丙型肝炎病毒抑制剂 对相关申请的交叉参考 本申请要求 2008 年 5 月 15 日提交的美国临时申请 61/053,477 的优先权。技术领域
本发明大体涉及抗病毒化合物， 更具体涉及对由丙型肝炎病毒 (HCV) 编码的 NS3 蛋白酶 ( 本申请也称作 “丝氨酸蛋白酶” ) 的功能进行抑制的化合物、 包含所述化合物的组 合物及对 NS3 蛋白酶的功能进行抑制的方法。背景技术
HCV 是主要的人类病原体， 其在世界范围内感染约一亿七千万人 - 大致是 1 型人类 免疫缺陷病毒感染数量的 5 倍。这些 HCV 感染个体中相当大的部分发展成严重的进行性肝 脏疾病， 包括肝硬化和肝细胞癌。 目前， 最有效的 HCV 疗法使用 α- 干扰素和利巴韦林的组合， 其在 40％的患者中 产生持续的效果。最新的临床结果证明， 作为单一疗法， PEG 化的 α- 干扰素优于未修饰的 α- 干扰素。然而， 即使就涉及 PEG 化 α- 干扰素和利巴韦林组合的实验性治疗方案而言， 相当多的患者也没有出现病毒载量的持续减少。因此， 就开发用于治疗 HCV 感染的有效疗 法而言， 存在明显和迫切的需要。
HCV 是正链 RNA 病毒。基于对所推断氨基酸序列进行的比较和 5’ - 非翻译区的广 泛相似性， 已经将 HCV 归类为黄病毒科 (Flaviviridae family) 中独立的属。黄病毒科的 所有成员都具有包封的病毒体 (enveloped virion)， 其含有的正链 RNA 基因组通过翻译单 一的连续的可读框而编码所有已知的病毒专属性蛋白质。
在整个 HCV 基因组的核苷酸序列和所编码的氨基酸序列中发现了相当程度的异 质性。已经表征了至少 6 种主要的基因型， 且已经描述了多于 50 种的亚型。HCV 的主要基 因型在世界范围内的分布是不同的， 且 HCV 遗传异质性的临床重要性仍然是难以确定的， 尽管对基因型对发病和治疗的可能影响进行了大量的研究。
单链 HCV RNA 基因组的长度为约 9500 个核苷酸， 且具有单一的可读框 (ORF)， 其编 码由约 3000 个氨基酸组成的单一的大的多蛋白。在被感染的细胞中， 这种多蛋白在多个位 点被细胞蛋白酶和病毒蛋白酶裂解， 从而产生结构蛋白和非结构 (NS) 蛋白。就 HCV 而言， 成熟的非结构蛋白 (NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A 和 NS5B) 的产生受到两种病毒蛋白酶的影 响。 认为第一种病毒蛋白酶在 NS2-NS3 接合处进行裂解 ； 第二种病毒蛋白酶是包含在 NS3 的 N- 端区域内的丝氨酸蛋白酶， 且介导 NS3 下游的所有随后裂解， 既在 NS3-NS4A 裂解位点以 顺式进行裂解， 又在其余的 NS4A-NS4B、 NS4B-NS5A、 NS5A-NS5B 位点以反式进行裂解。NS4A 蛋白似乎具有多种功能， 其充当 NS3 蛋白酶的辅因子， 且可能有助于 NS3 及其它病毒复制酶 组分的膜定位。NS3 蛋白与 NS4A 形成复合物， 这是在所有位点进行高效多蛋白加工从而促 进蛋白质水解所必须的。NS3 蛋白还显示出三磷酸核苷酶和 RNA 解螺旋酶活性。NS5B 是依 赖于 RNA 的 RNA 聚合酶， 在 HCV 的复制中涉及所述酶。
发明内容 本发明提供了可对 NS3 蛋白酶 ( 例如与 NS4A 蛋白酶组合 ) 的功能进行抑制的肽 化合物。此外， 本发明描述了对患者进行联合治疗， 其中可有效抑制 HCV NS3 蛋白酶的本发 明化合物可与一种或者两种具有抗 HCV 活性的额外化合物一起给药。
在第一个方面， 本发明提供了式 (I) 的化合物或者其药用盐 ：
其中
m 为 1、 2 或者 3 ； 1
R 选自羟基和 -NHSO2R6 ； 其中 R6 选自烷基、 芳基、 环烷基、 ( 环烷基 ) 烷基、 杂环基 a b 和 -NR R ， 其中所述烷基、 所述环烷基及所述 ( 环烷基 ) 烷基中的环烷基部分任选取代有选 自下述的一、 二或者三个取代基 ： 烯基、 烷氧基、 烷氧基烷基、 烷基、 芳基烷基、 芳基羰基、 氰 e f 基、 环烯基、 ( 环烷基 ) 烷基、 卤素、 卤代烷氧基、 卤代烷基和 (NR R ) 羰基 ； 2
R 选自氢、 烯基、 烷基和环烷基， 其中所述烯基、 烷基和环烷基任选取代有卤素 ； 3
R 选自烯基、 烷氧基烷基、 烷氧基羰基烷基、 烷基、 芳基烷基、 羧基烷基、 氰基烷基、 c d 环烷基、 ( 环烷基 ) 烷基、 卤代烷氧基、 卤代烷基、 ( 杂环基 ) 烷基、 羟基烷基、 (NR R ) 烷基和 e f (NR R ) 羰基烷基 ；
R4 选自苯基和五元或者六元部分不饱和或者完全不饱和环基， 所述环基任选含有 选自氮、 氧和硫的一、 二、 三或者四个杂原子 ； 其中所述环各自任选取代有独立选自下述的 一、 二、 三或者四个取代基 ： 烷氧基、 烷氧基羰基、 烷基、 烷基羰基、 烷基硫基、 羧基、 氰基、 环 c d e f e f 烷基、 环烷基氧基、 卤素、 卤代烷基、 卤代烷氧基、 -NR R 、 (NR R ) 羰基、 (NR R ) 磺酰基和氧 4 代； 条件是当 R 为取代的六元环基时， 所述环上除了氟之外的所有取代基相对于所述环与
母体分子部分的连接点必须在间位和 / 或者对位 ；
R5 选自烷基羰基、 芳基、 芳基烷基、 芳基烷基羰基、 芳基羰基、 杂环基、 杂环基烷 g h 基、 杂环基烷基羰基、 杂环基羰基和 (NR R ) 羰基， 其中所述芳基， 所述芳基烷基、 芳基烷 基羰基和芳基羰基中的芳基部分， 所述杂环基， 及所述杂环基烷基和杂环基烷基羰基中的 7 杂环基部分各自任选取代有一至六个 R 基团 ； 条件是当 R5 为杂环基时， 所述杂环基不是每个 R7 独立选自烷氧基、 烷氧基羰基、 烷基、 烷基羰基、 芳基、 羧基、 氰基、 氰基烷 c d 基、 环烷基、 卤素、 卤代烷基、 卤代烷氧基、 杂环基、 羟基、 羟基烷基、 硝基、 -NR R 、 (NRcRd) 烷 基、 (NRcRd) 烷氧基、 (NReRf) 羰基和 (NReRf) 磺酰基 ； 或者 7
两个相邻的 R 基团与它们所连接的碳原子一起形成四至七元部分不饱和或者完 全不饱和环基， 所述环基任选含有独立选自氮、 氧和硫的一个或者两个杂原子， 其中所述环 基任选取代有独立选自下述的一、 二或者三个基团 ： 烷氧基、 烷基、 氰基、 卤素、 卤代烷氧基 和卤代烷基 ；
Ra 和 Rb 独立选自氢、 烷氧基、 烷基、 芳基、 芳基烷基、 环烷基、 ( 环烷基 ) 烷基、 杂环 a b 基和杂环基烷基 ； 或者 R 和 R 与它们所连接的氮原子一起形成四至七元单环杂环基团 ； c d
R 和 R 独立选自氢、 烷氧基烷基、 烷氧基羰基、 烷基、 烷基羰基、 芳基烷基和卤代烷 基；
Re 和 Rf 独立选自氢、 烷基、 芳基、 芳基烷基和杂环基 ； 其中所述芳基、 所述芳基烷基 中的芳基部分及所述杂环基任选取代有独立选自烷氧基、 烷基和卤素的一个或者两个取代 基； 且
Rg 和 Rh 独立选自氢、 烷基、 芳基、 芳基烷基、 环烷基、 ( 环烷基 ) 烷基、 杂环基和杂环 g h 基烷基 ； 或者 R 和 R 与它们所连接的氮原子一起形成单环杂环基团， 其中所述单环杂环基 团任选与苯环基团稠合以形成二环系统 ； 其中所述单环杂环基团和二环系统任选取代有独 立选自下述的一、 二或者三个取代基 ： 烷氧基、 烷基、 卤素、 卤代烷氧基和卤代烷基。
在第一个方面的第一个实施方案中， 本发明提供了式 (I) 的化合物或者其药用 1 6 盐， 其中 R 为 -NHSO2R 。
在第一个方面的第二个实施方案中， 本发明提供了式 (I) 的化合物或者其药用 盐， 其中
m 为 1 或者 2 ；
R1 为 -NHSO2R6 ； 其中 R6 选自烷基、 芳基、 环烷基、 ( 环烷基 ) 烷基、 杂环基和 -NRaRb， 其中所述烷基、 所述环烷基及所述 ( 环烷基 ) 烷基中的环烷基部分任选取代有选自下述的 一、 二或者三个取代基 ： 烯基、 烷氧基、 烷氧基烷基、 烷基、 芳基烷基、 芳基羰基、 氰基、 环烯 e f 基、 ( 环烷基 ) 烷基、 卤素、 卤代烷氧基、 卤代烷基和 (NR R ) 羰基 ； 2
R 选自烯基、 烷基和环烷基， 其中所述烯基、 烷基和环烷基任选取代有卤素 ； 3
R 选自烯基和烷基 ；
R4 选自苯基和五元或者六元部分不饱和或者完全不饱和环基， 所述环基任选含有 选自氮、 氧和硫的一、 二、 三或者四个杂原子 ； 其中所述环各自任选取代有独立选自下述的 一、 二、 三或者四个取代基 ： 烷氧基、 烷氧基羰基、 烷基、 烷基羰基、 烷基硫基、 羧基、 氰基、 环 c d e f e f 烷基、 环烷基氧基、 卤素、 卤代烷基、 卤代烷氧基、 -NR R 、 (NR R ) 羰基、 (NR R ) 磺酰基和氧 4 代； 条件是当 R 为取代的六元环基时， 所述环上除了氟之外的所有取代基相对于所述环与 母体分子部分的连接点必须在间位和 / 或者对位 ；
R5 选自烷基羰基、 芳基、 芳基烷基、 芳基烷基羰基、 芳基羰基、 杂环基、 杂环基烷 g h 基、 杂环基烷基羰基、 杂环基羰基和 (NR R ) 羰基， 其中所述芳基， 所述芳基烷基、 芳基烷 基羰基和芳基羰基中的芳基部分， 所述杂环基， 及所述杂环基烷基和杂环基烷基羰基中的 7 杂环基部分各自任选取代有一至六个 R 基团 ； 条件是当 R5 为杂环基时， 所述杂环基不是每个 R7 独立选自烷氧基、 烷氧基羰基、 烷基、 烷基羰基、 芳基、 羧基、 氰基、 氰基烷 基、 环烷基、 卤素、 卤代烷基、 卤代烷氧基、 杂环基、 羟基、 羟基烷基、 硝基、 -NRcRd、 (NRcRd) 烷 基、 (NRcRd) 烷氧基、 (NReRf) 羰基和 (NReRf) 磺酰基 ； 或者
两个相邻的 R7 基团与它们所连接的碳原子一起形成四至七元部分不饱和或者完 全不饱和环基， 所述环基任选含有独立选自氮、 氧和硫的一个或者两个杂原子， 其中所述环 基任选取代有独立选自下述的一、 二或者三个基团 ： 烷氧基、 烷基、 氰基、 卤素、 卤代烷氧基 和卤代烷基 ；
Ra 和 Rb 独立选自氢、 烷氧基、 烷基、 芳基、 芳基烷基、 环烷基、 ( 环烷基 ) 烷基、 杂环 a b 基和杂环基烷基 ； 或者 R 和 R 与它们所连接的氮原子一起形成四至七元单环杂环基团 ；
Rc 和 Rd 独立选自氢、 烷氧基烷基、 烷氧基羰基、 烷基、 烷基羰基、 芳基烷基和卤代烷 基；
Re 和 Rf 独立选自氢、 烷基、 芳基、 芳基烷基和杂环基 ； 其中所述芳基、 所述芳基烷基 中的芳基部分及所述杂环基任选取代有独立选自烷氧基、 烷基和卤素的一个或者两个取代 基； 且
Rg 和 Rh 独立选自氢、 烷基、 芳基、 芳基烷基、 环烷基、 ( 环烷基 ) 烷基、 杂环基和杂环 基烷基 ； 或者 Rg 和 Rh 与它们所连接的氮原子一起形成单环杂环基团， 其中所述单环杂环基 团任选与苯环基团稠合以形成二环系统 ； 其中所述单环杂环基团和二环系统任选取代有独 立选自下述的一、 二或者三个取代基 ： 烷氧基、 烷基、 卤素、 卤代烷氧基和卤代烷基。
在第一个方面的第三个实施方案中， 本发明提供了式 (I) 的化合物或者其药用 盐， 其中
m 为 1 或者 2 ；
R1 为 -NHSO2R6 ； 其中 R6 为未取代的环烷基 ；
R2 选自烯基、 烷基和环烷基， 其中所述烯基、 烷基和环烷基任选取代有卤素 ；
R3 选自烯基和烷基 ；
R4 选自苯基和五元或者六元部分不饱和或者完全不饱和环基， 所述环基任选含有 选自氮、 氧和硫的一、 二、 三或者四个杂原子 ； 其中所述环各自任选取代有独立选自下述的 一、 二、 三或者四个取代基 ： 烷氧基、 烷氧基羰基、 烷基、 烷基羰基、 烷基硫基、 羧基、 氰基、 环 烷基、 环烷基氧基、 卤素、 卤代烷基、 卤代烷氧基、 -NRcRd、 (NReRf) 羰基、 (NReRf) 磺酰基和氧 代； 条件是当 R4 为取代的六元环基时， 所述环上除了氟之外的所有取代基相对于所述环与 母体分子部分的连接点必须在间位和 / 或者对位 ；
R5 选自烷基羰基、 芳基、 芳基烷基、 芳基烷基羰基、 芳基羰基、 杂环基、 杂环基烷 基、 杂环基烷基羰基、 杂环基羰基和 (NRgRh) 羰基， 其中所述芳基， 所述芳基烷基、 芳基烷 基羰基和芳基羰基中的芳基部分， 所述杂环基， 及所述杂环基烷基和杂环基烷基羰基中的 杂环基部分各自任选取代有一至六个 R7 基团 ； 条件是当 R5 为杂环基时， 所述杂环基不是
每个 R7 独立选自烷氧基、 烷氧基羰基、 烷基、 烷基羰基、 芳基、 羧基、 氰基、 氰基烷 基、 环烷基、 卤素、 卤代烷基、 卤代烷氧基、 杂环基、 羟基、 羟基烷基、 硝基、 -NRcRd、 (NRcRd) 烷 基、 (NRcRd) 烷氧基、 (NReRf) 羰基和 (NReRf) 磺酰基 ； 或者
两个相邻的 R7 基团与它们所连接的碳原子一起形成四至七元部分不饱和或者完 全不饱和环基， 所述环基任选含有独立选自氮、 氧和硫的一个或者两个杂原子， 其中所述环 基任选取代有独立选自下述的一、 二或者三个基团 ： 烷氧基、 烷基、 氰基、 卤素、 卤代烷氧基 和卤代烷基 ；
Ra 和 Rb 独立选自氢、 烷氧基、 烷基、 芳基、 芳基烷基、 环烷基、 ( 环烷基 ) 烷基、 杂环 a b 基和杂环基烷基 ； 或者 R 和 R 与它们所连接的氮原子一起形成四至七元单环杂环基团 ；
Rc 和 Rd 独立选自氢、 烷氧基烷基、 烷氧基羰基、 烷基、 烷基羰基、 芳基烷基和卤代烷 基；
Re 和 Rf 独立选自氢、 烷基、 芳基、 芳基烷基和杂环基 ； 其中所述芳基、 所述芳基烷基 中的芳基部分及所述杂环基任选取代有独立选自烷氧基、 烷基和卤素的一个或者两个取代 基； 且
Rg 和 Rh 独立选自氢、 烷基、 芳基、 芳基烷基、 环烷基、 ( 环烷基 ) 烷基、 杂环基和杂环 基烷基 ； 或者 Rg 和 Rh 与它们所连接的氮原子一起形成单环杂环基团， 其中所述单环杂环基 团任选与苯环基团稠合以形成二环系统 ； 其中所述单环杂环基团和二环系统任选取代有独 立选自下述的一、 二或者三个取代基 ： 烷氧基、 烷基、 卤素、 卤代烷氧基和卤代烷基。
在第一个方面的第四个实施方案中， 本发明提供了式 (I) 的化合物或者其药用 盐， 其中
m为1；
R1 为 -NHSO2R6 ； 其中 R6 为未取代的环烷基 ；
R2 为烯基 ；
R3 为烷基 ；
R4 选自苯基和五元或者六元部分不饱和或者完全不饱和环基， 所述环基任选含有 选自氮、 氧和硫的一、 二、 三或者四个杂原子 ； 其中所述环各自任选取代有独立选自下述的 一、 二或者三个取代基 ： 烷氧基、 烷氧基羰基、 烷基、 烷基羰基、 羧基、 氰基、 环烷基、 环烷基氧 基、 卤素、 卤代烷基、 卤代烷氧基、 -NRcRd、 (NReRf) 羰基、 (NReRf) 磺酰基和氧代 ； 条件是当 R4 为取代的六元环基时， 所述环上除了氟之外的所有取代基相对于所述环与母体分子部分的 连接点必须在间位和 / 或者对位 ；
R5 选自杂环基和 (NRgRh) 羰基， 其中所述杂环基任选取代有一至六个 R6 基团 ； 条件
是 R5 不是每个 R6 独立选自烷氧基、 芳基和杂环基 ；
Rc 和 Rd 独立选自氢、 烷氧基羰基、 烷基、 烷基羰基和芳基烷基 ； e f
R 和 R 独立选自氢、 烷基、 芳基和芳基烷基 ； 且
Rg 和 Rh 与它们所连接的氮原子一起形成单环杂环基团， 所述单环杂环基团与苯环 基团稠合以形成二环系统 ； 其中所述二环系统取代有卤素基团。
在第一个方面的第五个实施方案中， 本发明提供了式 (I) 的化合物或者其药用 盐， 其中
m为1；
R1 为 -NHSO2R6 ； 其中 R6 为未取代的环烷基 ；
R2 为烯基 ；
R3 为烷基 ；
R4 为含有一个氮原子的六元不饱和环基， 其中所述环任选取代有独立选自下述的 一、 二或者三个取代基 ： 烷氧基、 烷氧基羰基、 烷基、 烷基羰基、 羧基、 氰基、 环烷基、 环烷基氧 基、 卤素、 卤代烷基、 卤代烷氧基、 -NRcRd、 (NReRf) 羰基、 (NReRf) 磺酰基和氧代 ； 条件是所述环 上除了氟之外的所有取代基相对于所述环与母体分子部分的连接点必须在间位和 / 或者 对位 ；
R5 选自杂环基和 (NRgRh) 羰基， 其中所述杂环基任选取代有一至六个 R6 基团 ； 条件
是 R5 不是每个 R6 独立选自烷氧基、 芳基和杂环基 ； c d
R 和 R 独立选自氢、 烷氧基羰基、 烷基、 烷基羰基和芳基烷基 ； e f
R 和 R 独立选自氢、 烷基、 芳基和芳基烷基 ； 且 g h
R 和 R 与它们所连接的氮原子一起形成单环杂环基团， 所述单环杂环基团与苯环 基团稠合以形成二环系统 ； 其中所述二环系统取代有卤素基团。
在第一个方面的第六个实施方案中， 本发明提供了式 (I) 的化合物或者其药用 盐， 其中
m为1；
R1 为 -NHSO2R6 ； 其中 R6 为未取代的环烷基 ；
R2 为烯基 ；
R3 为烷基 ；
R4 为含有一个氮原子和一个硫原子的五元不饱和环基， 其中所述环任选取代有独
立选自下述的一、 二或者三个取代基 ： 烷氧基、 烷氧基羰基、 烷基、 烷基羰基、 羧基、 氰基、 环 c d e f e f 烷基、 环烷基氧基、 卤素、 卤代烷基、 卤代烷氧基、 -NR R 、 (NR R ) 羰基、 (NR R ) 磺酰基和氧 代；
R5 选自杂环基和 (NRgRh) 羰基， 其中所述杂环基任选取代有一至六个 R6 基团 ； 条件是 R5 不是每个 R6 独立选自烷氧基、 芳基和杂环基 ；
Rc 和 Rd 独立选自氢、 烷氧基羰基、 烷基、 烷基羰基和芳基烷基 ； e f
R 和 R 独立选自氢、 烷基、 芳基和芳基烷基 ； 且
Rg 和 Rh 与它们所连接的氮原子一起形成单环杂环基团， 所述单环杂环基团与苯环 基团稠合以形成二环系统 ； 其中所述二环系统取代有卤素基团。
在第二个方面， 本发明提供了一种组合物， 其包含式 (I) 的化合物或者其药用盐 及药用载体。在第二个方面的第一个实施方案中， 所述组合物还包含至少一种具有抗 HCV 活性的额外化合物。在第二个方面的第二个实施方案中， 所述额外化合物中的至少一种为 干扰素或者利巴韦林。在第二个方面的第三个实施方案中， 所述干扰素选自干扰素 α2B、 PEG 化的干扰素 α、 同感干扰素 (consensus interferon)、 干扰素 α2A 和淋巴细胞样干扰 素 τ。
在第二个方面的第四个实施方案中， 本发明提供了一种组合物， 其包含式 (I) 的 化合物或者其药用盐、 药用载体及至少一种具有抗 HCV 活性的额外化合物 ； 其中所述额外 化合物中的至少一种选自白细胞介素 2、 白细胞介素 6、 白细胞介素 12、 可提高 1 型辅助 T 细 胞应答发展的化合物、 干扰 RNA、 反义 RNA、 咪喹莫特 (Imiqimod)、 利巴韦林、 5’ - 单磷酸肌苷 脱氢酶抑制剂、 金刚烷胺和金刚乙胺。
在第二个方面的第五个实施方案中， 本发明提供了一种组合物， 其包含式 (I) 的 化合物或者其药用盐、 药用载体及至少一种具有抗 HCV 活性的额外化合物 ； 其中所述额外 化合物中的至少一种可有效抑制靶标的功能以治疗 HCV 感染， 所述靶标选自 HCV 金属蛋白 酶 (HCV metalloprotease)、 HCV 丝氨酸蛋白酶 (HCV serine protease)、 HCV 聚合酶 (HCV polymerase)、 HCV 解螺旋酶 (HCV helicase)、 HCV NS4B 蛋白 (HCV NS4B protein)、 HCV 进 入 (HCVentry)、 HCV 组装 (HCV assembly)、 HCV 释出 (HCV egress)、 HCV NS 5A 蛋白 (HCV NS5A protein) 和 IMPDH。
在第三个方面， 本发明提供了在患者中治疗 HCV 感染的方法， 其包括向所述患者 给药治疗有效量的式 (I) 的化合物或者其药用盐。在第三个方面的第一个实施方案中， 所 述方法还包括在给药式 (I) 的化合物或者其药用盐之前、 之后或者同时给药至少一种具有 抗 HCV 活性的额外化合物。在第三个方面的第二个实施方案中， 所述额外化合物中的至少 一种为干扰素或者利巴韦林。在第三个方面的第三个实施方案中， 所述干扰素选自干扰素 α2B、 PEG 化的干扰素 α、 同感干扰素、 干扰素 α2A 和淋巴细胞样干扰素 τ。
在第三个方面的第四个实施方案中， 本发明提供了在患者中治疗 HCV 感染的方
法， 其包括向所述患者给药治疗有效量的式 (I) 的化合物或者其药用盐及在给药式 (I) 的 化合物或者其药用盐之前、 之后或者同时给药至少一种具有抗 HCV 活性的额外化合物， 其 中所述额外化合物中的至少一种选自白细胞介素 2、 白细胞介素 6、 白细胞介素 12、 可提高 1 型辅助 T 细胞应答发展的化合物、 干扰 RNA、 反义 RNA、 咪喹莫特、 利巴韦林、 5’ - 单磷酸肌苷 脱氢酶抑制剂、 金刚烷胺和金刚乙胺。
在第三个方面的第五个实施方案中， 本发明提供了在患者中治疗 HCV 感染的方 法， 其包括向所述患者给药治疗有效量的式 (I) 的化合物或者其药用盐及在给药式 (I) 的 化合物或者其药用盐之前、 之后或者同时给药至少一种具有抗 HCV 活性的额外化合物， 其 中所述额外化合物中的至少一种可有效抑制靶标的功能以治疗 HCV 感染， 所述靶标选自 HCV 金属蛋白酶、 HCV 丝氨酸蛋白酶、 HCV 聚合酶、 HCV 解螺旋酶、 HCVNS4B 蛋白质、 HCV 进入、 HCV 组装、 HCV 释出、 HCVNS5A 蛋白和 IMPDH。
在第四个方面， 本发明提供了一种组合物， 其包含式 (I) 的化合物或者其药用盐， 一、 二、 三、 四或者五种具有抗 HCV 活性的额外化合物， 及药用载体。在第四个方面的第一个 实施方案中， 所述组合物包含三种或者四种具有抗 HCV 活性的额外化合物。在第四个方面 的第二个实施方案中， 所述组合物包含一种或者两种具有抗 HCV 活性的额外化合物。
在第五个方面， 本发明提供了在患者中治疗的 HCV 感染的方法， 其包括向所述患 者给药治疗有效量的式 (I) 的化合物或者其药用盐及在给药式 (I) 的化合物或者其药用盐 之前、 之后或者同时给药一、 二、 三、 四或者五种具有抗 HCV 活性的额外化合物。在第五个方 面的第一个实施方案中， 所述方法包括给药三种或者四种具有抗 HCV 活性的额外化合物。 在第五个方面的第二个实施方案中， 所述方法包括给药一种或者两种具有抗 HCV 活性的额 外化合物。
本发明其它方面可包括本申请所披露的实施方案的合适组合。
其它方面和实施方案可参见本申请所提供的说明书。
本发明说明书应该被解释为与化学键合法则和原理一致。 在一些情况下可能需要 的是， 为了使任何给定的位置适应取代基而除去氢原子。
应该理解的是， 本发明所包括的化合物是适于用作药物的稳定化合物。
应该理解的是， 在分子中具体位置的任何取代基或者变量的定义独立于所述取代 基或者变量在该分子中其它位置的定义。
将本说明书中引用的所有专利、 专利申请和参考文献完整引入本申请作为参考。 在不一致的情况下， 将以本发明 ( 包括定义 ) 为准。
本说明书中使用的以下术语具有下述意义 ：
除非上下文另有明确说明， 本申请使用的单数形式包括复数形式。
除非另有说明， 本发明所有芳基、 环烷基和杂环基可如在其相应定义中所各自描 述的那样被取代。例如， 芳基烷基中的芳基部分可如在术语 “芳基” 的定义中所描述的那样 被取代。
在一些情况下， 任何具体基团中碳原子的数目在表述所述基团前被指明。 例如， 术 语 “C6 烷基” 表示含有六个碳原子的烷基。当存在这样的指明时， 它们优先于本申请所含有 的所有其它定义。
除非上下文另有明确说明， 本申请使用的单数形式包括复数形式。本申请使用的术语 “烯基” 是指具有两个至六个碳原子且含有至少一个碳 - 碳双 键的直链或者支链基团。
本申请使用的术语 “烷氧基” 是指通过氧原子与母体分子部分相连的烷基。
本申请使用的术语 “烷氧基烷基” 是指取代有一、 二或者三个烷氧基的烷基。
本申请使用的术语 “烷氧基羰基” 是指通过羰基与母体分子部分相连的烷氧基。
本申请使用的术语 “烷氧基羰基烷基” 是指取代有一、 二或者三个烷氧基羰基的烷 基。
本申请使用的术语 “烷基” 是指由含有一个至十个碳原子的直链或者支链饱和烃 衍生的基团。
本申请使用的术语 “烷基羰基” 是指通过羰基与母体分子部分相连的烷基。
本申请使用的术语 “烷基硫基” 是指通过硫原子与母体分子部分相连的烷基。
本申请使用的术语 “芳基” 是指苯基或者其中一个或者两个环基是苯基的二环稠 合环系。二环稠合环系由与四元至六元芳族或者非芳族碳环稠合的苯基构成。本发明芳基 可通过所述基团中任何可取代的碳原子与母体分子部分相连。 芳基的代表性实例包括但不 限于茚满基、 茚基、 萘基、 苯基和四氢萘基。 本发明芳基可任选取代有一、 二、 三、 四或者五个 取代基， 所述取代基独立选自烷氧基、 烷氧基羰基、 烷基、 烷基羰基、 羧基、 环烷基、 环烷基氧 c d c d 基、 氰基、 卤素、 卤代烷氧基、 卤代烷基、 硝基、 -NR R 、 (NR R ) 羰基和氧代。
本申请使用的术语 “芳基烷基” 是指取代有一、 二或者三个芳基的烷基。 本申请使用的术语 “芳基烷基羰基” 是指通过羰基与母体分子部分相连的芳基烷基。 本申请使用的术语 “芳基羰基” 是指通过羰基与母体分子部分相连的芳基。
本申请使用的术语 “羰基” 是指 -C(O)-。
本申请使用的术语 “羧基” 是指 -CO2H。
本申请使用的术语 “羧基烷基” 是指取代有一、 二或者三个羧基的烷基。
本申请使用的术语 “氰基” 是指 -CN。
本申请使用的术语 “氰基烷基” 是指取代有一、 二或者三个氰基的烷基。
本申请使用的术语 “环烯基” 是指具有三个至十四个碳原子和 0 个杂原子的非芳 族的部分不饱和的单环、 二环或者三环环系。 环烯基的代表性实例包括但不限于环己烯基、 八氢萘基和降冰片烯基。
本申请使用的术语 “环烷基” 是指具有三个至十个碳原子和 0 个杂原子的饱和的 单环或者二环烃环系。环烷基的代表性实例包括但不限于环丙基、 环丁基和环戊基。
本申请使用的术语 “( 环烷基 ) 烷基” 是指被一、 二或者三个环烷基取代的烷基。
本申请使用的术语 “环烷基氧基” 是指通过氧原子与母体分子部分相连的环烷基。
本申请使用的术语 “卤代” 和 “卤素” 是指 F、 Cl、 Br 或者 I。
本申请使用的术语 “卤代烷氧基” 是指通过氧原子与母体分子部分相连的卤代烷 基。
本申请使用的术语 “卤代烷基” 是指被一、 二、 三或者四个卤素原子取代的烷基。
本申请使用的术语 “杂环基” 是指含有独立选自氮、 氧和硫的一、 二或者三个杂原 子的五、 六或者七元环。所述五元环具有 0 个至两个双键， 及所述六元和七元环具有 0 个至
三个双键。术语 “杂环基” 还包括二环基团， 其中所述杂环基环与四元至六元芳族或者非芳 族碳环或者另一个单环杂环基稠合。 本发明杂环基可通过所述基团中的碳原子或者氮原子 与母体分子部分相连。杂环基的实例包括但不限于苯并噻吩基、 呋喃基、 咪唑基、 二氢吲哚 基、 吲哚基、 异噻唑基、 异噁唑基、 吗啉基、 噁唑基、 哌嗪基、 哌啶基、 吡唑基、 吡啶基、 吡咯烷 基、 吡咯并吡啶基、 吡咯基、 噻唑基、 噻吩基和硫吗啉基。本发明杂环基可任选被一、 二、 三、 四或者五个取代基取代， 所述取代基独立选自烷氧基、 烷氧基羰基、 烷基、 烷基羰基、 羧基、 c d c d 环烷基、 环烷基氧基、 氰基、 卤素、 卤代烷氧基、 卤代烷基、 硝基、 -NR R 、 (NR R ) 羰基和氧代。
本申请使用的术语 “杂环基烷基” 是指被一、 二或者三个杂环基取代的烷基。
本申请使用的术语 “杂环基烷基羰基” 是指通过羰基与母体分子部分相连的杂环 基烷基。
本申请使用的术语 “杂环基羰基” 是指通过羰基与母体分子部分相连的杂环基。
本申请使用的术语 “羟基” 是指 -OH。
本申请使用的术语 “羟基烷基” 是指被一、 二或者三个羟基取代的烷基。
本申请使用的术语 “硝基” 是指 -NO2。 a b
本申请使用的术语 “-NR R ” 是指通过氮原子与母体分子部分相连的两个基团即 Ra 和 Rb。Ra 和 Rb 独立选自氢、 烷氧基、 烷基、 芳基、 芳基烷基、 环烷基、 ( 环烷基 ) 烷基、 杂环基 a b 和杂环基烷基 ； 或者 R 和 R 与它们所连接的氮原子一起形成五元或者六元单环杂环基团。
本申请使用的术语 “-NRcRd” 是指通过氮原子与母体分子部分相连的两个基团即 Rc 和 Rd。Rc 和 Rd 独立选自氢、 烷氧基羰基、 烷基和烷基羰基。 c d
本申请使用的术语 “(NR R ) 烷氧基”是指通过氧原子与母体分子部分相连的 c d (NR R ) 烷基。
本申请使用的术语 “(NRcRd) 烷基” 是指被一、 二或者三个 -NRcRd 基团取代的烷基。
本申请使用的术语 “(NRcRd) 羰基” 是指通过羰基与母体分子部分相连的 -NRcRd 基 团。
本申请使用的术语 “-NReRf” 是指通过氮原子与母体分子部分相连的两个基团即 Re 和 Rf。Re 和 Rf 独立选自氢、 烷基、 芳基和芳基烷基。 e f
本申请使用的术语 “(NR R ) 羰基” 是指通过羰基与母体分子部分相连的 -NReRf 基 团。
本申请使用的术语 “(NReRf) 羰基烷基”是指通过烷基与母体分子部分相连的 (NReRf) 羰基。
本申请使用的术语 “(NReRf) 磺 酰 基”是 指 通 过 磺 酰 基 与 母 体 分 子 部 分 相 连 的 -NReRf 基团。
本申请使用的术语 “(NRgRh) 羰基” 是指通过羰基与母体分子部分相连的 -NRgRh 基 团。
本申请使用的术语 “-NRgRh” 是指通过氮原子与母体分子部分相连的两个基团即 Rg 和 Rh。Rg 和 Rh 独立选自氢、 烷基、 芳基、 芳基烷基、 环烷基、 ( 环烷基 ) 烷基、 杂环基和杂环基 g h 烷基 ； 或者 R 和 R 与它们所连接的氮原子一起形成单环杂环基团， 其中所述单环杂环基团 任选与苯环基团稠合以形成二环系统 ； 其中所述单环杂环基团和二环系统任选取代有独立 选自下述的一、 二或者三个取代基 ： 烷氧基、 烷基、 卤素、 卤代烷氧基和卤代烷基。本申请使用的术语 “氧代” 是指＝ O。
本申请使用的术语 “磺酰基” 是指 -SO2-。
本申请使用的术语 “前药” 表示这样的化合物， 其通过在血液中水解而在体内快速 转化为母体化合物。本发明前药包括母体分子上羟基的酯、 母体分子上羧基的酯及母体分 子上氨基的酰胺。
本发明化合物可按药用盐形式存在。本申请使用的术语 “药用盐” 表示本发明化 合物的盐或者本发明化合物的两性离子形式， 所述盐或者两性离子形式是水溶性或者水可 分散的或者是油溶性或者油可分散的， 这些形式在合理的医药判断范围内适于与患者的组 织接触而不引起过度的毒性、 刺激性、 变态反应或者其它问题或者并发症， 这与合理的益处 / 风险比相称， 且所述盐或者两性离子形式就其预期的用途而言是有效的。 所述盐可在化合 物的最终分离和纯化期间来制备， 或者可通过使合适的碱性官能团与合适的酸反应来单独 制备。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、 己二酸盐、 海藻酸盐、 枸橼酸盐、 天冬氨酸盐、 苯甲酸 盐、 苯磺酸盐、 硫酸氢盐、 丁酸盐、 樟脑酸盐、 樟脑磺酸盐、 二葡糖酸盐、 甘油磷酸盐、 半硫酸 盐、 庚酸盐、 己酸盐、 甲酸盐、 富马酸盐、 盐酸盐、 氢溴酸盐、 氢碘酸盐、 2- 羟基乙磺酸盐、 乳酸 盐、 马来酸盐、 均三甲苯磺酸盐、 甲磺酸盐、 萘磺酸盐、 烟酸盐、 萘 -2- 磺酸盐、 草酸盐、 棕榈 酸盐、 果胶酸盐、 过硫酸盐、 3- 苯基丙酸盐、 苦味酸盐、 特戊酸盐、 丙酸盐、 琥珀酸盐、 酒石酸 盐、 三氯乙酸盐、 三氟乙酸盐、 磷酸盐、 谷氨酸盐、 碳酸氢盐、 对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐等。 可用于形成药用加成盐的酸的实例包括无机酸 ( 诸如盐酸、 氢溴酸、 硫酸和磷酸 ) 及有机酸 ( 诸如草酸、 马来酸、 琥珀酸和枸橼酸 )。
碱加成盐可在化合物的最终分离和纯化期间如下制备 ： 使酸性基团与合适的碱 ( 诸如金属阳离子的氢氧化物、 碳酸盐或者碳酸氢盐 ) 或者与氨、 有机伯胺、 有机仲胺或者 有机叔胺反应。 药用盐中的阳离子包括锂离子、 钠离子、 钾离子、 钙离子、 镁离子和铝离子及 无毒的季胺阳离子诸如铵根离子、 四甲基铵根离子、 四乙基铵根离子、 甲胺季胺阳离子、 二 甲胺季胺阳离子、 三甲胺季胺阳离子、 三乙胺季胺阳离子、 二乙胺季胺阳离子、 乙胺季胺阳 离子、 三丁胺季胺阳离子、 吡啶季胺阳离子、 N， N- 二甲基苯胺季胺阳离子、 N- 甲基哌啶季胺 阳离子、 N- 甲基吗啉季胺阳离子、 二环己胺季胺阳离子、 普鲁卡因季胺阳离子、 二苄胺季胺 阳离子、 N， N- 二苄基苯乙胺季胺阳离子和 N， N’ - 二苄基乙二胺季胺阳离子。可用于形成 碱加成盐的其它代表性有机胺包括乙二胺、 乙醇胺、 二乙醇胺、 哌啶和哌嗪。
本申请使用的术语 “抗 HCV 活性” 表示化合物可有效治疗 HCV 病毒。
术语 “本发明化合物” 及等价表达方式意在包括式 (I) 的化合物及其药用对映异 构体、 非对映异构体和盐。类似地， 在上下文允许的情况下， 当提及中间体时， 意在包括其 盐。
术语 “患者” 既包括人类又包括其它哺乳动物。
术语 “药物组合物” 表示包含本发明化合物及至少一种额外药物载体的组合物， 所述药物载体即辅料、 赋形剂或者媒介物， 诸如稀释剂、 防腐剂、 填充剂、 流动调节剂、 崩解 剂、 润湿剂、 乳化剂、 助悬剂、 甜味剂、 矫味剂、 芳香剂、 抗菌剂、 抗真菌剂、 润滑剂和分散剂， 这取决于给药方式的性质和剂型的性质。可使用例如在 Remington’ s Pharmaceutical th Sciences， 18 ed.， Mack Publishing Company， Easton， PA(1999) 中列出的成分。
本申请使用的短语 “药用” 是指这样的化合物、 材料、 组合物和 / 或者剂型， 其在合理的医药判断范围内适于与患者的组织接触而不引起过度的毒性、 刺激性、 变态反应或者 其它问题或者并发症， 这与合理的益处 / 风险比相称。
术语 “治疗有效量” 是指各种活性组分的总量， 所述总量足以显示出有意义的患者 益处 ( 例如病毒载量的持续减少 )。所述术语当用于单独给药的一种活性成分时是指所述 成分的单独量。 所述术语当用于组合时是指引起治疗效果的各种活性成分的组合量而不论 是组合给药、 连续给药或者同时给药。
术语 “治疗” 是指 ： (i) 在可能易患疾病、 障碍和 / 或者病症但尚未诊断患有所述疾 病、 障碍和 / 或者病症的患者中预防所述疾病、 障碍和 / 或者病症 ； (ii) 抑制所述疾病、 障 碍和 / 或者病症， 即阻止其发展 ； 和 / 或者 (iii) 减轻所述疾病、 障碍和 / 或者病症， 即引起 所述疾病、 障碍和 / 或者病症的消退。
当在本发明化合物的命名中使用时， 本申请使用的标记 P1’ 、 P1、 P2、 P2*、 P3 和 P4 描述了就天然肽裂解底物的结合而言蛋白酶抑制剂结合的氨基酸残基的相对位置。 就天然 底物而言在 P1 和 P1’ 之间发生裂解， 其中非初始位置表示开始于肽天然裂解位点的 C- 端 且向 N- 端延伸的氨基酸 ； 然而， 初始位置由裂解位点标识的 N- 端出发且向 C- 端延伸。例 如， P1’ 是指远离裂解位点 C- 端右侧的第一位置 ( 即 N- 端第一位置 ) ； 然而， P1 由裂解位 点 C- 端左侧开始编号， P2 为由所述 C- 端开始的第二位置等 ( 参见 Berger A.&Schechter I.， Transactions of the Royal Society London series(1970)， B257， 249-264])。
下图显示了对本发明化合物的标识。
不对称中心存在于本发明化合物中。例如， 所述化合物可包含下式的 P1 环丙基单元：
其中 C1 和 C2 各自表示在环丙基环的 1- 位和 2- 位的不对称碳原子。
R2 与羰基呈顺位R2 与羰基呈顺位R2 与酰胺呈顺位 R2 与酰胺呈顺位
应该理解的是， 本发明涵盖所有立体化学形式或者其混合物， 其具有抑制 HCV 蛋 白酶的能力。
本发明某些化合物还可按不同的稳定构象形式存在， 其是可分离的。由于围绕不 对称单键的受限旋转 ( 例如因为位阻或者环张力 ) 而导致的扭转不对称可使不同的构象异 构体得以分离。本发明包括这些化合物的每种构象异构体及其混合物。
本发明某些化合物可按两性离子形式存在， 且本发明包括这些化合物的每种两性 离子形式及其混合物。
当治疗有效量的式 (I) 的化合物及其药用盐可按化学物质原形式来给药而用于 治疗时， 活性成分可按药物组合物的形式来提供。因此， 本发明还提供了药物组合物， 其包 含治疗有效量的式 (I) 的化合物或者其药用盐及一种或者多种药用载体、 稀释剂或者赋形 剂。式 (I) 的化合物及其药用盐如上所述。载体、 稀释剂或者赋形剂就与制剂中的其它成
分相容而言必须是可接受的， 且就其接受者而言必须是没有害处的。本发明另一个方面还 提供了制备药物制剂的方法， 其包括将式 (I) 的化合物或者其药用盐与一种或者多种药用 载体、 稀释剂或者赋形剂混合。
药物制剂可按单位剂量形式来提供， 其在每个单位剂量中含有预定量的活性成 分。本发明化合物的以下剂量水平即约 0.01 至约 250 毫克 / 千克体重 (“mg/kg” )/ 日优 选为约 0.05 至约 100mg/kg 体重 / 日在对由 HCV 介导的疾病进行预防和治疗的单一疗法中 是典型的。 通常， 本发明药物组合物将被每日给药约 1 至约 5 次， 或者可选择地， 可按连续输 注的形式来给药。上述给药可用作慢性疗法或者急性疗法。可与载体物质混合以制备单一剂型的活性成分的量将基于以下因素而变化 ： 所治疗的病症、 所述病症的严重程度、 给药时 间、 给药途径、 所用化合物的排泄速率、 治疗的持续时间及患者的年龄、 性别、 体重和状态。 优选的单位剂量制剂是这样的单位剂量制剂， 其含有如上所述的日剂量或者亚剂量或者其 适当分数的活性成分。通常， 治疗开始于基本小于化合物最佳剂量的小剂量。然后剂量以 小的增幅增加， 直到实现对病情的最佳效果。 通常， 化合物以如下浓度水平来给药是最期望 的， 所述浓度水平通常将提供有效的抗病毒结果而不引起任何有害或者有毒的副作用。
当本发明组合物包含本发明化合物和一种或者多种额外的治疗药物或者预防药 物的组合时， 所述化合物和所述额外的药物通常都以如下剂量水平存在， 所述剂量水平为 单一疗法给药方案中所通常给药剂量的约 10 至 150％， 且更优选为约 10 至 80％。
可对药物制剂进行调整以通过任何适当的途径来给药， 所述途径为例如口服 ( 包 括口腔或者舌下 ) 途径、 直肠途径、 经鼻途径、 局部 ( 包括口腔、 舌下或者透皮 ) 途径、 阴道 途径或者肠胃外 ( 包括皮下注射或者输注、 皮内注射或者输注、 肌内注射或者输注、 关节内 注射或者输注、 滑膜内注射或者输注、 胸骨内注射或者输注、 鞘内注射或者输注、 病灶内注 射或者输注、 静脉内注射或者输注或者皮内注射或者输注 ) 途径。上述制剂可通过药学领 域已知的任何方法来制备， 所述方法为例如将活性成分与载体或者赋形剂混合。
针对口服给药而调整的药物制剂可按以下形式来提供 ： 离散的单位形式 ( 诸如胶 囊剂或者片剂 ) ； 粉末剂或者颗粒剂 ； 在水性或者非水性液体中的溶液剂或者混悬剂 ； 可食 用的泡沫剂 (foam) 或者搅打剂 (whip) ； 或者水包油型液态乳剂或者油包水型乳剂。
例如， 就以片剂或者胶囊剂形式进行的口服给药而言， 可将活性药物组分与口服 的无毒的药用惰性载体诸如乙醇、 甘油、 水等混合。粉末剂如下制备 ： 将化合物研磨至合适 的微细尺寸， 然后与经类似研磨的药物载体诸如可食用的碳水化合物 ( 例如淀粉或者甘露 醇 ) 混合。矫味剂、 防腐剂、 分散剂和着色剂也可存在。
胶囊剂如下制备 ： 如上所述来制备粉末混合物， 然后填充到成形的明胶壳中。 可将 助流剂和润滑剂诸如胶体二氧化硅、 滑石、 硬脂酸镁、 硬脂酸钙或者固体聚乙二醇加到粉末 混合物中， 然后进行填充操作。 也可加入崩解剂或者增溶剂诸如琼脂、 碳酸钙或者碳酸钠以 改善胶囊剂被摄入时的药物利用度。
此外， 当期望或者需要时， 也可将合适的粘合剂、 润滑剂、 崩解剂和着色剂掺到混 合物中。合适的粘合剂包括淀粉、 明胶、 天然糖 ( 诸如葡萄糖或者 β- 乳糖 )、 玉米甜味剂、 天然胶和合成胶 ( 诸如阿拉伯胶、 西黄蓍胶或者海藻酸钠 )、 羧甲基纤维素、 聚乙二醇等。 在 这些剂型中使用的润滑剂包括油酸钠、 氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、 甲基纤维素、 琼脂、 膨润土、 黄原胶等。片剂例如如下配制 ： 制备粉末混合物， 制粒或者预压， 加入润滑剂 和崩解剂， 然后压制成片剂。 粉末混合物如下制备 ： 将经合适研磨的化合物与上述稀释剂或 者基质及任选的粘合剂 ( 诸如羧甲基纤维素、 海藻酸盐、 凝胶或者聚乙烯吡咯烷酮 )、 溶解 延迟剂 ( 诸如石蜡 )、 吸收促进剂 ( 诸如季胺盐 ) 和 / 或者吸收剂 ( 诸如膨润土、 高岭土或 者磷酸二钙 ) 混合。粉末混合物可与粘合剂诸如糖浆、 淀粉糊、 阿拉伯胶液、 纤维素溶液或 者聚合物溶液一起湿法制粒， 然后挤压过筛。 作为可选择的制粒方法， 粉末混合物可通过压 片机来处理， 且结果是不完全成形的预压片破裂成颗粒。可通过加入硬脂酸、 硬脂酸盐、 滑 石或者矿物油来对颗粒进行润滑以防止与片剂成形模粘连。 然后将经润滑的混合物压制成 片剂。本发明化合物也可与可自由流动的惰性载体组合， 并在不经历制粒或者预压步骤的情况下直接压制成片剂。可提供透明或者不透明的保护性包衣， 所述包衣由以下包衣层构 成： 由虫胶形成的隔离包衣层、 由糖或者聚合物形成的包衣层和由蜡形成的光亮包衣层。 可 将染料加到这些包衣中以区分不同的单位剂量。
口服流体诸如溶液剂、 糖浆剂和酏剂可按剂量单位形式来制备， 从而使给定的量 含有预定量的化合物。糖浆剂可通过将化合物溶于经合适矫味的水溶液中来制备， 而酏剂 通过使用无毒的媒介物来制备。也可加入增溶剂和乳化剂 ( 诸如乙氧基化的异硬脂醇和聚 氧乙烯山梨醇醚 )、 防腐剂、 矫味添加剂 ( 诸如薄荷油、 天然甜味剂、 糖精或者其它人造甜味 剂 ) 等。
当适当时， 可对用于口服给药的剂量单位制剂进行微囊化。也可例如通过将颗粒 物质用聚合物、 蜡等包衣或者包埋到聚合物、 蜡等中来制备制剂以延长或者维持释放。
式 (I) 的化合物及其药用盐也可按脂质体递送系统的形式来给药， 所述脂质体递 送系统为诸如小单层脂囊 (small unilamellar vesicle)、 大单层脂囊 (largeunilamellar vesicle) 和多层脂囊 (multilamellar vesicle)。脂质体可由各种磷脂诸如胆固醇、 硬脂 酰胺或者磷脂酰胆碱来形成。
式 (I) 的化合物及其药用盐也可通过使用单克隆抗体作为与化合物分子偶联的 单独载体来递送。化合物也可与作为靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。上述聚合物可 包括聚乙烯基吡咯烷酮、 吡喃共聚物、 聚羟基丙基甲基丙烯酸酰胺苯酚 (polyhydroxyprop ylmethacrylamidephenol)、 聚羟基乙基天冬氨酸酰胺苯酚 (polyhydroxyethylaspartami dephenol) 或者取代有棕榈酰基的聚氧化乙烯聚赖氨酸 (polyethyleneoxidepolylysine substituted with palitoylresidue)。 此外， 化合物可与可用于实现药物控制释放的一类 生物可降解的聚合物偶联， 所述聚合物为例如聚乳酸、 聚 ξ- 己内酯、 聚羟基丁酸、 聚原酸 酯、 聚缩醛、 聚二氢吡喃、 聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联共聚物或者水凝胶的两亲性嵌段 共聚物。
针对透皮给药而调整的药物制剂可按离散的贴剂形式来提供， 其意在与接受者的 表皮紧密接触且保持延长的时段。例如， 如 Pharmaceutical Research， 3(6)， 318(1986) 中 所一般描述， 活性成分可通过离子电渗法 (iontophoresis) 从贴剂中来递送。
可将针对局部给药而调整的药物制剂配制成软膏剂、 乳膏剂、 混悬剂、 洗液、 粉末 剂、 溶液剂、 糊剂、 凝胶剂、 喷雾剂、 气雾剂或者油剂。
就治疗眼部或者其它外部组织例如口和皮肤而言， 制剂优选以局部用软膏剂或者 局部用乳膏剂的形式来施用。当配制成软膏剂时， 活性成分可与石蜡或者水可混溶性软膏 剂基质一起使用。可选择地， 可将活性成分与水包油型乳膏剂基质或者油包水型基质一起 配制成乳膏剂。
进行调整以适于局部给药至眼部的药物制剂包括滴眼剂， 其中将活性成分溶于或 者悬浮于合适的载体尤其是水性溶剂中。
进行调整以适于在口中局部给药的药物制剂包括锭剂、 含锭剂 (pastille) 和口 腔洗剂。
进行调整以适于直肠给药的药物制剂可按栓剂或者灌肠剂的形式来提供。
进行调整以适于鼻部给药的药物制剂 ( 其中载体为固体 ) 包括粒度范围为例如 20 至 500 微米的一系列粉末， 其以吸入方式来给药， 即从接近鼻的装有粉末的容器中经由鼻道而快速吸入。用于以鼻喷雾剂或者滴鼻剂的形式进行给药的合适制剂 ( 其中载体为液 体 ) 包括活性成分的水性溶液或者油溶液。
进行调整以适于吸入给药的药物制剂包括微细颗粒的粉尘或者气雾， 其可通过各 种类型的计量剂量的加压的气雾器、 喷雾器或者吸入器来产生。
进行调整以适于阴道给药的药物制剂可按阴道栓剂、 棉塞剂、 乳膏剂、 凝胶剂、 糊 剂、 泡沫剂或者喷雾剂的形式来提供。
进行调整以适于肠胃外给药的药物制剂包括 ： 水性和非水性无菌注射溶液剂， 其 可含有抗氧化剂、 缓冲剂、 抑菌剂和使制剂与所预期接受者的血液等渗的溶质 ； 及水性和非 水性无菌混悬剂， 其可包含助悬剂和增稠剂。所述制剂可存在于单位剂量容器或者多剂量 容器例如密封的安瓿和小瓶中， 并可在冷冻干燥的 ( 冻干的 ) 状态下贮存， 其仅需要恰在使 用前加入无菌液态载体例如注射用水。现用现配的注射溶液剂和混悬剂可由无菌粉末、 颗 粒或者片剂来制备。
应该理解的是， 除了上文具体提及的成分之外， 在已考虑到所涉及制剂的类型的 情况下， 所述制剂还可包含本领域中的其它常规物质， 例如适于口服给药的那些制剂可包 含矫味剂。 下表 1 列出了可与本发明化合物一起给药的化合物的一些示例性实例。本发明化 合物可在联合治疗中与其它具有抗 HCV 活性的化合物同时给药或者分开给药， 或者通过将 各化合物混合成组合物来给药。
表1
本发明化合物也可用作实验室试剂。所述化合物可用于提供以下研究工具， 所述 研究工具用于设计病毒复制测定、 验证动物测定系统和进行结构生物学研究以进一步提高 对 HCV 疾病机理的认识。此外， 本发明化合物可用于建立或者确定其它抗病毒化合物的结 合位点 ( 例如通过竞争性抑制 )。
本发明化合物也可用于处理或者预防物质的病毒污染， 因此降低了与这些物质 ( 例如血液、 组织、 手术器械和手术外衣、 实验室仪器和实验室外衣及采血装置和物质或者 输血装置和物质 ) 发生接触的实验室人员或者医务人员或者患者感染病毒的风险。
当具有式 (I) 的化合物通过合成性过程或者通过代谢性过程 ( 包括发生在人类或 者动物体内 ( 在体内 ) 的那些代谢性过程或者发生在体外的过程 ) 来制备时， 本发明旨在 包括具有式 (I) 的化合物。
本申请使用的缩写 ( 尤其包括以下示例性方案和实施例中使用的缩写 ) 是本领域 技术人员公知的。所使用的一些缩写如下 ： OAc 表示乙酸酯或者乙酸盐 ； t-Bu 表示叔丁基 ； TBMDSCl 表示叔丁基二甲基甲硅烷基氯 ； 1， 2-DME 表示 1， 2- 二甲氧基乙烷 ； DMA 表示 N， N- 二 甲基乙酰胺 ； n-BuLi 或者 n-buLi 表示正丁基锂 ； THF 表示四氢呋喃 ； Et3N 表示三乙胺 ； TBME 或者 MTBE 表示叔丁基甲基醚 ； rt 或者 RT 表示室温或者保留时间 ( 上下文将说明 ) ； Boc 或 者 BOC 表示叔丁氧基羰基 ； DMSO 表示二甲基亚砜 ； EtOH 表示乙醇 ； MeCN 表示乙腈 ； TFA 表示 三氟乙酸 ； h 表示小时 ； d 表示天 ； EtOAc 表示乙酸乙酯 ； CDI 表示 1， 1’ - 羰基二咪唑 ； DBU 表 示 1， 8- 二氮杂二环 [5.4.0] 十一碳 -7- 烯 ； DCM 表示二氯甲烷 ； Et2O 表示乙醚 ； HATU 表示 O-(7- 氮杂苯并三唑 -1- 基 )-N， N， N’ ， N’ - 四甲基脲鎓磷酸盐 ； NMM 表示 N- 甲基吗啉 ； DCE 表示 1， 2- 二氯乙烷 ； 且 DIEA 或者 DIPEA 表示二异丙基乙基胺。
可用于合成本发明化合物的起始原料是本领域技术人员已知的， 且可容易制备或 者可商购得到。
出于示例性目的而提供下述方法而非意在限制权利要求书的范围。应该理解的 是， 制备以下化合物可能是必须的， 所述化合物中的官能团使用常规保护基来保护， 然后除 去所述保护基， 从而提供本发明化合物。根据本发明来使用保护基的细节是本领域技术人 员已知的。
当构建式 (I) 的化合物时， P1’ 端使用如上概括描述且如下更详细描述的一般方 法之一来引入到分子中。在某些实施例中， 作为环烷基磺酰胺或者烷基磺酰胺的 P1’ 单元 可商购得到， 或者可由相应的烷基磺酰氯或者环烷基磺酰氯通过用氨处理磺酰氯来制备。 可选择地， 这些磺酰胺可使用下述一般方法来合成。可商购得到的 3- 氯丙基磺酰氯 (1) 例 如通过用叔丁胺处理来转化为经适当保护的磺酰胺。然后所得到的磺酰胺 (2) 通过在溶剂 ( 诸如 THF) 中在低温用 2 当量碱 ( 诸如丁基锂 ) 处理来转化为相应的环烷基磺酰胺。所得 到的环烷基磺酰胺可通过用酸处理来脱保护以提供所需未经保护的环烷基磺酰胺。
取代的环烷基磺酰胺也可使用上述操作的变化形式来引入到式 (I) 的化合物中。 例如， 下述中间体 2 可用 2 当量碱 ( 诸如丁基锂 ) 处理， 且所得到的反应混合物可用亲电试 剂 ( 诸如甲基碘 ) 处理以提供取代的环烷基磺酰胺 (3)。可在 N- 端对该中间体 (3) 进行脱 保护， 且所得到的化合物 (4) 在制备式 (I) 的化合物中用作中间体。
用于制备式 (I) 的化合物的 P1’ 中间体在某些情况下来自硫酰胺衍生物。在上述 情况下， 硫酰胺中间体可通过几种合成途径例如下述途径来得到。氨磺酰氯 (2) 可如下在原位制备 ： 将水 ( 例如 1 当量 ) 加到异氰酸氯磺酰基酯 (1) ( 例如 1 当量 ) 在溶剂 ( 诸如 THF) 中的溶液中， 同时保持在低温 ( 诸如 -20℃ )。然后将所 得到的溶液温热至 0℃。向该溶液中加入碱 ( 诸如无水三乙胺 ( 例如 1 当量 ))， 接着加入 胺 ( 例如 1 当量 )。然后将反应混合物温热至室温， 过滤， 并将滤液浓缩以提供所需硫酰胺 (3)。
所述硫酰胺可通过几种方法例如按照下述方案中定义的合成途径来引入到式 (I) 的化合物中。羧酸 P1 单元 (1) 用活化剂 ( 诸如 CDI) 处理。在另一个烧瓶中， 将强碱加到 上述硫酰胺的溶液中， 并将所得到的反应混合物搅拌几小时， 然后将该反应混合物加到含 有上述经活化的羧酸的烧瓶中以提供酰基硫酰胺衍生物 (2)。可将中间体 (2) 转化为本申 请所述的式 (I) 的化合物。
用于制备式 (I) 的化合物的 P1 单元在某些情况下可商购得到， 但也可使用本申请 所述的方法来合成， 且随后可使用本申请所述的方法来引入到式 (I) 的化合物中。取代的 P1 环丙基氨基酸可按照以下方案中描述的一般方法来合成。
可商购得到或者易于合成的亚胺 (1) 在碱存在下用 1， 4- 二卤代丁烯 (2) 处理以 提供所需亚胺 (3)。然后对 3 进行酸水解以提供 4， 其具有与羧基呈顺位的烯丙基取代基且 为主要产物。4 中的氨基部分可使用 Boc 基团来保护以提供经完全保护的氨基酸 5。该中
间体为外消旋化合物， 其可通过酶方法来拆分， 其中 5 中的酯基部分通过蛋白酶来裂解以 提供相应的羧酸。 抛开任何具体理论的束缚， 认为该反应是具有选择性的， 这是因为对映异 构体中的一种以比其镜像大得多的速率进行反应， 由此对中间体外消旋化合物进行动力学 拆分。 在本申请所述的实例中， 就引入到式 (I) 的化合物中而言较优选的立体异构体为 5a， 其具有 (1R， 2S) 立体化学。在酶存在下， 该对映异构体不发生酯基裂解， 因此从反应混合物 中回收该对映异构体 5a。然而， 较不优选的对映异构体 5b( 其具有 (1S， 2R) 立体化学 ) 发 生酯基裂解即水解以提供游离酸 6。该反应完成后， 酯 5a 可通过常规方法 ( 例如水萃取法 或者色谱法 ) 而与酸产物 6 分离。
几种氨基芳基产物如下合成 ： 使自制的核心二肽胺与可商购得到的 N- 芳基氨基 酸片段进行常规肽偶联。当 N- 芳基氨基酸片段不能商购得到时， 对其进行合成。合成这些 N- 芳基氨基酸片段的途径包括但不限于以下 ：
(1) 使具有足够亲电性的芳族或者杂芳族物质与氨基酸酯进行亲核芳族取代， 接 着对产物进行脱酯 ：
(2)Buchwald-Hartwig 型反应， 其涉及将由膦配体介导的 Pd(0) 插入到芳基卤化 学键或者杂芳基卤化学键中， 接着用氨基酸叔丁酯进行置换， 然后对产物进行脱酯 (Shen， Q. ； Shekhar， S； Stambuli， J.P. ； Hartwig， J.F.Angew.Chem.Int.Ed.2005， 44， 1371-1375) ：
(3)Ullmann 样缩合， 其中使芳基卤或者杂芳基卤和游离氨基酸通过由 CuI 介导 的过程进行反应以直接得到芳基氨基酸 (Ma， D. ； Zhang， Y. ； Yao， J. ； Wu， S. ； Tao， F.J.Am. Chem.Soc.1998， 120， 12459-12467) ：
(4) 将游离氨基酸中的二价阴离子亲核加成到芳基卤或者杂芳基卤 ( 通常为芳基 氟或者杂芳基氟 ) 中 ( 类似于 Saitton， S. ； Kihlberg， J. ； Luthman， K.Tetrahedron 2004， 60， 6113-6120) ：
在某些情况下， 氨基芳基终产物可如下得到 ： 使芳基环与完全组装的在 P3 亚区末 端具有游离氨基的核心三肽直接进行亲核芳族取代 ：这些反应限于以下情况 ： 芳环在本质上所具有的亲电性足以允许在相对温和的条 件 ( 即需要最低程度的加热 ) 下进行置换。
外消旋 (1R， 2S)/(1S， 2R)-1- 氨基 -2- 乙烯基环丙烷羧酸乙酯的制备 ：
方案 1
步骤 1 ：
将甘氨酸乙酯盐酸盐 (304g， 2.16 摩尔 ) 混悬在叔丁基甲基醚 (1.6L) 中。加入 苯甲醛 (231g， 2.16 摩尔 ) 和无水硫酸钠 (155g， 1.09 摩尔 ) 并使用冰水浴将混合物冷却 至 0 ℃。历时 30 分钟逐滴加入三乙胺 (455mL， 3.26 摩尔 ) 并将混合物在室温搅拌 48 小
时。然后通过加入冰冷的水 (1L) 将反应混合物淬灭并分离有机层。水相用叔丁基甲基醚 (0.5L) 萃取且合并有机相并用饱和 NaHCO3 水溶液 (1L) 和盐水 (1L) 的混合物洗涤。有机 物经 MgSO4 干燥并真空浓缩， 得到 392.4g N- 苄基亚胺产物， 其为稠厚黄色油状物， 所述油状 1 物直接用于下一步。 H NMR(CDCl3， 300MHz)δ1.32(t， J ＝ 7.1Hz， 3H)， 4.24(q， J ＝ 7.1Hz， 2H)， 4.41(d， J ＝ 1.1Hz， 2H)， 7.39-7.47(m， 3H)， 7.78-7.81(m， 2H)， 8.31(s， 1H).
步骤 2 ：
历时 60 分钟向叔丁醇锂 (84.1g， 1.05mol) 在无水甲苯 (1.2L) 中的混悬液中逐 滴加入甘氨酸乙酯的 N- 苄基亚胺 (100g， 0.526mol) 和反式 -1， 4- 二溴 -2- 丁烯 (107g， 0.500mol) 在无水甲苯 (0.6L) 中的混合物。加完后， 深红色混合物通过加入水 (1L) 和叔 丁基甲基醚 (TBME， 1L) 来淬灭。分离水相并再用 TBME(1L) 萃取。合并有机相， 加入 1.0M HCl(1L) 并将混合物在室温搅拌 2 小时。分离有机相并用水 (0.8L) 萃取。然后合并水相， 用盐 (700g) 饱和并加入 TBME(1L) 且将混合物冷却至 0℃。然后通过逐滴加入 10.0M NaOH 将搅拌的混合物碱化至 pH ＝ 14， 分离有机层且水相用 TBME(2×500mL) 萃取。合并有机萃 取物， 经 MgSO4 干燥， 过滤并浓缩至体积为 1L。向该游离胺的溶液中加入 Boc2O( 一缩二碳 酸二叔丁酯 )(131g， 0.600mol) 并将混合物在室温搅拌 4 天。将额外的一缩二碳酸二叔丁 酯 (50g， 0.23mol) 加到反应混合物中并将混合物回流 3 小时， 然后冷却至室温过夜。反应 混合物经 MgSO4 干燥， 过滤并真空浓缩， 得到 80g 粗物质。该残留物通过快速色谱 (2.5kg SiO2 且用 1 ％至 2 ％ MeOH/CH2Cl2 洗脱 ) 来纯化， 得到 57g(53 ％ ) 外消旋 N-Boc-(1R， 2S)/ (1S， 2R)-1- 氨基 -2- 乙烯基环丙烷羧酸乙酯， 其为黄色油状物， 所述油状物当在冰箱中静 1 置时固化。 H NMR(CDCl3， 300MHz)δ1.26(t， J ＝ 7.1Hz， 3H)， 1.46(s， 9H)， 1.43-1.49(m， 1H)， 1.76-1.82( 宽多重峰， 1H)， 2.14(q， J ＝ 8.6Hz， 1H)， 4.18(q， J ＝ 7.2Hz， 2H)， 5.12(dd J ＝ 10.3， 1.7Hz， 1H)， 5.25( 宽单峰， 1H)， 5.29(dd， J ＝ 17.6， 1.7Hz， 1H)， 5.77(ddd， J ＝ 17.6， 10.3， 8.9Hz， 1H)。MS m/z254.16(M-1)。
N-Boc-(1R， 2S)/(1S， 2R)-1- 氨基 -2- 乙烯基环丙烷羧酸乙酯的拆分 ：
方案 1
拆分 A
向容纳在 12L 套层反应器中的磷酸钠缓冲剂水溶液 (0.1M， 4.25 升 (“L” )， pH 8) ( 保持在 39℃且以 300rpm 搅拌 ) 中加入 511 克 Acalase 2.4L( 约 425mL)(Novozymes North America Inc.)。当混合物的温度达到 39℃时， 通过加入 50％ NaOH 在水中的溶液将 pH 调 节至 8.0。然后历时 40 分钟加入外消旋 N-Boc-(1R， 2S)/(1S， 2R)-1- 氨基 -2- 乙烯基环丙 烷羧酸乙酯 (85g) 在 850mLDMSO 中的溶液。然后将反应温度保持在 40℃且保持 24.5 小时， 其间在 1.5 小时和 19.5 小时时间点使用 50 ％ NaOH 在水中的溶液将混合物的 pH 调节至
8.0。24.5 小时后， 确定酯的对映异构体过量为 97.2％且将反应混合物冷却至室温 (26℃ ) 并搅拌过夜 (16 小时 )， 然后确定酯的对映异构体过量为 100％。然后反应混合物的 pH 用 50％ NaOH 调节至 8.5 且所得到的混合物用 MTBE(2×2L) 萃取。然后合并的 MTBE 萃取物用 5％ NaHCO3(3×100mL) 和水 (3×100mL) 洗涤并真空蒸发， 得到对映异构体纯的 N-Boc-(1R， 2S)-1- 氨基 -2- 乙烯基环丙烷羧酸乙酯， 其为浅黄色固体 (42.55g ； 纯度为 97％ @210nm( 不 含有酸 ) ； 100％对映异构体过量 (“ee” ))。
然后来自萃取过程的水层用 50 ％ H2SO4 酸化至 pH ＝ 2 且用 MTBE(2×2L) 萃取。 MTBE 萃取物用水 (3×100mL) 洗涤并蒸发， 得到酸， 其为浅黄色固体 (42.74g ； 纯度为 99％ @210nm( 不含有酯 ))。
拆分 B
在 24 孔板的孔 ( 容量为 10mL/ 孔 ) 中向 0.5mL 100mM Heps·Na 缓冲液 (pH ＝ 8.5) 中加入 0.1mL Savinase 16.0L( 来自 Bacillus clausii 的蛋白酶 )(Novozymes North America Inc.) 和外消旋 N-Boc-(1R， 2S)/(1S， 2R)-1- 氨基 -2- 乙烯基环丙烷羧酸乙酯 (10mg) 在 0.1mL DMSO 中的溶液。将板密封并在 40℃以 250rpm 培养。18 小时后， 如下确 定酯的对映异构体过量为 44.3％： 取出 0.1mL 反应混合物并与 1mL 乙醇充分混合 ； 离心后， 10 微升 (“μl” ) 上清液用手性 HPLC 分析。向剩余的反应混合物中加入 0.1mL DMSO 并将 板在 40℃以 250rpm 再培养 3 天， 然后将 4mL 乙醇加到孔中。离心后， 10μl 上清液用手性 HPLC 分析且确定酯的对映异构体过量为 100％。
拆分 C
在 24 孔板的孔 ( 容量为 10mL/ 孔 ) 中向 0.5mL 100mM Heps·Na 缓冲液 (pH ＝
8.5) 中加入 0.1ml Esperase 8.0L( 来自 Bacillus halodurans 的蛋白酶 )(Novozymes North America Inc.) 和外消旋 N-Boc-(1R， 2S)/(1S， 2R)-1- 氨基 -2- 乙烯基环丙烷羧酸 乙酯 (10mg) 在 0.1mL DMSO 中的溶液。将板密封并在 40℃以 250rpm 培养。18 小时后， 如 下确定酯的对映异构体过量为 39.6％ ： 取出 0.1mL 反应混合物并与 1mL 乙醇充分混合 ； 离 心后， 10μl 上清液用手性 HPLC 分析。向剩余的反应混合物中加入 0.1mL DMSO 并将板在 40℃以 250rpm 再培养 3 天， 然后将 4mL 乙醇加到孔中。离心后， 10μl 上清液用手性 HPLC 分析且确定酯的对映异构体过量为 100％。
样品分析如下进行 ：
1) 样品制备 ： 将约 0.5mL 反应混合物与 10 倍体积的 EtOH 充分混合。离心后， 将 10μl 上清液注射到 HPLC 柱中。
2) 转化确定 ：
柱： YMC ODS A， 4.6×50mm， S-5μm ；
溶剂 ： A ＝ 1mM HCl 在水中的溶液 ； B ＝ MeCN ；
梯度 ： 30％ B 保持 1 分钟 ； 30％ B 历时 0.5 分钟至 45％ B ； 45％ B 保持 1.5 分钟 ； 45％ B 历时 0.5 分钟至 30％ B ；
流速 ： 2mL/ 分钟 ；
UV 检测 ： 210nm ；
保留时间 ： 酸为 1.2 分钟 ； 酯为 2.8 分钟。
3) 确定酯的对映异构体过量 ：
柱： CHIRACEL OD-RH， 4.6×150mm， S-5μm ；
流动相 ： MeCN/50mM HCl 在水中的溶液 (67/33) ；
流速 ： 0.75mL/ 分钟 ；
UV 检测 ： 210nm ；
保留时间 ：
酸的 (1S， 2R) 异构体 ： 5.2 分钟 ；
外消旋化合物 ： 18.5 分钟和 20.0 分钟 ；
酯的 (1R， 2S) 异构体 ： 18.5 分钟。
环丙基磺酰胺的制备 ：
环丙基磺酰胺 方案 1步骤 1 ：
将叔丁胺 (3.0mol， 315mL) 溶解在 THF(2.5L) 中。将溶液冷却至 -20℃。缓慢加入 3- 氯丙烷磺酰氯 (1.5mol， 182mL)。将反应混合物温热至室温并搅拌 24 小时。将混合物过 滤并将滤液真空浓缩。 将残留物溶解在 CH2Cl2(2.0L) 中。 所得到的溶液用 1.0M HCl(1.0L)、 水 (1.0L) 和盐水 (1.0L) 洗涤， 经 Na2SO4 干燥， 过滤并真空浓缩， 得到微黄色固体， 其用己烷 1 结晶， 得到产物， 其为白色固体 (316.0g， 99％ )。 H NMR(CDCl3)δ1.38(s， 9H)， 2.30-2.27(m， 2H)， 3.22(t， J ＝ 7.35Hz， 2H)， 3.68(t， J ＝ 6.2Hz， 2H)， 4.35(b， 1H)。
步骤 2 ：
在 -78℃向 N- 叔丁基 -3- 氯丙基磺酰胺 (2.14g， 10.0mmol) 在 THF(100mL) 中的溶 液中加入 n-BuLi( 正丁基锂 )( 浓度为 2.5M 的己烷溶液， 8.0mL， 20.0mmol)。历时 1 小时将 反应混合物温热至室温。将挥发物真空除去。将残留物在 EtOAc 和水 ( 各 200mL) 之间分 配。 经分离的有机相用盐水洗涤， 经 Na2SO4 干燥， 过滤并真空浓缩。 残留物用己烷重结晶， 得 1 到所需产物， 其为白色固体 (1.0g， 56％ )。 H NMR(CDCl3)δ0.98-1.00(m， 2H)， 1.18-1.19(m， 2H)， 1.39(s， 9H)， 2.48-2.51(m， 1H)， 4.19(b， 1H)。
步骤 3 ：
将环丙烷磺酸叔丁基酰胺 (110g， 0.62mmol) 在 TFA(500mL) 中的溶液在室温搅拌 16 小时。将挥发物真空除去。残留物用 EtOAc/ 己烷 (60mL/240mL) 重结晶， 得到所需产 1 物， 其为白色固体 (68.5g， 91％ )。 H NMR(DMSO-d6)δ0.84-0.88(m， 2H)， 0.95-0.98(m， 2H)， 2.41-2.58(m， 1H)， 6.56(b， 2H)。
P1P1’ 的制备 ：
方案 1
步骤 1 ：
向 1(R)- 叔丁氧基羰基氨基 -2(S)- 乙烯基 - 环丙烷羧酸乙酯 (3.28g， 13.2mmol) 在 THF(7mL) 和 甲 醇 (7mL) 中 的 溶 液 中 加 入 LiOH(1.27g， 53.0mmol) 在 水 (14mL) 中 的 混 悬 液。 将 混 合 物 在 室 温 搅 拌 过 夜。 向 混 合 物 中 加 入 1.0MNaOH(15mL)、 水 (20mL) 和 EtOAc(20mL)。将混合物振摇， 分离各相且有机相再用 20mL 0.5M NaOH 萃取。合并的水 相用 1.0M HCl 酸化直到 pH ＝ 4 并用 EtOAc(3×40mL) 萃取。合并的有机萃取物用盐水 洗涤并干燥 (MgSO4)， 得到标题化合物， 其为白色固体 (2.62g， 87 ％ )。1H NMR ： (DMSO-d6)
δ1.22-1.26(m， 1H)， 1.37(s， 9H)， 1.50-1.52(m， 1H)， 2.05(q， J ＝ 9Hz， 1H)， 5.04(d， J ＝ 10Hz， 1H)， 5.22(d， J ＝ 17Hz， 1H)， 5.64-5.71(m， 1H)， 7.18， 7.53(s， NH( 旋 转 异 构 体 ))， + 12.4( 宽单峰， 1H)。LC-MS MS m/z 228(M +H)。
步骤 2 ：
将步骤 1 的产物 (2.62g， 11.5mmol) 和 CDI(2.43g， 15.0mmol) 在 THF(40mL) 中的溶 液在氮气下回流加热 50 分钟。 将溶液冷却至室温并经由套管转移至环丙基磺酰胺 (1.82g， 15.0mmol) 在 THF(10mL) 中 的 溶 液 中。 向 所 得 到 的 溶 液 中 加 入 DBU(2.40mL， 16.1mmol) 并继续搅拌 20 小时。混合物用 1.0M HCl 淬灭至 pH ＝ 1 并将 THF 真空蒸发。混悬液用 EtOAc(2×50mL) 萃取并合并有机萃取物且干燥 (Na2SO4)。通过用己烷 -EtOAc(1 ∶ 1) 重 结晶来纯化， 得到标题化合物 (2.4g)， 其为白色固体。母液通过 Biotage 40S 柱 ( 用 9％ 丙酮 /DCM 洗脱 ) 来纯化， 得到第二批标题化合物 (1.1g)。将两批合并 ( 总收率为 92％ )。 1 HNMR ： (DMSO-d6)δ0.96-1.10(m， 4H)， 1.22(dd， J ＝ 5.5， 9.5Hz， 1H)， 1.39(s， 9H)， 1.70(t， J ＝ 5.5Hz， 1H)， 2.19-2.24(m， 1H)， 2.90(m， 1H)， 5.08(d， J ＝ 10Hz， 1H)， 5.23(d， J ＝ 17Hz， + 1H)， 5.45(m， 1H)， 6.85， 7.22(s， NH( 旋转异构体 ))。LC-MS MSm/z 331(M +H)。
步骤 3 ：
将步骤 2 的产物 (3.5g， 10.6mmol) 在 DCM(35mL) 和 TFA(32mL) 中的溶液在室温搅 拌 1.5 小时。将挥发物真空除去且将残留物混悬在 1.0M HCl 在乙醚 (20mL) 中的溶液中并 真空浓缩。将该操作重复一次。所得到的混合物用戊烷研磨并过滤， 得到标题化合物， 其为 1 吸湿性灰白色固体 (2.60g， 92％ )。 HNMR(DMSO-d6)δ1.01-1.15(m， 4H)， 1.69-1.73(m， 1H)， 1.99-2.02(m， 1H)， 2.38(q， J ＝ 9Hz， 1H)， 2.92-2.97(m， 1H)， 5.20(d， J ＝ 11Hz， 1H)， 5.33(d， + J ＝ 17Hz， 1H)， 5.52-5.59(m， 1H)， 9.17( 宽单峰， 3H)。LC-MS MS m/z 231(M +H)。
实施例 1 ： 化合物 1A 和 1B 的制备
方案 1步骤 1 ：
将 6- 苯基 -4-( 噻吩 -2- 基 ) 吡啶 -2(1H)- 酮 (1.07mg， 4.23mmol)( 根据 S.Wang 等人， Synthesis 4， 487-490， 2003 来制备 ) 在磷酰氯 (15mL) 中的溶液加热至回流且保持三 天。 将过量的磷酰氯真空除去且残留物用冰水研磨。 研磨物用 NaOH 水溶液碱化并将产物萃 取到 DCM 中。有机层用盐水洗涤， 干燥， 用硅藻土过滤并蒸发。粗产物通过快速柱色谱来纯 1 化， 得到白色固体产物 (624mg， 54％收率 )。 H NMR(CDCl3)δppm 7.16(dd， J ＝ 5.13， 3.7Hz， 1H)， 7.44-7.52(m， 5H)， 7.55(dd， J ＝ 3.7， 1.1Hz， 1H)， 7.79(d， J ＝ 1.5Hz， 1H)， 8.02(dd， J + ＝ 8.1， 1.5Hz， 2H)。LC-MS MS m/z 272(M +H)。
方案 3
步骤 2 ：
向 Boc-Hyp-OH(254mg， 1.1mmol) 在 DMSO(5mL) 中的溶液中加入叔丁醇钾 (295mg， 2.5mmol)。在室温搅拌 1 小时后， 加入实施例 1 步骤 1 的氯吡啶产物并将所得到的混合物 在室温搅拌过夜。将反应混合物在 EtOAc 和枸橼酸水溶液之间分配。有机相用 H2O 和盐水 洗涤， 然后经 MgSO4 干燥并真空蒸发。 对粗混合物进行的 LC/MS 显示了产物∶氯吡啶起始原 料的 2.5 ∶ 1 混合物。粗混合物通过快速柱色谱 (SiO2， 90 ∶ 10DCM ∶ MeOH) 来纯化， 得到 1 固体产物 (270mg， 58％收率 )。H NMR(CD3OD)δ1.45(s， 9H)， 2.37-2.42(m， 1H)， 2.63(q， J＝ 13.9Hz， 1H)， 3.79(d， J ＝ 11.9Hz， 1H)， 3.88(d， J ＝ 12.2Hz， 1H)， 4.41-4.46(m， 1H)， 5.70( 宽 单峰， 1H)， 6.92( 宽单峰， 1H)， 7.15(d， J ＝ 3.4Hz， 1H)， 7.40(t， J ＝ 6.1Hz， 1H)， 7.45(q， J＝ 6.7Hz， 2H)， 7.51(d， J ＝ 4.0Hz， 1H)， 7.65( 宽单峰， 2H)， 8.05(d， J ＝ 7.0Hz， 2H)。LC-MS MS + m/z 467(M +H)。
步骤 3 ：
将实施例 1 步骤 2 的产物 (260mg， 0.56mmol) 与 N- 甲基吗啉 (284mg， 2.79mmol)、 环丙烷磺酸 (1(R)- 氨基 -2(S)- 乙烯基 - 环丙烷羰基 )- 酰胺盐酸盐 (202mg， 0.61mmol) 和 HATU(276mg， 0.73mmol) 在 DCM(5mL) 中的溶液混合。在室温搅拌 2 小时后， 将反应混合物 倒入枸橼酸水溶液中且产物用 EtOAc 萃取。有机层用碳酸氢盐水溶液和盐水洗涤， 然后经 MgSO4 干燥并真空蒸发。 粗混合物通过快速柱色谱 (SiO2， 1.5％ MeOH/DCM) 来纯化， 得到白色 1 固体产物 (250mg， 66％收率 )。 H NMR(CD3OD)δ1.07(q， J ＝ 7.1Hz， 2H)， 1.18(dd， J ＝ 9.5， 4.3Hz， 1H)， 1.23-1.29(m， 1H)， 1.43(q， J ＝ 6.1Hz， 1H)， 1.47(s， 9H)， 1.88(q， J ＝ 5.5Hz， 1H)， 2.25(q， J ＝ 8.5Hz， 1H)， 2.30(dd， J ＝ 9.5， 4.6Hz， 1H)， 2.51(dd， J ＝ 13.5Hz， 1H)， 2.93-2.97(m， 1H)， 3.77(d， J ＝ 11.9Hz， 1H)， 3.89(dd， J ＝ 11.6， 4.1Hz， 1H)， 4.32(t， J＝
8.3Hz， 1H)， 5.12(d， J ＝ 10.4Hz， 1H)， 5.31(d， J ＝ 17.1Hz， 1H)， 5.76( 宽单峰， 1H)， 6.93(s， 1H)， 7.16(t， J ＝ 4.3Hz， 1H)， 7.41(t， J ＝ 6.9Hz， 1H)， 7.46(t， J ＝ 7.5Hz， 2H)， 7.54(d， J＝ + 4.9Hz， 1H)， 7.68( 宽单峰， 2H)， 8.06(d， J ＝ 7.6Hz， 2H)。LC-MS MS m/z 678(M +H)。
步骤 4 ：
向实施例 1 步骤 3 的产物 (0.707g， 1.04mmol) 在 1 ∶ 1DCM ∶ DCE(20mL) 中的溶 液中加入 TFA(10mL)。在室温搅拌 0.5 小时后， 将反应混合物真空浓缩。将所得到的残留物 重新溶解在 DCE(20mL) 中并重新浓缩。然后将所得到的棕色粘稠油状物溶解在 DCM(3mL) 中并逐滴加到快速搅拌的 1N HCl 在 Et2O(100mL) 中的溶液中。 所形成的沉淀物通过真空过 滤来得到 [ 灰白色固体 (0.666g， 98％收率 )] 并用 Et2O 洗涤。LC-MS MS m/z 579(M++H)。
步骤 5 ：
向 实 施 例 1 步 骤 4 的 产 物 (240.0mg， 0.368mmol)、 DIEA(0.277g， 2.14mmol) 和 (+/-)-2-(4， 6- 二甲基吡啶 -2- 基氨基 )-3- 甲基丁酸 (0.135g， 0.610mmol， 购自 Specs， 分 类号 AP-836/41220382) 在 DCM(4mL) 中的混合物中加入 HATU(210.1mg， 0.552mmol)。将反 应混合物在室温搅拌 8 小时。再加入 HATU(070.0mg， 0.184mmol) 和 (+/-)-2-(4， 6- 二甲基 吡啶 -2- 基氨基 )-3- 甲基丁酸 (0.141.0mg， 0.0.184mmol) 并将所得到的混合物再搅拌 8 小时以试图使反应进一步接近完全。将混合物真空浓缩， 溶解在 EtOAc(50mL) 中并用 1.0M HCl 水溶液 (2×5mL) 洗涤。合并的盐酸洗涤液用 EtOAc(50mL) 反萃取。合并有机物并用 10％ NaHCO3 水溶液 (50mL) 和盐水洗涤， 然后经 MgSO4 干燥， 过滤并浓缩。通过反相制备性 HPLC(Sunfire 制备性 HPLC 柱， 溶剂 A ＝ H2O( 含有 0.1％ TFA)， 溶剂 B ＝ MeOH( 含有 0.1％ TFA)， 梯度为 15％ A 历时 30 分钟至 100％ B) 来纯化， 得到经 LCMS 确定具有相同 m/z 的两 种产物。合并每种产物的 HPLC 馏分， 浓缩， 用 1N HCl 和 MeOH 处理， 然后重新浓缩并真空干 燥， 得到单盐酸盐产物。 将反相制备性 HPLC 所洗脱的第一异构体标记为化合物 1A(91.0mg， 28.9％ ) 且将所洗脱的第二异构体标记为化合物 1B(16.9mg， 5.4％ )。 1
化 合 物 1A ： H NMR(500MHz， MeOD)δppm 1.01(d， J ＝ 6.7Hz， 3H)， 1.09(d， J＝ 6.7Hz， 3H)， 1.11-1.17(m， 2H)， 1.20-1.32(m， 2H)， 1.44-1.49(m， 1H)， 1.94(dd， J ＝ 8.2， 5.5Hz， 1H)， 2.18-2.24(m， 3H)， 2.25-2.35(m， 2H)， 2.34-2.38(m， 3H)， 2.39-2.49(m， 2H)， 2.63(dd， J ＝ 13.4， 7.0Hz， 1H)， 2.94-3.03(m， 1H)， 4.15-4.28(m， 2H)， 4.52(d， J ＝ 7.6Hz， 1H)， 4.58-4.65(m， 1H)， 5.17(d， J ＝ 10.4Hz， 1H)， 5.36(d， J ＝ 17.1Hz， 1H)， 5.73-5.86(m， 1H) ， 6.00(s ， 1H) ， 6.59(s ， 1H) ， 6.75(s ， 1H) ， 6.90-6.93(m ， 1H) ， 7.17-7.23(m ， 1H) ， 7.44-7.55(m， 3H)， 7.56-7.62(m， 1H)， 7.70-7.80(m， 2H)， 8.15(d， J ＝ 7.3Hz， 2H)。LC-MS MS + m/z 783(M +H)。 1
化合物 1B ： H NMR(500MHz， MeOD)δppm 0.96(d， J ＝ 6.4Hz， 6H)， 1.00-1.14(m， 4H)， 1.30-1.38(m， 1H)， 1.39-1.45(m， 1H)， 1.93(dd， J ＝ 8.1， 5.3Hz， 1H)， 2.03-2.15(m， 1H)， 2.32(q， J ＝ 8.7Hz， 1H)， 2.40-2.42(m， 3H)， 2.43-2.48(m， 3H)， 2.58-2.67(m， 1H)， 2.82-2.92(m， 2H)， 4.19-4.28(m， 1H)， 4.62(dd， J ＝ 16.6， 7.2Hz， 2H)， 5.17(d， J ＝ 11.9Hz， 1H)， 5.35(d， J ＝ 17.1Hz， 1H)， 5.73-5.83(m， 1H)， 6.01(s， 1H)， 6.69(s， 1H)， 6.83(s， 1H)， 6.96(s， 1H)， 7.18-7.25(m， 1H)， 7.43-7.55(m， 3H)， 7.57-7.63(m， 1H)， 7.72-7.77(m， 1H)， + 7.80(s， 1H)， 8.15(d， J ＝ 7.3Hz， 2H)， 9.53(s， 1H)。LC-MS MS m/z 783(M +H)。
实施例 2 ： 化合物 2 的制备
方案 2步骤 1 ：
实施例 2 步骤 1 的产物通过与实施例 1 步骤 3 的产物相同的操作起始于 Boc-Hyp-OH 而非实施例 1 步骤 2 的产物来制备。1H NMR(500MHz， MeOD)δppm 1.09(d， J ＝ 7.63Hz， 2H)1.16-1.22(m， 1H)1.25-1.32(m， 1H)1.42(dd， J ＝ 9.46， 5.49Hz， 1H)1.47(s， 1.7H)1.50(s， 7.3H)1.88(dd， J ＝ 8.09， 5.34Hz， 1H)1.94-2.03(m， 1H)2.13(dd， J ＝ 12.97， 6.87Hz， 1H)2.26(q， J ＝ 8.85Hz， 1H)2.97(ddd， J ＝ 12.51， 8.09， 4.73Hz， 1H)3.47(d， J＝ 11.60Hz， 1H)3.56-3.62(m， 1H)4.25(dd， J ＝ 9.61， 6.87Hz， 1H)4.42(s， 1H)5.15(d， J ＝ 10.38Hz， 1H)5.34(d， J ＝ 17.09Hz， 1H)5.74-5.85(m， 1H)。LCMS， MS m/z ＝ 442(M-H) 。
步骤 2 ：
向 实 施 例 2 步 骤 1 的 产 物 (1.0g， 2.25mmol) 在 DCM(20mL) 中 的 溶 液 中 加 入 1， 1’ - 羰 基 二 咪 唑 (439mg， 2.71mmol)。 在 室 温 搅 拌 3 小 时 后， 加 入 4- 氟 异 二 氢 吲 哚 ( 根 据 L.M.Blatt 等 人， PCT 国 际 申 请 (2005)， 244 页， WO 2005037214 中 描 述 的 操 作 来 制 备 )(617mg， 4.50mmol) 并 将 所 得 到 的 混 合 物 在 室 温 搅 拌 过 夜。 反 应 混 合 物 用
EtOAc(100mL) 稀释并用 2×10mL 1N HCl 水溶液洗涤。水层用 2×50mL EtOAc 萃取。合 并的有机层用盐水洗涤， 经 MgSO4 干燥并浓缩， 得到暗棕色粘稠油状物。粗混合物通过 快速柱色谱 (SiO2， 97 ∶ 3 和 95 ∶ 5DCM ∶ MeOH) 来纯化， 得到灰色泡沫状固体 (1.3g， 1 95 ％ 收 率 )。 HNMR(500MHz， 氯 仿 -D)δppm 1.29-1.37(m， 2H)1.38-1.45(m， 2H)1.47(s， 9H)1.95-2.00(m， 1H)2.07-2.14(m， 1H)2.28-2.35(m， 1H)2.37-2.46(m， 1H)2.90-2.97(m， 1H)3.65(d， J ＝ 12.80Hz， 1H)3.72(d， J ＝ 12.50Hz， 1H)4.26(t， J ＝ 7.02Hz， 1H)4.68(d， J ＝ 9.46Hz， 2H)4.77(d， J ＝ 9.16Hz， 2H)5.15(d， J ＝ 10.38Hz， 1H)5.29(d， J ＝ 17.10Hz， 1H)5.33(s， 1H)5.73-5.84(m， 1H)6.97(t， J ＝ 8.70Hz， 1H)7.01(d， J ＝ 7.63Hz， 1H)7.28(dd， + J ＝ 8.09， 2.90Hz， 1H)10.00(s， 1H)。LC-MS MSm/z 629(M +Na)。
步骤 3 ：
实施例 2 步骤 3 的产物以 94％的收率由实施例 2 步骤 2 的产物通过与就制备实 施例 1 步骤 4 的产物所述相同的操作来制备。1H NMR(500MHz， MeOD)δppm 1.05-1.11(m， 1H)1.11-1.17(m， 1H)1.18-1.23(m， 1H)1.27-1.34(m， 1H)1.40(dd， J ＝ 9.61， 5.65Hz， 1H)1.98(dd， J ＝ 7.93， 5.80Hz， 1H)2.27-2.33(m， 1H)2.36(q， J ＝ 8.80Hz， 1H)2.75(dd， J ＝ 14.34 ， 7.32Hz ， 1H)2.96-3.03(m ， 1H)3.65-3.75(m ， 2H)4.61-4.67(m ， 1H)4.78(s ， 2H)5.19(d ， J ＝ 10.38Hz ， 1H)5.36(d ， J ＝ 17.09Hz ， 1H)5.48(s ， 1H)5.64-5.73(m ， 1H)7.06(t， J ＝ 8.70Hz， 1H)7.17(dd， J ＝ 16.17， 7.63Hz， 1H)7.37(q， J ＝ 7.63Hz， 1H)。 LC-MS + MS m/z 507(M +H)。 步骤 4 ：
实施例 2 步骤 4 的产物由实施例 2 步骤 3 的产物通过与就制备实施例 1 步骤 5 的 产物所述相同的操作来制备， 其中化合物 2A 的收率为 24.9％且化合物 2B 的收率为 8.4％。 1
化 合 物 2A ： H NMR(500MHz， MeOD)δppm 1.03(d， J ＝ 4.9Hz， 3H)， 1.11(d， J＝ 5.5Hz， 3H)， 1.13-1.20(m， 2H)， 1.24-1.30(m， 2H)， 1.45(dd， J ＝ 9.5， 5.2Hz， 1H)， 1.93(dd， J ＝ 8.1 ， 5.3Hz ， 1H) ， 2.23-2.32(m ， 2H) ， 2.35(s ， 3H) ， 2.48(s ， 3H) ， 2.49-2.55(m ， 1H) ， 2.94-3.03(m， 1H)， 4.03-4.10(m， 1H)， 4.20(d， J ＝ 12.2Hz， 1H)， 4.54(t， J ＝ 7.6Hz， 1H)， 4.62(d， J ＝ 6.4Hz， 1H)， 4.67(s， 1H)， 4.71-4.78(m， 4H)， 5.17(d， J ＝ 10.1Hz， 1H)， 5.35(d， J ＝ 17.1Hz， 1H)， 5.50(d， J ＝ 3.7Hz， 1H)， 5.75-5.86(m， 1H)， 6.67(s， 1H)， 6.86(s， 1H)， + 7.18(d， J ＝ 7.6Hz， 2H)， 7.32-7.41(m， 1H)。LC-MS MS m/z 711(M +H)。 1
化 合 物 2B ： H NMR(500MHz， MeOD)δppm 1.03-1.13(m， 8H)， 1.26-1.32(m， 1H)， 1.38-1.42(m， 1H)， 1.91(dd， J ＝ 8.1， 5.3Hz， 1H)， 2.20-2.36(m， 4H)， 2.44(s， 3H)， 2.49(s， 3H)， 2.83-2.90(m， 2H)， 2.91-2.99(m， 1H)， 3.14-3.25(m， 1H)， 4.11-4.18(m， 2H)， 4.50-4.56(m， 1H)， 4.65-4.69(m， 1H)， 4.71(s， 1H)， 4.77(d， J ＝ 5.8Hz， 4H)， 5.16(d， J ＝ 11.6Hz， 1H)， 5.35(d， J ＝ 17.1Hz， 1H)， 5.50(s， 1H)， 5.70-5.81(m， 1H)， 6.72(s， 1H)， 7.14(d， J ＝ 7.3Hz， 1H)， 7.19(d， J ＝ 7.9Hz， 1H)， 6.85(s， 1H)， 7.05(d， J ＝ 9.2Hz， 1H)， + 7.33-7.41(m， 1H)。LC-MS MS m/z711(M +H)。
实施例 3 ： 化合物 3 的制备
实施例 3 的方案 1步骤 1 ：
向 3- 甲氧基苯胺 (300g， 2.44mol) 和苯甲酰基乙酸乙酯 (234.2g， 1.22mol) 在 甲苯 (2.0L) 中的溶液中加入 HCl( 浓度为 4.0N 的二噁烷溶液， 12.2mL， 48.8mmol)。使用 Dean-Stark 装置将所得到的溶液回流 6.5 小时 ( 收集约 56mL 水溶液 )。将混合物冷却 至室温， 用 HCl 水溶液 (10％， 3×500mL)、 NaOH 水溶液 (1.0N， 2×200mL) 和水 (3×200mL) 分配多次， 将有机层干燥 (MgSO4)， 过滤并真空浓缩， 得到油状残留物 (329.5g)。使用 Dean-Stark 装置将粗产物在油浴 (280℃ ) 中加热 80 分钟 ( 收集约 85mL 液体 )。将反应 混合物冷却至室温， 固体残留物用 CH2Cl2(400mL) 研磨， 将所得到的混悬液过滤且滤饼再用 CH2Cl2(2×150mL) 洗涤。 将所得到的固体真空干燥 (50℃； 1托 ； 1 天 )， 得到分析纯的产物， 其 1 为浅棕色固体 (60.7g， 总计 20％ )。 H NMR(DMSO-d6)δ3.86(s， 3H)， 6.26(s， 1H)， 6.94(dd， J ＝ 9.0， 2.4Hz， 1H)， 7.21(d， J ＝ 2.4Hz， 1H)， 7.55-7.62(m， 3H)， 7.80-7.84(m， 2H)， 8.00(d， 13 J ＝ 9.0Hz， 1H)， 11.54(s， 1H)。 CNMR(DMSO-d6)δ55.38， 99.69， 107.07， 113.18， 119.22， 126.52， 127.17， 128.97， 130.34， 134.17， 142.27， 149.53， 161.92， 176.48。LC-MS MS m/z + 252(M +1)。
步骤 2 ：
将步骤 1 的产物 (21.7g， 86.4mmol) 混悬在 POCl3(240mL) 中。将混悬液回流 2 小 时。真空除去 POCl3 后， 将残留物在乙酸乙酯 (1L) 和冷的 NaOH 水溶液 ( 由 200mL 1.0N NaOH 和 20mL 10.0N NaOH 来制备 ) 之间分配并搅拌 15 分钟。有机层用水 (2×200mL) 和盐 水 (200mL) 洗涤， 干燥 (MgSO4) 并真空浓缩， 得到所需产物 (21.0g， 90％ )， 其为浅棕色固体。 1 H NMR(DMSO-d6)δ3.97(s， 3H)， 7.36(dd， J ＝ 9.2， 2.6Hz， 1H)， 7.49-7.59(m， 4H)， 8.08(d， J 13 ＝ 9.2Hz， 1H)， 8.19(s， 1H)， 8.26-8.30(m， 2H)。 C NMR(DMSO-d6)δ55.72， 108.00， 116.51， 119.52， 120.48， 124.74， 127.26， 128.81， 130.00， 137.58， 141.98， 150.20， 156.65， 161.30。 + LC-MS MS m/z 270(M +1)。
实施例 3 的方案 2
步骤 1 ：
将 1-( 叔丁氧基羰基氨基 )-2- 乙烯基环丙烷羧酸乙酯的 (1R， 2S) 和 (1S， 2R) 的外消旋混合物 (9.39g， 36.8mmol) 溶解在 4N HCl/ 二噁烷 (90mL， 360mmol) 中并在室温 搅拌 2 小时。将反应混合物浓缩， 以定量收率得到所需产物 (7g， 100％ )。1H NMR(CD3OD) δ1.32(t， J ＝ 7.1， 3H)， 1.72(dd， J ＝ 10.2， 6.6Hz， 1H)， 1.81(dd， J ＝ 8.3， 6.6Hz， 1H)， 2.38(q， J ＝ 8.3Hz， 1H)， 4.26-4.34(m， 2H)， 5.24(dd， 10.3， 1.3Hz， 1H)5.40(d， J ＝ 17.2， 1H)， 5.69-5.81(m， 1H)。
实施例 3 的方案 3
步骤 1 ：
在 0℃向 Boc-4R- 羟基脯氨酸 (16.44g， 71.1mmol) 在 DMSO(250mL) 中的混悬液中 加入 t-BuOK( 叔丁醇钾 )(19.93g， 177.6mmol)。 将所得到的混合物搅拌 1.5 小时， 然后历时 1 小时分三批加入方案 1 步骤 2 的产物 (21.02g， 77.9mmol)。将反应混合物搅拌一天， 倒入 冷水 (1.5L) 中并用乙醚 (4×200mL) 洗涤。将水溶液酸化至 pH 4.6， 过滤， 得到白色固体， 1 并真空干燥， 得到产物 (32.5g， 98％ )。 H NMR(DMSO-d6)δ1.32， 1.35( 两个单峰 ( 旋转异
构 体 )， 9H)， 2.30-2.42(m， 1H)， 2.62-2.73(m， 1H)， 3.76(m， 2H)， 3.91(s， 3H)， 4.33-4.40(m， 1H)， 5.55(m， 1H)， 7.15(dd， J ＝ 9.2， 2.6Hz， 1H)， 7.37(d， J ＝ 2.6Hz， 1H)， 7.42-7.56(m， 4H)， + 7.94-7.99(m， 1H)， 8.25， 8.28(2s， 2H)， 12.53( 宽单峰， 1H)。LC-MS MS m/z 465(M +1)。
步骤 2A ：
在 0 ℃ 历 时 10 分 钟 向 步 骤 1 的 产 物 (11.0g， 23.7mmol)、 方案 2 步骤 1 的产物 (5.40g， 28.2mmol) 和 NMM(20.8mL， 18.9mmol) 在 500mL 50％ CH2Cl2/THF 中的溶液中分三批加入偶联剂溴三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐 (Pybrop)(16.0g， 34.3mmol)。 将溶液在室温搅拌 一天， 然后用 pH 4.0 缓冲液 (4×50mL) 洗涤。有机层用饱和 NaHCO3 水溶液 (100mL) 洗涤， 含水洗涤液用乙酸乙酯 (150mL) 萃取且有机层用 pH 4.0 缓冲液 (50mL) 和饱和 NaHCO3 水溶 液 (50mL) 反洗涤。 将有机溶液干燥 (MgSO4)， 过滤， 浓缩并通过快速柱色谱 (SiO2， 用 50％乙 酸乙酯 / 己烷洗脱 ) 来纯化， 得到所需产物的 (1R， 2S) 和 (1S， 2R)P1 异构体的 1 ∶ 1 混合 物 ( 超过 7.5g， 总计 50％ )， 或者可选择地， 用 15％至 60％乙酸乙酯 / 己烷缓慢梯度洗脱， 得到 3.54g(25％ ) 所洗脱的高 Rf(1R， 2S)P1 异构体和 3.54g(25％ ) 所洗脱的低 Rf(1S， 2R) P1 异构体。 1
(1R， 2S)P1 异 构 体 的 数 据 ： H NMR(CDCl3)δ1.21(t， J ＝ 7Hz， 3H)， 1.43(s， 9H)， 1.47-1.57(m， 1H)， 1.88(m， 1H)， 2.05-2.19(m， 1H)， 2.39(m， 1H)， 2.88(m， 1H)， 3.71-3.98(m， 2H)， 3.93(s， 3H)， 4.04-4.24(m， 2H)， 4.55(m， 1H)， 5.13(d， J ＝ 10Hz， 1H)， 5.22-5.40(m， 1H)， 5.29(d， J ＝ 17Hz， 1H)， 5.69-5.81(m， 1H)， 7.02( 宽单峰， 1H)， 7.09(dd， J ＝ 9， 2Hz， 1H)， 13 7.41-7.52(m， 4H)， 7.95(d， J ＝ 9Hz， 1H)， 8.03， 8.05(2s， 2H)。 C NMR(CDCl3)δ ： 14.22， 22.83 ， 28.25 ， 33.14 ， 33.58 ， 39.92 ， 51.84 ， 55.47 ， 58.32 ， 61.30 ， 75.86 ， 81.27 ， 98.14 ， 107.42， 115.00， 117.84， 118.27， 122.63， 123.03， 127.50， 128.72， 129.26， 133.39， 140.06， + 151.23， 159.16， 160.34， 161.35， 169.78， 171.68。LC-MS MS m/z 602(M +1)。 1
(1S， 2R)P1 异 构 体 的 数 据 ： H NMR δ1.25(t， J ＝ 7Hz， 3H)， 1.44(s， 9H)， 1.46-1.52(m ， 1H) ， 1.84(m ， 1H) ， 2.12-2.21(m ， 1H) ， 2.39(m ， 1H) ， 2.94(m ， 1H) ， 3.82(m ， 2H)， 3.97(s， 3H)， 4.05-4.17(m， 2H)， 4.58(m， 1H)， 5.15(d， J ＝ 10.8Hz， 1H)， 5.33(d， J ＝ 17Hz， 1H)， 5.30-5.43(m， 1H)， 5.72-5.85(m， 1H)， 7.05(s， 1H)， 7.13(dd， J ＝ 9， 2Hz， 1H)， + 7.46-7.60(m， 4H)， 7.98(d， J ＝ 9， 1H)， 8.06-8.10(m， 2H)。LC-MSMS m/z 602(M +1)。
步骤 2B ：
将方案 2 步骤 1 的产物 (7.5g， 39.1mmol) 与二异丙基乙基胺 (32.5mL， 186mmol) 在 二氯甲烷 (150mL) 中的溶液混合。 向所得到的混合物中加入 HOBT 水合物 (6.85g， 44.7mmol) 和步骤 1 的产物 (17.3g， 37.3mmol)， 接着加入 HBTU(16.96g， 44.7mmol)。 立即出现轻微放热 并将混合物在室温搅拌过夜。然后将混合物真空浓缩并重新溶解在乙酸乙酯 (600mL) 中。 然后溶液用水 (2×200mL) 洗涤， 然后用 10％碳酸氢钠水溶液 (2×200mL) 洗涤， 然后用水 (150mL) 洗涤， 最后用盐水 (150mL) 洗涤。有机物经无水硫酸镁干燥， 过滤并将滤液真空浓 缩， 得到米色玻璃状固体。分多批 ( 每批 7g) 通过快速色谱 (SiO2， 用 66％己烷 / 乙酸乙酯 洗脱 ) 来纯化， 得到 (1R， 2S)P1 异构体， 其为首先洗脱的异构体 ( 总计 9.86g， 44.0％收率 )， 接着洗脱 (1S， 2R)P1 异构体， 其为第二洗脱的异构体 ( 总计 10.43g， 46.5％收率 )。回收总 计 1.97g 混合馏分， 转化为两种非对映异构体的总转化率为 99.3％。 1
(1R， 2S)P1 异构体的数据 ： H NMR( 甲醇 -d4)δ1.23(t， J ＝ 7.2Hz， 3H)， 1.4(s， 4H)， 1.45(s， 6H)， 1.73(dd， J ＝ 7.9， 1.5Hz， 0.4H)， 1.79(dd， J ＝ 7.8， 2.4Hz， 0.6H)， 2.21(q， J ＝ 8.2Hz， 1H)， 2.44-2.49(m， 1H)， 2.66-2.72(m， 0.4H)， 2.73-2.78(m， 0.6H)， 3.93-3.95(m， 2H)， 3.96(s， 3H)， 4.10-4.17(m， 2H)， 4.44(q， J ＝ 7.8Hz， 1H)， 5.13(d， J ＝ 10.7Hz， 1H)， 5.31(d， J ＝ 17.7Hz， 0.4H)， 5.32(d， J ＝ 17.4Hz， 0.6H)， 5.49( 宽单峰， 1H)， 5.66-5.82(m， 1H)， 7.16(dd， J ＝ 9.2， 2.5Hz， 1H)， 7.26(s， 1H)， 7.42(d， J ＝ 2.4Hz， 1H)， 7.48-7.55(m， 3H)， + 8.02-8.05(m， 3H)。LC-MS MS m/z 602(M +1)。1 (1S， 2R)P1 异构体的数据 ： H NMR( 甲醇 -d4)δ1.23(t， J ＝ 7.2Hz， 3H)， 1.40(s， 3.5H)， 1.43(s， 6.5H)， 1.8(dd， J ＝ 7.2， 5.3Hz， 0.4H)， 1.87(dd， J ＝ 7.8， 5.7Hz， 0.6H)， 2.16(q， J ＝ 8.9Hz， 0.6H)， 2.23(q， J ＝ 8.85Hz， 0.4H)， 2.42-2.50(m， 1H)， 2.67-2.82(m， 1H)， 3.87-3.95(m， 2H)， 3.96(s， 3H)， 4.07-4.19(m， 3H)， 4.41-4.47(m， 1H)， 5.09-5.13(m， 1H)， 5.30(dd， J ＝ 17.09， 0.92Hz， 1H)， 5.48(s， 1H)， 5.70-5.77(m， 1H)， 7.15(dd， J ＝ 9.16， 2.44Hz， 1H)， 7.25(s， 1H)， 7.41(d， J ＝ 2.14Hz， 1H)， 7.48-7.55(m， 3H)， 8.02-8.05(m， 3H)。 + LC-MS MS m/z 602(M +1)。
实施例 3 的方案 4
步骤 1 ：
方案 3 步骤 2 的 (1R， 2S)P1 异构体 (9.86g， 16.4mmol) 用 1N NaOH(50mL， 50mmol) 在 THF(150mL) 和甲醇 (80mL) 的混合物中的溶液处理 12 小时。将混合物真空浓缩直到 仅残留水相。加入水 (100mL) 并缓慢加入 1N HCl 直到达到 pH 3。然后混合物用乙酸乙 酯 (3×200mL) 萃取且合并的有机萃取物用盐水洗涤， 经无水硫酸钠干燥并过滤。将滤 液真空浓缩， 得到所需产物， 其为白色粉末 (9.2g， 98 ％收率 )。1H NMR(CD3OD)δ1.41(s，
2H)， 1.45(s， 9H)， 1.77(dd， J ＝ 7.9， 5.5Hz， 1H)， 2.16-2.21(m， 1H)， 2.44-2.51(m， 1H)， 2.74-2.79(m， 1H)， 3.93-3.96(m， 2H)， 3.98(s， 3H)， 4.44(t， J ＝ 7.9Hz， 1H)， 5.11(d， J ＝ 9.5Hz， 1H)， 5.30(d， J ＝ 17.1Hz， 1H)， 5.52(s， 1H)， 5.79-5.86(m， 1H)， 7.22(dd， J ＝ 9.16， 2.14Hz， 1H)， 7.32(s， 1H)， 7.43(d， J ＝ 2.14Hz， 1H)， 7.54-7.60(m， 3H)， 8.04(dd， J ＝ 7.8， + 1.4Hz， 2H)， 8.08(d， J ＝ 9.1Hz， 1H)。LC-MS MS m/z 574(M +1)。
步骤 2 ：
将 步 骤 1 的 产 物 (7.54g， 13.14mmol) 与 CDI(3.19g， 19.7mmol) 和 DMAP(2.41g， 19.7mmol) 在无水 THF 中的溶液混合并将所得到的混合物加热至回流且保持 45 分钟。 将稍微不透明的混合物冷却至室温并向其中加入环丙基磺酰胺 (1.91g， 15.8g)。加入 DBU(5.9mL， 39.4mmol) 后， 混合物变得澄清。将棕色溶液搅拌过夜。然后将混合物真空浓 缩， 得到油状物并重新溶解在乙酸乙酯 (500mL) 中。溶液用 pH 4 缓冲液 (3×200mL) 洗涤 且合并的缓冲液洗涤液用乙酸乙酯 (200mL) 反萃取。合并的有机物用盐水 (150mL) 洗涤， 经无水硫酸钠干燥并过滤。将滤液真空浓缩， 得到米色固体。粗产物通过快速色谱 (SiO2， 用 25 ％己烷 / 乙酸乙酯洗脱 ) 来纯化， 得到所需产物 (5.85g， 66 ％收率 )。1HNMR(CD3OD) δ1.03-1.09(m， 2H)， 1.15-1.28(m， 2H)， 1.40-1.44(m， 2H)， 1.46(s， 9H)， 1.87(dd， J ＝ 8.1， 5.6Hz， 1H)， 2.21-2.27(m， 1H)， 2.36-2.42(m， 1H)， 2.65(dd， J ＝ 13.7， 6.7Hz， 1H)， 2.93-2.97(m， 1H)， 3.90-3.96(m， 2H)， 4.00(s， 3H)， 4.40(dd， J ＝ 9.5， 7.0Hz， 1H)， 5.12(d， J ＝ 10.4Hz， 1H)， 5.31(d， J ＝ 17.4Hz， 1H)， 5.64(s， 1H)， 5.73-5.80(m， 1H)， 7.30(dd， J＝ 9.2， 2.1Hz， 1H)， 7.40(s， 1H)， 7.47(s， 1H)， 7.61-7.63(m， 3H)， 8.04-8.05(m， 2H)， 8.15(d， J + ＝ 9.5Hz， 1H)。LC-MS MS m/z677(M +1)。 步骤 3A ：
步骤 2 的产物 (5.78g， 8.54mmol) 用 4.0M HCl 在 1， 4- 二噁烷中的溶液 (50mL， 200mmol) 处理过夜。将反应混合物真空浓缩并在 50℃真空烘箱中放置几天。得到所需产 1 物， 其为米色粉末 (5.85g， 定量 )。 H NMR( 甲醇 -d4)δ1.03-1.18(m， 3H)， 1.26-1.30(m， 1H)， 1.36-1.40(m， 2H)， 1.95(dd， J ＝ 8.2， 5.8Hz， 1H)， 2.37(q， J ＝ 8.9Hz， 1H)， 2.51-2.57(m， 1H)， 2.94-2.98(m， 1H)， 3.09(dd， J ＝ 14.6， 7.3Hz， 1H)， 3.98(d， J ＝ 3.7Hz， 1H)， 3.99(s， 1H)， 4.08(s， 3H)， 4.80(dd， J ＝ 10.7， 7.6Hz， 1H)， 5.15(dd， J ＝ 10.2， 1.4Hz， 1H)， 5.32(dd， J ＝ 17.1， 1.2Hz， 1H)， 5.61-5.69(m， 1H)， 5.99(t， J ＝ 3.7Hz， 1H)， 7.51(dd， J ＝ 9.3， 2.3Hz， 1H)， 7.59(d， J ＝ 2.4Hz， 1H)， 7.65(s， 1H)， 7.72-7.79(m， 3H)， 8.09(dd， J ＝ 7.0， 1.5Hz， 2H)， + 8.53(d， J ＝ 9.2Hz， 1H)。LC-MS MS m/z 577(M +1)。
步骤 3B ：
向 (2S， 4R)-2-((1R， 2S)-1-( 环丙基磺酰基氨甲酰基 )-2- 乙烯基环丙基氨甲酰 基 )-4-(7- 甲氧基 -2- 苯基喹啉 -4- 基氧基 ) 吡咯烷 -1- 羧酸叔丁酯即步骤 2 的产物 (3.0g， 4.43mmol) 在 1 ∶ 1DCM(25mL)/DCE(25.00mL) 中的溶液中加入三氟乙酸 (25mL， 324mmol)。 在 25℃搅拌 0.5 小时后， 将所得到的棕色反应混合物浓缩， 得到棕色粘稠油状物， 将其重新 溶解在 DCE(50mL) 中并重新浓缩。 将残留物溶解在 DCM(10mL) 中并逐滴加到 1N HCl 在 Et2O 中的溶液 (50mL， 50.0mmol) 中。过滤所得到的浅棕色沉淀物， 用 1N HCl 在 Et2O(40mL) 中
的溶液洗涤并在 50℃真空烘箱中干燥 1 小时， 得到 (2S， 4R)-N-((1R， 2S)-1-( 环丙基磺酰基 氨甲酰基 )-2- 乙烯基环丙基 )-4-(7- 甲氧基 -2- 苯基喹啉 -4- 基氧基 ) 吡咯烷 -2- 甲酰胺二盐酸盐 (2.8g， 4.31mmol， 97％收率 )， 其为浅棕色固体。1H-NMR 显示产物含有约 0.75 当量四甲基脲副产物 ( 在 2.83ppm 处的单峰信号 )， 但该物质无需进一步纯化即用于下一 步。1H NMR(500MHz， MeOD)δppm 1.0-1.2(m， 3H)， 1.2-1.3(m， 1H)， 1.4(dd， J ＝ 9.5， 5.5Hz， 2H)， 1.9(dd， J ＝ 7.9， 5.8Hz， 2H)， 2.4(q， J ＝ 8.7Hz， 1H)， 2.5-2.6(m， 1H)， 2.9-2.9(m， 1H)， 3.1(dd， J ＝ 14.6， 7.3Hz， 1H)， 4.0-4.0(m， 2H)， 4.1(s， 3H)， 4.8-4.9(m， 1H)， 5.1(dd， J ＝ 10.4， 1.5Hz， 1H)， 5.3(dd， J ＝ 17.2， 1.4Hz， 1H)， 5.6-5.7(m， 1H)， 6.0(s， 1H)， 7.5(dd， J ＝ 9.3， 2.3Hz， 1H)， 7.6(d， J ＝ 2.4Hz， 1H)， 7.7(s， 1H)， 7.7-7.8(m， 3H)， 8.1(d， J ＝ 6.7Hz， 2H)， + 8.6(d， J ＝ 9.2Hz， 1H)。LC-MS MS m/z 577.2(M +H)。
步骤 4A ：
向 步 骤 3A 的 产 物 (0.671mmol) 在 DCM(10mL) 中 的 溶 液 中 加 入 DIEA(542μL， 3.36mmol)、 HATU(354mg， 1.01mmol)、 HOAt(127mg， 1.01mmol) 和 Boc-L-Tle-OH(173mg， 0.805mmol)。在室温搅拌 16 小时后， 将溶剂浓缩且所得到的棕色粘稠油状物通过快速柱色 谱 (SiO2， 用 95％ MeOH/DCM 洗脱 ) 来纯化， 得到微黄色泡沫状物 (527mg， 99％收率 )。LC-MS + MS m/z 790(M +1)。
步骤 4B ：
向 (2S， 4R)-N-((1R， 2S)-1-( 环 丙 基 磺 酰 基 氨 甲 酰 基 )-2- 乙 烯 基 环 丙 基 )-4-(7- 甲氧基 -2- 苯基喹啉 -4- 基氧基 ) 吡咯烷 -2- 甲酰胺二盐酸盐即步骤 3B 的产 物 (1.2g， 1.847mmol)、 N， N- 二异丙基乙胺 (1.126mL， 6.47mmol) 和 Boc-L-Tle-OH(0.513g， 2.217mmol) 在 DCM(15mL) 中的溶液中加入 HATU(1.054g， 2.77mmol)。将所得到的浅棕色 反应混合物在室温搅拌 13 小时， 将反应混合物浓缩， 重新溶解在 EtOAc(50mL) 中并用 1N HCl 水溶液 (25mL) 洗涤。酸性水层用 EtOAc(50mL) 萃取。合并有机层， 用 10 ％ Na2CO3 水 溶液 (20mL) 和盐水洗涤， 经 MgSO4 干燥并浓缩。所得到的粘稠棕色油状物通过快速柱色谱 (SiO2， 用 95 ∶ 5DCM ∶ MeOH 洗脱 ) 来纯化， 得到 (S)-1-((2S， 4R)-2-((1R， 2S)-1-( 环丙基 磺酰基氨甲酰基 )-2- 乙烯基环丙基氨甲酰基 )-4-(7- 甲氧基 -2- 苯基喹啉 -4- 基氧基 ) 吡咯烷 -1- 基 )-3， 3- 二甲基 -1- 氧代丁 -2- 基氨基甲酸叔丁酯， 其为浅棕色泡沫状物， 所 述泡沫状物的纯度足以用于下一步。然而， 为了通过 NMR 对分析性样品进行表征， 85mg 该 产物通过反相 HPLC 来进一步纯化， 其中使用下述溶剂系统和条件 ： 溶剂 A ＝ H2O， 溶剂 B ＝ MeOH， 两者均含有 0.1 ％ TFA ； 50 ％ B 历时 20 分钟至 100 ％ B， 在 100 ％ B 保持 4 分钟。合 并的 HPLC 馏分用 1N NaOH 水溶液中和并浓缩直到所残留的大部分为水。所得到的白色乳 状混合物用 EtOAc(2×25mL) 萃取。合并有机层， 用盐水洗涤， 经 MgSO4 干燥， 浓缩并真空 1 干燥， 得到分析纯的白色粉末严物。 H NMR(500MHz， MeOD)δppm 0.9-1.0(m， 2H)， 1.0(s， 9H)， 1.1-1.2(m， 1H)， 1.2-1.2(m， 3H)， 1.3(s， 9H)， 1.4-1.4(m， 1H)， 1.9(dd， J ＝ 7.9， 5.5Hz， 1H)， 2.2(q， J ＝ 8.7Hz， 1H)， 2.3-2.3(m， 1H)， 2.6(dd， J ＝ 13.9， 6.9Hz， 1H)， 2.9-3.0(m， 1H)， 3.9(s， 3H)， 4.0-4.1(m， 1H)， 4.2(d， J ＝ 9.5Hz， 1H)， 4.5-4.5(m， 2H)， 5.1(d， J ＝ 11.0Hz， 1H)， 5.3(d， J ＝ 17.1Hz， 1H)， 5.5(s， 1H)， 5.7-5.8(m， 1H)， 6.6(d， J ＝ 9.5Hz， 1H)， 7.1(dd， J ＝ 9.0， 1.7Hz， 1H)， 7.2(s， 1H)， 7.4(d， J ＝ 1.8Hz， 1H)， 7.5-7.5(m， 3H)， 8.0(t， J ＝ 7.3Hz， 13 3H)。 C NMR(126MHz， MeOD)δppm 5.6， 5.8， 17.6， 22.6， 26.1， 27.6， 31.2， 34.7， 35.0， 35.2， 41.7， 42.8， 54.4， 55.1， 59.5， 59.9， 77.2， 79.5， 99.2， 106.4， 115.5， 117.6， 117.9， 118.4， 123.3 ， 128.0 ， 128.8 ， 129.7 ， 133.3 ， 140.1 ， 151.0 ， 151.1 ， 157.1 ， 160.2 ， 161.0 ， 162.3 ，169.8， 172.5， 174.0。LC-MS MS m/z 790.30(M++H)。
步骤 5A ：
步骤 4A 的产物 (950mg， 1.20mmol) 在 DCM(75mL) 中的溶液用 TFA(25mL) 缓慢处理 以控制 CO2 气体的剧烈鼓泡。在室温搅拌 1.5 小时后， 将溶剂浓缩， 得到浅棕色浆液并加入 Et2O 以发生沉淀。浅棕色产物 (1.10g， 99％收率 ) 二 TFA 盐通过真空过滤来得到且无需进 + 一步纯化即使用。LC-MS MS m/z690(M +1)。
步骤 5B ：
向 (S)-1-((2S， 4R)-2-((1R， 2S)-1-( 环丙基磺酰基氨甲酰基 )-2- 乙烯基环丙基 氨甲酰基 )-4-(7- 甲氧基 -2- 苯基喹啉 -4- 基氧基 ) 吡咯烷 -1- 基 )-3， 3- 二甲基 -1- 氧代 丁 -2- 基氨基甲酸叔丁酯即步骤 4B 的产物 (1.00g， 1.266mmol) 在 DCM(5mL) 和 DCE(1 ∶ 1， 5.00mL) 中的溶液中加入三氟乙酸 (5mL， 64.9mmol)。 在 25℃搅拌 15 分钟后， 将反应混合物 浓缩。将所得到的粘稠棕色油状物重新溶解在 DCM(3mL) 中并逐滴加到剧烈搅拌的 1N HCl 在 Et2O 中的溶液 (50mL) 中。过滤所得到的浅棕色沉淀物， 用 Et2O(25mL) 洗涤并在 50 ℃ 真空烘箱中干燥 2 小时， 得到 (2S， 4R)-1-((S)-2- 氨基 -3， 3- 二甲基丁酰基 )-N-((1R， 2S)-1-( 环丙基磺酰基氨甲酰基 )-2- 乙烯基环丙基 )-4-(7- 甲氧基 -2- 苯基喹啉 -4- 基 氧基 ) 吡咯烷 -2- 甲酰胺二盐酸盐 (0.907g， 1.189mmol， 94 ％收率 )， 其为浅棕色固体， 所述固体的纯度足以用于下一步。然而， 为了通过 NMR 对分析性样品进行表征， 80mg 产 物通过反相 HPLC 来进一步纯化， 其中使用下述溶剂系统和条件 ： 溶剂 A ＝ H2O， 溶剂 B ＝ MeOH， 两者均含有 0.1 ％ TFA ； 15 ％ B 历时 20 分钟至 100 ％ B， 在 100 ％ B 保持 4 分钟。合 并的 HPLC 馏分用 1N HCl 水溶液 (3mL) 处理， 浓缩至干并真空干燥， 得到二盐酸盐产物， 1 其 为 白 色 粉 末。 HNMR(500MHz， MeOD)δppm 1.0-1.1(m， 4H)， 1.2(s， 9H)， 1.2-1.3(m， 2H)， 1.4(s， 1H)， 1.9(s， 1H)， 2.3(d， J ＝ 5.8Hz， 1H)， 2.4(s， 1H)， 2.8-2.9(m， 1H)， 2.9-3.0(m， 1H)， 4.1(s， 3H)， 4.2(s， 2H)， 4.6(d， J ＝ 8.2Hz， 1H)， 4.8(s， 1H)， 5.1(d， J ＝ 10.4Hz， 1H)， 5.3(d， J ＝ 17.1Hz， 1H)， 5.6-5.7(m， 1H)， 5.9(s， 1H)， 7.5(d， J ＝ 8.2Hz， 1H)， 7.6-7.7(m， 13 2H)， 7.7-7.8(m， 3H)， 8.1(d， J ＝ 4.0Hz， 2H)， 8.5(d， J ＝ 8.5Hz， 1H)。 CNMR(MeOD)δppm 5.0(s)， 5.8， 5.8， 22.4， 25.9， 31.3， 34.6， 34.9， 35.0， 41.8， 42.8， 54.7， 56.1， 59.5， 60.5， 80.4， 99.8， 101.5， 115.1， 117.9， 120.9， 125.8， 129.2， 129.8， 132.3， 132.9， 133.1， 142.7， + 157.2， 165.6， 166.8， 168.2， 169.4， 173.2。LC-MS MSm/z 690.2(M +H)。
步骤 6A ：
向步骤 5A 的产物 (0.132g， 0.143mmol) 在 DCM(2mL) 中的溶液中加入聚乙烯基吡 啶 (PVP)(0.046g， 0.429mmol) 和 Fmoc- 异硫氰酸酯 (0.042g， 0.150mmol)。 将所得到的棕色 溶液在室温搅拌。 16 小时后， 除去溶剂且残留物通过快速柱色谱 (SiO2， 用 95 ∶ 5DCM ∶ MeOH 洗脱 ) 来纯化， 得到浅棕色固体产物 (0.126mg， 91％收率 )。
步骤 6B ：
向 (2S， 4R)-1-((S)-2- 氨基 -3， 3- 二甲基丁酰基 )-N-((1R， 2S)-1-( 环丙基磺酰 基氨甲酰基 )-2- 乙烯基环丙基 )-4-(7- 甲氧基 -2- 苯基喹啉 -4- 基氧基 ) 吡咯烷 -2- 甲 酰胺二盐酸盐即步骤 5B 的产物 (0.500g， 0.656mmol) 和 N， N- 二异丙基乙胺 (0.343mL， 1.967mmol) 在 DCM(8mL) 中的溶液中加入 Fmoc- 异硫氰酸酯 (0.240g， 0.852mmol)。将所得 到的棕色反应混合物在 25℃搅拌 16 小时。 将反应混合物浓缩， 残留物用 EtOAc(50mL) 吸收并用 0.1N HCl 水溶液 (10mL) 洗涤。水层用 EtOAc(25mL) 萃取。合并有机层， 用盐水洗涤， 经 MgSO4 干燥并浓缩， 得到黄色固体粗产物， 其通过快速柱色谱 (SiO2， 用 95 ∶ 5DCM ∶ MeOH 洗脱 ) 来纯化， 得到 (2S， 4R)-1-((S)-2-(3-(((9H- 芴 -9- 基 ) 甲氧基 ) 羰基 ) 硫脲基 )-3， 3- 二甲基丁酰基 )-N-((1R， 2S)-1-( 环丙基磺酰基氨甲酰基 )-2- 乙烯基环丙基 )-4-(7- 甲 氧基 -2- 苯基喹啉 -4- 基氧基 ) 吡咯烷 -2- 甲酰胺 (615.4mg， 0.634mmol， 97 ％收率 )， 其 为浅黄色固体， 所述固体的纯度足以用于下一步。然而， 45mg 产物通过反相 HPLC 来进一 步纯化， 其中使用下述溶剂系统和条件 ： 溶剂 A ＝ H2O， 溶剂 B ＝ MeOH， 两者均含有 0.1 ％ TFA ； 50％ B 历时 20 分钟至 100％ B， 在 100％ B 保持 4 分钟。注意 ： 使用 0.5mL DMF 和 1mL MeOH 来溶解 HPLC 样品以防止样品在 HPLC 柱中析出。浓缩合并的 HPLC 馏分直到所残留的 大部分为水， 然后加入 1N NaOH 水溶液以中和白色乳状混合物， 然后其用 EtOAc(2×25mL) 萃取。合并有机层， 经 MgSO4 干燥并浓缩， 得到分析纯的样品， 其为白色粉末， 所述粉末用 1 于 LC/MS 和 NMR 分析。 HNMR(500MHz， MeOD)δppm 1.0-1.0(m， 2H)， 1.1(s， 9H)， 1.2-1.2(m， 2H)， 1.2(t， J ＝ 7.2Hz， 1H)， 1.3(s， 1H)， 1.4(dd， J ＝ 9.3， 5.3Hz， 1H)， 1.9(dd， J ＝ 8.1， 5.6Hz， 1H)， 2.0(s， 1H)， 2.2(q， J ＝ 8.7Hz， 1H)， 2.4-2.4(m， 1H)， 2.7(dd， J ＝ 14.2， 6.9Hz， 1H)， 2.9-2.9(m， 1H)， 4.0(s， 3H)， 4.1-4.1(m， 1H)， 4.2(t， J ＝ 6.9Hz， 1H)， 4.4-4.5(m， 2H)， 4.6(dd， J ＝ 10.7， 7.0Hz， 1H)， 4.8(d， J ＝ 7.3Hz， 1H)， 5.0(d， J ＝ 12.2Hz， 1H)， 5.1(dd， J ＝ 10.4， 1.2Hz， 1H)， 5.3(dd， J ＝ 17.2， 1.1Hz， 1H)， 5.6-5.7(m， 1H)， 5.8(s， 1H)， 7.3-7.3(m， 3H)， 7.4(t， J ＝ 7.5Hz， 2H)， 7.4(d， J ＝ 2.1Hz， 1H)， 7.5(s， 1H)， 7.6(d， J ＝ 7.0Hz， 2H)， 7.6-7.7(m， 3H)， 7.8(d， J ＝ 7.6Hz， 2H)， 8.0(dd， J ＝ 7.6， 1.8Hz， 2H)， 8.2(d， J ＝ 9.2Hz， 13 1H)， 10.3(d， J ＝ 7.3Hz， 1H)。 C NMR(MeOD)δppm 5.6， 5.6， 13.5， 22.0， 26.3， 31.2， 34.7， 34.8， 35.4， 42.0， 42.8， 47.0， 54.2， 55.8， 60.0， 60.5， 64.3， 64.4， 68.1， 79.8， 100.9， 101.3， 115.3 ， 117.7 ， 120.0 ， 120.2 ， 125.1 ， 125.2 ， 127.3 ， 128.0 ， 128.7 ， 129.6 ， 132.1 ， 133.2 ， 141.6 ， 143.6 ， 143.8 ， 144.7 ， 154.1 ， 157.9 ， 164.8 ， 165.5 ， 169.4 ， 170.6 ， 172.0 ， 174.1 ， + 180.8， 180.9， 188.0。LC-MS MS m/z971.18(M +H)。
步骤 7 ：
向 步 骤 6 的 产 物 (0.342mg， 0.352mmol) 在 DMF(4mL) 中 的 溶 液 中 加 入 哌 啶 (0.805mL)。 将所得到的棕色溶液混合物在室温搅拌过夜。 溶剂和过量的哌啶使用旋转蒸发 仪来减压除去， 得到所需产物， 且还得到 1 当量 1-((9H- 芴 -9- 基 ) 甲基 ) 哌啶副产物。 所得 + 到的粗产物混合物无需进一步纯化即用于下一步。 LC-MS MS m/z 749(M +H)。 向上述残留物 (77.3mg， 0.076mmol) 在 DMF(2mL) 中的溶液中加入 1- 溴 -2- 丁酮 (23.0mg， 0.152mmol)。 在 室温搅拌 16 小时后， 将反应混合物浓缩且产物通过柱色谱来纯化， 得到化合物 3。LC-MSMS + m/z 801.31(M +H)。
实施例 4 ： 化合物 4 的制备
化合物 4 通过与就制备化合物 3 的产物所述相同的操作来制备， 其中用 1- 溴 -3， + 3- 二甲基 -2- 丁酮代替 1- 溴 -2- 丁酮。LC-MS MS m/z 829.38(M +H)。
实施例 5 ： 化合物 5 的制备
化合物 5 通过与就制备化合物 3 的产物所述相同的操作来制备， 其中用 3- 溴 -1， + 1， 1- 三氟丙酮代替 1- 溴 -2- 丁酮。LC-MS MS m/z 841.28(M +H)。
生物学研究
HCV NS3/4A 蛋白酶复合酶测定和基于细胞的 HCV 复制子测定用于本发明， 并如下 制备、 进行和验证 ：
重组 HCV NS3/4A 蛋白酶复合物的制备
来自 BMS 株、 H77 株或者 J4L6S 株的 HCV NS3 蛋白酶复合物如下制备。制备这些 经纯化的重组蛋白以在均质测定 ( 见下 ) 中使用， 从而显示本发明化合物如何有效地抑制 HCV NS3 蛋白水解活性。
来自 HCV 感染患者的血清得自 Dr.T.Wright， San Francisco Hospital。HCV 基 因组 (BMS 株 ) 的工程化全长 cDNA( 互补脱氧核糖核酸 ) 模板由以下 DNA 片段来构建， 所述 DNA 片段如下得到 ： 对血清 RNA( 核糖核酸 ) 进行反转录 PCR(RT-PCR) 且使用基于其它基因 型 1a 株之间的同源性而选择的引物。通过确定完整基因组序列且根据 Simmonds 等人的分 类方法 ( 参见 PSimmonds， KA Rose， S Graham， SW Chan， F McOmish， BC Dow， EA Follett， PLYap and H Marsden， J.Clin.Microbiol.， 31(6) ： 1493-1503(1993)) 将基因型 1a 归属为 HCV 隔离群。 非结构区域中的氨基酸序列 NS2-5B 被证实与 HCV 基因型 1a(H77) 具有＞ 97％ 的相同且与基因型 1b(J4L6S) 具有＞ 87％的相同。感染性克隆 H77( 基因型 1a) 和感染性 克隆 J4L6S( 基因型 1b) 得自 R.Purcell(NIH)， 且序列公开在 Genbank 中 (AAB67036， 参见 Yanagi， M.， Purcell， R.H.， Emerson， S.U. 和 Bukh， J.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94(16) ： 8738-8743(1997) ； AF054247， 参见 Yanagi， M.， St Claire， M.， Shapiro， M.， Emerson， S.U.， Purcell， R.H. 和 Bukh， J， Virology 244(1)， 161-172.(1998))。
H77 株和 J4L6S 株用于制备重组 NS3/4A 蛋白酶复合物。这些株中编码重组 HCV
NS3/4A 蛋白酶复合物 ( 氨基酸 1027 至 1711) 的 DNA 如 P.Gallinari 等人所述那样来处 理 ( 参见 Gallinari P， Paolini C， Brennan D， Nardi C， Steinkuhler C， De Francesco R.Biochemistry.38(17) ： 5620-32， (1999))。简单来说， 在 NS4A 编码区域的 3’ - 端加入三 赖氨酸增溶尾部。将位于 NS4A-NS4B 裂解位点中 P1- 位的半胱氨酸 ( 氨基酸 1711) 变为甘 氨酸以避免赖氨酸标签的蛋白水解性裂解。此外， 通过 PCR 在氨基酸 1454- 位将半胱氨酸 变异为丝氨酸以防止 NS3 解螺旋酶区域的自溶性裂解。按照经修改的 P.Gallinari 等人所 述的规程 ( 参见 Gallinari P， Brennan D， Nardi C， BrunettiM， Tomei L， Steinkuhler C， De Francesco R.， J Virol.72(8) ： 6758-69(1998))， 将变体 DNA 片段克隆至 pET21b 细菌表 达载体 (Novagen) 中， 且在大肠杆菌株 BL21(DE3)(Invitrogen) 中表达 NS3/4A 复合物。简 单来说， NS3/4A 蛋白酶复合物的表达用 0.5 毫摩尔浓度 (mM) 的异丙基 β-D-1- 硫代吡喃 半乳糖苷 (IPTG) 在 20℃诱导 22 小时 (h)。常规发酵 (1 升 (L)) 得到约 10 克 (g) 湿的细 胞团块。将细胞重新混悬在细胞溶解缓冲液中 (10mL/g)[ 所述细胞溶解缓冲液含有 25mM N-(2- 羟基乙基 ) 哌嗪 -N’ -(2- 乙磺酸 )(HEPES)(pH 7.5)、 20％甘油、 500mM 氯化钠 (NaCl)、 0.5％ Triton X-100、 1 微克 / 毫升 (“μg/mL” ) 溶菌酶、 5mM 氯化镁 (MgCl2)、 1μg/ml DNA 酶 I、 5mM β- 巯基乙醇 (βME)、 蛋白酶抑制剂 - 乙二胺四乙酸 (EDTA)( 游离的 )(Roche)]， 匀化， 并在 4℃培养 20 分钟 (min)。对匀浆进行超声波处理并通过在 4℃以 235000G 超速 离心 1 小时而变得澄清。将咪唑加到上清液中至终浓度为 15mM 并将 pH 调节至 8.0。将粗 蛋白提取物加载到用缓冲液 B(25mM HEPES(pH 8.0)、 20％甘油、 500mM NaCl、 0.5％ Triton X-100、 15mM 咪唑、 5mM βME) 预平衡的镍 - 氨基三乙酸 (Ni-NTA) 柱上。样品以 lmL/min 的 流速来加载。柱用 15 倍柱体积的缓冲液 C( 与缓冲液 B 相同但含有 0.2％ Triton X-100) 洗涤。蛋白质用 5 倍柱体积的缓冲液 D( 与缓冲液 C 相同但含有 200mM 咪唑 ) 洗脱。
合并含有 NS3/4A 蛋白酶复合物的馏分并加载到用缓冲液 D(25mMHEPES(pH 7.5)、 20％甘油、 300mM NaCl、 0.2％ Triton X-100、 10mM βME) 预平衡的脱盐柱 Superdex-S200 上。样品以 lmL/min 的流速来加载。合并含有 NS3/4A 蛋白酶复合物的馏分并浓缩至约 0.5mg/ml。来自 BMS、 H77 和 J4L6S 株的 NS3/4A 蛋白酶复合物的纯度通过 SDS-PAGE 和质谱 分析而确定为大于 90％。将酶贮存在 -80℃， 在冰上解冻， 稀释， 然后在测定缓冲液中使用。
FRET 肽测定以监测 HCV NS3/4A 蛋白水解活性
该体外测定的目的是测量本发明化合物对上述来自 BMS 株、 H77 株或者 J4L6S 株 的 HCV NS3 蛋白酶复合物的抑制。该测定显示了本发明化合物如何有效地抑制 HCV NS3 蛋 白水解活性。
为了监测 HCVNS3/4A 蛋白酶活性， 使用 NS3/4A 肽底物。底物为 RETS1( 共振能量 转移缩酚酸肽底物 ； AnaSpec， Inc. 目录号 22991)(FRET 肽 )( 参见 Taliani et al.， Anal. Biochem.240(2) ： 60-67(1996))。 该肽的序列不精确地基于 HCV NS3 蛋白酶所针对的 NS4A/ NS4B 天然裂解位点， 不同的是在裂解位点存在酯连接基而非酰胺键。所述肽还在其一端附 近含有荧光供体 EDANS 及在另一端附近含有荧光受体 DABCYL。 通过供体和受体之间的分子 间共振能量转移 (RET) 将肽的荧光淬灭， 但当 NS3 蛋白酶使肽裂解时， 产物不再发生 RET 淬 灭且供体的荧光变得明显。
在不存在或者存在本发明化合物的情况下， 将肽底物与三种重组 NS3/4A 蛋白酶 复合物之一一起培养。 化合物的抑制作用如下确定 ： 使用 Cytofluor 4000 系列来实时监测荧光反应产物的形成。
试剂如下 ： HEPES 和甘油 ( 超纯的 ) 得自 GIBCO-BRL。二甲基亚砜 (DMSO) 得自 Sigma。β- 巯基乙醇得自 Bio Rad。
测 定 缓 冲 液： 50mM HEPES(pH 7.5) ； 0.15MNaCl ； 0.1 ％ Triton ； 15 ％ 甘 油 ； 10mMβME。底物 ： 2μM 终浓度 ( 由 2mM 在 DMSO 中的储备液 ( 贮存在 -20℃ ) 稀释 )。HCV NS3/4A 蛋白酶 1a(1b) 型 ： 2-3nM 终浓度 ( 由 5μM 在 25mMHEPES(pH 7.5)、 20％甘油、 300mM NaCl、 0.2％ Triton-X 100、 10mM βME 中的储备液稀释 )。对于效能接近测定极限的化合 物， 如下使测定变得较灵敏 ： 将 50μg/ml 牛血清白蛋白 (Sigma) 加到测定缓冲液中并将蛋 白酶终浓度降至 300pM。
测定在 96 孔聚苯乙烯黑色板 (Falcon) 中进行。每个孔含有 NS3/4A 蛋白酶复合 物在测定缓冲液中的 25μl 溶液、 本发明化合物在 10％ DMSO/ 测定缓冲液中的 50μl 溶液 和底物在测定缓冲液中的 25μl 溶液。对照溶液 ( 无化合物 ) 也在同一测定板中制备。将 酶复合物与化合物或者对照溶液混合 1 分钟， 然后通过加入底物来引发酶反应。测定板立 即使用 Cytofluor 4000 系列 (Perspective Biosystems) 来读取。 将仪器设定为在 25℃读 取 340nm 的发射波长和 490nm 的激发波长。反应通常进行约 15 分钟。
抑制百分数用下述方程式计算 ：
100-[(δF 抑制剂 /δF 对照 )×100]
其中 δF 为曲线线性范围内的荧光变化。将非线性曲线拟合应用于抑制 - 浓度 数据， 且 50 ％有效浓度 (IC50) 通过 Excel XLfit 软件使用方程式 y ＝ A+((B-A)/(1+((C/ x)^D))) 来计算。
发现所测试的所有化合物都抑制 NS3/4A 蛋白酶复合物的活性， 其中 IC50 为 135nM 或者更小。此外， 发现用多于一种类型的 NS3/4A 复合物测试的本发明化合物具有类似的抑 制性质， 尽管与 1a 株相比， 化合物都显示出对 1b 株的较大效能。
特异性测定
进行特异性测定以证实与其它丝氨酸或者半胱氨酸蛋白酶相比， 本发明化合物就 抑制 HCV NS3/4A 蛋白酶复合物而言具有体外选择性。
本发明化合物的特异性用多种丝氨酸蛋白酶 ( 人中性粒细胞弹性蛋白酶 (HNE)、 猪胰弹性蛋白酶 (PPE) 和人胰糜蛋白酶 ) 和一种半胱氨酸蛋白酶 ( 人肝组织蛋白酶 B) 确 定。在所有情况下， 如前所述 (PCT 专利申请 WO 00/09543) 使用 96 孔板形式规程 ( 对于 丝氨酸蛋白酶测定进行一些修改 )， 所述规程使用专属于每种酶的荧光性氨基 - 甲基 - 香 豆素 (AMC) 底物。所有酶购自 Sigma 和 EMDbiosciences， 而底物来自 Bachem、 Sigma 和 EMDbiosciences。
化合物的浓度为 100 至 0.4μM， 这取决于它们的效能。酶测定各自如下引发 ： 将 底物加到在室温预培养 10 分钟的酶 - 抑制剂中并水解至转化率为 15％ ( 用 Cytofluor 测 量 )。
每项测定的最终条件如下 ：
50mM 三 ( 羟基甲基 ) 氨基甲烷盐酸盐 (Tris-HCl)(pH 8)、 0.5M 硫酸钠 (Na2SO4)、 50mM NaCl、 0.1mM EDTA、 3％ DMSO、 0.01％吐温 -20、 5μMLLVY-AMC 和 1nM 糜蛋白酶。
50mM Tris-HCl(pH 8.0)、 50mM NaCl、 0.1mM EDTA、 3％ DMSO、 0.02％吐温 -20、 5μM琥珀酸 -AAPV-AMC 和 20nM HNE 或者 8nM PPE。
100mM NaOAc( 乙酸钠 )(pH 5.5)、 3％ DMSO、 1mM TCEP( 三 (2- 羧基乙基 ) 膦盐酸 盐 )、 5nM 组织蛋白酶 B( 使用前将酶储备液在含有 20mM TCEP 的缓冲液中活化 ) 和在 H2O 中 稀释的 2μM Z-FR-AMC。
抑制百分数使用下式来计算 ：
[1-((UV 抑制剂 -UV 空白 )/(UV 对照 -UV 空白 ))]×100
将非线性曲线拟合应用于抑制 - 浓度数据， 且 50％有效浓度 (IC50) 通过使用 Excel XLfit 软件来计算。
HCV 复制子的制备
HCV 复制子全细胞系统如 Lohmann V， Korner F， Koch J， Herian U， Theilmann L， Bartenschlager R.， Science 285(5424) ： 110-3(1999) 中所述来建立。该系统能够评价本 发明 HCV 蛋白酶化合物对 HCV RNA 复制的作用。简单来说， 使用 Lohmann 论文中描述的 HCV 1b 株序列 ( 登录号为 AJ238799)， HCV cDNA 由 Operon Technologies， Inc.(Alameda， CA) 来合成， 然后使用标准分子生物学技术将全长复制子组装到质粒 pGem9zf(+)(Promega， Madison， WI) 中。所述复制子包括 (i) 与壳体蛋白中的前 12 个氨基酸融合的 HCV 5’ UTR、 (ii) 新霉素磷酸转移酶基因 (neo)、 (iii) 来自脑心肌炎病毒 (EMCV) 的 IRES 和 (iv)HCV NS3 至 NS5B 基因和 HCV 3’ UTR。质粒 DNA 用 ScaI 线性化， 且 RNA 转录物使用 T7MegaScript 转录试剂盒 (Ambion， Austin， TX) 根据制造商说明书来在体外合成。将 cDNA 的体外转录物 转染到人肝瘤细胞系 HUH-7 中。在选择性标志物新霉素 (G418) 存在下将组成性表达 HCV 复制子的细胞选择出来。所得到的细胞系用正链和负链 RNA 随时间的产生和蛋白质随时间 的产生来表征。
HCV 复制子 FRET 测定
开发出 HCV 复制子 FRET 测定以监测本发明化合物对 HCV 病毒复制的抑制作用。 使 组成性表达 HCV 复制子的 HUH-7 细胞在 Dulbecco 改进的 Eagle 培养基 (DMEM)(Gibco-BRL) ( 含有 10％胎牛血清 (FCS)(Sigma) 和 1mg/mlG418(Gibco-BRL)) 中生长。在测定前夜将细 胞接种在 96 孔组织培养无菌板中 (1.5×104 个细胞 / 孔 )。化合物和无化合物的对照在稀 释板中在 DMEM( 含有 4％ FCS、 1 ∶ 100 青霉素 / 链霉素 (Gibco-BRL)、 1 ∶ 100L- 谷氨酰胺 和 5％ DMSO) 中制备 (DMSO 在测定中的终浓度为 0.5％ )。将化合物 /DMSO 混合物加到细 胞中并在 37℃培养 4 天。4 天后， 首先就细胞毒性而言对细胞进行评价， 其中使用 Alamar Blue(Trek Diagnotstic 系统 ) 以读取 CC50。化合物的毒性 (CC50) 通过将 1/10 倍体积 的 Alamar Blue 加到培养细胞的培养基中来确定。4 小时后， 来自每个孔的荧光信号使用 Cytofluor 4000 系列 (Perspective Biosystems) 来读取， 其中激发波长为 530nm 且发射波 长为 580nm。然后板用磷酸盐缓冲盐水 (PBS)(3 次 150μl) 充分淋洗。细胞用 25μl 细胞 溶解测定试剂溶解， 所述细胞溶解测定试剂含有 HCV 蛋白酶底物 (5× 细胞萤光素酶细胞培 养溶解试剂 (Promega#E153A) 用蒸馏水稀释至 1× 且加入 NaCl 至终浓度为 150mM 且 FRET 肽底物 ( 如以上就酶测定所述 ) 由 2mM 在 100％ DMSO 中的储备液稀释至终浓度为 10μM)。 然后将板置于 Cytofluor 4000 仪器中， 已将所述仪器设定为 340nm 激发波长 /490nm 发射 波长， 以自动化模式运行 21 个周期， 且在动力学模式中对板进行读取。如就确定 IC50 所述 那样来确定 EC50。HCV 复制子萤光素酶报告子测定
作为第二种测定， 复制子 FRET 测定中确定的 EC50 在复制子萤光素酶报告子测定 中得以证实。复制子萤光素酶报告子测定的使用首先由 Krieger 等人描述 (Krieger N， Lohmann V， and Bartenschlager R， J.Virol.75(10) ： 4614-4624(2001))。 用于本申请 FRET 测定的复制子构建体如下修饰 ： 插入对花虫萤光素酶基因人化形式进行编码的 cDNA 和与 萤光素酶基因 3’ - 端直接融合的连接子序列。该插入片段使用位于核心中且在新霉素标 志物基因直接上游的 Asc1 限制位点来引入到复制子构建体中。还在 1179- 位引入了适应 性变异 ( 丝氨酸至异亮氨酸 )(Blight KJ， Kolykhalov， AA， Rice， CM， Science 290(5498) ： 1972-1974)。组成性表达该 HCV 复制子构建体的稳定细胞系如上得到。萤光素酶报告子测 定如就 HCV 复制子 FRET 测定所述那样来建立， 其中具有下述修改。在 37℃ /5％ CO2 培养 箱中培养 4 天后， 细胞的花虫萤光素酶活性使用 Promega Dual-Glo 萤光素酶测定系统来分 析。从含有细胞的每个孔中除去培养基 (100μl)。向剩余的 50μl 培养基中加入 50μl Dual-Glo 萤光素酶试剂， 并将板在室温振摇 10 分钟至 2 小时。 然后将 Dual-Glo Stop &Glo 试剂 (50μl) 加到每个孔中， 并将板在室温再振摇 10 分钟至 2 小时。 板在 Packard TopCount NXT 上使用发光程序来读取。
抑制百分数使用下式来计算 ：
对值进行作图且使用 XLfit 来分析以得到 EC50 值。
本发明代表性化合物在 HCV 酶测定、 HCV 复制子细胞测定和 / 或者所述几种特异 性测定中来评价。例如， 在酶测定中发现化合物 2A 对 NS3/4ABMS 株的 IC50 为 8.9 纳摩尔浓 度 (nM)。用公开的 H77 株 (IC50 为 1.4nM) 和 J4L6S 株 (IC50 为 1.2nM) 得到了类似的效能 值。复制子 FRET 测定中的 EC50 值为 69nM。
在特异性测定中， 发现同一化合物具有下述活性 ： HLE ＝ 4.6μM ； PPE ＞ 100μM ； 糜蛋白酶＝ 2.1μM ； 组织蛋白酶 B ＞ 100μM。这些结果表明， 该族化合物对 NS3 蛋白酶具 有高度特异性， 且多种这些化合物抑制 HCV 复制子的复制。
测试了本发明化合物且发现它们具有下述活性 ：
IC50 活性范围 (NS3/4ABMS 株 ) ： A 为＞ 0.2μM ； B 为 0.02-0.2μM ； C 为 4-20nM。
EC50 活性范围 ( 对于所测试的化合物 ) ： A 为＞ 1μM ； B 为 0.1-1μM ； C 为 14-100nM。
表2
本领域技术人员应该理解的是， 本发明不限于上述示例性实施例， 且在不背离本 发明基本属性的情况下本发明可按其它具体形式来实施。 因此， 应该理解的是， 所述实施例 在各个方面都应该被视为示例性而非限制性， 应该参考所附权利要求书而非上述实施例， 且落入权利要求书的等价意义和范围内的所有变化形式都应该包括在本发明范围内。52