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一种多菌灵降解菌及其应用
    【技术领域】
     本发明涉及一种细菌， 尤其涉及一种多菌灵降解菌及其应用。背景技术 多菌灵是一种高效低毒的光谱内吸性杀菌剂， 对葡萄胞菌、 镰刀菌等引起的真菌 病害具有很好的保护和治疗作用， 广泛应用于水稻、 棉花、 蔬菜、 果树、 药材等病害的防治。
     多菌灵在我国农业生产上得到广泛应用的同时， 它在环境中的残留引起环境污染 问题也日趋严重。因其化学性质稳定， 在环境中半衰期较长 (3-6 个月 )， 易产生积累效应， 对微生物、 植物、 动物以及人体产生危害。 研究表明， 多菌灵能能引起肝病， 还能导致染色体 畸变， 干扰哺乳动物的内分泌， 并对精母细胞的减数分裂产生影响。
     多菌灵很难被水解、 热解和光解等物理方法分解， 在生态系统中， 微生物对农药的 分解起着重要作用。 因此寻找多菌灵的高效降解菌对于消除多菌灵的环境污染具有重要的 现实意义。
     发明内容 本发明提供了一种降解速度快、 降解效率高的多菌灵降解菌。
     一种多菌灵降解菌， 经鉴定命名为假单胞菌 (Pseudomonas sp.)CBW， 保藏于中 国典型培养物保藏中心 ( 地址为 ： 湖北省武汉市珞珈山武汉大学保藏中心 )， 保藏日期为 2009 年 11 月 4 日， 保藏号为 CCTCC No.M209251。该菌株 16S rDNA 的 Genbank 登陆号为 GQ454926。
     该菌株主要生物学特征为 ： 革 兰 氏 反 应 阴 性， 菌 体 杆 状， 无 鞭 毛， 大小约为 (0.5μm ～ 0.8μm)×(1.5μm ～ 2μm)( 图 1)， 接触酶阳性， 氧化酶阳性。
     本发明还提供了一种含有上述多菌灵降解菌的菌剂， 该菌剂的制备方法就是将上 述菌种与常规的附加剂混合均匀后制成水剂。
     本发明多菌灵降解菌对多菌灵降解效率高， 降解速度快， 可有效修复 多菌灵在土 壤中的污染。
     附图说明
     图 1 为多菌灵降解菌 CBW 的电镜照片。 图 2 为本发明多菌灵降解菌对不同浓度的多菌灵的降解曲线图。具体实施方式
     培养基
     无机盐培养基 ： MgSO4·7H2O 0.4g、 FeSO4·7H2O 0.02g、 K2HPO40.2g、 (NH4)2SO40.2g、 CaSO40.08g、 去离子水 1000mL， 混合搅拌均匀， 调节 pH 值为 7.0， 高压蒸汽灭菌 (121 ℃， 20min) 制得。分离纯化培养基 ： 在无机盐培养基中添加 20g 琼脂， 高压蒸汽灭菌 (121℃， 20min)制得。 普通培养基 ： 牛肉膏 10g、 蛋白胨 5.0g、 氯化钠 10.0g、 去离子水 1000mL， 混合搅拌 均匀， 调节 pH 值为 7.0， 高压蒸汽灭菌 (121℃， 20min) 制得。
     菌种分离纯化
     (1) 取浙江大学华家池校区蚯蚓地土壤 5g 置于 100mL 三角瓶中， 加入 50mL 无机 盐培养基， 加入多菌灵 5mg， 置于摇床 (30℃， 150rpm) 中振荡培养一周。取 1mL 悬浮液接种 于 30mL 以 10mg/L 的多菌灵为唯一碳源和能源的无机盐培养基中， 振荡培养一周 (30 ℃， 150rpm)。同样条件培养 3 次， 每次培养均取前一次的培养液作为接种液。
     (2) 将最后一次获得的培养液稀释 (10-5) 后于含 20mg/L 多菌灵的分离纯化培养 基划线分离筛选， 挑取单菌落接种于含 10mg/L 多菌灵的无机盐培养基中， 置于摇床 (30℃， 150rpm) 中振荡培养， 观察菌的生长并测定多菌灵的降解情况。重复上述过程纯化 3 次， 选 取能在含多菌灵的无机盐培养基中生长并且能快速降解多菌灵的单菌落进行鉴定。 菌种保 存于斜面培养基上， 所用培养基为普通培养基。
     鉴定命名
     上述分离纯化获得菌株的主要生物学特征为 ： 革兰氏反应阴性， 菌体 杆状， 无鞭 毛， 大小约为 (0.5μm ～ 0.8μm)×(1.5μm ～ 2.0μm)( 图 1)， 接触酶阳性， 氧化酶阳性。 最适生长条件为 ： pH ＝ 7.0， 温度 30℃。
     其详细的生理特性如下表 1 所示 ：
     +： 生长良好， - 不生长 ； +W ： 生长缓慢
     4CN 101955893 A说明5书项目 革兰氏染色 形状 环糊精 糊精 淀粉 吐温 40 吐温 80 N- 乙酰基 -D 半乳糖胺 N- 乙酰基 -D- 葡萄糖胺 侧金盏花醇 L- 阿拉伯糖 D- 阿拉伯糖 D- 纤维二糖 乙酸 顺 - 乌头酸 ( 丙烯三羧 酸 ) 柠檬酸 甲酸 D- 乳糖酸内酯 D- 半乳糖醛酸 D- 葡萄糖酸 D- 葡萄糖胺 D- 葡萄糖酸 α- 羟基丁酸 β- 羟基丁酸 γ- 羟基丁酸 L- 组氨酸 羟基 -L- 脯氨酸 L- 亮氨酸 L- 鸟氨酸 L- 苯丙氨酸结果 + 杆状 + + + + + + + + + + + + + + + +W项目 氧化酶 赤藻糖醇 D- 果糖 L- 果糖 D- 半乳糖 龙胆二糖 α-D- 葡萄糖 m- 肌醇 -D- 乳糖 乳果糖 麦芽糖 D- 甘露醇 D- 甘露糖 p- 羟基苯乙酸 衣康酸 α- 酮丁酸 α- 酮戊二酸 α- 酮戊酸 D， L- 乳酸 丙二酸 丙酸 奎尼酸 D- 葡糖二酸 癸二酸 琥珀酸 L- 焦谷氨酸 D- 丝氨酸 L- 丝氨酸 L- 苏氨酸 D， L- 肉碱结果 + + +W +W + + + +W + +W + + + + + +W + + + + + +项目 接触酶 D- 蜜二糖 β- 甲基 -D- 葡萄糖苷 阿洛酮糖 D- 棉子糖 L- 棉子糖 D- 山梨醇 蔗糖 D- 海藻糖 松二糖 木糖醇 甲基丙酮酸 单甲基琥珀酸 溴丁二酸 琥珀酰胺酸 葡糖醛酰胺 L- 丙氨酸胺 D- 丙氨酸 L- 丙氨酸 L- 丙氨酰甘氨 L- 天冬酰胺酸 L- 天门冬氨 L- 谷氨酸 甘氨酰 -L- 天门冬氨酸 甘氨酰 -L- 谷氨酸 尿刊酸 肌苷 尿苷 胸腺嘧啶核苷 苯乙胺结果 + +W + + + +W + + + + + + + + + +W +3/5 页CN 101955893 A说明书4/5 页表1
     Biolog 鉴定结果表明， 上述菌株是假单胞菌 (Pseudomonas sp.) 的可能性最大， 相似性为 0.536。
     根据 BLAST 的分析， CBW 的 16S rDNA 基因序列与假单胞菌 (Pseudomonas sp.) 的 同源性达 99％。
     6L- 脯氨酸 2- 氨基乙醇 D， L-α- 磷酸甘油+ + -γ- 氨基丁酸 2， 3- 丁二醇 1- 磷酸葡萄糖+ +W -丁二胺 丙三醇 6- 磷酸葡萄糖+ + -CN 101955893 A
     说明书5/5 页综上所述， 将该菌株鉴定为假单胞菌 (Pseudomonas sp.)， 株号为 CBW。
     配制菌剂
     将在斜面培养基上保藏的菌种接种于含 10mg/L 的无机盐培养基中活化， 然后接 种至含 20mg/L 多菌灵的普通培养基中， 培养至对数期， 离心收集菌体， 将菌体用 pH7.0 的 -1 0.1mol· L Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液洗涤三次， 置入同一缓冲液制成菌悬液 (OD610 ＝ 1.0)， 即 为菌剂。该菌剂可用于土壤中多菌灵污染的治理。
     降解多菌灵
     (1) 将多菌灵降解菌菌剂接种于分别含 1.0mg/L、 10.0mg/L 和 100.0mg/L 多菌灵 的无机盐培养基中， 接种菌剂使接种后培养液的 OD610 ＝ 0.05 ； 未接种的分别含 1.0mg/L、 10.0mg/L 和 100.0mg/L 多菌灵的无机盐培养基作为对照。
     (2) 将上述 6 组培养液置于摇床 (30℃、 150rpm) 中振荡培养。
     (3) 培养 0、 1、 2、 3、 4d， 分别定量取样 ( 培养液 )， 于 250ml 分液漏斗中用二氯甲烷 振荡提取 3 次， 有机相经无水硫酸钠合并于 250mL 平底烧瓶， 在旋转蒸发器上浓缩至近干， 然后用氮气流吹干， 最后用甲醇定容至 10.0mL， 在液相色谱仪 (Agilent 1200) 上测定多菌 灵的残留量， 多菌灵残留量及残留百分率计算公式如下 ：
     式中 ： X， 样品中多菌灵残留量 (mg/L) ； Ax， 样品多菌灵峰面积 ； A0， 标样多菌灵峰面 积； v1， 样品体积 (mL) ； v2， 最后定容体积 (mL) ； a， 标样多菌灵含量 (mg/L)。
     上述 6 个处理每个处理重复 3 次， 取其平均值表示， 测定结果如图 1 所示。该菌 剂能在 3 天内将 1mg/L 和 10mg/L 的多菌灵基本上降解完全， 100mg/L 多菌灵的降解率为 12.2％ ； 未加菌的对照中 4 天后多菌灵的降解率均小于 20％， 说明该菌对多菌灵有很强的 降解能力。