一种应用硅胶柱层析分离去氢紫堇碱的方法 ( 一 ) 技术领域
本发明涉及应用硅胶柱层析从元胡粗提物中分离得到高纯度去氢紫堇碱的方法。 ( 二 ) 背景技术
元胡 (Corydalis yanhusuo W.T.Wang) 为罂粟科 (Popaveraceae) 植物延胡索的 干燥块茎， 性味辛、 苦、 温， 归肝、 脾经， 主产于浙江、 江苏、 安徽、 四川等省， 元胡是著名的 “浙 八味” 之一。 元胡具有活血、 利气、 止痛的作用， 可用于胸胁、 脘腹疼痛， 经闭痛经， 产后瘀阻， 跌扑肿痛。现代研究表明元胡有效成分主要是生物碱， 据报道， 元胡中生物碱大约有 40 余 种， 主要包括 ： 延胡索乙素、 原阿片碱、 去氢紫堇碱 (Dehydrocorydaline) 等数十种生物碱。 现代药理实验已经证明元胡所含的生物碱中延胡索乙素为主要的镇痛、 镇静成分， 去氢紫 堇碱具有扩张冠状血管， 提高冠脉血流量， 改善心肌营养性血流量， 增强心肌耐缺氧能力及 保护心肌缺血、 坏死等作用， 为治疗冠心病、 心绞痛药物元胡制剂 “可达灵” 的有效成分。此 外， 去氢紫堇碱在治疗溃疡病也取得了较好的疗效。
目前， 文献报道去氢紫堇碱的分离有两种 ： 一种是应用标准高速逆流色谱， 此方法 上样量小， 且使用的仪器较昂贵， 难以得到广泛应用 ； 另一种是综合运用各种柱层析 ( 大孔 吸附树脂， 氧化铝柱色谱及凝胶柱色谱 )， 此方法步骤繁琐， 效率低， 且经过多次层析， 样品 的死吸附较大。 ( 三 ) 发明内容
本发明的目的是提供一种分离高纯度去氢紫堇碱的方法， 该方法工艺简单， 分离 效率高， 可用于工业化生产。
本发明的技术方案如下 ：
一种应用硅胶柱层析分离去氢紫堇碱的方法， 所述方法包括以下步骤 ：
(1) 取 200 ～ 300 目的硅胶， 加入氯仿搅拌， 置于超声振荡器中振荡至没有气泡后 倒入层析柱中装柱， 得到硅胶柱 ；
(2) 将元胡的乙醇粗提物用少量氯仿、 甲醇体积比为 50 ∶ 1 混合的溶剂溶解， 制成 供试品溶液， 取供试品溶液作为样品溶液上样， 使样品溶液完全吸附于硅胶上， 所述样品溶 液中元胡的乙醇粗提物与硅胶柱中硅胶的质量比为 1 ∶ 30 ～ 105， 依次用氯仿、 甲醇体积 比为 50 ∶ 1 的洗脱剂洗脱 150 ～ 250min、 氯仿、 甲醇体积比 40 ∶ 1 的洗脱剂洗脱 150 ～ 250min， 氯仿、 甲醇体积比 30 ∶ 1 的洗脱剂洗脱至薄层层析跟踪检测至洗脱液中无去氢紫 堇碱组分， 洗脱剂流速为 1.6 ～ 2.5ml/min， 等体积收集洗脱液， 将收集得到的洗脱液用薄 层层析与高效液相色谱进行检测， 合并与去氢紫堇碱标准品 Rf 值及保留时间相同且去氢紫 堇碱纯度大于 90％的洗脱液， 用旋转蒸发仪回收溶剂， 得到去氢紫堇碱粗品 ；
(3) 步骤 (2) 得到的去氢紫堇碱粗品除色素后用甲醇或氯仿结晶， 得到去氢紫堇 碱纯品。
所述元胡的乙醇粗提物按如下方法制得 ： 取元胡药材粉碎， 用 60 ～ 98％乙醇回流提取 1 ～ 5 次， 合并各次的提取液， 抽滤后滤液减压浓缩至浸膏状， 用酸溶液调 pH 值为 2 ～ 3， 静置 10 ～ 30 小时， 取上清液过滤除去沉淀 ； 滤液用氯仿萃取 1 ～ 5 次， 收集合并氯仿层， 旋转蒸发回收氯仿， 得元胡的乙醇粗提物。
所述的酸溶液为质量浓度为 1 ～ 2％的盐酸水溶液或 1 ～ 2％的硫酸水溶液。
所述步骤 (3) 中， 去氢紫堇碱粗品除色素的方法为下列之一 ：
(A) 去氢紫堇碱粗品用少量无水乙醇溶解色素， 用滴管吸出色素， 剩余物再用甲醇 或氯仿结晶， 得到去氢紫堇碱纯品 ；
(B) 去氢紫堇碱粗品溶于甲醇， 加入少量活性炭， 活性炭的质量用量通常以所得溶 液体积计为 0.01 ～ 0.02g/ml， 搅拌 45 ～ 60min， 过滤除去活性炭， 取滤液旋转蒸发除去溶 剂， 剩余物再用甲醇或氯仿结晶， 得到去氢紫堇碱纯品。
所述步骤 (1) 中装柱是向硅胶中加入氯仿搅拌， 置于超声振荡器中振荡至没有气 泡后倒入层析柱中装柱， 并用双联球加压至硅胶面不再下降。
所述步骤 (2) 中上样是待氯仿与硅胶面齐平后， 用滴管滴加样品溶液至样品完全 吸附于硅胶上。
所述步骤 (2) 中将元胡的乙醇粗提物用少量氯仿、 甲醇体积比为 50 ∶ 1 混合的溶 剂溶解， 所述少量是指刚好能够使元胡的乙醇粗提物完全溶解的量即可， 这是本领域人员 能够理解的。 所 述 步 骤 (2) 中 高 效 液 相 色 谱 的 检 测 条 件 为 ： ODS C18 column(4.6×250mm， 5μm) ； 柱温 ： 30℃； 流动相 ： 乙腈 -0.03mol/L 磷酸二氢钠 (32 ∶ 68， v/v)， 等度洗脱 ； 流速 ： 0.6ml/min ； 检测波长 ： 345nm ； 进样量 ： 20μl。
得到的去氢紫堇碱纯品可进一步用上述高效液相色谱检测条件进行检测， 进一步 确定其为去氢紫堇碱， 纯度大于 98％。
本发明的有益效果在于 ： 本发明分离得到的去氢紫堇碱纯度高， 工艺简单， 回收率 高， 对元胡药材的充分利用有重要作用。
( 四 ) 具体实施方式
下面以具体实施例来对本发明做进一步说明， 但本发明的保护范围不限于此。
实施例 1
取元胡药材 1500g 粉碎后用 22.5L 的 70％乙醇回流提取 30 分钟， 按同样方法提 取 3 次， 合并 3 次的提取液， 抽滤后滤液减压浓缩至浸膏状， 用 2％盐酸溶液调 pH 值为 3， 静 置 15h， 抽滤， 滤液用 4×400mL 氯仿萃取， 合并氯仿层用旋转蒸发仪回收氯仿， 得元胡粗提 物 10.4g。
称取 200-300 目硅胶 25g， 加入 300mL 氯仿， 搅拌， 置于超声振荡器中振荡至没有气 泡后倒入层析柱中装柱， 得到硅胶柱。
称取元胡粗提物 239mg( 样品与硅胶比例为 1 ∶ 105)， 用 4mL 洗脱剂 ( 氯仿 - 甲醇 ＝ 50 ∶ 1(v/v)) 溶解， 得样品溶液。
用滴管将全部样品溶液滴加到硅胶表面并使其完全吸附于硅胶。
依次用氯仿、 甲醇体积比为 50 ∶ 1 的洗脱剂洗脱 250min、 氯仿、 甲醇体积比 40 ∶ 1 的洗脱剂洗脱 250min， 氯仿、 甲醇体积比 30 ∶ 1 的洗脱剂洗脱至薄层层析跟踪检测至洗脱液中无去氢紫堇碱组分， 洗脱剂流速为 2.5ml/min， 用锥形瓶收集洗脱液， 每 50ml 收集一 瓶， 将收集得到的洗脱液用薄层层析与高效液相色谱进行检测， 合并与去氢紫堇碱标准品 Rf 值及保留时间相同且去氢紫堇碱纯度大于 90％的洗脱液， 用旋转蒸发仪回收溶剂， 得到 去氢紫堇碱粗品。
去氢紫堇碱粗品用 3mL 无水乙醇溶解色素， 用滴管将其吸出， 剩余的成分用 5mL 甲 醇结晶， 得到黄色晶体 26mg， 将得到的晶体进行高效液相色谱检测， 进一步确定其为去氢紫 堇碱， 纯度为 99.6％， 回收率为 84.9％ ( 以元胡粗提物计 )。
高效液相色谱的检测条件为 ： ODS C18 column(4.6×250mm， 5μm) ； 柱温 ： 30℃ ； 流 动相 ： 乙腈 -0.03mol/L 磷酸二氢钠 (32 ∶ 68， v/v)， 等度洗脱 ； 流速 ： 0.6ml/min ； 检测波长 ： 345nm ； 进样量 ： 20μl。
实施例 2
称取 200-300 目硅胶 20g， 加入 250mL 氯仿， 搅拌， 置于超声振荡器中振荡至没有气 泡后倒入层析柱中装柱， 得到硅胶柱。
称取实施例 1 提取得到的元胡粗提物 368mg( 样品与硅胶比例为 1 ∶ 54)， 用 5mL 洗脱剂 ( 氯仿 - 甲醇＝ 50 ∶ 1(v/v)) 溶解， 得样品溶液。
用滴管将全部样品溶液滴加到硅胶表面并使其完全吸附于硅胶。
依次用氯仿、 甲醇体积比为 50 ∶ 1 的洗脱剂洗脱 150min、 氯仿、 甲醇体积比 40 ∶ 1 的洗脱剂洗脱 200min， 氯仿、 甲醇体积比 30 ∶ 1 的洗脱剂洗脱至薄层层析跟踪检测至洗脱 液中无去氢紫堇碱组分， 洗脱剂流速为 2.0ml/min， 用锥形瓶收集洗脱液， 每 50ml 收集一 瓶， 将收集得到的洗脱液用薄层层析与高效液相色谱进行检测， 合并与去氢紫堇碱标准品 Rf 值及保留时间相同且去氢紫堇碱纯度大于 90％的洗脱液， 用旋转蒸发仪回收溶剂， 得到 去氢紫堇碱粗品。
去氢紫堇碱粗品用 40mL 甲醇溶解， 加入 0.4g 活性炭， 搅拌 45min， 过滤除去活性 炭， 取滤液旋转蒸发除去溶剂， 剩余物再用 6mL 甲醇结晶， 得到黄色晶体 37mg， 经高效液相 检测确定其为去氢紫堇碱， 纯度 99.6％， 回收率 78.4％ ( 以元胡粗提物计 )。
高效液相色谱的检测条件为 ： ODS Ci8 column(4.6×250mm， 5μm) ； 柱温 ： 30℃ ； 流 动相 ： 乙腈 -0.03mol/L 磷酸二氢钠 (32 ∶ 68， v/v)， 等度洗脱 ； 流速 ： 0.6ml/min ； 检测波长 ： 345nm ； 进样量 ： 20μl。
实施例 3
称取 200-300 目硅胶 9g， 加入 200mL 氯仿， 搅拌， 置于超声振荡器中振荡至没有气 泡后倒入层析柱中装柱， 得到硅胶柱。
称取实施例 1 提取得到的元胡粗提物 296mg( 样品与硅胶比例为 1 ∶ 30)， 用 4mL 洗脱剂 ( 氯仿 - 甲醇＝ 50 ∶ 1(v/v)) 溶解， 得样品溶液。
用滴管将全部样品溶液滴加到硅胶表面并使其完全吸附于硅胶。
依次用氯仿、 甲醇体积比为 50 ∶ 1 的洗脱剂洗脱 150min、 氯仿、 甲醇体积比 40 ∶ 1 的洗脱剂洗脱 150min， 氯仿、 甲醇体积比 30 ∶ 1 的洗脱剂洗脱至薄层层析跟踪检测至洗脱 液中无去氢紫堇碱组分， 洗脱剂流速为 1.6ml/min， 用锥形瓶收集洗脱液， 每 50ml 收集一 瓶， 将收集得到的洗脱液用薄层层析与高效液相色谱进行检测， 合并与去氢紫堇碱标准品 Rf 值及保留时间相同且去氢紫堇碱纯度大于 90％的洗脱液， 用旋转蒸发仪回收溶剂， 得到去氢紫堇碱粗品。
去氢紫堇碱粗品用 55mL 甲醇溶解， 加入 1.1g 活性炭， 搅拌 60min， 过滤除去活性 炭， 取滤液旋转蒸发除去溶剂， 剩余物再用 5mL 氯仿结晶， 得到黄色晶体 30mg， 经高效液相 检测确定为去氢紫堇碱， 纯度 99.4％， 回收率为 78.9％ ( 以元胡粗提物计 )。
高效液相色谱的检测条件为 ： ODS C18 column(4.6×250mm， 5μm) ； 柱温 ： 30℃ ； 流 动相 ： 乙腈 -0.03mol/L 磷酸二氢钠 (32 ∶ 68， v/v)， 等度洗脱 ； 流速 ： 0.6ml/min ； 检测波长 ： 345nm ； 进样量 ： 20μl。6