一种奥利司他的制备方法 【技术领域】
本发明属化学制药领域， 涉及一种有机化合物的纯化制备方法， 具体而言， 本发明 涉及一种制备高纯度脂肪酶抑制剂奥利司他的纯化方法。技术背景
奥利司他 (Orlistat) 是放线菌毒三素链霉菌 (Streptomyces Toxytricini) 发酵 次级代谢产物利普司他汀 (lipstatin) 经催化加氢后得到的衍生物， 故又叫四氢利普司他 汀 (Tetrahydrolipstatin， THL)， 化学名称 N- 甲酰基 -L- 亮氨酸 (1S)-1-[[(2S， 3S)-3- 己 基 -4- 氧 - 氧杂环丁基 ] 甲基 ] 十二烷基酯或 (S)-2- 甲酰氨 -4- 甲基 - 戊酸 (S)-1-[[(2S， 3S)-3- 己基 -4- 氧代 - 氧杂环丁基 ] 甲基 ] 十二烷基酯。利普司他汀 (lipstatin) 经催化 加氢后生成奥利司他 (Orlistat) 的化学反应式如下 ：
奥利司他是一种特异性胃肠脂肪酶抑制剂， 由罗氏公司原研， 最早于 1998 年在新 西兰上市。经放射性同位素 C14 示踪法研究表明， 奥利司他通过与胃肠脂肪酶活性位点丝 氨酸残基特异性共价结合， 使脂肪酶失活， 从而阻止食物中人体不能直接吸收利用的脂肪 ( 三酰基甘油酯 ) 水解成可吸收的单酰基甘油酯， 进而减少食物中约 30％左右的脂肪吸收， 而自身却极少吸收入血 ( 血药浓度极低， 峰值＜ 10ng/ml)， 因而疗效及安全性较以往治疗 超重、 肥胖症药物有显著提高。该产品目前分别作为 OTC 和 Rx 药物 ( 双跨 ) 被广泛用于体 重超重 ( 身体质量指数 BMI ≥ 25.0) 或肥胖症 ( 身体质量指数 BMI ≥ 30.0) 患者的治疗。
关于奥利司他的制备方法， 国内外已有较为深入的研究， 现简析如下 ：
奥利司他原研企业瑞士罗氏公司分别申请了以下专利 ： 专利号为 US4,598,089 的 美国专利， 及公开号为 CN85109209、 发明名称为 《氧杂环丁 -2- 酮类化合物的制备方法》 的 中国专利申请， 公开号为 CN85108888、 发明名称为 《环氧丙烷酮类化合物的制备方法》 的 中国专利申请， 公开号为 CN97109732.1、 发明名称为 《生产脂抑制素和四氢脂制素的方法》 的中国专利申请， 催化氢化制得的奥利司他粗品均使用以硅胶为载体的低压柱层析进行纯 化。如在发明 US4,598,089 中， 分别有用到以硅胶为载体、 氯仿为洗脱液进行的硅胶过滤层 析， 以硅胶为载体及以己烷、 乙酸乙酯或己烷 - 乙酸乙酯混合溶液为洗脱液进行的低压柱 层析， 以非极性的反相硅胶为载体、 以甲醇等极性溶剂为洗脱液的低压反相柱层析等纯化 方式。该法因需进行多次柱层析及反复结晶， 纯化效率及收率均比较低， 且设备不适合工 业放大， 每批产能十分有限。如发明 US4,598,089 分别优选使用默克公司的低压 柱( RP-8， Size C)， 批处理量仅为毫克级 ； 使用默克公司 Gel60 硅胶、 规格为
φ10cm×100cm 的层析柱批纯化处理量亦只达到克级， 收率约为 20 ％～ 30 ％。公开号为 CN1391906、 发明名称为 《一种新型脂肪酶抑制剂》 的中国专利申请亦采用默克公司 Gel60 硅胶、 规格为 φ10cm×100cm 的层析柱进行分离纯化， 层析柱载样量约为 10％， 经三次柱层 析， 分别依次用氯仿、 己烷 - 乙酸乙酯 (9 ∶ 1 ～ 4 ∶ 1)、 甲醇溶液洗脱， 收率仅为 2％左右。
公开号为 CN1266058、 发明名称为 《一制胰脂菌素的提纯方法》 的中国专利申请通 过使用与利普司他汀双流萃取相同的溶剂溶解奥利司他粗品进行结晶来分离提纯， 优选的 溶剂为己烷或庚烷。该法较之前采用的低压硅胶柱层析纯化法相比较， 虽易于放大， 批处 理量也有大幅提高， 收率可达 75％以上， 但纯度仅为 90％～ 97％， 远远达不到近年不断提 高的临床用药质量标准要求 ( 目前国内奥利司他原料药质量标准要求经 HPLC 检验纯度需 达 99.0％以上， 且单杂＜ 0.2％、 总杂质＜ 1.0％、 含量 98.0％以上， 较之前的仅要求纯度达 97％～ 98％即可上市又有了较大提高 )。我们按照该发明专利技术重复结晶纯化生产过 程， 发现若要制备符合当前质量标准要求的奥利司他产品， 其纯化效率及收率仍然很低， 纯 化收率在 10％以下。公开号为 CN1763021、 发明名称为 《一种提纯奥利司他的方法》 的中国 专利申请， 对于催化氢化后的奥利司他样品仍采用以结晶为主的纯化制备方式， 且待纯化 样品含量要求高达 85％以上， 纯化后产品纯度为 98.5％左右， 单个杂质高达 0.5％， 制备效 率及收率仍未有较大突破。公开号为 CN101948450A、 发明名称为 《一种生产制备奥利司他 的方法》 的中国专利申请亦仍采用普通硅胶柱与反复结晶相结合的方式进行纯化， 操作步 骤简易程度、 放大线性及收率均仍有待进一步提高。
此外还有采用萃取、 冷却结晶， 萃取、 吸附过滤与真空干燥相结合的制备方式， 如 WO2005/007639、 WO2005/026140、 WO2009/040827 等专利所述， 这些专利申请一定程度上仍 是在罗氏专利技术基础上的局部改进， 纯化工艺未有显著突破。 发明内容
本发明提供一种使用基于动态轴向压缩柱 (Dynamic Axial Compression， DAC) 的 半制备或制备型高效液相系统 (Pre-HPLC) 进行奥利司他纯化的新的生产制备方法。
为了实现上述发明目的， 本发明采用了以下技术方案 ： 一种奥利司他的制备方法， 包括以下步骤 ：
(1) 以反相硅胶或反相聚合物树脂作为 DAC 制备柱填料， 以有机溶剂与填料混合 搅拌均匀制浆 ；
(2) 将匀好的填料浆液装入 DAC 制备柱柱筒中， 开启装柱机进行轴向压缩 ；
(3) 用制备泵将流动相泵入 DAC 制备柱中对柱内有机溶剂进行置换洗涤， 同时平 衡制备柱， 柱效测试理论塔板数不低于 35000N/m ；
(4) 将奥利司他粗品溶液用高压制备泵注射至 DAC 制备柱内上柱吸附 ；
(5) 上柱吸附结束后用流动相进行解析， 并对解析液分段收集 ；
(6) 将纯度合格样合并、 浓缩、 结晶及干燥， 制得奥利司他成品。
其中， 所述反相硅胶填料或反相聚合物树脂填料的粒径为 5μm ～ 30μm， 优选 10μm ～ 20μm ； 孔径为 50 ～ 300 ， 优选 100 ～ 150 ； 填料形状为不规则形或球形， 优 选球形。
具体地来说， 所述反相硅胶填料为以 SiO2 或其衍生物为基质， 以 C4 ～ C18 脂肪烃链为键合相的硅胶， 优选以辛基 C8 或十八烷基 C18 为键合相的硅胶 ； 所述反相聚合物树脂 为可耐高压聚合物树脂， 其基质为聚苯乙烯 / 联乙烯苯 ( 苯乙烯——二乙烯苯 )、 丙烯酸、 酚 醛的一种或一种以上的混合作为基质的填料， 优选以聚苯乙烯 / 联乙烯苯材料为基质的填 料。
根 据 填 料 类 型 及 规 格 选 择 适 当 装 柱 参 数， 如硅胶填料常用装柱压力一般为 10MPa ～ 45MPa、 柱床高度一般为 20cm ～ 35cm， 反相聚合物树脂填料装柱压力视装柱高度一 般可选择从 1MPa 到 10MPa 左右不等。
其中， 所述制浆的适宜溶剂是与所用填料及流动相溶液化学性质兼容的粘度为 2mPa·s ～ 5mPa·s(25℃ ) 的低分子水溶性有机溶剂， 优选配制流动相溶剂的同系物作为 制浆溶剂。如异丙醇等低级脂肪醇等。
其中， 所述填料浆液其浓度一般为 50％～ 80％ ( 体积 / 体积， 即每 100ml 浆液中 含填料体积为 50ml ～ 80ml)。
其中， 上柱吸附的载样量对于反相硅胶填料为 0.1％～ 5.0％ ( 质量 / 质量 )， 优选 0.5％～ 2.0％ ( 质量 / 质量 ) ； 对于反相聚合物树脂为 0.5％～ 30.0％ ( 质量 / 质量 )， 优 选 1.0％～ 10.0％ ( 质量 / 质量 )。 其中， 所述 DAC 制备柱在平衡、 上样及解析的溶液流速为 0.02B.V./min ～ 0.50B. V./min， 优选 0.10B.V./min ～ 0.20B.V./min。
所述的奥利司他粗品溶液是将奥利司他中间体利普司他汀经水溶性低粘度低分 子有机溶剂或将其配制成的流动相溶解稀释后再催化氢化而制得， 或直接采购市售奥利司 他粗品经流动相溶解稀释后制得， 奥利司他样品上样浓度为 0.5％～ 10％ ( 质量 / 体积， 表 示每 100ml 溶液中含样品 0.5g ～ 10g)， 优选 2％～ 5％ ( 质量 / 体积， 表示每 100ml 溶液中 含样品 2g ～ 5g)。
具体地来说， 所述流动相采用的水溶性低粘度低分子有机溶剂为含 1 ～ 3 个碳原 子的低级脂肪烃的 -OH、 -CN、 卤素原子、 氧代、 羰基、 羧基等基团的低取代物、 衍生物或其混 合物， 且其粘度≤ 5mPa·S(25℃ )， 如低级脂肪醇、 低级酯、 醚、 酮、 腈等， 优选水溶性强的溶 剂， 如甲醇、 乙醇。
具体地来说， 所述分段收集是根据 UV 检测仪监控峰形曲线分段收集解析液， 收集 分三大段完成， 分别为紫外曲线开始显著上升至 75％～ 80％峰高处左右为第一大段， 曲线 上升阶段的 75％～ 80％峰高处至曲线下降阶段的 80％～ 70％峰高处为第二大段， 曲线下 降阶段的 80％～ 70％峰高处至曲线基本回落至基线处为第三大段， 每一大段进一步细分 小段收集， 收集时长一般 5 秒 / 样～ 60 秒 / 样， 优选 15 秒 / 样～ 40 秒 / 样。
作为另一种实施方式， 所述奥利司他粗品溶液采用分批连续方式上柱、 解析的连 续进样纯化方式， 且对每批解析液进行分段收集。
本发明研究开发的奥利司他纯化制备方法， 其批纯化制备量高达千克级甚至万克 级， 纯化制备批量放大倍数达以往工艺的近四个数量级， 纯化生产周期亦由以往的长达数 十小时缩短至约 1 ～ 2 小时， 若进行连续进样生产周期甚至可进一步降低至 20 ～ 40 分钟。 催化氢化后纯度为 85％～ 95％左右、 含量约为 50％～ 70％ ( 重量 / 重量 ) 左右的奥利司 他粗品， 直接经一次 DAC 制备柱纯化后其纯度即可满足当前临床用药质量标准要求， 纯化 合格样品仅需结晶一次制得药用 B 晶型后即可用于奥利司他制剂生产。该法易于生产操
控， 可实现不同生产规模的线性放大， 同时采用连续进样方式更可有效降低单位产量产品 的溶媒消耗， 相比低压柱层析与简单的反复结晶纯化， 可大幅缩短生产周期至原周期的 5％ 左右。纯化收率可达 90％～ 95％， 纯化与结晶总收率达 85％～ 93％， 收率最高可达当前其 它生产技术的近十倍甚至数十倍。 附图说明
图 1 为 DAC 制备柱纯化解析过程 UV 检测仪监控曲线及分段收集示意图 ； 其中
图 1a 为 DAC 制备柱单针进样纯化解析紫外监测图谱及分段收集示意图 ；
图 1b 为 DAC 制备柱多针连续进样纯化解析紫外监测图谱及分段收集示意图 ；
图 2 为 DAC 制备柱纯化前奥利司他粗品的 HPLC 检测结果 ； 其中
图 2a 为实施例一、 二、 四纯化前奥利司他粗品的 HPLC 检验结果 ；
图 2b 为实施例三纯化前奥利司他粗品 HPLC 的检验结果 ；
图 3 为纯化后奥利司他成品的 HPLC 检测结果， 其中
图 3a 为实施例一纯化后奥利司他成品 HPLC 检验结果 ；
图 3b 为实施例二纯化后奥利司他成品 HPLC 检验结果 ；
图 3c 为实施例三纯化后奥利司他成品 HPLC 检验结果 ； 图 3d 为实施例四纯化后奥利司他成品 HPLC 检验结果。具体实施方式
以下实施例为对本发明的详细说明， 而非限制本发明。
实施例一
将约 80Kg 调和粒径为 10μm、 孔径为 300 的反相 C18 球形硅胶填料倒入约 150L 异丙醇中， 搅拌均匀制成填料浆液， 去除填料碎片及细粉后， 快速倾倒至内径为 φ800mm 的 DAC 制备柱柱筒中， 设定装柱压力 20MPa， 开启装柱机气动活塞杆进行轴向压缩， 同时打开 DAC 制备柱下端阀门将异丙醇排出、 回收。 活塞压缩至设定压力 20MPa 时， 完成装柱， 柱床高 度 250mm， 柱床规格 φ800mm×250mm。 装好的 DAC 制备柱经柱效测试， 理论塔板数达 46812N/ m。
将利普司他汀 ( 纯度 87.46 ％， 含量 66.20 ％ ) 用 86 ％甲醇溶液溶解， 溶解稀 释后利普司他汀浓度约为 2.5 ％， 然后进行催化氢化。催化氢化的方法可采用美国专利 US4,598,089 中的方法， 在此不作赘述。完成氢化经过滤除去 Pd/C 催化剂， 制得纯度为 88.81％ ( 如图 2a 所示 ) 的待纯化奥利司他粗品的甲醇溶液。
开启 UV 检测仪， 设定检测波长为 195nm， 预热半小时。 依次分别用 2B.V. 无水甲醇 及 80％甲醇溶液对 DAC 制备柱内异丙醇进行置换、 洗涤、 平衡， 至 UV 检测仪监控曲线水平稳 定后基线调零。本发明中的 B.V. 指 Bed Volume， 即柱床体积。
取含有 2Kg 奥利司他粗品的上述溶液， 用高压制备泵以 0.2B.V./min 的流速上样 吸附。上样结束后立即用 80％～ 83％甲醇溶液线性梯度洗涤， 洗至 UV 监测曲线水平后换 用 85％甲醇溶液解析， 出峰后根据峰形曲线按每 15 秒 / 样～ 30 秒 / 样立即进行分段收集， 流速均为 0.2B.V./min， 各收集液分别取样进行 HPLC 检测。
将经 HPLC 检测奥利司他主峰纯度＞ 99.0％、 单杂＜ 0.2％且总杂＜ 1.0％的符合用药质量标准要求的收集液合并、 浓缩、 结晶及干燥， 结晶及干燥采用现有技术， 例如可采 用美国专利 US6,734,314 所记载的方法。制得符合当前药用标准的奥利司他 1.84Kg。经检 验， 成品纯度为 99.82％ ( 如图 3a 所示 )， 最大单杂 0.10％， 总杂 0.18％， 含量 99.62％， 纯 化收率 92.13％。
本发明所述纯度、 含量均为 HPLC 法检测值， 其具体含义及计算方法在 《中国药典》 附录 《高效液相色谱法》 相关章节均有说明。本发明所述纯度具体是按照药典附录 《高效液 相色谱法》 项下的 “面积归一化法” 检测计算得到， 含量是按照外标法检测计算得到。
实施例二
将约 75Kg 调和粒径为 10μm、 孔径为 100 的反相 C8 球形硅胶填料倒入约 150L 异丙醇中， 搅拌均匀制成填料浆液， 去除填料碎片及细粉后， 快速倾倒至内径为 φ800mm 的 DAC 制备柱柱筒中， 设定装柱压力 24MPa， 开启装柱机气动活塞杆进行轴向压缩， 同时打开 DAC 制备柱下端阀门将异丙醇排出、 回收。 活塞压缩至设定压力 24MPa 时， 完成装柱， 柱床高 度 250mm， 柱床规格 φ800mm×250mm。 装好的 DAC 制备柱经柱效测试， 理论塔板数达 42663N/ m。
将利普司他汀 ( 纯度 87.46 ％， 含量 66.20 ％ ) 用 85 ％甲醇溶液溶解， 溶解稀 释后利普司他汀浓度约为 3 ％， 然后进行催化氢化。催化氢化的方法可采用美国专利 US4,598,089 中的方法， 在此不再赘述。完成氢化经过滤除去 Pd/C 催化剂， 制得纯度为 88.81％ ( 如图 2a 所示 ) 的待纯化奥利司他粗品的甲醇溶液。 开启 UV 检测仪， 设定检测波长为 195nm， 预热半小时。 依次分别用 2B.V. 无水甲醇 及适量 85％甲醇溶液对 DAC 制备柱内异丙醇进行置换、 洗涤、 平衡， 至 UV 检测仪监控曲线水 平稳定后调零。
取含有 2Kg 奥利司他粗品的上述溶液， 用高压泵以 0.2B.V./min 的流速上样吸附。 上样结束后立即用 85％甲醇溶液洗涤并解析， 出峰后按每 15 秒 / 样～ 30 秒 / 样立即进行 分段收集， 流速为 0.15B.V./min， 各收集液分别取样进行 HPLC 检测。
将经 HPLC 检测奥利司他主峰纯度＞ 99.0％、 单杂＜ 0.2％且总杂＜ 1.0％的符合 当前临床用药质量标准要求的收集液合并、 浓缩， 按美国专利 US6,734,314 所述方法进行 结晶、 干燥， 制得符合当前药用质量标准的奥利司他 1.83Kg。经检验， 成品纯度为 99.80％ ( 如图 3b 所示 )， 最大单杂 0.10％， 总杂 0.20％， 含量 99.48％， 纯化收率 91.53％。
实施例三
将约 10Kg 调和粒径为 15μm、 孔径为 100 的以聚苯乙烯 / 联乙烯苯为基质的耐高 压反相聚合物树脂填料倒入约 20L 异丙醇中， 搅拌均匀制成填料浆液， 去除填料碎片及细 粉后， 快速倾倒至内径为 φ300mm 的 DAC 制备柱柱筒中， 设定压力 10MPa， 开启装柱机气动活 塞杆进行轴向压缩， 同时打开 DAC 制备柱下端阀门将异丙醇排出、 回收。活塞压缩至设定压 力 10MPa 时， 完成装柱， 柱床高度 300mm， 柱床规格 φ300mm×300mm。装好的 DAC 制备柱经 柱效测试， 理论塔板数达 38764N/m。
将利普司他汀 ( 纯度 89.17％， 含量 64.56％ ) 用用 84％乙醇溶液溶解， 溶解后利 普司他汀浓度约为 3％， 催化氢化可依照美国专利 US4,598,089 中所记载的方法进行。 完成 氢化并经过滤除去 Pd/C 催化剂后， 制得纯度为 90.15％ ( 如图 2b 所示 ) 的奥利司他粗品的 乙醇溶液。
开启 UV 检测仪， 设定检测波长为 195nm， 预热半小时。 依次分别用 2B.V. 无水乙醇 及适量 82.5％乙醇溶液对 DAC 制备柱内异丙醇进行置换、 洗涤、 平衡， 至 UV 检测仪监控曲线 水平稳定后调零。
取含有 1.5Kg 奥利司他粗品的上述溶液， 用高压制备泵以 0.15B.V./min 的流速上 样吸附。上样结束后立即用 75％～ 82％乙醇溶液线性梯度洗涤至 UV 检测曲线水平后改用 83.0％乙醇溶液解析， 流速均为 0.1B.V./min， 出峰后按每 20 秒 / 样～ 40 秒 / 样立即进行 分段收集， 各收集液分别取样进行 HPLC 检测。
将经 HPLC 检测奥利司他主峰纯度＞ 99.0％、 单杂＜ 0.2％且总杂＞ 1.0％的符合 临床用药质量标准要求的收集液合并、 浓缩， 按美国专利 US6,734,314 所述方法进行结晶、 干燥， 制得药用标准的奥利司他 1.40Kg。经检验， 成品纯度为 99.66％ ( 如图 3c 所示 )， 最 大单杂 0.17％， 总杂 0.34％， 含量 98.87％， 纯化收率 93.46％。
实施例四
本实施例基于前述实施例。 在完成装柱、 利普司他汀催化氢化、 紫外检测仪预热平 衡稳定及调零等准备工作后， 每次取含有相当于 DAC 制备柱内硅胶填料重量 1.5％～ 2.5％ ( 或聚合物树脂重量 10％～ 15％ ) 的奥利司他粗品的溶液， 用高压泵以 0.2B.V./min 的流 速上样吸附， 上样结束后立即用 85％的甲醇溶液以同样流速洗涤、 解析。 在解析至奥利司他 峰即将流出前适当时间进行第二针纯化样上柱吸附， 上柱结束立即平衡、 解析。 如此进行多 批的样品 “上柱吸附 -85％甲醇溶液洗涤、 解析” 循环连续纯化制备 ( 如图 1b 所示 )。 连续循 环进样纯化过程中， 进样密度以前后相邻两次进样的解析流出峰完全分开且相邻样品间杂 质峰与主峰不重叠为宜， 解析样出峰后按每 15 秒 / 样～ 40 秒 / 样立即进行分段收集， 各收 集液分别取样进行 HPLC 检测。 将经 HPLC 检测奥利司他主峰纯度＞ 99.0％、 单杂＜ 0.2％且 总杂＜ 1.0％的符合临床用药质量标准要求的收集液合并、 浓缩， 按美国专利 US6,734,314 所述方法进行结晶、 干燥， 制得药用标准的奥利司他。
本例是基于实施例一 ( 采用与实施例 1 相同的试验条件 )， 连续进样三针， 每针 进样量均含奥利司他约 1.8Kg， 合并三针纯化解析合格样， 浓缩并结晶， 得奥利司他成品 4.98Kg。经检验， 成品纯度为 99.64％ ( 如图 3d 所示 )， 最大单杂 0.13％， 总杂 0.36％， 含 量 99.12％， 纯化收率 92.30％。
本例采用连续进样纯化制备奥利司他， 在保证纯化收率处于较高水平的情况下， 生产周期缩短至平均每批 30 分钟左右， 且溶媒消耗量降低， 具有可观的应用前景。