一种高纯度紫杉醇及其衍生物的提取方法
技术领域
本发明属于天然化学物质提取技术领域，具体涉及紫杉醇及其衍生物的提取方法，特别是从曼地亚红豆杉枝叶中提取高纯度紫杉醇及其衍生物的方法。
背景技术
紫杉醇、紫杉醇注射液已收载于现行美国药典和中国国家药品标准中，用于治疗转移性卵巢癌和乳腺癌、肺癌、食管癌。紫杉醇，英文名称Paclitaxel，分子式C47H51NO14，分子量853.92，白色结晶性粉末，无臭、无味，美国药典和中国国家药品标准规定其纯度要求是，按干燥品计算，含C47H51NO14应为98.0％～102.0％。
紫杉醇是继阿霉素后最热点的抗癌新药之一。目前，生产紫杉醇的原料主要来源于红豆杉树皮，由于树皮为不可再生资源，供应有限，而叶片中紫杉醇含量又很低，导致提取紫杉醇的原料十分匮乏。
紫杉醇的提取非常困难，特别是工业化提取更难，例如，200610047378.2公开的“一种高效分离纯化紫杉醇的方法”中，仅获得了1％紫杉醇含量的提取物，出膏率约为1.36％。造成紫杉醇提取困难的主要原因为：1)紫杉醇在植物中的含量极低，目前，紫杉醇含量最高的曼地亚红豆杉中也只达到0.017～0.046％。2)紫杉醇作为一种生物大分子物质，受温度、有机溶剂、酸、碱等环境条件的影响，易降解或异构生成其他紫杉烷类物质，如紫杉醇在强酸性或弱碱性条件下会降解为巴卡亭III或发生表位异构生成7-表紫杉醇；温度较高时也会发生降解反应，生成相应的小分子物质。3)紫杉醇除了以游离态存在于植物体外，还常常以结合态存在，即形成紫杉醇键合物如7-木糖紫杉醇、7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇等。由于糖基是水溶性的，导致这些紫杉醇键合物也具有水溶性，不溶于脂，而紫杉醇在水中的溶解度很低，属于脂溶性物质，所以结合态的紫杉醇在提取过程中一般会有损失。
分布于北美加拿大的曼地亚红豆杉是东北红豆杉T.cuspidata和欧洲红豆杉T.baccata的天然杂交种，不仅在树皮中含有紫杉醇，且4～5年生植物的叶子中的紫杉醇含量与生长70～80年的天然红豆杉树皮中的紫杉醇含量相当。曼地亚红豆杉为灌木植物，枝叶萌发力强，生物量大，已在我国引种成功，是用红豆杉属植物提取紫杉醇的最佳替代原料。
存在于红豆杉枝叶中的紫杉烷萜类化合物不仅自身具有抗癌活性，还可以作为合成紫杉醇或其类似物的前体，例如10-去乙酰基巴卡亭III本身不具有抑制肿瘤的作用，但利用它可以合成比紫杉醇具有更高抗癌活性的多西紫杉醇，因此，提取紫杉醇衍生物同样具有重要意义。
然而，从曼地亚红豆杉枝叶中提取分离紫杉醇也有着特有的困难：枝叶中的色素、蜡质、鞣质酸等含量比树皮中要高，杂质处理更加困难；人们推测紫杉醇键合物可能是紫杉醇在植物体内运输的一种特殊形式，一般认为紫杉醇的合成部位是嫩芽、枝叶或根、茎等，而储存部位是树皮，所以以一般的方法从曼地亚红豆杉整株中提取紫杉醇将会损失更多的结合态紫杉醇。
因此，目前从曼地亚红豆杉枝叶中提取紫杉醇及其衍生物的主要方法存在着提取效率低、成分损失大、成本过高、工业化水平低等缺点，特别是紫杉醇提取物干膏中的紫杉醇含量很低，紫杉醇衍生物含量更低，杂质高，为后续纯化分离成药品紫杉醇、纯紫杉醇衍生物造成了很大的困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种高纯度紫杉醇及其衍生物的提取方法，该方法从曼地亚红豆杉枝叶中提取紫杉醇及其衍生物，提取过程中紫杉醇及其衍生物损失少，提取物干膏中紫杉醇及其衍生物含量高、杂质少。
本发明一种高纯度紫杉醇及其衍生物的提取方法包括以下步骤：
1)将曼地亚红豆杉枝叶干燥至水分10％以下，粉碎成80～120目的曼地亚红豆杉枝叶粉末；
2)向曼地亚红豆杉枝叶粉末中加入占其重量10倍体积的甲醇，室温下浸提12小时以上，再于35～45℃浸提3～4小时，冷却，过滤，得滤渣1，滤液减压回收甲醇，得浓缩液1；
3)取滤渣1，加入体积为红豆杉枝叶粉末重量8倍的甲醇，于35～45℃浸提3～4小时，放置12小时以上，过滤，得滤渣2，滤液减压回收甲醇，得浓缩液2；
4)取滤渣2，以体积为曼地亚红豆杉枝叶粉末重量8倍的甲醇渗漉提取，渗漉液减压回收甲醇，得浓缩液3；
5)将浓缩液1、浓缩液2、浓缩液3合并，得紫杉醇及其衍生物提取液，加入与提取液等体积的石油醚脱脂，再加入与提取液等体积的正己烷脱脂，得紫杉醇及其衍生物稠膏。
6)将紫杉醇及其衍生物稠膏低温干燥成干膏，得到高纯度紫杉醇及其衍生物。
本发明中，所述曼地亚红豆杉枝叶的干燥温度不超过45℃；曼地亚红豆杉枝叶粉末的粒度优选100目。
在曼地亚红豆杉枝叶粉末的提取全过程中，要避免接触酸碱，同时要避免高温，一般的甲醇浸提温度不宜超过35～45℃，优选40℃。
在使用石油醚对紫杉醇及其衍生物的提取液进行脱脂时，最好是选择沸程为60～90℃的石油醚。
刚开始干燥紫杉醇及其衍生物稠膏时，温度不宜超过40℃；干燥到水分小于30％以后，温度可适当提高，但不宜超过45℃；干燥到水分小于20％以后，可提高到不超过50℃的温度干燥。
本发明选择曼地亚红豆杉枝叶作为紫杉醇及其衍生物的提取原材料，主要是考虑到曼地亚红豆杉在我国已经引种成功，其枝叶属于可再生资源，解决了紫杉醇及其衍生物的原材料来源问题。
本发明选择甲醇作为提取溶剂，一方面是考虑到甲醇的沸点较低，沸程仅为64～65℃，减压回收甲醇的过程，同时也是紫杉醇及其衍生物提取液的浓缩过程，由于提取过程条件温和，特别是温度控制得当，在此过程中紫杉醇及其衍生物不会发生高温降解。另一方面，甲醇的极性较高，能够以氢键的形式与结合态紫杉醇结合，将曼地亚红豆杉枝叶中的结合态紫杉醇最大限度地提取出来，紫杉醇及其衍生物提取完全，成分损失很少。尽管本发明中甲醇的用量比较大，但是绝大部分可以回收精制再使用，使用成本低。
因此，尽管曼地亚红豆杉枝叶中的杂质处理困难，但按照本发明提供的提取方法，生产出的紫杉醇及其衍生物提取物干膏的紫杉醇含量能达到约4％，出膏率约0.6～0.7％，不仅提取完全、纯度高、杂质少，而且为后续工业化或非工业化纯化分离药品紫杉醇、纯紫杉醇衍生物创造了更加有利的条件。
具体实施方式
实施例1
取适量曼地亚红豆杉枝叶，40℃真空干燥，以干燥失重法测得含水分为8.5％。将干燥后的曼地亚红豆杉枝叶粉碎成100目的粉末，称取200g，装于布袋内，加入2000mL甲醇，放置过夜(约15小时)，加热至40℃回流提取3.5小时，自然冷却后，过滤，得滤渣1，滤液减压回收甲醇后，得浓缩液1。在滤渣1内加甲醇1600mL，40℃回流提取3小时，放置过夜(约15小时)，过滤，得滤渣2，滤液减压回收甲醇后，得浓缩液2。将滤渣2用1600mL甲醇进行渗漉提取，渗漉液减压回收甲醇后，得浓缩液3。合并浓缩液1、浓缩液2和浓缩液3，先以等体积的石油醚(60℃～90℃)脱脂，再用等体积的正己烷脱脂，除尽甲醇，40℃常压干燥成半流体，再于45℃减压干燥成半干的固体，最后在50℃减压干燥成固体干膏，得到的干膏重1.31g，紫杉醇含量51mg。
实施例2
取适量曼地亚红豆杉枝叶，阴干，以干燥失重法测得含水分为9.2％。将干燥后的曼地亚红豆杉枝叶粉碎成100目的粉末，称取5kg，装于布袋内，加入50L甲醇，放置过夜(约15小时)，加热至40℃回流提取3.5小时，自然冷却后，过滤，得滤渣1，滤液减压回收甲醇后，得浓缩液1。在滤渣1内加入40L甲醇，40℃回流提取3.5小时，放置过夜(约15小时)，过滤，得滤渣2，滤液减压回收甲醇后，得浓缩液2。将滤渣2用40L甲醇渗漉提取，渗漉液减压回收甲醇后，得浓缩液3。合并浓缩液1、浓缩液2和浓缩液3，先以等体积的石油醚(60℃～90℃)脱脂，再用等体积的正己烷脱脂，除尽甲醇，于40℃常压干燥成半流体，再于45℃减压干燥成半干的固体，最后在50℃减压干燥成固体干膏，得到的干膏重31.52g，紫杉醇含量1.25g。
实施例3
将适量曼地亚红豆杉枝叶于40℃烘干，干燥失重法测得含水分为9.1％。将干燥后的曼地亚红豆杉枝叶粉碎成100目的粉末，称取200kg，装于布袋内，加入2000L甲醇，放置过夜(约15小时)，加热至40℃回流提取3小时，自然冷却后，过滤，得滤渣1，滤液减压回收甲醇后，得浓缩液1。在滤渣1内加入1600L甲醇，40℃回流提取4小时，放置过夜(约15小时)，过滤，得滤渣2，滤液减压回收甲醇后，得浓缩液2。将滤渣2用1600L甲醇渗漉提取，渗漉液减压回收甲醇后，得浓缩液3。合并浓缩液1、浓缩液2和浓缩液3，先以等体积的石油醚(60℃～90℃)脱脂，再用等体积的正己烷脱脂，除尽甲醇，于40℃常压干燥成半流体，再于45℃减压干燥成半干的固体，最后在50℃减压干燥成固体干膏，得到的干膏重1.26kg，紫杉醇含量50.85g。