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1、10申请公布号CN101948399A43申请公布日20110119CN101948399ACN101948399A21申请号201010502812822申请日20101011C07C229/08200601C07C227/40200601B01D15/1820060171申请人江南大学地址214122江苏省无锡市无锡市滨湖区蠡湖大道1800号江南大学生物工程学院72发明人丁彦蕊张伟国蔡宇杰廖祥儒王亚辉李枝玲罗军侠张大兵74专利代理机构无锡市大为专利商标事务所32104代理人时旭丹刘品超54发明名称一种使用模拟移动床色谱连续分离纯化发酵液中缬氨酸的方法57摘要一种使用模拟移动床色谱连续分离纯。
2、化发酵液中缬氨酸的方法，属于生物制品加工技术领域。本发明设计了适用于缬氨酸发酵液组成特性的模拟移动床色谱分离装置，以水为流动相，以先前发明的缬氨酸分离专用树脂（中国专利2009102317354已公开）为固定相，采用本发明方法可以完全去除缬氨酸发酵液中的杂质丙氨酸与亮氨酸，使产品纯度达到997以上，达到药用标准，可实现连续化生产，有较高的回收率和生产强度，克服了当前缬氨酸分离纯化过程中存在的纯度低、效率低和污染大等缺点。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图1页CN101948401A1/1页21一种使用模拟移动床色谱连续分离纯化发酵液中缬氨。
3、酸的方法，其特征在于设计了适用于缬氨酸发酵液组成特性的模拟移动床色谱分离装置，以水为流动相，以缬氨酸分离专用树脂为固定相，对缬氨酸发酵液中缬氨酸进行连续分离纯化，步骤如下（1）设计了开放式五区模拟移动床色谱分离装置，该装置共有5区，每个区由13根色谱柱组成，并串联联接，所有色谱柱的规格完全相同，柱直径为150CM，色谱柱采用夹套加热保温；每两根柱子中间有3个出口，3个入口，分离过程除了区5和区1之间有两个出、入口可用外，其它区/柱中间只有一个出、入口可用，不用的出、入口均处于关闭状态；区1区2区3区4区5的方向为液流方向，区5区4区3区2区1区5为柱切换方向；柱内装有缬氨酸专用分离树脂；（2）。
4、缬氨酸发酵过程结束后，用盐酸将发酵液PH调节到25，离心去除菌体、蛋白质和多糖杂质，然后将得到的清液用活性炭脱色；（3）将脱色后的缬氨酸发酵液在60真空减压浓缩，控制清液中缬氨酸质量浓度为7080G/L；或者发酵液不经浓缩直接进行分离；（4）将清液放入步骤（1）所述的模拟移动床色谱分离装置中进行分离，从出口1中得到高纯度的缬氨酸溶液，再经浓缩、结晶得到固体缬氨酸成品；流动相为水，水温控制在2080；5个区中的液体线速度控制在2100CM/MIN；出口2中得到弱吸附杂质，出口3中得到强吸附杂质，这些杂质包括未发酵完的葡萄糖、发酵过程中产生的丙氨酸、异亮氨酸，少量杂蛋白质。权利要求书CN10194。
5、8399ACN101948401A1/4页3一种使用模拟移动床色谱连续分离纯化发酵液中缬氨酸的方法技术领域0001一种使用模拟移动床色谱连续分离纯化发酵液中缬氨酸的方法，属于生物制品的加工技术领域。背景技术0002L缬氨酸属于分支链氨基酸BRANCHEDCHAINAMINOACID，BCAA，是人体必需氨基酸之一，具有多种生理功能，广泛应用于医药、食品及调味剂、动物饲料和化妆品的制造，在医学研究和治疗中的作用也日益受到重视。0003近年来在我国科技人员的努力下，我国发酵法生产缬氨酸的上游技术也取得长足进步，基本达到了工业化水平。但缬氨酸发酵过程中产生的05左右的丙氨酸和亮氨酸与其化学性质相近、。
6、分离困难。传统的离子交换等分离方法制取的成品中缬氨酸含量低，杂质多，大部分只符合食品添加剂的质量标准，制约了其价格。0004无锡晶海氨基酸有限公司宁健飞等人在专利号为CN101503366的膜分离与工业色谱分离联用提取分离L缬氨酸的方法中使用膜分离与工业色谱分离联用提取分离L缬氨酸的方法有较高的收率与产品纯度，但是使用存在效率低、时间长、成本高等缺点。彭奇均等在专利号CN101168512的一种从缬氨酸液中分离提纯缬氨酸的方法中，设计了一种五区模拟移动床分离缬氨酸的方法，但该方法仅能得到纯度为93左右的缬氨酸，无法得到更高纯度的缬氨酸，另外其采用的金属鳌合树脂对缬氨酸的特异性吸附较差，导致了分。
7、离纯度的下降。万贵红等人（模拟移动床技术分离缬氨酸和丙氨酸，食品与发酵工业，2005，3112,5053）也报道了一种模拟移动床色谱分离缬氨酸的方法，但需采用氨水等试剂，对环境会产生很大的污染，而且产品纯度也较低。发明内容0005本发明的目的在于针对当前缬氨酸分离过程中存在的问题，本发明以水为流动相，以先前发明的缬氨酸分离专用树脂为固定相，并设计了适用于缬氨酸发酵液组成特性的模拟移动床色谱分离装置，可以完全去除缬氨酸发酵液中的杂质丙氨酸与亮氨酸，使产品纯度达到997以上，达到药用标准，可实现连续化生产，有较高的回收率和生产强度。0006本发明的技术方案一种使用模拟移动床色谱连续分离纯化发酵液中。
8、缬氨酸的方法，设计了适用于缬氨酸发酵液组成特性的模拟移动床色谱分离装置，以水为流动相，以缬氨酸分离专用树脂为固定相，对缬氨酸发酵液中缬氨酸进行连续分离纯化，步骤如下（1）设计了开放式五区模拟移动床色谱分离装置，该装置共有5区，每个区由13根色谱柱组成，并串联联接，所有色谱柱的规格完全相同，柱直径为150CM，色谱柱采用夹套加热保温；每两根柱子中间有3个出口，3个入口，分离过程除了区5和区1之间有两个出、入口可用外，其它区/柱中间只有一个出、入口可用，不用的出、入口均处于关闭状态；区1区2区3区4区5的方向为液流方向，区5区4区3区2区1区5为柱切换方说明书CN101948399ACN10194。
9、8401A2/4页4向；柱内装有缬氨酸专用分离树脂；区1和区5之间的开放结构保证了填料被充分清洗，从而可以制备得到高纯度的缬氨酸。附图中实线为液流方向，虚线为柱切换方向，设备运行的基本原理可参见之前发明人已发表的文章（模拟移动床色谱技术及其应用，色谱，2004,222,111115）。柱内装有自主研发的缬氨酸专用分离树脂，中国专利2009102317354已公开，该树脂对缬氨酸具有很强的特异性吸附能力。0007（2）缬氨酸发酵过程结束后，用盐酸将发酵液PH调节到25，离心去除菌体、蛋白质和多糖杂质，然后将得到的清液用活性炭脱色；（3）将脱色后的缬氨酸发酵液在60真空减压浓缩，控制清液中缬氨酸质。
10、量浓度为7080G/L；或者发酵液不经浓缩直接进行分离；（4）将清液放入步骤（1）所述的模拟移动床色谱分离装置中进行分离，从出口1中得到高纯度的缬氨酸溶液，再经浓缩、结晶得到固体缬氨酸成品；流动相为水，水温控制在2080；5个区中的液体线速度控制在2100CM/MIN；出口2中得到弱吸附杂质，出口3中得到强吸附杂质，这些杂质包括未发酵完的葡萄糖、发酵过程中产生的丙氨酸、异亮氨酸，少量杂蛋白质。0008所述中国专利2009102317354已公开的缬氨酸分离专用大孔吸附树脂的制备方法，步骤为（1）用蒸馏水配制水相物质其中聚乙烯醇质量浓度012，和NH4SO4质量浓度056；（2）配制有机相物质取。
11、交联剂与极性单体混合，交联剂与极性单体重量比为101251，向其中加入混合物13倍体积的致孔剂，使极性单体与交联剂进行悬浮共聚合，得到有机相物质；（3）树脂制备将水相物质升温至3040，边搅拌边将有机相物质和二碳酸二叔丁酯倒入水相物质中，完成混合后升温至7080，聚合反应45小时，水相与有机相的质量比例为20151，二碳酸二叔丁酯占反应体系总重量的011；（4）后处理滤出树脂，用水清洗，真空干燥，真空度为100PA，干燥温度40，得到120150M粒径成品大孔吸附树脂；所述的交联剂选用苯乙烯、二乙烯苯、三乙烯苯、二乙烯基甲苯、二乙烯基苯、二乙烯基二甲苯、二乙烯基乙基苯中的一种或几种；所述的极性。
12、单体选用丙烯酸乙酯、醋酸丙烯酯、醋酸烯丙酯或甲基乙烯基吡咯烷酮；所述的致孔剂选用甲苯、二甲苯、200汽油、庚烷、异辛烷、正丁醇或叔戊醇。0009所述的NH4SO4可以用NASO4，NACL，MGCL2或MGSO4替代。0010所述的交联剂选用二乙烯苯与苯乙烯以质量比11的比例使用。0011所述的极性单体与交联剂的比例是0181。0012所述的致孔剂是甲苯或200汽油，致孔剂的加量为单体混合物总量的2倍体积。0013本发明的有益效果1、得到高纯度的缬氨酸，同时也可以得到较高纯度的丙氨酸和亮氨酸；2、采用连续色谱进行分离，使树脂得到有效的利用；3、生产过程完全自动化，生产强度低；4、生产过程用水做。
13、流动相，成本低廉，基本没有污染物产生，有利于保护环境。说明书CN101948399ACN101948401A3/4页5附图说明0014图1模拟移动床色谱柱分区图。具体实施方式0015实施例1发酵结束后缬氨酸浓度约为30G/L，用盐酸调节到PH2，3000转/MIN离心后得到上清液，加入清液重量5的活性碳脱色，过滤去除活性碳，清液真空浓缩后缬氨酸浓度为80G/L。模拟移动床内柱的直径为5CM，15区的柱的数目为2、2、2、2、2，15区的流速度分别为25、15、20、16、30CM/MIN，系统温度控制在60，发酵清液的处理量为98ML/MIN。最终从出口1得到的缬氨酸产品浓度为32G/L，纯度。
14、达995，回收率为80。0016实施例2发酵结束后缬氨酸浓度约为35G/L，用盐酸调节到PH5，8000转/MIN离心后得到上清液，加入清液重量10的活性碳脱色，过滤去除活性碳，清液真空浓缩后缬氨酸浓度为70G/L。模拟移动床内柱的直径为1CM，15区的柱的数目为1、1、1、1、1，15区的流速度分别为30、22、27、18、50CM/MIN，系统温度控制在80，发酵清液的处理量为39ML/MIN。最终从出口1得到的缬氨酸产品浓度为328G/L，纯度达991，回收率为75。0017实施例3发酵结束后缬氨酸浓度约为20G/L，用盐酸调节到PH3，10000转/MIN离心后得到上清液，加入清液重量。
15、4的活性碳脱色，过滤去除活性碳，清液真空浓缩后缬氨酸浓度为75G/L。模拟移动床内柱的直径为20CM，15区的柱的数目为3、3、3、3、3，15区的流速度分别为35、25、32、16、40CM/MIN，系统温度控制在20，发酵清液的处理量为22L/MIN。最终从出口1得到的缬氨酸产品浓度为378G/L，纯度达990，回收率为72。0018实施例4发酵结束后缬氨酸浓度约为30G/L，用盐酸调节到PH4，5000转/MIN离心后得到上清液，加入清液重量10的活性碳脱色，过滤去除活性碳，清液真空浓缩后缬氨酸浓度为80G/L。模拟移动床内柱的直径为50CM，15区的柱的数目为2、3、3、1、2，15区。
16、的流速度分别为37、20、30、15、35CM/MIN，系统温度控制在70，发酵清液的处理量为196L/MIN。最终从出口1得到的缬氨酸产品浓度为358G/L，纯度达993，回收率为76。0019实施例5发酵结束后缬氨酸浓度约为30G/L，用盐酸调节到PH3，7000转/MIN离心后得到上清液，加入清液重量6的活性碳脱色，过滤去除活性碳，清液真空浓缩后缬氨酸浓度为80G/L。模拟移动床内柱的直径为30CM，15区的柱的数目为2、2、3、1、3，15区的流速度分别为28、19、26、17、32CM/MIN，系统温度控制在50，发酵清液的处理量为49L/MIN。最终从出口1得到的缬氨酸产品浓度为4。
17、66G/L，纯度达996，回收率为75。0020实施例5发酵结束后缬氨酸浓度约为32G/L,用盐酸调节到PH3，8000转/MIN离心后得到上清液，加入清液重量4的活性碳脱色，过滤去除活性碳，清液真空浓缩后缬氨酸浓度为70G/L。模拟移动床内柱的直径为10CM，15区的柱的数目为2、1、2、1、3，15区的流速度分别为8、2、7、3、10CM/MIN，系统温度控制在30，发酵清液的处理量为392ML/MIN。最终从出口1说明书CN101948399ACN101948401A4/4页6得到的缬氨酸产品浓度为42G/L，纯度达991，回收率为72。0021实施例6发酵结束后缬氨酸浓度约为35G/L，用盐酸调节到PH3,5000转/MIN离心后得到上清液，加入清液重量4的活性碳脱色，过滤去除活性碳，清液真空浓缩后缬氨酸浓度为80G/L。模拟移动床内柱的直径为50CM，15区的柱的数目为2、1、2、1、3，15区的流速度分别为100、60、90、70、100CM/MIN，系统温度控制在30，发酵清液的处理量为589L/MIN。最终从出口1得到的缬氨酸产品浓度为179G/L，纯度达990，回收率为68。说明书CN101948399ACN101948401A1/1页7图1说明书附图CN101948399A。