从莲子心中分离制备莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的方法 【技术领域】
本发明涉及一种采用色谱法从莲子心中分离制备出高纯度单体莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱的方法。
背景技术
莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱是莲子心的主要生物碱。莲子心为睡莲科莲属植物种子的胚芽，是我国重要的中药之一，具有清心火、降血压、强心等功用。大量的研究表明莲子心的有效成分是这三种生物碱。由于这三种生物碱在心脑血管等方面的突出疗效，分离制备高纯的化合物单体成为研究的一个重要内容。然而，这三种酚性生物碱的化学性质却不稳定，易氧化，而且也不易形成结晶。因此，采用传统的分离技术如薄层色谱、柱色谱以及高效液相色谱等时，常常因为固体载体的吸附而产生拖尾、污染、损耗，结果很难获得较高纯度的化合物单体的。
中国专利CN1117735C公开了一种从莲子心中提取纯化异莲心碱和莲心碱的方法，这种方法是将莲子芯生物碱总碱成盐后分步结晶，操作步骤繁琐，难以规模化生产。因此，迫切需要一种高效、快速地分离方法，使莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱从莲子心生物碱粗品中以较高的收率被分离制备出来。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种低成本、高回收率、适合于大规模从莲子心中分离制备莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的方法。
本发明的从莲子心中分离制备莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的方法，采用的是逆流色谱方法，包括以下步骤：
1)将莲子心粉用有机溶剂反复浸提，将提取液合并、浓缩成浸膏，所得浸膏用浓度低于20％酸水溶液溶解，过滤，滤液调PH至碱性，析出沉淀物，得到莲子心生物碱粗品；或者将莲子心粉直接用浓度低于20％酸水溶液浸提，过滤，滤液调PH至碱性，析出沉淀物，得到莲子心生物碱粗品；
2)将用于分离的溶剂倒入分液器中，形成互不相溶的上下两相溶剂，上下两相的体积比为0.5-2.0；
3)将莲子心生物碱粗品溶于步骤2)的两相溶剂中，得到莲子心生物碱样品溶液；
4)将步骤2)两相溶剂中的一相注入逆流色谱仪分离柱内作为固定相，将步骤3)所得的莲子心生物碱粗品溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，注入两相溶剂中的另一相作移动相，莲子心生物碱便在逆流色谱仪内进行连续的分配，通过在线检测器的检测，收集、合并流出物，分别得到纯化的莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱。
上述步骤1)所说的有机溶剂可以是正构烷烃、卤代烃、脂肪醇、脂肪酮、脂肪酯或醚。
上述步骤2)所说的用于分离的溶剂可为正构烷烃、卤代烃、脂肪醇、脂肪酮、脂肪酯、醚类或水中的两种或两种以上的混合物，这些溶剂对莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱有较好的分配系数。
本发明采用的逆流色谱方法是一种连续的无需任何固体支持物的液液分配色谱方法，它避免了固态支持体或载体造成的吸附、损耗和变性等问题，具有能保证较高的峰型分辨度，分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和，节约溶剂等特点，能直接分离大量粗提样品或合成混合物，分离结果纯度可达到95％以上。而且所用的逆流色谱仪为普通仪器，它较高效液相色谱仪远为简单便宜，其溶剂由普通溶剂配制，价格便宜，因此是一种经济的从莲子心提取物中分离莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的方法。
【附图说明】
图1为实施例1中莲子心生物碱粗品的高效液相分析图；
图2为实施例1中莲子心生物碱分离的逆流色谱及纯化的化合物的高效液相分析图；
图3为实施例1中莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的化学结构图；
图4为实施例2中莲子心生物碱分离的逆流色谱及纯化的化合物的高效液相分析图。
【具体实施方式】
下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明。
实施例1
1.将12kg干的莲子心粉用95％乙醇10L室温冷浸48小时，抽滤出溶剂，在滤渣中再加入10L的95％乙醇，重复以上操作三次，将提取液合并用旋转蒸发器减压浓缩成浸膏，浓缩温度为40℃。所得浸膏用4L的1.5％的盐酸溶解，抽滤，滤液用10％氨水调PH至8.5，析出淡黄色沉淀。收集析出的淡黄色沉淀，得85g莲子心生物碱粗品。高效液相色谱分析(如图1，图中1为莲心碱，2为异莲心碱，3为甲基莲心碱)表明三种主要成分的含量分别为15.4％，15.9％，47.6％。
2.用逆流色谱仪分离莲子心生物碱提取物。用石油醚、乙酸乙酯、四氯化碳、氯仿、甲醇和水，按体积比为1∶1∶4∶4∶6∶1配制两相溶剂，在分液容器中静置分层，分出上下相。将莲子心生物碱粗品1102mg溶于9ml上相和9ml下相中形成样品溶液。逆流色谱柱内径4mm，柱体积为1600ml。以上相作固定相，下相为移动相，待逆流色谱仪分离柱内中注满固定相后，将样品溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，转速为450转，以5ml/min的流速注入移动相，通过在线的紫外检测器监测流分，检测波长280nm，收集、合并流出物，分别得到莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱，其纯度分别为97.45％，95.32％，98.43％，见图2，图中1为莲心碱，2为异莲心碱，3为甲基莲心碱。经现代波谱测试证明经逆流色谱分离得到的化合物结构如图3所示，图中1为莲心碱，2为异莲心碱，3为甲基莲心碱。表1-表6分别列出了所得的莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的一维和二维核磁共振波谱数据。
表1.莲心碱的1H-NMR和1H-1H COSY谱图数据
原子序号 化学位移 δ，ppm 多重性 1H-1H COSY 1 3.50 1H，d，J＝8.30Hz H-9 2-CH3 2.58 3H，s 3ax 2.74 1H，m H-3eq，H-4 3eq 3.19 1H，m H-3ax，H-4 4 2.84 2H，m H-4ax，H-3 5 6.67 1H，s 6-OCH3 3.88 3H，s 8 6.45 1H，s 9ax 2.69 1H，m H-9eq，H-1 9eq 3.22 1H，m H-1，H-9ax 11 6.98 1H，d，J＝8.15 H-12 12 6.79 1H，d，J＝8.15 H-11 14 6.79 1H，d，J＝8.15 H-15 15 6.98 1H，d，J＝8.15 H-14
1′ 3.69 1H，d，J＝9.00Hz H-9′ 2′-CH3 2.54 3H，s 3′ax 3.00 1H，m H-3′eq，H-4′ 3′-eq 3.46 1H，m H-4′，H-3′ax 4′ax 2.59 1H，m H-4′eq，H-3′ 4′eq 3.01 1H，m H-3′，H-4′ax 5′ 6.58 1H，s 6′-OCH3 3.84 3H，s 7′-OCH3 3.43 3H，s 8′ 5.71 1H，s 9′ax 2.62 1H，m H-9′eq，H-1′ 9′eq 3.13 1H，m H-9′ax，H-1′ 11′ 6.81 1H，s 14′ 6.72 1H，d，J＝8.15 H-15′ 15′ 6.39 1H，d，J＝8.15 H-14′
表2.莲心碱的13C-NMR和2D NMR谱图数据
原子序号 13C-NMRDEPTa HMQC HMBC 1 65.604 CH 3.5 H9，2-CH3 2-CH3 42.709 CH3 2.58 H-1，H-3 3 48.143 CH2 3.19，2.74 H-4，2-CH3 4 26.57 CH2 2.84 H-3，H-5 4a 129.773 qb H-8，H-4 5 112.17 CH 6.67 6 148.223 q H-5，H-8，6-OCH3 6-OCH3 55.985 CH3 3.88 7 143.378 q H-5，H-8 8 118.027 CH 6.45 H-1 8a 130.671 q H-1，H-8 9 40.087 CH2 3.22，2.69 H-1，H-11，H-15
10 130.725 q H-9，H-11，H-15 11 130.992 CH 6.98 H-12，H-15 12 116.921 CH 6.79 H-11，H-14 13 155.755 q H-11，H-15，H-12，H-14 14 116.921 CH 6.79 H-12，H-15 15 130.992 CH 6.98 H-11，H-14 1′ 64.655 CH 3.69 H-9′，2′-CH3 2′-CH3 40.435 CH3 2.54 H-3′，H-1′ 3′ 44.237 CH2 3.46，3.00 H-4′，2′-CH3 4′ 21.705 CH2 3.01，2.59 H-5′ 4′a 123.427 q H-4′，H-3′，H-8′ 5′ 111.349 CH 6.58 6′ 147.75 q H-5′，H-8′，6′-OCH3 6′-OCH3 55.826 CH3 3.84 7′ 146.307 q H-5′，H-8′，7′-OCH3 7′-OCH3 55.423 CH3 3.43 8′ 111.474 CH 5.71 H-1′ 8′a 126.654 q H-5′，H-1′，H-9′ 9′ 42.546 CH2 3.13，2.62 H-1′，H-11′，H-15′ 10′ 130.725 q H-11′，H-14′，H-9′ 11′ 121.827 CH 6.81 H-15′，H-9′ 12′ 144.101 q H-11′，H-14′ 13′ 146.462 q H-14′，H-15′，H-11′ 14′ 115.377 CH 6.72 15′ 127.496 CH 6.39 H-11′，H-9′
a DEPT 135. b季碳.
表3.异莲心碱的1H-NMR和1H-1H COSY谱图数据
原子序号 化学位移δ，ppm 多重性 1H-1H COSY 1 3.66 1H，m H-9 2-CH3 2.39 3H，s
3ax 2.64 1H，m H-3eq，H-4 3eq 3.08 1H，m H-4，H-3ax 4ax 2.47 1H，m H-4eq，H-3 4eq 2.70 1H，m H-4ax，H-3 5 6.47 1H，s 6-OCH3 3.81 3H，s 8 6.34 1H，s 9ax 2.77 1H，m H-9eq，H-1 9eq 3.03 1H，m H-9ax，H-1 11 6.90 1H，d，J＝8.42 H-12 12 6.70 1H，d，J＝8.42 H-11 13-OCH3 3.73 3H，s 14 6.70 1H，d，J＝8.42 H-15 15 6.90 1H，d，J＝8.42 H-14 1′ 3.57 1H，m H-9′ 2′-CH3 2.51 3H，s 3′ax 2.78 1H，m H-3′eq，H-4′ 3′eq 3.16 1H，m H-4′，H-3′ax 4′ax 2.66 1H，m H-4′eq，H-3′ 4′eq 2.87 1H，m H-4′ax，H-3′ 5′ 6.64 1H，s 6′-OCH3 3.79 3H，s 8′ 6.30 1H，s 9′ax 2.80 1H，m H-9′eq，H-1′ 9′eq 2.93 1H，m H-9′ax，H-1′ 11′ 6.46 1H，s 14′ 6.81 1H，d，J＝8.16 H-15′ 15′ 6.72 1H，J＝8.16 H-14′
表4.异莲心碱的13C-NMR和2D NMR谱图数据
原子序号 13C-NMRDEPTa HMQC HMBC 1 64.569 CH 3.66 H-8，2-CH3，H-9 2-CH3 42.692 CH3 2.39 3 47.468 CH2 3.08，2.64 2-CH3 4 25.562 CH2 2.70，2.47 H-5，H-3 4a 130.034 qb H-5 5 110.640 CH 6.47 6 145.254 q H-5，6-OCH3 6-OCH3 55.982 CH3 3.81 7 143.568 q H-5，H-8 8 113.869 CH 6.34 8a 125.601 q H-8，H-4 9 39.339 CH2 3.03，2.77 H-11，H-15 10 131.436 q H-12，H-14 11 130.503 CH 6.90 H-9，H-12 12 113.572 CH 6.70 H-11 13 157.867 q 13-OCH3， H-11，H-15，H-12，H-14 13-OCH3 55.206 CH3 3.73 14 113.572 CH 6.70 H-15 15 130.503 CH 6.90 H-9，H-14 1′ 64.418 CH 3.57 H-8′2′-CH3，H-9′ 2′-CH3 42.748 CH3 2.51 3′ 46.952 CH2 3.16，2.78 2′-CH3 4′ 26.115 CH2 2.87，2.66 H-3′，H-5′ 4′a 130.699 q H-1′，H-5′ 5′ 112.455 CH 6.64 H-4′eq 6′ 149.090 q H-5′，H-8′，6′-OCH3 6′-OCH3 55.821 CH3 3.79
7′ 142.866 q H-5′，H-8′ 8′ 120.067 CH 6.30 8′a 130.383 q H-1′，H-5′ 9′ 40.679 CH2 2.93，2.80 H-11′，H-15′ 10′ 131.810 q H-14′ 11′ 119.085 CH 6.46 H-15′，H-9′ 12′ 144.577 q H-11′，H-14′ 13′ 145.254 q H-15′，H-11′ 14′ 115.427 CH 6.81 15′ 125.239 CH 6.72 H-11′
aDEPT 135. b季碳.
表5.甲基莲心碱的1H-NMR和1H-1H COSY谱图数据
原子序号 1H-NMRδ，ppm 多重性 1H-1H COSY 1 3.62 1H，m H-9 2-CH3 2.48 3H，s 3ax 2.73 1H，m H-3eq 3eq 3.13 1H，m H-3ax，H-4 ax 2.62 1H，m H-4eq，H-3 eq 2.79 1H，m H-4ax，H-3 5 6.61 1H，s 6-OCH3 3.79 3H，s 8 6.34 1H，s 9ax 2.77 1H，m H-9eq，H-1 9eq 2.98 1H，m H-9ax，H-1 11 6.89 1H，s H-12 12 6.67 1H，d，J＝7.06 H-11 13-OCH3 3.70 3H，s 14 6.67 1H，d，J＝7.06 H-15 15 6.89 1H，d，J＝7.06 H-14 1′ 3.62 1H，m H-9′
2′-CH3 2.45 3H，s 3′ax 2.73 1H，m H-3′eq，H-4′ 3′eq 3.08 1H，m H-3′ax，H-4′ 4′ax 2.59 1H，m H-4′eq，H-3′ 4′eq 2.78 1H，m H-4′ax，H-3′ 5′ 6.49 1H，s 6′-OCH3 3.76 3H，s 7′-OCH3 3.52 3H，s 8′ 5.97 1H，s 9′ax 2.67 1H，m H-9′eq，H-1′ 9′eq 3.06 1H，m H-9′ax，H-1′ 11′ 6.51 1H，s 14′ 6.82 1H，d，J＝6.68 H-15′ 15′ 6.66 1H，d，J＝6.68 H-14′
表6.甲基莲心碱13C-NMR和2D NMR谱图数据
原子序号 13C-NMR DEPTa HMQC HMBC 1 64.48 CH 3.62 2-CH3，H-8 2-CH3 42.766 CH3 2.48 3 47.275 CH2 3.13，2.73 2-CH3 4 26.194 CH2 2.79，2.62 H-3，H-5 4a 130.466 qb H-5 5 112.421 CH 6.61 6 149.064 q H-5，H-6，H-8 6-OCH3 55.794 CH3 3.79 7 142.893 q H-5，H-8 8 120.094 CH 6.34 8a 130.979 q H-8，H-5，H-4 9 39.94 CH2 2.98，2.77 H-15，H-11 10 131.506 q H-12，H14，H-9
11 130.555 CH 6.89 H-12，H-9，H-15 12 113.515 CH 6.67 H-11，H-14 13 157.877 q H-11，H-15，H-12， H-14，13-OCH3 13-OCH3 55.191 CH3 3.70 14 113.515 CH 6.67 H-12，H-15 15 130.555 CH 6.89 H-14，H-9，H-11 1′ 64.834 CH 3.62 2′-CH3，H-8′ 2′-CH3 42.521 CH3 2.45 3′ 46.644 CH2 3.08，2.73 2′-CH3 4′ 25.214 CH2 2.78，2.59 H-5′ 4′a 129.07 q H-5′，H-8′ 5′ 111.211 CH 6.49 6′ 147.298 q H-5′，H-8′，H6′-OCH3 6′-OCH3 55.919 CH3 3.76 7′ 146.367 q H-5′，7′-OCH3，H-8′ 7′-OCH3 55.537 CH3 3.52 8′ 111.066 CH 5.97 8′a 125.653 q H-8′ 9′ 40.706 CH2 3.06，2.67 H-15′，H-11′ 10′ 131.720 q H-11′，H-15′，H-9′ 11′ 119.265 CH 6.51 H-9′，H-15′ 12′ 144.995 q H-14′ 13′ 145.715 q H-15′，H-11′ 14′ 115.879 CH 6.82 15′ 125.299 CH 6.66 H-9′，H-11′
aDEPT 135. b季碳
实施例2：
莲子心生物碱粗品制备方式同实施例1，用逆流色谱仪分离莲子心生物碱提取物。用乙酸乙酯、四氯化碳、甲醇和水，按体积比为1∶6∶4∶1配制两相溶剂，在分液容器中静置分层，分出上下相。将莲子心生物碱粗品5850mg溶于15ml上相和15ml下相中形成样品溶液。逆流色谱柱内径4mm，柱体积为1600ml。以上相作固定相，下相为移动相，待逆流色谱仪分离柱内中注满固定相后，将样品溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，转速为450转，以5ml/min的流速注入移动相，通过在线的紫外检测器监测流分，检测波长280nm，收集、合并流出物，分别得到莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱，其纯度分别为98.52％，97.12％，99.54％，见图4。
实施例3：
莲子心生物碱粗品制备方式同实施例1，用逆流色谱仪分离莲子心生物碱提取物。用乙醚、乙酸乙酯、四氯化碳、甲醇和水，按体积比为1∶1∶7.5∶5∶1配制两相溶剂，在分液容器中静置分层，分出上下相。将莲子心生物碱粗品150mg溶于1.5ml上相和1.5ml下相中形成样品溶液。逆流色谱柱内径2mm，柱体积为380ml。以上相作固定相，下相为移动相，待逆流色谱仪分离柱内中注满固定相后，将样品溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，转速为550转，以1.5ml/min的流速注入移动相，通过在线的紫外检测器监测流分，检测波长280nm，收集、合并流出物，分别得到莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱，其纯度分别为96.54％，95.13％，97.27％。
实施例4：
莲子心生物碱粗品制备方式同实施例1，用逆流色谱仪分离莲子心生物碱提取物。用正己烷和水，按体积比为10∶7配制两相溶剂，在分液容器中静置分层，分出上下相。将莲子心生物碱粗品55mg溶于1ml上相和1ml下相中形成样品溶液。逆流色谱柱内径1.6mm，柱体积为280ml。以上相作固定相，下相为移动相，待逆流色谱仪分离柱内中注满固定相后，将样品溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，转速为550转，以1ml/min的流速注入移动相，通过在线的紫外检测器监测流分，检测波长280nm，收集、合并流出物，分别得到莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱，其纯度分别为97.24％，95.45％，96.33％。