔反应得到通式为 (j) 的化合物， 然后 与相应的酸在 EDC 和 DMAP 催化下反应得到通式为 (m) 的化合物 ；
路线之二 ： 通式为 (i) 的化合物直接和相应的亚胺基化合物反应得到通式为 (l) 的化合物 ；
路线之三 ： 对通式为 (i) 的化合物进行亲和取代反应得到通式为 (k) 的化合物， 进 一步与相应的酸在以 EDC 和 DMAP 催化下， 缩合得到通式为 (n) 的化合物。
通式 (i)、 通式 (j)、 通式 (m)、 通式 (l)、 通式 (k)、 通式 (n) 是本发明所述通式 I 进 一步细化后的化学通式。其同时用于对本发明化合物作进一步的说明。
依据图 1、 图 3 所示流程可以合成通式 I 中 R2 选自卤素、 烷基、 取代烷基， 芳基及取
代芳基， 杂环及取代杂环， 或者
-CH2R4 的化合物。上述方法中所用试剂均可从商业销售渠道获得。具体实施方式 以下实施例 1 ～ 8 是本发明的具体化合物以及重要中间体的合成实例。
实施例 1
(1) 合成中间体 4- 苯基 -3- 三氟甲基 -5- 氨基 -1H- 吡唑
按照图 1 所示流程， 将 2.3 克金属钠加入 25ml 绝对乙醇中， 完全溶解后趁热加入 苯乙腈 (11.7g) 和三氟乙酸乙酯 (15.8g)， 回流反应 2 小时， 减压回收乙醇， 加水 20ml 溶解 产物， 用石油醚洗水层三次， 每次 15ml， 减压浓缩水层， 得到 14.0 白色固体。将所得的固体 物质 4.75g(20mmol)， 硫酸肼 5.2g， 碳酸二甲酯 50ml， 80℃反应 12 小时， 减压过滤， 滤液回收 碳酸二甲酯， 加入异丙醚 10ml， 重结晶， 得到 4- 苯基 -3- 三氟甲基 -5- 氨基 -1H- 吡唑 ( 本 发明的重要中间体 )3.8g。 白色固体， 纯度大于 98％ (HPLC-UV 面积归一化 ) ； ESI-Ms(m/z) ：
228.1(M+1)+。
(2) 合成中间体 4-(4- 氯苯基 )-3- 三氟甲基 -5- 氨基 -1H- 吡唑 ：
按照图 1 所示流程， 将 2.3 克金属钠加入 25ml 绝对乙醇中， 完全溶解后趁热加入 4- 氯苯乙腈 (15.1g) 和三氟乙酸乙酯 (15.8g)， 回流反应 2 小时， 减压回收乙醇， 加水 20ml 溶解产物， 用石油醚洗水层三次， 每次 15ml， 水层用稀硫酸调解 pH 值到 5-6， 用乙酸乙酯萃 取三次， 每次 20ml， 加入适量无水硫酸镁干燥酯层， 减压浓缩， 16.0g。将所得的固体物质 4.95g(20mmol)， 水合肼 2.0g， 无水乙醇 30ml， 甲基磺酸 1.93g， 回流反应 0.5 小时， 回收乙 醇， 浓缩物水洗到 pH 值不再发生变化， 浓缩后加入异丙醚 10ml， 重结晶， 得到 4-(4- 氯苯 基 )-3- 三氟甲基 -5- 氨基 -1H- 吡唑化合物 5.0g。白色固体， 纯度大于 97％ (HPLC-UV 面 + 积归一化 ) ； ESI-Ms(m/z) ： 262(M+1) 。
以下中间体化合物亦为本发明的重要中间体。其可以通过图 1 所示流程通法合成 而得。具体操作可参照实施例 1， 并根据化合物的不同性质按照常规方法进行适当调整。
3- 氯 -4- 苯基 -5- 氨基 -1H- 吡唑 ：
白色固体， 纯度大于 98％ (HPLC-UV 面积归一化 ) ； ESI-Ms(m/z) ： 194(M+1)+。
4-( 噻吩 -2- 基 )-3- 氯 -5- 氨基 -1H- 吡啶 ：
红棕色固体， 纯度大于 97％ (HPLC-UV 面积归一化 ) ； ESI-Ms(m/z) ： 200(M+1)+。
4-( 萘基 -1- 基 )-3- 三氟甲基 -5- 氨基 -1H- 吡唑 ： 浅黄色固体物质， 纯度大于 + 95％ (HPLC-UV 面积归一化 ) ； ESI-Ms(m/z) ： 278.1(M+1) 。
实施例 2
合成 5- 氯甲基 -3- 苯基 -2- 三氟甲基吡唑 [1， 5-a] 嘧啶 -7(4H)- 酮 ： ( 以下简称 21 号化合物 )
按 照 图 2 所 示 流 程， 取 中 间 体 4- 苯 基 -3- 三 氟 甲 基 -5- 氨 基 -1H- 吡 唑 0.227g(1mmol)， 4- 氯乙酰乙酸乙酯 0.130g， 冰醋酸 3ml， 放入平行合成仪 ( 瑞士步琦 )， 回 流反应 4 小时， 停止加热， 在合成仪低温模块中通入冷水， 用固体析出， 先用冰醋酸洗涤， 然 后水洗至中性， 得到 5- 氯甲基 -3- 苯基 -2- 三氟甲基吡唑 [1， 5-a] 嘧啶 -7(4H)- 酮化合 物 30mg， 为白色固体。纯度大于 98 ％ (HPLC-UV 面积归一化 ) ； ESI-Ms(m/z) ： 328(M+1)+， 1 HNMR(500MHz， CD3OD) ： 7.56(d， 2H)， 7.42(m， 2H)， 7.33(m， 1H)， 6.12(s， 1H)，
实施例 3
合成 2- 三氟甲基 -3- 苯基 -5-(2， 6- 二氯 -5- 氟吡啶 -3- 基 ) 吡唑并 [1， 5-a] 嘧 啶 -7(4H)- 酮 ( 以下简称 24 号化合物 )。
(1) 参照实施例 1 合成中间体 3- 三氟甲基 -4- 苯基 -5- 氨基 -1H- 吡唑 .
(2) 合成 24 号化合物
按 照 图 2 所 示 流 程， 取 中 间 体 4- 苯 基 -3- 三 氟 甲 基 -5- 氨 基 -1H- 吡 唑 0.227g(1mmol)， 氟氯烟酸酯 0.28g， 冰醋酸 3ml， 放入平行合成仪 ( 瑞士步琦 )， 回流反应 4 小时， 停止加热， 在合成仪低温模块中通入冷水， 用固体析出， 先用冰醋酸洗涤， 然后水洗 至， 得到 24 号化合物。中性白色固体， 收率 30％， 纯度大于 97％ (HPLC-UV 面积归一化 ) ； + 1 ESI-Ms(m/z) ： 443(M+1) ，HNMR(500MHz， CD3OD) ： 7.54(d， 2H)， 7.41(m， 2H)， 7.33(m， 1H)， 6.12(s， 1H)。
实施例 45- 氯甲基 -3-( 萘 -1- 基 )-2- 三氟甲基吡唑 [1， 5] 嘧啶 -7(4H)- 酮 ( 以下简称 39 号化合物 )
(1) 参照实施例 1 合成中间体 3- 三氟甲基 -4-( 萘基 -1- 基 )-5- 氨基 -1H- 吡唑。
(2) 合成 5- 氯甲基 -3-( 萘 -1- 基 )-2- 三氟甲基吡唑 [1， 5] 嘧啶 -7(4H)- 酮
按照图 2 所示流程， 取中间体 3- 三氟甲基 -4-( 萘基 -1- 基 )-5- 氨基 -1H- 吡唑 0.277g(1mmol)， 4- 氯乙酰乙酸乙酯 0.130g， 冰醋酸 3ml， 放入平行合成仪 ( 瑞士步琦 )， 回 流反应 4 小时， 停止加热， 在合成仪低温模块中通入冷水， 用固体析出， 先用冰醋酸洗涤， 然 后水洗至中性， 得到目标化合物。白色固体， 收率 20％， 纯度大于 99％ (HPLC-UV 面积归一 + 1 化 )； ESI-Ms(m/z) ： 378(M+1) ，HNMR(500MHz， CD3OD) ： 8.03(d， 1H)， 7.98(d， 1H)， 7.60(q， 1H)， 7.53(m， 3H)， 7.47(m， 1H)， 6.14(s， 1H)， 4.46(s， 2H)。
实施例 5
合成 3-( 萘 -1- 基 )-2， 5- 二 ( 三氟甲基 ) 吡唑 [1， 5] 嘧啶 -7(4H)- 酮 ( 以下简 称 38 号化合物 )
(1) 参照实施例 1 合成中间体 4-( 萘基 -1- 基 )-3- 三氟甲基 -5- 氨基 -1H- 吡唑。
(2) 合成 38 号化合物。
按照图 2 所示流程， 取中间体 3- 三氟甲基 -4-( 萘基 -1- 基 )-5- 氨基 -1H- 吡唑 0.277g(1mmol)， 三氟乙酰乙酸乙酯 0.184g， 冰醋酸 3ml， 放入平行合成仪 ( 瑞士步琦 )， 回流 反应 4 小时， 停止加热， 在合成仪低温模块中通入冷水， 用固体析出， 先用冰醋酸洗涤， 然后 水洗至中性， 得到 38 号化合物。其为白色固体， 收率 25％， 纯度大于 99％ (HPLC-UV 面积归 + 1 一化 ) ； ESI-Ms(m/z) ： 398(M+1) ， HNMR(500MHz， CD3OD) ： 8.03(d， 1H)， 7.98(d， 1H)， 7.60(q， 1H)， 7.53(m， 3H)， 7.47(m， 1H)， 6.44(s， 1H)。
实施例 6
合成 5-(2， 6- 二氯 -5- 氟吡啶 -3- 基 )-3-( 萘 -1- 基 )-2-( 三氟甲基 ) 吡唑 [1， 5-a] 嘧啶 -7(4H)- 酮 ( 以下简称 42 号化合物 )
(1) 参照实施例 1 合成中间体 4-( 萘基 -1- 基 )-3- 三氟甲基 -5- 氨基 -1H- 吡唑 .
(2) 合成 42 号化合物
按 照 图 2 所 示 流 程， 取 中 间 体 4- 苯 基 -3- 三 氟 甲 基 -5- 氨 基 -1H- 吡 唑 0.277g(1mmol)， 氟氯烟酸酯 0.28g， 冰醋酸 3ml， 放入平行合成仪 ( 瑞士步琦 )， 回流反应 4 小时， 停止加热， 在合成仪低温模块中通入冷水， 用固体析出， 先用冰醋酸洗涤， 然后水 洗至， 得到 42 号化合物。白色固体， 收率 35 ％， 纯度大于 99 ％ (HPLC-UV 面积归一化 ) ； + 1 ESI-Ms(m/z) ： 493(M+1) ，HNMR(500MHz， CD3OD) ： 8.00(q， 2H)， 7.96(d， 1H)， 7.59(q， 1H)， 7.53(m， 3H)， 7.41(m， 1H)， 6.12(s， 1H)。
实施例 7
2- 三氟甲基 -3- 苯基 -5-( 哌啶 -1- 基甲基 ) 吡唑 [1， 5-a] 嘧啶 -7(4H)- 酮 ( 以 下简称 25 号化合物 )
取 21 号化合物 0.327g， K2CO30.3g， 及哌嗪 0.22g 于 10mlDMF 中， 加热至 50 ℃， 在 该温度反应 1h， 冷却到室温， 加入 20ml 水， 冷却后用乙酸乙酯萃取两次， 每次 15ml， 适量 水洗酯层一次， 减压浓缩乙酸乙酯， 析出 218mg 目标 25 号化合物。产物为白色固体， 纯度 + 1 大于 99.8 ％ (HPLC-UV 面积归一化 ) ； ESI-Ms(m/z) ： 377.15(M+1) ， HNMR(500MHz， CD3OD) ：7.55(d， 2H)， 7.42(m， 2H)， 7.33(m， 1H)， 5.83(2， 1H)， 4.10(s， 2H)， 3.30(m， 4H)， 1.82(m， 4H)， 1.66(t， 3H)。
实施例 8
合成 N-((2- 三氟甲基 -3- 苯基 -7- 氧 -4， 7- 二氢吡唑 [1， 5-a] 嘧啶 -5- 基 ) 甲 基 )-2-(4- 三氟甲基苯基 ) 乙酰胺 ( 以下简称 35 号化合物 )
①制备 5- 胺甲基 -3- 苯基 -2- 三氟甲基吡唑 [1， 5-a] 嘧啶 -7(4H)- 酮 ：
取邻苯二甲酰亚胺钾盐 0.3g(1.62mmol) 加至三口烧瓶中， 加入干燥的 DMF20ml 和 21 号化合物 0.327mg， 在 100℃反应 8 小时， 冷却到室温。加水 20ml 后， 用乙酸乙酯萃取三 次， 每次 15ml， 酯层用 20ml 水洗涤， 无水硫酸镁干燥。减压浓缩得白色固体 0.50g。将所得 白色固体全部投入到 20ml 无水乙醇中， 溶解后加入 80％水合肼 0.2ml， 加热回流半小时。 回 收乙醇， 得到的白色固体用适当浓度的乙醇 - 水重结晶， 得到 5- 胺甲基 -3- 苯基 -2- 三氟 甲基吡唑 [1， 5-a] 嘧啶 -7(4H)- 酮化合物 0.18g。
②目标化合物的合成
参 照 流 程 图 3， 取 上 述 5- 胺 甲 基 -3- 苯 基 -2- 三 氟 甲 基 吡 唑 [1， 5-a] 嘧 啶 -7(4H)- 酮化合物 0.154g， 盐酸 EDC0.192g， DMAP0.15g， 4- 三氟甲基苯乙酸 0.1g， 溶于 20ml 二氯甲烷中， 室温反应过夜。 二氯甲烷先用 5％盐酸洗三次， 每次 15ml， 然后用 5％的碳 酸氢钠洗三次， 每次 15ml， 最后用 20ml 水洗一次， 回收二氯甲烷， 得到白色固体 0.2g， 用少 量的 70％乙醇重结晶， 得到 35 号化合物 0.08g。为白色固体， 纯度大于 99.0％ (HPLC-UV 面 + 1 积归一化 ) ； ESI-Ms(m/z) ： 495.15(M+1) ， HNMR(500MHz， CD3OD) ： 7.82(d， 2H)， 7.54(m， 2H)， 7.46(m， 4H)， 7.38(m， 1H)， 5.89(s， 1H)， 4.04(s， 2H)， 3.55(s， 2H)。
参照实施例 1 ～ 8 所述方法以及常规的化学合成方法， 选择适当的反应物、 反应条 件， 可以合成本发明所述化合物。如 ：
3， 5- 二苯基 -2- 三氟甲基吡唑 [1， 5-a] 嘧啶 -7(4H)- 酮 (19 号化合物 )
白色固体， 收率 50 ％， 纯度大于 99.5 ％ (HPLC-UV 面积归一化 ) ； ESI-Ms(m/z) ： + 1 356.09(M+1) ，HNMR(500MHz， CD3OD) ： 7.67(d， 1H)， 7.54(m， 1H)， 7.46(t， 1H)， 7.38(m， 6H)， 7.31(d， 2H)。
7- 氧 -5- 苯基 -2- 三氟甲基 -4， 7- 二氢吡唑 [1， 5-a] 嘧啶 -3- 羧酸乙酯 (5 号化 合物 )
白 色 固 体， 收 率 18 ％， 纯 度 大 于 97 ％ (HPLC-UV 面 积 归 一 化 ) ； ESI-Ms(m/z) ： + 1 352.08(M+1) ，HNMR(500MHz， CD3OD) ： 8.05(m， 2H)， 7.53(m， 2H)， 7.41(m， 1H)， 7.38(m， 6H)， 5.98(s， H)， 4.36(q， 4H)， 1.35(t， 3H)。
2- 氯 -5- 氯甲基 -3-( 噻吩 -2- 基 ) 吡唑 [1， 5-a] 嘧啶 -7(4H)- 酮 (108 号化合 物)
白 色 固 体， 收 率 38 ％， 纯 度 大 于 98 ％ (HPLC-UV 面 积 归 一 化 ) ； ESI-Ms(m/z) ： + 1 299.8(M+1) ，HNMR(500MHz， CD3OD) ： 7.40(m， 1H)， 7.17(m， 3H)， 7.67(m， 1H)， 6.12(s， 1H)， 4.46(s， 2H)。
本发明所有化合物在以下至少一个实验中显示出具有生理及药理活性作用。 以下 实验例仅用于详述本发明的活性。并非是对未明示的本发明化合物的限定。
本发明化合物的生物活性测定实施例 9 原子吸收 Rb+ 流出高通量测定
(1) 测试化合物 ： 24 号、 42 号化合物
(2) 测试方法 ：
原子吸收 Rb+ 流出测定技术在钾离子通道调节剂的高通量筛选中更加安全快速， 并且具有直接反映离子通道活性及调节剂调节作用的特点。Rb 与 K 有相近的原子大小， 并 + + 且钾离子通道对于 Rb 具有通透性， 可以通过检测 Rb 流出的浓度来测定钾通道的开放或关 闭。Rb 在 780nm 有特异的原子吸收， 可以通过原子吸收的方法检测的 Rb+ 浓度。故可以采 用原子吸收光谱测定法通过测定 Rb+ 流出的高通量测定技术用于筛选钾通道的开放剂或关 闭剂。
将处于对数生长期的稳转 KCNQ4 通道的 CHO 细胞以 2×104 个 / 孔的密度接种于 96 孔培养板。每个浓度设三复孔。并设相应浓度的溶媒对照孔。贴壁生长过夜后， 弃培养液， 加入 200μl 含 RbCl 的装载缓冲液， 在 37℃、 5％ CO2 条件下培养 3 小时。 然后弃去装载缓冲 液， 用洗涤缓冲液洗涤 3 遍。若筛选通道开放剂， 在去极化缓冲液中稀释待测化合物， 并将 200μl 上述溶液加入细胞中， 反应 10 分钟。孵育 10 分钟后， 小心吸取 200μl 上清到另一 块 96 孔板中， 用 ICR8000 原子吸收测定仪测定 780nm 处的 Rb+ 原子吸收。按公式 Fsupern ＝ (Rb_supern/cpd/Rb_supern/d)*100 计算相对流出量。 (3) 测试结果 ：
如图 4 所示， 原子吸收 Rb+ 流出高通量测定技术测定的 24 号和 42 号化合物分别在 0.03、 0.1、 0.3、 1、 3 和 10μM 浓度下对稳转 KCNQ4 钾离子通道的 CHO 细胞的剂量依赖性的激 活作用。RTG 为实验阳性对照品 Retigabine， 24 号化合物测量组 EC50 ＝ 0.21±0.08μM， 42 号化合物测量组 EC50 ＝ 0.96±0.51μM。
由此可见 24 号、 42 号化合物可为 KCNQ4 钾离子通道开放剂。
采用上述方法对本发明的其他一些化合物的 Rb+ 流出浓度进行了测试， 其测试结 果详见表 2.
表2
实施例 10 电生理膜片钳测定
(1) 测试化合物 ： 21 号化合物
(2) 测试方法 ： 中国仓鼠卵巢细胞 (CHO) 的培养 ： 稳转了 KCNQ2/Q3 通道的 CHO 细胞 培养于含有 10％胎牛血清， 100U/ml 青霉素和链霉素的 DMEM 培养液中， 胰酶消化传代。将 细胞铺于 12mm 的圆形盖玻片上， 24 孔板培养。
膜片钳技术记录细胞膜电流 ： 膜片钳放大器采用 HEKA-EPC10。电极内应用两性霉 素 B( 终浓度 0.1 ～ 0.2mg/ml) 做打孔膜片钳记录。 微电极抛光后， 灌充电极内液， 控制电阻 值在 2 ～ 4MΩ。记录 CHO 细胞时所用电极内液为 (mM) ： KCl 160， HEPES 5， MgCl23， CaCl21， EGTA 3， 用 KOH 调 pH 至 7.4 ； 细胞外液成分为 (mM) ： NaCl 160， KCl 2.5， HEPES 10， glucose 8， MgCl21， CaCl25。微电极与细胞膜形成巨阻封接后， 钳制在 -80mV 等待 5-10min 后开始按 照不同的刺激程序进行电流记录。
(3) 测试结果 ： 如图 5 所示， 图 5a 为 21 号化合物激活 KCNQ2/3 通道的电流图。采
用 -80mV 作为钳制电压， 去极化到 -40mV， 引发通道电流， 21 号化合物可以明显激活 KCNQ2/3 通道电流。图 5b 以 -40mV 下 KCNQ2/3 平台期的激活电流为纵轴， 以记录时间为横轴做图， 并设置对照药 Retigabine(RTG)。
鉴于本发明化合物对 KCNQ 家族钾通道具有开放作用， 因此认为他们可以用于增 加哺乳动物 ( 例如人 ) 的电压依赖性钾通道的电流。适用于治疗 KCNQ 家族钾离子通道电 流增加敏感的疾病， 如癫痫、 各种焦虑症， 以及各种神经性疼痛。
本发明化合物的药效学实验
实施例 11
“最大电休克” 实验 ： 该实验通过电的方法测量由非特异性 CNS 刺激诱发的癫痫发 作。
试验用药 ： 试验组采用 21 号化合物， 阳性对照采用苯妥英钠。
实验方法 ： 在各组雄性小鼠中使用角膜电极， 给予 26mA 方波电流 0.4 秒， 诱导以 后肢强直性伸展为特征的惊厥 (Wlaz 等， Epilepsy Research 1998， 30， 219-229) 后灌胃 给药。试验组的给药量分别 10mg/kg( 体重 )/ 次、 25mg/kg( 体重 )/ 次、 50mg/kg( 体重 )/ 次、 )， 对照组的给药量为 25mg/kg( 体重 )/ 次。
实验结果 ： 本发明化合物具有与苯妥英钠同样明显的抗惊厥表征作用， 其 ED50 ＝ 12.2±0.8mg/kg。
实施例 12
“毛果芸香碱诱发的癫痫发作” 实验 ：
毛果芸香碱诱发的癫痫通常难以用现有的许多抗癫痫发作的药物来治疗， 因此是 “耐药性癫痫发作” 模型。
实验用药 ： 试验组采用 24 号化合物， 对照组采用苯妥英钠。
实验方法 ：
各 组 雄 性 小 鼠 经 腹 膜 内 注 射 毛 果 芸 香 碱 250mg/kg， 诱发毛果芸香碱诱发的 癫痫发作， 在 30 分钟内， 观察癫痫发作活动导致的步态紊乱 (Starr 等， Pharmacology Biochemistry and Behavior 1993， 45， 321-325)。腹腔注射给药。给药量分别 1mg/kg( 体 重 )/ 次、 5mg/kg( 体重 )/ 次、 10mg/kg( 体重 )/ 次 )， 对照组的给药量为 50mg/kg( 体重 )/ 次。
实验结果 ： 本发明化合物具有较为明显的抗癫痫表征作用， ED50 ＝ 5.1±0.5mg/ kg。与阳性对照组相比不具有显著的统计学差异 P ＞ 0.05。
实施例 13
“杏仁核点燃” 实验 ：
该实验用来测量疾病进程， 当接受进一步刺激时， 与正常动物一样， 这个模型动物 的癫痫发作会更严重。
试验用药 ： 试验组采用含有 21 号化合物的羧甲基纤维素钠混悬液， 对照组为相同 浓度的羧甲基纤维素钠空白混悬液。
试验方法 ： 对大鼠实施手术将三极式电极 (tri-polar electrode) 植入背外侧 杏仁核。手术后使动物恢复之后， 给予各组大鼠不同剂量的试验化合物或者药物溶媒。动 物每天用其初始后放电阈值 +25μA 刺激共 3-5 周， 记录每次癫痫发作的严重程度、 癫痫发作持续时间和放电后的电持续时间 (Racine.Electroencephalography and Clinical Neurophysiology 1972， 32， 281-294)。给药量与实施例 11 相同。
实验结果 ： 对照组惊厥值与杏仁核后放电时程无明显变化 (P)0.05)， 而试验组惊 厥值的提高与杏仁核后放电时程的缩短均较用药前改变明显 (P<0.05>， 且与对照组比较有 统计学差异性 (P<0.01>
实施例 14
福尔马林致痛模型
试验用药 ： 试验组采用 42 号化合物。对照组为不给药的空白疼痛模型
实验方法 ： 方法雄性 SD 大鼠随机分为对照组、 同侧给药组、 对侧给药组 . 给药 30min 后于给药侧或给药对侧后爪足底皮下注射 20g/L 福尔马林 50μl， 出现典型鼠尾侧向 甩动和抖动视为致痛模型制作成功， 观察其后 60min 内每 5min 大鼠咬舔注射福尔马林爪的 时间变化。
实验结果 ： 结果大鼠注射福尔马林后第一相 (0 ～ 10min) 咬 / 舔后爪累积时间， 给 药组与对照组比较差异无统计学意义 (P ＞ 0.05). 第二相 (10 ～ 60min) 同侧给药组各剂 量与对照组比较咬 / 舔后爪累积时间减少， 差异有统计学意义 P ＜ 0.05。由此说明本发明 化合物具有显著的镇痛作用。
实施例 15
毒副作用实验 ：
通 过 测 量 小 鼠 停 留 在 转 杆 装 置 上 的 时 间 (Capacio 等， Drug and Chemical toxicology 1992， 15， 177-201) ； 或者通过记录越过实验笼红外光束的数目以衡量小鼠的 自主活动能力 (Watson 等， Neuropharmacology 1997， 36， 1369-1375)， 来测量对中枢神经 系统的副作用。通过直肠探测或能够测体温的植入型无线电遥测传感器 (radiotelemetry transmitter)， 测量化合物对动物核心体温的低体温作用。
试验结果表明， 本发明化合物几乎都没有副作用或者副作用在临床上可以忽略不 计。
实施例 16
按照本领域已知的方法制备片剂， 每片含有下述成分 ：
21 号化合物 50mg
乳糖 70mg
硬脂酸镁 3mg
聚乙烯比咯烷酮 130mg
实施例 17
按照本领域已知的方法制备胶囊剂， 每个胶囊中含有下述成分 ：
35 号化合物 50mg
乳糖 70mg
玉米淀粉 25mg
硬脂酸镁 1mg
聚乙烯比咯烷酮 130mg
本发明所述化合物的化学结构示例 ： ( 详见表 3)表3：
在本发明中编号相同的化合物为同一化合物 ( 如表 1、 表 2、 表 3 及实施例 2 中所 述的 21 号化合物为同一化合物 )， 只是从不同侧面对同一化合物进行表述。
以上所有实施例、 实验实施例和制剂实施例用于更详细地说明本发明， 但不以任 何形式限制本发明。