一种碱性果胶酶生产方法及在造纸制浆中的应用 技术领域 本发明涉及一种果胶酶及造纸制浆工艺， 具体地说是一种碱性果胶酶生产方法及 在造纸制浆中的应用。
背景技术
现代造纸工艺已有几百年的历史， 但造纸工艺的进步却非常缓慢。传统的化学制 浆工艺， 如烧碱法、 硫酸盐法等， 该类工艺都具有高温、 高压、 高能耗、 得率低、 损伤纤维强度 等缺点， 不仅生产成本高， 还具有一定的安全隐患， 在生产过程中还会产生大量黑液， 具有 粘度高、 有机物含量低、 硅含量高、 热值低等特点， 导致难以进行有效回收， 造成了严重的环 境污染。生物制浆技术被认为是解决此类问题的有效途径之一。国内外大量的研究表明， 原料经过生物处理后， 可以降低蒸煮时的化学物质消耗， 因而降低了黑液的污染负荷。 现有 的生物处理工艺主要有两类 ： 一类是采用微生物直接处理原料， 一类是采用木质素酶、 木聚 糖酶、 半纤维素酶等处理原料。采用微生物直接处理原料的， 如公开号为 CN1683711A， 发明名称为一种造纸 生物制浆工艺 ； 公开号为 CN1420229A， 发明名称为一种造纸草浆制浆工艺 ； 公开号为 CN101225614A， 发明名称为一种以生物发酵制浆法替代化学制浆工艺的造纸工艺方法 ； 公 开号为 CN1188830A， 发明名称为生物脱木素－机械制浆技术等专利申请都是采用微生物直 接处理原料， 它们的主要缺点有 ： ⑴生物处理周期长， 一般需几天时间 ； ⑵微生物处理前， 一般应对原料进行灭菌处理， 增加了生产成本， 同时有可能降低原料质量 ； ⑶生物处理过程 难以有效控制， 常常出现处理后的原料质量均匀性差， 碳水化合物降解严重等问题， 导致制 浆得率降低 ； ⑷生物处理后原料质量均匀性差， 还直接影响制浆质量， 从而影响最终的产品 质量 ； ⑸采用上述方法生产出的纸浆与普通化学浆相比， 纸浆的物理性能及漂白性能都较 差， 不能用来生产高白度、 高强度的纸张， 只能用来生产低档次的纸张。
采用木质素酶、 木聚糖酶、 半纤维素酶等酶处理原料的， 如公开号为 CN1616758A， 发明名称为生物制浆工艺 ； 公开号为 CN1421570A， 发明名称为草类原料酶法制浆的方法等 专利， 该工艺的主要缺点是 ： 酶液的成本高， 在工业化生产中不占有成本优势 ； 同时， 木质 素酶、 木聚糖酶、 半纤维素酶对相应成分的破坏难以控制， 可能过多去除木质素、 木聚糖、 半 纤维素， 影响纸浆得率。
发明内容
本发明的目的是提供一种碱性果胶酶生产方法及在造纸制浆中的应用， 其使用成 本低、 环保且过程可控。
本发明是利用细菌经液体深层发酵生产的碱性果胶酶， 其酶活力测定是用 DNS 显 色， 分光光度计比色法测得。其测定条件为 ： 以 1 ﹪的果胶为底物在 pH9.6、 60℃水浴反应 10 分钟， 加 DNS 沸水浴显色， 550nm 比色。酶活力单位定义为 ： 在测定条件下， 每小时水解果 胶产生 1mg 还原糖 （以半乳糖醛酸计） 所需的酶量定义为一个酶活力单位。本发明是采用如下技术方案实现其发明目的的， 一种碱性果胶酶生产方法， 它包 括菌株选育、 菌种培养、 摇瓶发酵、 酶液制备。
本发明所述的菌株选育是按照本领域已知的方法， 在土壤中通过自然采集菌样， 从近百株菌株中经摇瓶筛选得到二株出发菌株， 并在细胞水平下采用亚硝基胍和紫外线辐 射诱变得到近万株菌株， 经过摇瓶筛选得到一株实验室编号为 MAPLE61 的菌株， 即耐热枯 草芽胞杆菌 （Heat-resistant Bacillus subtilis） ， 其生物学特性为 ： 菌体呈杆状， 菌体两 端较平整， 单个细胞 (0.7— 0.75)*(2.5— 2.9) 微米， 无荚膜， 周生鞭毛， 菌落乳白色， 革兰 氏染色阳性， 需氧菌， 液体培养生长期菌体多数呈链状排例且以三连体或四连体居多 ； 形成 芽胞， 芽孢形态椭圆到杆状， （0.6—0.8） （1.0—1.4） * 微米， 位于菌体中央或稍偏。 该菌种已 于 2010 年 1 月 11 日提交中国典型培养物保藏中心保藏， 保藏号为 ： CCTCC NO ： M 2010004， 并于 2010 年 1 月 15 日提交了保藏存活证明。
本发明所述的菌种培养为 CCTCC NO ： M 2010004 菌种在如下配制的斜面上生长 良好， 斜面培养基配方为 ： 1000mL 蒸馏水中， 加入牛肉膏 5g-10g， 酵母膏 5g-10g， 蛋白胨 10g-15g， 葡萄糖 5g-10g， 氯化钠 5g-10g， 碳酸钠 0.3-0.5g, 琼脂粉 20g， 调 pH 值 6.9 － 7.1， 0.1MPa 灭菌 20 分钟－ 30 分钟， 制成试管斜面， 接种该菌种， 33℃－ 35℃， 培养 18 小时－ 24 小时， 备用。
本发明所述的摇瓶发酵为 CCTCC NO ： M 2010004 菌种在规定的培养条件下可产生 高活力的果胶酶， 这种培养条件是 ： 以质量计， 培养基配方 ( ﹪ ) 麦麸 6 － 8、 玉米粉 0.5 － 1、 玉米浆 （氮含量 40 ％） 1 － 2、 氯化钠 0.5 － 0.8、 碳酸钠 0.2-0.3、 纤维质粉 1 － 2、 水 85.0 － 91.0， 其中所述各组分之和为 100 ﹪， 灭菌前， 调 pH 值为 8.0-8.5， 0.1MPa 灭菌 25 分钟－ 35 分钟， 培养条件 ： 33℃－ 35℃， 转速 260 r/ 分钟 -280r/ 分钟， 培养 18 小时 -22 小时。
本发明所述的酶液制备为由茄瓶斜面到种子罐到发酵罐， 二级发酵， 以质量计， 其 培养基配方为 （﹪） 麦麸 6 － 8、 玉米粉 0.5 － 1、 玉米浆 （氮含量 40％） 1 － 2、 氯化钠 0.5 － 0.8、 碳酸钠 0.2-0.3、 纤维质粉 1 － 2、 水 85.0 － 91.0， 其中所述各组分之和为 100 ﹪， 灭 菌前， 调 pH 值为 8.0-8.5， 0.1MPa 灭菌 25 分钟－ 35 分钟， 装罐总体积不超过 70％ ； 培养条 件： 温度 （℃） ： 33 － 38， 搅拌转速 （r/ 分钟） ： 180 － 220， 通气量 （v/v） ： 1： 0.25 － 0.55， 罐 压 0.06 MPa － 0.08MPa， 培养周期 ： 种子罐为 7 小时 -8 小时， 发酵罐为 12 小时 -16 小时。
本发明为利于菌体的生长和酶液的产生， 种子罐的培养条件 ： 温度 （℃） ： 36 ℃－ 38 ℃， 搅拌转速 （r/ 分 钟） ： 220， 通气量 （v/v） 0 时 － 5 时， 1： 0.40 － 0.46、 5 时以后 1 ： 0.50 － 0.56 ； 发酵罐的培养条件 ： 温度 （℃） ： 0 小时－ 4 小时， 36 － 38， 4 小时以后 33 － 35， 搅拌转速 （r/min） ： 0 小时－ 4 小时， 180， 4 小时－ 6 小时， 200， 6 小时以后 220， 通气量 （v/ v） ： 0 小时－ 4 小时， 1： 0.25 － 0.27， 4 小时－ 6 小时， 1： 0.33 － 0.36， 6 小时以后 1 ： 0.5 － 0.55。
本发明为制备标准果胶酶液， 在酶液制备后， 将发酵醪液经过板框过滤、 硅藻土除 菌， 经防腐处理得到酶活力保持率 （15℃ 三个月） 为 95 ﹪以上的标准果胶酶液。
一种上述碱性果胶酶在造纸制浆中的应用， 它是在造纸原料经预处理、 浸酸处理 后进行酶处理， 即将原料用碱性果胶酶液浸泡， 酶处理条件为 ： 活力 20u/ml ～ 120u/ml， 温 度 50℃～ 60℃， pH 值 8.0 ～ 9.0， 浸酶时间 50 分钟～ 150 分钟， 碱性果胶酶液与原料绝干质量比为 1:6 ～ 8 ； 酶处理后在蒸煮锅中蒸煮， 蒸煮条件为 ： NaOH 浓度 6 ﹪～ 12 ﹪， 温度为 120℃～ 150℃， 时间为 30 分钟～ 120 分钟， 碱液与原料绝干质量比为 1:6 ～ 10。
本发明为降低成本， 在造纸原料经预处理、 浸酸处理后， 酶处理前用制浆废液预浸 10 分钟～ 30 分钟， 废液中的残碱浓度为 2 g/L ～ 10g/L（以 NaOH 计） 。
本发明所述的造纸原料为麦草、 稻草、 玉米秸秆、 芦苇、 棉花、 竹子、 苎麻、 亚麻、 红 麻、 剑麻、 蔗渣、 龙须草、 枸树皮中的一种。
由于采用上述技术方案， 本发明较好的实现了发明目的， 其酶活力高， 单位成本 低， 发酵周期短， 工业化程度高， 产品指标符合相关国家或行业标准 ； 用于造纸制浆制备的 化学浆具有良好的强度性能和可漂白性能， 经过简单的氧化氯漂白后， 浆白度 （ISO） 可达到 80％ -90％， 断裂长可达到 6000 m ～ 7000m， 同时节约了 20 ﹪～ 40 ﹪的用碱量， 生产成本 降低 20 ﹪左右。 具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例 1 ： 一种碱性果胶酶生产方法， 它包括菌株选育、 菌种培养、 摇瓶发酵、 酶液制备。 本发明所述的菌株选育是按照本领域已知的方法， 在土壤中通过自然采集菌样， 从近百株菌株中经摇瓶筛选得到二株出发菌株， 并在细胞水平下采用亚硝基胍和紫外线辐 射诱变得到近万株菌株， 经过摇瓶筛选得到一株实验室编号为 MAPLE61 的菌株， 即耐热枯 草芽胞杆菌 （Heat-resistant Bacillus subtilis） ， 其生物学特性为 ： 菌体呈杆状， 菌体两 端较平整、 单个细胞 (0.7— 0.75)*(2.5— 2.9) 微米， 无荚膜， 周生鞭毛， 菌落乳白色， 革兰 氏染色阳性， 需氧菌， 液体培养生长期菌体多数呈链状排例且以三连体或四连体居多 ； 形成 芽胞， 芽孢形态椭圆到杆状， （0.6—0.8） （1.0—1.4） * 微米， 位于菌体中央或稍偏。 该菌种已 于 2010 年 1 月 11 日提交中国典型培养物保藏中心保藏， 保藏号为 ： CCTCC NO ： M 2010004， 并于 2010 年 1 月 15 日提交了保藏存活证明。
CCTCC NO ： M 2010004 菌种在含如下斜面 （包括试管斜面和茄瓶斜面） 培养基上， 能 保持高产酶能力， 菌种经该斜面培养基传代 6 代以上产酶能力稳定。本发明所述的菌种培 养为 CCTCC NO ： M 2010004 菌种在如下配制的斜面上生长良好， 斜面培养基配方为 ： 1000mL 蒸馏水中， 加入牛肉膏 5g-10g， 酵母膏 5g-10g， 蛋白胨 10g-15g， 葡萄糖 5g-10g， 氯化钠 5g-10g， 碳酸钠 0.3-0.5g， 琼脂粉 20g， 调 pH 值 6.9 － 7.1， 0.1MPa 灭菌 20 分钟－ 30 分钟， 制成试管斜面， 接种该菌种， 33℃－ 35℃， 培养 18 小时－ 24 小时， 备用。 本实施例斜面培养 基配方为 ： 1000mL 蒸馏水中， 加入牛肉膏 5g， 酵母膏 5g， 蛋白胨 10g， 葡萄糖 5g， 氯化钠 5g, 碳酸钠 0.3g， 琼脂粉 20g， 用氢氧化钠调 pH 值 7.0， 0.1MPa 灭菌 30 分钟， 制成试管斜面， 接 种该菌种， 34℃， 培养 24 小时， 置于 4℃冰箱备用。
CCTCC NO ： M 2010004 菌种通过摇瓶试验， 分别对不同碳源 （葡萄糖、 淀粉、 蔗糖、 玉 米粉、 纤维质粉、 麦麸、 橘皮粉、 甜菜渣、 苹果渣等） 、 氮源 （硫酸铵、 玉米浆、 硝酸铵、 氯化铵、 尿素、 蛋白胨、 酵母膏、 豆饼粉、 花生饼粉等） 、 无机盐 （氯化钠、 硫酸镁、 磷酸氢二钾、 硝酸钠 等） 、 装液量、 摇床转速、 起始 pH 值、 培养温度、 培养周期进行了试验， 得到高产果胶酶的最适 培养基和摇瓶培养条件。本发明所述的摇瓶发酵为 CCTCC NO ： M 2010004 菌种在规定的培
养条件下可产生高活力的果胶酶， 这种培养条件是 ： 以质量计， 培养基配方 ( ﹪ ) 麦麸 6 － 8、 玉米粉 0.5 － 1、 玉米浆 （氮含量 40％） 1 － 2、 氯化钠 0.5 － 0.8、 碳酸钠 0.2-0.3、 纤维 质粉 1 － 2、 水 85.0 － 91.0， 其中所述各组分之和为 100 ﹪， 灭菌前， 调 pH 值为 8.0-8.5， 0.1MPa 灭菌 25 分钟－ 35 分钟， 培养条件 ： 33 ℃－ 35 ℃， 转速 260 r/ 分钟 -280r/ 分钟， 培养 18 小时 -22 小时。本实施例培养基配方 ( ﹪ ) 为 ： 麦麸 8、 玉米粉 1、 玉米浆 （氮含量 40％） 2、 氯化钠 0.5、 碳酸钠 0.2、 纤维质粉 2、 水 86.3， 其中所述各组分之和为 100 ﹪， 灭菌 前， 用碳酸钠或氢氧化钠调 pH 值为 8.5（本实施例用氢氧化钠） ， 0.1MPa 灭菌 30 分钟， 培养 条件 ： 34℃， 转速 270 r/ 分钟， 培养 20 小时。其果胶酶活力最高达到 15000u/ml， 平均水平 可达 12800 u/ml。
本发明所述的酶液制备为由茄瓶斜面到种子罐到发酵罐， 二级发酵， 以质量计， 其 培养基配方为 （﹪） 麦麸 6 － 8、 玉米粉 0.5 － 1、 玉米浆 （氮含量 40％） 1 － 2、 氯化钠 0.5 － 0.8、 碳酸钠 0.2-0.3、 纤维质粉 1 － 2、 水 85.0 － 91.0， 其中所述各组分之和为 100 ﹪， 本实 施例培养基配方为 （﹪） 麦麸 8、 玉米粉 1、 玉米浆 （氮含量 40％） 2、 氯化钠 0.5、 碳酸钠 0.2、 纤维质粉 2、 水 86.3。灭菌前， 用碳酸钠或氢氧化钠调 pH 值为 8.0-8.5 （本实施例用氢氧化 钠） ， 0.1MPa 灭菌 25 分钟－ 35 分钟， 装罐总体积不超过 70％； 培养条件 ： 温度 （℃） ： 33 － 38， 搅拌转速 （r/ 分钟） ： 180 － 220， 通气量 （v/v） ： 1： 0.25 － 0.55， 罐压 0.06 MPa － 0.08MPa， 培养周期 ： 种子罐为 7 小时 -8 小时， 种子成熟标准为菌体 90 ﹪以上呈单体， 染色均匀， 果胶 酶系酶活力不高于 600 u/ml， pH 值 6.3 － 6.7 ； 发酵罐为 12 小时 -16 小时， 放罐条件 ： pH 值 上升至 7.0+， 酶活力不再增加、 菌体 90 ﹪以上形成芽孢并有部分发生自溶现象。
本发明为利于菌体的生长和酶液的产生， 种子罐的培养条件 ： 温度 （℃） ： 36 － 38 （本实施例为 37） ， 搅拌转速 （r/ 分钟） ： 220， 通气量 （v/v） 0 时－ 5 时， 1： 0.40 － 0.46（本 实施例为 0.44） 、 5 时以后 1 ： 0.50 － 0.56（本实施例为 0.52） ， 罐压 0.07 Mpa， 发酵周期 7 小时 -8 小时 （本实施例为 7 小时） ； 发酵罐的培养条件 ： 温度 （℃） ： 0 小时－ 4 小时， 36 － 38（本实施例为 37） ， 4 小时以后 33 － 35（本实施例为 34） ， 搅拌转速 （r/ 分钟） ： 0 小时－ 4 小时， 180， 4 小时－ 6 小时， 200， 6 小时以后 220， 通气量 （v/v） ： 0 小时－ 4 小时， 1： 0.25 － 0.27（本实施例为 0.27） ， 4 小时－ 6 小时， 1： 0.33 － 0.36（本实施例为 0.36） ， 6 小时以后 1： 0.5 － 0.55（本实施例为 0.5） ， 罐压 0.06MPa。发酵周期 12 小时 -16 小时 （本实施例为 16 小时） ， 前 8 时每隔 4 小时、 后期每隔 2 小时检测 pH 值、 菌体形态、 酶活力一次， 其果胶酶 活力最高达到 12350u/ml， 平均水平可达 10000 u/ml 以上。
本发明为制备标准果胶酶液， 在酶液制备后， 即将发酵醪液经过板框过滤、 硅藻土 除菌、 标准化制备成果胶酶活力≥ 8000 u/ml， 经防腐处理得到酶活力保持率 （15℃ 三个 月） 为 95 ﹪以上的标准高活力果胶酶。
一种上述碱性果胶酶在造纸制浆中的应用， 它是在造纸原料经预处理、 浸酸处理 后进行酶处理， 即将原料用碱性果胶酶液浸泡。
所述的造纸原料为麦草、 稻草、 玉米秸秆、 芦苇、 棉花、 竹子、 苎麻、 亚麻、 红麻、 剑 麻、 蔗渣、 龙须草、 枸树皮中的一种 （本实施例为芦苇） 。
首先用粉碎机将芦苇粉碎成 3cm 长的细丝， 按水体积 （毫升） 与芦苇绝干质量 （克） 之比为 8:1 的比例加入水， 用浓硫酸调节 pH 值至 5.5， 升温至 60℃， 浸泡 60 分钟， 倒掉酸液， 将芦苇冲洗至中性。本发明为降低成本， 在造纸原料经预处理、 浸酸处理后， 酶处理前用制浆废液预浸 10 分钟～ 30 分钟 （本实施例为 20 分钟） ， 废液中的残碱浓度以 NaOH 计为 2 g/L ～ 10g/L （本实施例为 4g/L） 。
再对原料用碱性果胶酶液浸泡， 酶处理条件为 ： 活力 20u/ml ～ 120u/ml（本实施 例为 80u/ml） ， 温度 50℃～ 60℃ （本实施例为 55℃） ， pH 值 8.0 ～ 9.0 （本实施例为 8.0） ， 浸 酶时间 50 分钟～ 150 分钟 （本实施例为 50 分钟） ， 碱性果胶酶液与原料绝干质量比为 1:6 ～ 8（本实施例为 8） 。
酶处理后的原料在蒸煮锅中蒸煮， 蒸煮条件为 ： NaOH 浓度 6 ﹪～ 12 ﹪ （本实施例 为 10 ﹪） ， 温度为 120℃～ 150℃（本实施例为 150℃） ， 时间为 30 分钟～ 120 分钟 （本实施 例为 50 分钟） ， 碱液与原料绝干质量比为 1:6 ～ 10（本实施例为 1:6） 。
蒸煮完毕后， 放锅， 用螺旋挤压机挤出浆料中的黑液， 然后对浆料进行洗涤， 待洗 出的废液无色后将纸浆甩干， 进行各指标检测， 黑液送入黑液贮罐， 用于下一次酶处理前原 料的预浸液。
采用上述工艺制得的纸浆， 其中纸浆得率为 51.56 ﹪， 粗渣率为 0.36， 残碱 ： 10.6， K值 （高锰酸钾值） 9.8， 平均纤维长度 0.95 ㎜， 经氧化氯漂白后， 浆白度 （ISO） 为 89.6 ﹪， 断裂长为 6200m。 实施例 2 ： 本实施例采用苎麻为原料。首先用粉碎机将苎麻粉碎成 2-4cm 长的细丝， 除尘后按水 体积 （毫升） 与原料绝干质量 （克） 之比为 10:1 的比例加入水， 加入浓硫酸 2g/l 升温至 60℃， 浸泡 90 分钟， 倒掉酸液， 将原料冲洗至中性。
再对原料用碱性果胶酶液浸泡， 酶处理条件为 ： 活力 20u/ml ～ 120u/ml（本实施 例为 100u/ml） ， 温度 50℃～ 60℃（本实施例为 55℃） ， pH 值 8.0 ～ 9.0（本实施例为 8.5） ， 浸酶时间 50 分钟～ 150 分钟 （本实施例为 90 分钟） ， 含碱性果胶酶的水溶液与原料绝干质 量比为 1:6 ～ 8 （本实施例为 1 ： 8） 。酶处理后的原料在蒸煮锅中蒸煮， 蒸煮条件为 ： NaOH 浓 度 6 ﹪～ 12 ﹪ （本实施例为 10 ﹪） ， 温度为 120℃～ 150℃ （本实施例为 150℃） ， 时间为 30 分钟～ 120 分钟 （本实施例为 90 分钟） ， 蒸煮液与原料绝干质量比为 1:6 ～ 10 （本实施例为 1:10） 。蒸煮流程为 ： 装锅后先空转 20 分钟， 然后开始升温， 升温至 120℃时， 排气， 排完气 等锅内压力降到零后， 再升温至 150℃保温 60 分钟， 蒸煮完成。
采用上述工艺制得的纸浆， 其中纸浆得率为 55.36 ﹪， 粗渣率为 0.35， 残碱 ： 9.18， K值 （高锰酸钾值） 12.2， 平均纤维长度 0.86 ㎜， 经氧化氯漂白后， 浆白度 （ISO） 为 80.8 ﹪， 断裂长为 6500m。
余同实施例 1。
实施例 3 ： 本实施例采用麦草为原料。首先用切草机将麦草粉碎成 2-4cm 长的细丝， 除尘后按水 体积 （毫升） 与麦草绝干质量 （克） 之比为 8:1 的比例加入水， 用浓硫酸调节 pH 值至 5.5， 升 温至 60℃， 浸泡 60 分钟， 倒掉酸液， 将麦草冲洗至中性。
再对原料用碱性果胶酶液浸泡， 酶处理条件为 ： 活力 20u/ml ～ 120u/ml（本实施 例为 60u/ml） ， 温度 50℃～ 60℃（本实施例为 55℃） ， pH 值 8.0 ～ 9.0（本实施例为 8.0） ， 浸酶时间 50 分钟～ 150 分钟 （本实施例为 60 分钟） ， 含碱性果胶酶的水溶液与原料绝干质
量比为 1:6 ～ 8 （本实施例为 1 ： 6） 。酶处理后的原料在蒸煮锅中蒸煮， 蒸煮条件为 ： NaOH 浓 度 6 ﹪～ 12 ﹪ （本实施例为 8 ﹪） ， 温度为 120℃～ 150℃（本实施例为 150℃） ， 时间为 30 分钟～ 120 分钟 （本实施例为 60 分钟） ， 蒸煮液与原料绝干质量比为 1:6 ～ 10 （本实施例为 1:6） 。蒸煮流程为 ： 装锅后先空转 20 分钟， 然后开始升温， 升温至 120℃时， 排气， 排完气等 锅内压力降到零后， 再升温至 150℃保温 30 分钟， 蒸煮完成。
采用上述工艺制得的纸浆， 其中纸浆得率为 53.36 ﹪， 粗渣率为 0.31， 残碱 ： 9.16， K值 （高锰酸钾值） 8.6， 平均纤维长度 0.86 ㎜， 经氧化氯漂白后， 浆白度 （ISO） 为 86.8 ﹪， 断裂长为 6100m。
余同实施例 1。9