液体混合物的制备 【技术领域】
本发明涉及产生具有受控的 pH 和离子强度的液体混合物的方法，并且涉及可在 这种方法中应用的设备。 本发明大体关注需要精确的缓冲剂制备的任何情况。背景技术
在许多情况下，如当使用具有规定的 pH 且可选地还具有离子强度的缓冲剂时， 获得具有确知的成分的液体是重要的。 另外，在许多情况下，液体的成分不仅应当在各 个时刻为确知和受控制的，而且还应当以精确且受控的方式随时间而变化。
其中液体的成分极为重要的一种应用是在液相层析中，并且更具体而言，是当 通过梯度洗提来执行洗提 ( 即从层析基质中释放隔离的目标分子 ) 时。 例如，在离子交 换层析 ( 它是用于分离和净化生物分子的常用方法 ) 中，有时使用梯度洗提来 ( 例如 ) 寻 找使得能够实现使用逐步洗提的工业过程的设计的最优洗提条件。 众所周知，洗提液包 含惰性盐，并且通过改变这个盐的浓度来执行梯度。 众所周知，盐浓度 ( 即离子强度 ) 的改变还影响 pH，并且已经充分记录了洗提液的 pH 和离子强度是控制离子交换树脂上 的蛋白质分离的选择性的两个最重要的参数。
美国专利 No.5,112,949(Vukovich) 涉及一种用于使用梯度来执行分离的自动化 系统。 具有逐渐改变的梯度的这种手动和自动化系统的问题在于，如果使梯度浅了，就 要花很多时间来执行洗提，而如果使梯度陡了，则代替所关注的各个生物分子依次被洗 提，生物分子的洗提会交迭。 这会导致若干种类的生物分子被收集在各个部分中，而不 是各个物类的生物分子被收集在其本身的单独的部分中。
美国专利 7,138,051(DeLamotte) 涉及一种用于分离生物分子的层析系统、方法 和软件。 更具体而言，这个专利涉及从层析柱中洗提的生物分子的分离的优化，在层析 柱中，添加到洗提缓冲剂的组分的浓度被改变，以便形成具有浓度逐渐改变的所述添加 的组分的洗提缓冲剂溶液。
Okamoto(Hirokazu Okamoto 等人， Pharmaceutical Research( 药物研究 ).Vol.14， No. 3 ， 1997 ：Theory and Computer Programs for CalculatingSolution pH ， Buffer formula， and Buffer Capacity for MultipleComponent System at a Given ionic strength and Temperature( 用于在给定离子强度和温度处计算多组分系统的溶液 pH、缓冲剂配方和缓 冲容量的理论和计算机程序 )) 描述了用以在给定离子强度和温度处计算溶液 pH、缓冲剂 配方和缓冲容量的计算机程序。 但是，由 Okamoto 等人制备的缓冲剂溶液显示了随着增 加的盐浓度 ( 甚至是在诸如 0.3M 的低浓度处 ) 而增加的 pH 变化。 因此，Okamoto 方法 不足以提供也包含盐的具有恒定的 pH 的缓冲剂溶液。
梯度形成的传统方式涉及小心地制备包括惰性盐以及具有预定的 pH 的缓冲剂的 洗提液，以在恒定的 pH 处实现离子强度梯度。 已经通过改变惰性盐梯度的斜率以及 / 或 者用具有不同的 pH 的一种缓冲剂系统代替该缓冲剂系统来实现蛋白质的分离的优化。
在早期的现有技术中，优化包括制备具有预定的 pH 和盐浓度的许多缓冲剂溶液，必须对缓冲剂溶液进行小心的滴定，以使分离可重现。 显然，这种方法即耗时又不 方便。
在文献中记录了用于在中等离子强度 ( 直至 100mM) 处计算缓冲剂 pH 的方法， 并且这些方法基于存在于缓冲剂溶液中的各种带电及不带电的物类之间的平衡方程的基 于代数或计算机的解决方案。
对于与对应的酸性物类 ( 其分别可为共轭酸 BH+ 或酸 HA) 处于平衡状态的特定 的碱性物类 ( 其可为碱 B 或共轭碱 A-)，平衡方程可写作 ：
H++ 碱性物类 < ＝＝ > 酸性物类 + 方程 1.1
对应的平衡常量 Ka 定义为
Ka ＝ (H+)( 碱性物类 )/( 酸性物类 +) 方程 1.2
其中，括号表示各个物类的活度。 对方程 1.2 的两边取对数，并且在 pH 定义 为 -log(H+) 的情况下进行求解得到
pH ＝ pKa+log{( 碱性物类 )/( 酸性物类 )} 方程 1.3
这有时称为亨德森 - 哈塞尔巴赫 (Henderson-Hasselbach) 方程。 将活度而非对 应的浓度用于方程 1.2 中的原因是，由于主要是静电的相互作用，相关的离子倾向于变得 与环境屏蔽开。 但是，尽管 pH 度量是对质子的活度的直接观测，例如通过对它们的量和 体积进行称重、移液或泵送所观测到的是浓度而非缓冲剂离子的对应的活度。 各个离子 的活度通过活度系数 与对应的浓度相关
方程 1.4在无限稀释的理想状态下， 变为 1，并且每个离子的活度变成等于对应的浓 度。 但是，在真实情况下，离子强度不同于 0，并且不同的物类的活度系数变得小于 1。
在所谓的德拜 - 休克尔 (Debye-Huckel) 理论中，已经发展出了针对这些偏差的 良好地确立的模型，已知为 ：
方程 1.5其中， A 是常量，或者是温度依赖参数～ -0.51。 使用众所周知的数据，可将 A 的值准确地计算为 A ＝ 0.4918+0.0007*T+0.000004*T^2，其中，T 是以摄氏度表示的温 度。 Z 是离子的电荷，数量为 α，在德拜和休克尔的原始论文中，水合离子的半径 ( 以 表示 ) 描述为 “接近 (approach) 离子的 ( 正的或负的 ) 的平均距离”。
在 Kielland 的上述文章中呈现的表中，显示了这个参数 ( 也已知为离子大小参 数 ) 对于不同的离子物类是不同的。 I 是离子强度 ( 包括所有离子 ) 方程 1.6
Ci 是浓度，而 Zi 是存在于溶液中的离子的电荷 ( 以电子电荷为单位 )。 将方程 1.4 代入方程 1.3 中关于浓度而非活度给出了 pH ：
6CN 102016567 A CN 102016577 A
说明书方程 1.73/16 页其中， 方程 1.8是允许使用不同的缓冲剂物类的浓度的可测值的表观 (apparent)pKa 值。 可通过 将方程 1.5 代入方程 1.8 中来计算 pKa′的值，将方程 1.5 代入方程 1.8 中给出了 ：
pKa′＝ pKa+(AZa2I0.5)/(1+0.33*108aaI0.5)-(AZb2I0.5)/(1+0.33*108abI0.5) 方程 1.9 其 中，下标 a 和 b 的引入是必要的，以规定分别对应于酸和碱的参数。 因此，
Za ＝酸性物类的电荷
Zb ＝碱性物类的电荷
αa ＝酸性物类的离子大小参数
αb ＝酸性物类的离子大小参数
应用于 pH 计算，德拜 - 休克尔理论导致缓冲剂的 pKa 值 ( 称为热力学 pKa 值 ) 修 改成由方程 1.9 给出的对应的 pKa′值。 方程 1.9 中的大部分参数是直截了当地估计的。 最具挑战性的参数是 α。
Guggenheim&Schindler( 见 GuggenheimEA&SchindlerTD.(1934)J.Phys.Chem.( 物 从而导致理化学杂志 )33.533) 已经提出了对于所有缓冲剂分子使参数 α 设定近似为稍微简化的公式
pKa′＝ pKa+(AZa2I0.5)/(1+I0.5)-(AZb2I0.5)/(1+I0.5) 方程 1.10 上面的方程 110 是在 文献中常见的用于离子强度修正的公式。 有时将修正项添加到这个方程的右手边，以补 偿各种缓冲剂在更高的离子强度处的准确度损失。 但是，当离子强度高达 1M( 这在例如 离子交换层析和 HIC 中的梯度洗提中通常使用的范围内 ) 时，这样做所获得的准确度是较 差的。
Kielland(Jacob Kielland， Activity Coefficients of Ions in AqueousSolutions( 水溶液 中的离子的活度系数 )，1937 年 9 月 ) 已经研究了液体中的离子的活度系数，并且提供了 离子活度系数的扩展表，考虑了水合离子的直径。使用四个不同的模型来获得 Kielland 所 提供的用于水合离子大小参数 ai 的数据 ：Bonino 的模型，其考虑了晶体半径和可塑性 ； 众所周知的方程 108ai ＝ 182zi/l ∞，其考虑了离子迁移率 ；Brull 对上述方程的经验性修 正 ；以及最后是 Ulrich 熵不足 (entropydeficiency) 方法。 使用了所述四个模型的圆整平 均值来获得那个研究中报导的数据。 Kielland 提出的 ai 值呈现较大的变化 ( 从 2.5 至多达 11)，并且取决于离子的性质基于这个变化对活度系数提出非常规模型，即针对无机离子 的一个方程和针对有机离子的一个不同的方程。
US 6,221,250(Stafstróm) 涉及一种制备液体混合物的方法，其有利地使用了参数 α 的上述近似。 更具体而言，所公开的制备混合物的方法包括以下组分 ：(i) 一个或多 个缓冲物类 ；(ii) 酸或 ( 备选地 ) 碱 ；(iii)( 可选地 ) 盐 ；以及 (iv) 溶剂。 组分 (i) 至 (iv) 的比例以这样的方式伴随性地变化 ：即，以便考虑液体混合物的 pH 和离子强度的相 互关系，以在各个时刻获得混合物的预先选择的 pH，并且该方法基于使用修改的且重复 性的 Guggenheim-Schindler(1.10，见下文 ) 方程，其中，使用对缓冲剂而言专有的修正因 子来沿着梯度获得恒定的 pH。 因此，在某些情况下，这个方法的一个缺点可为 ：如果需要引入新的缓冲剂，则需要再次进行计算。
其中必须制备具有受控的 pH 和离子强度的液体混合物的另一个应用是在高吞吐 量 (throughput) 筛选 (HTS) 中， HTS 是一种用于常用于药物发现但是还与生物和化学领 域相关的科学实验的方法。 通过结合现代机器人技术、数据处理和控制软件、液体处理 装置和敏感的探测器， HTS 允许研究者在短时期内有效地进行数百万次的生物化学、基 因或药理学测试。 通过这个过程，人们可快速地辨识调整特定的生物分子路径的活性化 合物、抗体或基因。 这些实验的结果可 ( 例如 ) 为药物设计以及为理解生物学中的特定 的生物化学过程的相互作用或角色提供起点。
自动化在 HTS 的有用性方面是重要的元素。 专用机器人通常负责单个化验盘的 寿命中的许多过程，从产生直到最终分析。 HTS 机器人通常可同时制备和分析许多盘， 从而进一步加速数据收集过程。 但是，为了使这些机器人准确地起作用，液体混合物 ( 例如具有精确地受控的 pH 以及离子强度的缓冲剂 ) 的制备再次是必要的。
在 HTS 领 域 内 的、 正 变 得 越 来 越 有 价 值 的 一 种 应 用 是 高 吞 吐 量 过 程 开 发 (HTPD)，其中，pH 和离子强度的角色在它们控制目标 ( 一个或多个 ) 和污染物 ( 一个或 多个 ) 的结合行为时非常重要。 通过成功地设计这种高吞吐量过程，可准确地预测关于 高的质量转移速率及因此过程经济性以及还有最优的洗提和因而最高的回收的条件。 但 是，这种成功的设计将需要自动的缓冲剂制备或至少通过自动的缓冲剂制备来获得较大 的改进，从而允许在短的时间间隔中准备许多条件，例如 pH 和 I。 精确且良好地受控的缓冲剂制备的另一个需要出现在微型盘和其它实验室设备 格式中。 基于微型盘和过滤器盘的化验中的许多步骤易于通过使用例如用于处理的多个 吸液管和真空块以及用于探测结果的盘阅读器来平行进行。 通常不存在对更高水平的自 动化 - 即盘的自动化运送的需要。 甚至对于许多 “吞吐量应用” 这也是有效的，因为 首先就已经通过盘结合获得了该多个实验中的因子 96 或 384。 但是，存在涉及在盘中缓 慢地制备单独的井的情况。 虽然专用的小占地面积 (footprint) 的盘阅读器被想当然地用 于探测和分析单独的井，但是对于在一个微型盘中的单独的井中的缓冲剂制备来说，不 存在类似的专用的、价格合理的、小占地面积的解决方案。 TECAN 是已经通过编写软 件而使用它们的实验室自动操作平台在微型盘中提供缓冲剂制备来解决该问题的公司。 乍一看可能认为这是上等的解决方案，但是其导致为了相对简单的任务而在装备优良的 自动化实验室中占用昂贵的自动化基础设施达若干个小时。 此外，为了使小型实验室从 TECAN 解决方案中获益，需要巨大的投资。
因此，还存在对这样的自动分配装置 - 例如独立单元的需要 ：其可与自动化解 决方案一起用作工作站，例如以减少主要自动化基础设施中的工作量。
发明简述
本发明的一方面是提供一种精确且准确地控制液体混合物的 pH 和离子强度的方 法。 简要而言，这可通过提供一种制备诸如缓冲剂的液体混合物的方法来实现，该方法 考虑了有机离子以及无机离子的大小和电荷两者。 这可如所附的权利要求中的一个或多 个所限定的那样来实现。
本发明的另一个目标是提供一种改进的缓冲剂制备方法，其中，首先计算确切 的成分，并且随后在单个步骤中制备缓冲剂。
本发明的一个具体的方面是提供用于缓冲剂制备的工具，其中，通过计算缓冲 容量，存在各个相应的缓冲剂的有保证的 pH 范围。
本发明的另一方面是提供一种基于期望的 pH 和 / 或离子强度和缓冲容量根据缓 冲剂物类、缓冲剂浓度和 / 或盐浓度来限定液体混合物的成分的方法。 因此，从液体混 合物的期望的 pH 并且可选地还有期望的离子强度和缓冲容量开始，本发明将限定适当的 缓冲剂物类以及缓冲剂和盐浓度的适当的值，以获得所述 pH 和离子强度以及缓冲容量。
最后，本发明的另一方面是在自动分配装置中使用本缓冲剂限定方法来在微型 盘和其它实验室设备中智能地制备缓冲剂。 这可通过引入基于上述的模型的软件来实 现。 在一个具体方面中，该装置包括用于自动化的接口。
根据后面的详细描述和权利要求书，本发明的另外的方面和优点将显现出来。
定义
在本文， “缓冲剂” 的意思是不管是否添加了大量的酸和 / 或碱都在液体溶液 中保持几乎恒定的 pH 值的组分或化合物。 在本文中，用语 “计算机程序” 与用语 “软 件” 可互换地使用。 附图说明 图 4 公开了表 1，表 1 显示了三种不同方法的实验 pH 值之间以及计算 pH 值和实 验 pH 值之间的均方根差异。
发明详述
在第一方面，本发明涉及一种确定以下各个中的至少一个的相对组分比例、以 便提供具有预先限定的 pH 和离子强度的液体混合物的方法 ：
缓冲剂 ；
酸或碱 ；
溶剂 ；以及可选地
盐，
其中，使用德拜 - 休克尔方程来确定相对组分比例，其中，德拜 - 休克尔方程中 的离子大小参数 a 确定为对液体混合物的离子强度有贡献 ( 即起作用 ) 的所有物类的加权 平均离子大小，且其中，各个物类的离子强度用作加权参数。
因此，提供了可应用于包括有机缓冲剂物类和无机物类的液体混合物的一般方 法。 如上所述，这种缓冲的液体混合物广泛用于许多化学和生物领域中。 本方法允许相 对组分比例的改进的预计 ( 确定 )，以便实现具有预先限定的 pH 和离子强度的液体混合 物 ( 尤其是在高的缓冲剂和 / 或盐浓度处 )，这得到了以下的实验结果的支持。 还应当注 意到，可以以相反的方式使用本方法，以确定具有特定组成的液体混合物的所得到的 pH 和离子强度。
如上所述，广泛地使用德拜 - 休克尔方程的不同的近似解，以便确定缓冲剂溶 液等的相对组分比例，但是到目前为止它们都在较高的缓冲剂和 / 或盐浓度处提供较差 的精度。 提出的方法通过将离子大小参数 α 确定为对液体混合物的离子强度有贡献的所 有物类的加权平均离子大小来克服了这些问题，且其中，各个物类的离子强度用作加权 参数。
根据一个实施例，液体混合物的离子大小参数 α 计算为 方程 1.11其中， Ii 是离子强度，而 ai 是物类 i 的离子大小参数，而 I 是上面的方程 1.6 中 定义的总的离子强度。 从所述方程开始，然后 ：
方程 1.12物类 i 的离子大小参数 ai 是通过实验建立的值或通过实验近似的值，并且一些缓 冲剂和盐的 ai 值的实例在实例 2 的表 2 中列出。
贯穿本公开，用语 “物类” 覆盖了对液体混合物的离子强度有贡献的任何和所 有离子或分子，并且更具体而言，一个组分，例如，诸如弱酸的缓冲剂系统，可对应于 两个或更多个具有不同电荷的物类，各个具有相关联的 ai 值。 由于在具体环境中 ai 与 “离子大小” 相关，已经发现，一个具体物类的 ai 值对于组分 ( 例如缓冲剂、盐等 ) 的 不同组合可为不同的。 例如，已经发现，与醋酸盐缓冲剂相比，当与磷酸盐缓冲剂混合 时，NaCl 的 ai 值不同，如下面的表 2 中所示。 但是，已经发现，使用本方法，对于被测 的组分组合， ai 值在宽的 pH 和离子强度的范围上均有效，从而导致本质上在整个范围上 的改进的可预测性。 实例 2 的图 5 显示了基于以上方法制备的大量的缓冲剂样本的计算 的 pHvs 测得的 pH 的图示。 根据这个图，显而易见的是，所公开的方法能够在很宽的 pH 范围上限定相关的相对组分比例。
根据一个实施例，已经进一步发现，德拜 - 休克尔方程中的离子大小参数 α 可 近似为
a ＝ 0.5*(mass)1/3+shell 方程 1.13
其中， α 的确定需要较少的处理容量。 在这个方程中，项 “shell( 外层 )” 可 通过另外的层来激发，另外的层可认为是离子的 “水合层”。 关于这个实施例，已经发 现，如果 “shell” 设定在具体的、固定的值处，则德拜 - 休克尔方程中的称为 “常量” 的项等于 0.5，如例如在图 4 中呈现的表 1 中所显现的那样。
因此，在一个实施例中，对于带正电荷的离子物类， “shell” 固定在一个具体 值处，而对于带负电荷的离子物类， “shell” 固定在另一个不同的值处。 在一个实施例 中，对于带正电荷的离子物类 (shellpos ＝ 4)，“shell”在 3.8-4.2 的范围中，例如 3.9-4.1 或 4。 在另一个具体实施例中，对于带负电荷的离子物类 (shellneg ＝ 0)， “shell” 在 0-0.2 的范围中，例如 0-0.1 或 0。
与诸如上述 Okamoto 的现有技术方法相比，本发明的一个优点是，本发明使得 不仅能够在低的盐浓度处而且还能够在更高的盐浓度 ( 例如高于 1M，高于 2M 或甚至高 于 5M) 处制备液体混合物，例如缓冲剂。
因此，在一个具体实施例中，本发明是一种提供诸如缓冲剂的液体混合物的方 法，其中，盐浓度直至 1M，特别是在 1-2M 的范围中，或更特别地高于 2M。
根据一个实施例，使用迭代过程来确定相对组分比例。
根据一个具体实施例，如果 1 示意性地显示，迭代过程包括 ：
(a) 确定 10 相对组分比例，其中，液体混合物的预先限定的离子强度根据物类之间的预先限定的分布针对这些物类来分配 (address)20 ；
(b) 基于在前述步骤中确定的相对组分比例，计算 30 混合物中的各个物类的离 子强度 ；
(c) 确定 40 新的一组相对组分比例 ；考虑在 (b) 中计算的离子强度，以及
(d) 重复步骤 (b) 和 (c)，直到满足 50 预定的收敛标准。
在步骤 (a) 中，液体混合物的预先限定的离子强度在物类之间的分配预先限定， 以便实现迭代过程的适当的起始点，以便实现快速收敛，以及避免假收敛。 根据一个实 施例，液体混合物的预先限定的离子强度针对盐物类来分配，因为盐物类通常是对包括 盐组分的缓冲剂的总的离子强度的主要贡献者。 对于不具有任何盐组分的液体混合物， 分配液体混合物的预先限定的离子强度。
在步骤 (b) 中，使用在前述步骤 ( 即第一次迭代中的步骤 (a) 和随后的迭代中的 步骤 (c)) 中确定的相对组分比例来计算混合物中的各个物类的离子强度。 因此，使用如 相对组分比例所限定的各个物类的浓度来计算更准确的离子强度分布，该离子强度分布 随后用来确定更准确的相对组分比例 ( 步骤 (c)) 等等，直到收敛为止。
预定的收敛标准可选择为确保以合理的计算工作量将相对组分比例限定成具有 足够的精度的任何适合的标准。 根据一个实施例，当最后一组相对组分比例和紧接在前 面的步骤中发现的组之间的偏差不超过预先限定的最大水平时，收敛标准可选择为迭代 步骤，然后在以给定的盐浓度产生具有选定的 pH 的混合物时保留这个最后一组相对组分 比例。 在备选实施例中，收敛标准可 ( 例如 ) 选择为固定数量的迭代或其它适合的关系。 在一个具体实施例中，以上过程迭代不到 10 次，优选地不到 8 次，更优选地 4-6 次，例 如 5 次。 根据图 2 中示意性地显示的一个实施例，可在用于提供具有预先限定的 pH 和离 子强度 70 的液体混合物的方法中使用确定液体混合物的相对组分比例的方法，该方法包 括：
提供 80 以下各个中的至少一个的组分储备溶液 ：
缓冲剂 ；
酸或碱 ；
溶剂 ；以及可选地
盐，
使用上述方法来确定 90 待混合的各个组分储备溶液的相对比例，混合 100 储备 溶液。
在备选实施例中，可用所述组分的固相储备源来代替一个或多个组分储备溶 液，由此，在混合组分之后，溶解相对比例的固相。
通过这个方法，响应于预先限定的 pH 和离子强度，可以以高的精度来制备大范 围的缓冲剂溶液或其它液体混合物。
根据一个实施例，该方法可用来制备这样的液体混合物 ：其中，通过组合伴随 性地变化的比例的组分储备溶液，离子强度随时间 ( 即随体积 ) 而逐渐改变，且其中，液 体流的 pH 值可保持基本相同。 如果需要，可制备具有 pH 梯度或甚至 pH 梯度与离子强 度梯度的组合的液体混合物。
本发明可用来确定诸如包括两个或多个缓冲物类的缓冲剂 ( 通常称为多缓冲剂 物类液体 ) 的液体混合物的相对组分比例。 因此，在一个实施例中，本发明是如以上所 论述的方法，其中，制备了两种或更多种储备溶液，该储备溶液包括不同的缓冲物类。 在一个备选实施例中，提供了包括至少两种 ( 例如三种、四种或更多 ) 缓冲物类的储备溶 液。
在一个实施例中，确定相对组分比例的本方法可称为用于缓冲剂限定的方法， 其限定选自由获得具有期望的 pH 值和 / 或期望的离子强度和缓冲容量的缓冲剂所需要 的缓冲剂物类、缓冲剂浓度以及盐浓度组成的组的参数中的一个或多个。 在一个实施例 中，在一个具体时间点处获得缓冲剂限定。 在一个备选实施例中，以连续过程在线获得 本缓冲剂限定。 缓冲剂限定的方法可包括上面在制备液体混合物的背景中论述的元素中 的一个或多个。
如上所述，使用本方法制备的液体混合物可为缓冲剂，其可用于诸如高吞吐量 筛选应用的各种应用中及应用于层析中。 在层析中，根据本方法制备的液体有利地是洗 提液，其相应地将包括逐渐改变的离子强度 ( 也称为盐梯度 )。 这种梯度可逐渐增大或减 小。 在另一方面，本发明涉及能够执行上述计算的计算机程序。
根据一个具体实施例，提供了一种用于确定以下各个中的至少一个的相对组分 比例、以便根据确定相对组分比例的以上方法来提供具有预先限定的 pH 和离子强度的液 体混合物的计算机程序 ：
缓冲剂 ；
酸或碱 ；
溶剂 ；以及可选地
盐，
其中，将确定的组分混合比例显示给用户，以进行评价，以及 / 或者使用该确 定的组分混合比例来控制液体混合器装置。
可在诸如磁盘或记忆棒 (stick) 的存储器装置上提供的或者作为控制装置的一部 分提供的、根据本发明的计算机程序，对于以自动化的方式制备具有受控的 pH 和离子强 度的液体混合物 ( 优选液体流 ) 来说是有用的。
在根据上面所述的、确定相对组分比例以提供具有预先限定的 pH 和离子强度的 液体混合物的方法的基于计算机的实现的一个实施例中，各个物类的离子大小参数 αi 存 储在可访问的数据库、表等中，以在计算中使用。 这种表的一个实例参照实例 2 在表 2 中显示。
在一个具体实施例中，计算机程序可在设计模式中运行，这意味着程序将计算 接收物 ( 即滴定剂、滴定剂、水和盐的量 )，以获得具有给定的 pH 和离子强度 ( 或者盐 浓度而非离子强度 ) 的溶液。 在一个备选实施例中，计算机程序可在 pH 计算模式中运 行，这意味着程序将计算在混合一定量的缓冲剂组分时获得的 pH 和离子强度。
在图 3 中示意性地显示的第三方面中，提供了一种缓冲剂制备装置 190，包括 ：
液体混合器装置 200，包括混合液体出口端口 210，以及连接到以下各个中的至 少一个的组分源 230 上的多个入口端口 220 ：
缓冲剂 ；
酸或碱 ；
溶剂 ；以及可选地
盐，
混合器控制单元 240，其布置成以便控制通过混合器装置的入口端口供应的相对 组分比例，从而在出口端口提供具有预先限定的 pH 和离子强度的液体混合物，混合器控 制单元布置成以便使用德拜 - 休克尔方程来确定相对组分比例，其中，德拜 - 休克尔方程 中的离子大小参数 a 确定为对液体混合物的离子强度有贡献的所有物类的加权平均离子大 小，其中，各个物类的离子强度用作加权参数。
根据一个实施例，缓冲剂制备装置包括一个或多个可控阀 250、泵 260 等，以对 混合器装置提供相关联的组分的相对比例。 在所公开的实施例中，阀 250 和泵 260 示意 性地显示为结合在液体混合器装置中，但是备选地，它们可作为分开的构件来提供。
根据一个实施例，缓冲剂制备装置结合成液相层析系统的一部分。 因此，缓冲 剂制备装置有利地用于层析中，如上述美国专利 6,221,250 中详细论述的那样，该专利由 此通过引用而包括在本文中。
在一个具体实施例中，缓冲剂制备装置包括多端口入口阀，例如 4 入口快速开 关阀 ；用于缓冲剂滴定的机构 ；实际缓冲剂混合率的显示器 ；用于独立于离子强度和温 度而保持 pH 的机构 ；用于缓冲容量的自动检查的机构。 四元 (quaternary) 阀将打开一个 端口较短的时间，且然后打开下一个端口等等。 不同的储备溶液体积段 (segment) 将在 混合器中完全混合，以形成所选择的缓冲剂。 打开时间由算法控制，以获得正确的 pH。
缓冲剂滴定可用对应的酸 / 碱或强酸 / 碱两者来完成。 实际缓冲剂混合率可通 过软件 ( 例如 UNICORN(GE 医疗 ) 的修正版 ) 显示和 / 或控制。 独立于离子强度和温 度获得制备好的溶液的稳定的 pH。 可存在缓冲容量的自动检查。 可在方法中设定缓冲 剂浓度和 pH。
在又一方面，提供了提供流体流的机器人操作的液体处理器，其中，在改变离 子强度时， pH 保持基本相同。 根据这个实施例的机器人操作的液体处理器可用于 ( 例 如 ) 在高吞吐量筛选过程中控制缓冲剂成分 ；用于质量控制 ；用于 DNA 定量和归一化 ； 用于 PCR 中等。 在一个有利的实施例中，机器人操作的本处理器组成允许在 96 井格式 中进行完全自动化的缓冲剂制备的系统的一部分，以实现高吞吐量过程开发。 在这种系 统中，根据本发明的计算机程序以容易引入到机器人装置中的格式提供输出设计。
最后，本发明还涉及在自动分配装置中使用上述确定相对组分比例的方法，以 在 ( 例如 ) 微型盘或其它格式中以及可能在其它实验室设备中进行智能缓冲剂制备。 根 据本发明的方法的一个优点在于在高达 1M 或更高的离子强度值处的 pH 预测的精确性。 在一个实施例中，该方法尤其适用于具有带正电荷的缓冲剂离子的缓冲剂系统。 根据本 发明的独立的缓冲剂制备装置可用于涉及化学、生物、生物化学、用于类似于高吞吐量 过程开发的应用的医学研究和开发、用于晶化条件的筛选、用于结合条件的筛选等的任 何实验室，以及大体用于需要以 μl-ml 尺度平行地进行的缓冲剂制备的任何应用中。 取 决于所包括的软件，该装置也可针对需要相同的单元操作的其它应用容易地进行定制。
附图详述图 4 是显示了三种不同的方法的实验 pH 值之间和计算 pH 值与实验 pH 值之 间的均方根差异的表。 这些方法在离子强度的 pKa 值的类型修正方面是不同的 ：根据 Guggenheim&Schindler 方程 1.10 的修正和根据这个方法的方程 1.9 与方程 1.11 的修正。 括号中的数字给出了大于 0.1pH 单位的差异的数量。 还以 pH 单位给出了均方根差异 (r.m.s.d) 值。 NOK 是每 pH 单位具有处于或高于 0.01 摩尔的强酸 / 碱的缓冲容量 (logβ ＞ -2) 的实验的数量。 呈灰色的 Shell 的值没有影响。
图 2 公开了通过四入口快速开关阀进行的、根据本发明的缓冲剂制备的一个具 体实施例。 缓冲剂滴定可与对应的酸 / 碱或强酸 / 碱两者一起进行。 实际的缓冲剂混合 率通过软件显示，在这种情况下，软件为 UNICORN(GE 医疗 ) 的特别修改版本。 独立 于离子强度和温度来获得制备好的溶液的稳定的 pH。 存在缓冲容量的自动检查。 缓冲 剂浓度和 pH 可在方法中设定。 四元阀将打开一个端口较短的时间，然后打开下一个端 口等。 不同的储备溶液体积段将在混合器中完全混合，以形成所选择的缓冲剂。 打开时 间由算法控制，以获得正确的 pH。 在运行期间使用的实际比例在 UNICORN 中的 System Control( 系统控制器 ) 中以及 Evalution( 评价系统 ) 中显示为曲线圆锥 (Conc)Q1 至 Q4 中 的百分比。
实验部分
仅出于说明性目的给出了下面的实例，并且它们不应当被理解为限制所附的权 利要求书限定的本发明。
实例 1- 软件开发
材料 / 研究的单元
所有编程都在具有奔腾 4 处理器和 windows XP 操作系统的个人计算机中进行。
方法
在开发工作的第一部分中，使用了 Borland′ s C++Builder 的版本 5，并且使用了 Visual C++ 编译器的较后来的 4.2 版本。
接受标准
在这个实验的开始，决定该方法应当以 0.2pH 单位的精度给出正确的 pH。 因 为所使用的泵和阀系统的规格是 0.5％，并且正常的储备浓度将是 0.2M，在给定的为 0.01 的最小缓冲容量 ( 见下文 ) 的情况下，约 0.1 将对应于比例的精度，而 0.1 对应于算法的 精度。 在缓冲容量定义为 |dn/dpH| 时，得到最小的缓冲容量，其中， dn 是在 pH 中引起 ( 小 ) 变化 dpH 的强酸 / 碱的量 ( 以摩尔为单位 ) 的 ( 小 ) 变化。 通过与缓冲剂溶液的 实验 pH 度量比较来估计算法的精度。 在试验阶段的开始时估计吸液误差，并且同与实验 pH 确定 ( 数据未显示 ) 相关的其它误差相比，可认为吸液误差很小。 因此，通过使用具 有不同类型的电极的两个不同的 pH 仪表来测量各个缓冲剂样本的 pH 来估计实验误差， 不同类型的电极导致了两个不同的 pH 值 ( 在本文中表示为 pHExp 和 pHExp1)。 根据以 下公式计算各个实验序列 ( 数据集 ) 的均方根差 (r.m.s.e.)
r.m.s.e. ＝ Sqrt(∑(pHExp-pHExp1)2/NOK) 方程 2.1
其中，获得对应的缓冲容量大于 0.01 的情况下的那些 pH 值的和，且其中， NOK 是这种情况 ( 仅考虑其缓冲容量 (β) 的对数 ( 底为 10) 大于 -2 的情况的结果 ) 的数量。 如果发现 r.m.s.e. 大于 0.05pH 单位，则拒绝数据集 ( 对应于一个 pH 仪表 ) 中的至少一半，在这种情况下，与文献中发现的缓冲常量 (pKa 和 pKa 的温度依赖 ) 的已确定的值更 相符的数据集保持和用于离子强度补偿参数的优化。 在存在与来自文献的缓冲剂常量的 已确定的值相符的另一个数据集的情况下，甚至可拒绝数据集中相符的一半。 通过实验 获得作为缓冲容量的更低的限值的值 0.01(log-2.0)，因为观测到在这个限值以下，对于 大多数缓冲剂系统 ( 数据未显示 )， r.m.s.e. 增加超过 0.05。 作为比较，在上述美国专利 6,221,250(Stafstróm) 中使用的对应的值是 0.0063(log-2.2)。 在文献中未发现对 “通常接 受的值” 的引用。
结果
程序 “Buffalo” 以 Visual C++ 编写，并且可在 Windows 中运行，以在高达 1M 的离子强度处准确计算缓冲剂 pH。
程序的结构
可在两种模式中运行程序 “Buffalo”：设计模式和计算 _pH 模式。 设计模式用 于实验的设计和理论滴定曲线的计算，可在实验的设计之前使用理论滴定曲线，以便确 定适当的 pH 范围。 计算 _pH 模式用于在给定一组成对的 pH 度量的情况下进行参数优 化。 两种模式中的程序的输入是缓冲剂体积 (buff_vol)、温度 (TT)、缓冲剂浓度 (buff_ conc)、盐浓度 (salt_conc)、缓冲物质 (buff_choice) 和滴定物质 (titrate_choice)。 除此 之外，在设计模式中，需要期望的 pH(pH) 作为输入，而在计算 _pH 模式中，需要实验 pH(pHExp)、对应的复制 (pHExp1) 和用于实验中的滴定剂的摩尔数量 ( 滴定 _ 摩尔 _ 实验 )。 此外，在两种模式中，可行的是考虑一定数量 (n_buffs ＝ 1，2 或 3) 的缓冲剂 buff_choice(1)、 buff_choice(2)、 buff_choice(3) 的混合，而非由单种缓冲物质组成的缓 冲剂 ( 已经针对最大数量的三种缓冲物质实现了该程序，但是该程序可容易地修改成包 括更多种缓冲物质 )。 在这种情况下，对应的缓冲剂浓度应当提供为 buff_conc(1)，buff_ conc(2)， buff_conc(3)。
一元缓冲剂 vs 多元缓冲剂
可用亨德森 - 哈塞尔巴赫方程 ( 方程 1.3 或方程 1.7) 来预测一元缓冲剂的 pH。
碱物类和酸物类的浓度通过缓冲剂浓度和滴定剂浓度确定。 在给定这些和一元 缓冲剂的 pKa 的情况下，可获得 ( 对应于计算 pH 模式 )pH，或者，在给定期望 pH 和缓 冲剂浓度的情况下，可获得滴定剂的摩尔量 ( 对应于设计模式 )。 当许多使用的缓冲剂是 多元的时候，即它们的缓冲剂分子可接受和释放对应于不止一个 pKa 值的不止一个质子 时，可引起复杂化。 这种缓冲剂系统中的物类的数量始终比 pKa 值的数量 (nr_of_pKa) 大 一。 为了简化程序的实现，实现了三托品 (tritropic) 缓冲剂的一般模型 ( 甚至更多个 pKa 值的扩展应当是直接的，但并非不重要的，并且必须实现 )。定义了四种质子化状态或物 类 (s1、 s2、 s3 和 s4)，但是参数 nr_of_pKa( 其可为 1、2 或 3) 限制了计算，使得对于例 如一元缓冲剂， s1 对应于酸性物类， s2 对应于碱性物类，而 s3 和 s4 的浓度设定为 0。
两种模式之间的差异和相似性
两种模式使用实质上相同的方法来工作 - 即，求解在给定缓冲剂浓度处获得给 定的 pH 需要的滴定剂的摩尔量。 在这样做之前，需要求解可能的数量的质子化状态 ( 或 物类 ) 中的各个中的缓冲剂的摩尔量。 模式之间的差异在于，在设计模式中，过程仅进 行两次 (kmax ＝ 2) ：一次针对期望的 pH，而另一次针对 pH+pH_step( 见下文 )，以便在数字上估计缓冲容量。 然后，针对期望的 pH 获得的滴定剂的摩尔量是设计模式的输出。 另一方面，在计算 pH 模式中，在整个 pH 尺度上重复该过程 (1-13，kmax ＝ 2600)，产生 与实验中使用的滴定剂的摩尔量最一致的滴定剂的摩尔量的 pH 值是计算的 pH 值。 pH_ step(0.005) 限制了 pH 和缓冲容量计算的精度。 发现有利的是在两种模式中使用相同的 算法，因为这样会使误差和不必要的差异最小化。
平衡方程
各个质子化物类中的摩尔量的计算等于利用具有多一个和 / 或少一个质子的 “相邻” 的物类且利用氢原子浓度 (pH) 来求解各个物类的平衡方程。 换句话说，直接 从方程 1.7 推导出三个方程 ( 对应于三个 pKa 值 )
xx[i] ＝ 10^(pH-pKaprime[i]) 方程 3.1
其中，各个 i 对应于各个 pKa(i) 值 (i ＝ 1，2，3)，而 xx[i] 是对应的碱和对应的 酸的浓度之间的比例，即， xx[1] ＝ [s2]/[s1]， xx[2] ＝ [s3]/[s2]， xx[3] ＝ [s4]/[s3]。
除了这三个方程之外，因为质量守恒而产生方程式 ：
[s1]+[s2]+[s3]+[s4] ＝ buff_conc 方程 3.2
且因为电荷守恒而产生方程式 [H+]-[OH-]+∑spec_chrg(si)-titrant_charge*[titrant]
spec_chrg(start_species)*[start_species] ＝ 0 方程 3.3
通过起始物类 (start species) 来表示在混合前的缓冲物质的物类，即在罐或储备 溶液中的缓冲剂的质子化状态。 这个质子化状态通过每个缓冲剂分子的抗衡离子的量确 定，因为宏观目标，罐或储备溶液必须是电中性的。 [OH-] 前面的负号是由于 OH 离子的 电荷的负号的原因，而两个最后项前面的负号分别是由于滴定剂和起始物类的抗衡离子 的电荷的原因。
最后，水离解平衡方程
[OH-][H+] ＝ 10-14 方程 3.4
方程 3.1-3.4 意味着，对于 3 个 pKa 值的情况，存在具有六个未知数 ( 四个 [si]、 [OH ] 和 [H+]) 的六个方程。 在这里实现求解的方式中，假设 pH 为已知，之后是 [H+]， 并且通过方程 3.4 配平 [OH-]，并且作为代替，将求解的是滴定剂浓度。 五个剩下的方程 对应于五个未知数 ( 四个 [si] 和 [titrant])。
滴定剂的摩尔量的计算
一旦已知在平衡状态下的各个物类 [si] 的浓度，就可使用方程 3.3 来求解滴定剂 浓度。 取决于滴定剂的类型，存在要考虑强酸 / 碱和对应的酸 / 碱的两种情况。 但是， 不管是哪种情况下，在方程 3.3 中求解滴定剂浓度得到
[titrant] ＝ (-[H+]+[OH-]-∑spec_chrg(si)*[si]+
spec_chrg(start_species)*[start_species])/proton_step 方程 3.10 其中
proton_step ＝ -titrant_charge( 强酸 / 碱 ) 方程 3.11a 或
proton_step ＝ spec_charge(start_species)-titrant_charge( 对应的酸 / 碱 ) 方程 3.11b
换句话说，对于 HCl，参数 proton_step 为 -1，而对于 NaOH，为 +1，在弱酸或 碱滴定剂的情况下，滴定剂的 proton_step 根据方程 3.11b 或下面的等价方程而取决于缓冲 剂的起始物类 ：
proton_step ＝ titr_species-start_species 方程 3.12
这个过程重复许多次，只要存在缓冲剂组分，并且最终的 titrate_mol 是来自各个 组分的滴定剂的摩尔量的和 ( 见下文 )。
在大多数情况下 (pH 在约 3.5 和 10.5 之间 )， [H+]( 在低 pH 值处 ) 或 [OH-]( 在 高 pH 值处 ) 对电荷平衡的贡献可忽略，并且可在方程 3.10 中设定为零。
滴定剂的选择
滴定剂可为强性的 (HCl 或 NaOH)。 这两者之间的唯一差别是它们贡献的质子 的数量的标号。 另外，滴定剂可为弱性的，在这种情况下，应当提供滴定剂质子化状态 ( 在罐或储备溶液中 )。 或者，可给出酸性质子的数量。 这两者之间的关系是
titr_species ＝ Nr_of_pKa+1-Nr_of_Acidic_Protons 方程 3.13
离子强度迭代循环
当根据所有离子的浓度计算离子强度时，必须在准确计算离子强度之前知道这 些浓度。 但是，这些浓度本身是来自平衡方程的解的输出，平衡方程需要 pKaprime[i]， 并且 pKaprime[i] 又是根据 pKa( 所谓的在 25℃和 0 离子强度处的热力学 pKa 值 )、温度 和离子强度来计算的。 因此，必须执行迭代过程。 在这种过程的第一阶段，仅将离子强 度设定成等于盐浓度。 在第二个迭代步骤中，使用了从第一次循环获得的离子强度，等 等。 发现这个过程非常迅速地收敛。 例如，发现五次迭代就远远不止足以获得期望精度 ( 数据未显示 )。 因此，对于所有情况，迭代数量设定为 5。
在离子强度的计算中的分开的电荷
发现在计算具有不只一个电荷且其中电荷被良好地分开 ( 如在电荷之间具有 4 个和 5 个碳原子的柠檬酸盐离子的情况下那样 ) 的离子的离子强度时，获得了好得多的 精度 ( 如果将电荷看作分开的而非单个点电荷的话 )。 这导致标记变量 separate_charge 的引入，对于柠檬酸盐， separate_charge 设定为真，而对于所考虑的所有其它缓冲剂， separate_charge 设定为假。
对缓冲剂组分的数量、缓冲剂参数的循环
对于各个缓冲剂物类，需要以下参数。 缓冲物质的质量 (Mbuff)，pKa 值的数量 (No of_pKa)、pKa 值 (pKa[i])、各个 pKa 值对温度的依赖的值 (dpKadT[i])，最基本的形 式的电荷 (be) 以及罐或储备溶液中的缓冲剂质子化状态 (start_species)。 或者，可给出 酸性质子的数量。 这两者之间的关系是
start species ＝ Nr of pKa+1-Nr of Acidic Protons 方程 3.14
除了这些之外，还需要离子强度修正参数 (konst， shellpos andshellneg)。
滴定剂的总摩尔数 (titrate_mol) 等于各个缓冲剂组分所需的滴定剂的摩尔数的 和，以便在期望的 pH 处建立平衡，而且，使用这个循环来计算这个和。 在循环期间计算 的其它和是各个缓冲剂组分的抗衡离子的数量，以及还有在平衡状态下的各个组分对离 子强度的贡献。 对不同的质子化状态的循环、 pKa 的温度修正
对于各个质子化状态，计算了以下中的各个 ：电荷 (spec_chrg[j])、电荷的平方 (qsq[j])、外层 (shell[j])、常量 (konst[j]) 和温度修正后的 pKa 值 (pKaT[j])。 后者根据以 下公式计算
pKaT ＝ pKa[i]+(TT-25)*dpKadT[i] 方程 3.15其中，TT 是以摄氏度为单位的温度。 还计算了仅依赖于质量的离子大小参数 α 的部分 aaa[i]( 我们可称之为非水合半径 aaa[i])
aaa[i] ＝ konst[i]*(Mbuff)1/3 方程 3.16
对 pKa 值的循环、 pKa′的计算
根据以下公式计算对应于各个 pKa 值的酸性和碱性物类的活度系数 ( 或更确切地 讲，它们的对数 )。
logfiBase ＝ -A*(qsq[i+1])*rool/(1+0.33*(aaa[i+1]+shell[i+1])*rootI)
方程 3.17a
logfiAcid ＝ -A*(qsq[i])*rootI/(1+0.33*(aaa[i]+shell[i])*rootI)
方程 3.17b
其中，root1 是离子强度的平方根。 方程 1 的参数 α 对应于数量 aaa[j]+shell[j]。
根据这些活度系数， pKaprimes 计算为
pKaprime[i] ＝ pKaT+logfiBase-logfiAcid 方程 3.18
[H+] 和 [OH-] 对电荷平衡的影响
在非常低和非常高的 pH 值处，[H+]( 在低 pH 值处 ) 或 [OH-]( 在高 pH 值处 ) 对 电荷平衡的贡献不再是可忽略的。 因此，由于 [H+] 和 [OH-] 的原因而包括对 titrate_mol 的修正的可行性在版本 5.07 和以后的版本中实现，尤其当对于低 pH 范围 ( 低于 2.5) 中的 磷酸盐缓冲剂，始终观测到计算值和测得值之间的差异时。 这实现成使得通过添加两项 来在对缓冲剂组分的数量循环结束时修正滴定剂的摩尔量 ：用以电中和 [H+] 的
-10^-{pH}/(proton_step*buff_vol)
和用以电中和 [OH-] 的
+10^{pH-14}/(proton_step*buff_vol)
计算值与实验值的比较
这里记录了总共 31 个缓冲剂系统 ( 标准滴定剂和 tirant( 滴定剂 ) 的组合 )。 已 经执行了约 2100 个实验，其中 817 个由于拒绝标准 (2.3 节 ) 的原因而被拒绝。 已经执 行了强酸 / 碱以及对应的酸 / 碱滴定以及两种缓冲剂混合。 在图 4 表 1 中记录了不是混 合物的缓冲剂系统的列表。 与根据 Guggenheim&Schindler( 方程 1.10) 的德拜 - 休克尔公 式解释相比以及还有与实验差异相比，在表中还呈现了应用这个方法 ( 程序 Buffalo 版本 6.00) 的结果的误差统计。 在表中显示的所有情况下，已经包括了由于 [H+] 和 [OH-] 的 贡献 ( 节 3.13) 而作出的修正。 仅在考虑低 pH 的情况下，这个修正才产生精度的较大改 进。 在剩余的情况下，差异是可忽略的。
仅呈现了非拒绝数据中的缓冲容量 (β) 的对数 ( 底为 10) 大于 -2 的结果。 作 为实验误差的估计，还包括来自根据两个不同的 pH 仪表的相同的缓冲剂混合物的两个度 量的均方根差 (r.m.s.e.)( 方程 2.1)。
缓冲剂混合物
考虑了两种混合物。 用于阳离子交换层析 (pH 2.5-7.2CIEX) 的混合物和用于阴 离子交换层析 (pH 5.3-9.5AIEX) 的混合物。
AIEX 混合物 (AIEX-mix) 通过混合 0.1M Tris 和 0.1M Bis-Tris 制成。 被测的 pH 范围是 5.3-9.5。 第一数据集组成单个 pH 度量。 第二 AIEX 数据集的 r.m.s.e. 是 0.08，所以它的序列中的 ( 不止 ) 一个被拒绝。
对于这个方法，第一数据集和第二数据集的非拒绝序列的结果是 27 个可能的值 中有 1 个在 0.1 限值 (r.m.s.e.0.06) 之外，与此相比，关于由于 Guggenheim&Schindler(r. m.s.e.0.10) 的原因而获得的离子强度修正，27 个中有 10 个可能偏出。
CIEX 混合物 (CIEX-mix) 通过混合 0.0375M Na2HPO4、0.0125Na-FORMATE 和 0.025M Na-ACETATE 来制成。 被测的 pH 范围是 2.5-7.2。 实验 r.m.s.e 是 0.02，104 个中 有 0 个可能的 (NrOK) 大于 0.1 的差异。 对于这个方法，pH 计算的结果是 104 个中有 4 个 可能在 0.1 限值以外的值 (r.m.s.e.0.05)，与此相比，对于由于 Guggenheim&Schindler(0.1) 的原因而获得的离子强度修正，102 个中有 36 个可能偏出。
实例 2
材料 / 研究的单元
如实例 1 中的那样。
方法
使用了 visual C++ 的版本 4.2。
结果
程序″ Buffalo+ ″以 Visual C++ 编写，并且可在 Windows 中运行，以在高达 1M( 对于以下缓冲剂系统 ：磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐和缓冲生理盐水 (Tris)) 的离子强 度和缓冲剂浓度处准确计算缓冲剂 pH。
程序结构
如实例 1 那样，还有一个补充 ：该程序还可在第三种模式 “优化参数” 中运 行，第三种模式用来使用牛顿 - 拉夫逊 (Newton Raphson) 方法来同时优化参数 ( 各个缓 冲剂系统的带不同电荷的物类的半径 )。
一元缓冲剂 vs 多元缓冲剂
如实例 1 中的那样。
模式之间的差异和相似性
如实例 1 那样，但是计算 _pH 模式和优化参数模式 kmax ＝ 3。
滴定剂的选择
如实例 1 中的那样。
离子强度迭代循环
如实例 1 中的那样。
对缓冲剂组分的数量、缓冲剂参数的循环
如实例 1 中的那样。
对 pKa 值的循环、 pKa 的温度修正和 pKa′的计算
根据以下公式，计算对应于各个 pKa 值的酸性物类和碱性物类的活度系数 ( 或更 确切地讲是它们的对数 )
logfiBase ＝ -A(qsq[i+1])*rootI/(1+0.33*ion_rad*rootI)
logfiAcid ＝ -A(qsq[i])*rootI/(1+0.33*ion_rad*rootI)
其中， rootI 是离子强度的平方根。 qsq[i] 和 qsq[i+1] 是分别对应于 pKa 值的酸 和碱的电荷的平方。pKaT ＝ pKa[i]+(TT-25)*dpKadT[i]
其中，TT 是以摄氏度为单位的温度，而 dpKadT[i] 是在考虑 pKa[i] 的情况下 pKa 值的温度系数。
pKaprime[i] ＝ pKaT+logfiBase-logfiAcid。
平衡方程
如实例 1 中的那样。
离子大小参数的计算
如所描述的那样，这个计算为各个物类的半径的离子强度加权平均。 表 2 显示 了磷酸盐、柠檬酸盐和醋酸盐缓冲剂系统中的物类的确立的离子大小参数 ai，以及 NaCl 的相关联的离子大小参数 ai。 在表 2 中，仅列出了带电荷的物类的离子大小参数，并且 “离子大小 2” 指的是最低电荷的离子物类。 因此， “离子大小 1” 将指的是非离子 物类，但是因为这样的物类的电荷为零，它们不对总的离子大小参数 α 有贡献，如上所 述。 因为醋酸盐是一元酸，所以仅列出了一个单个 ai 值。 如上所述，已经发现，至少一 些盐 ( 例如 NaCl) 的离子大小参数 ai 取决于在表 2 中显示的缓冲剂系统。
表2
滴定剂的摩尔量的计算
如实例 1 中的那样。
[H+] 和 [OH-] 对电荷平衡的影响
如实例 1 中的那样。
计算值与实验值的比较
图 5 显示了 155pH 度量 vs 使用 Buffalo+ 计算的对应的预测值的图示。 所研究的 缓冲剂系统包括磷酸盐、柠檬酸盐和醋酸盐。