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聚酮类化合物及其应用
    【技术领域】
     本发明属于医药技术领域， 涉及聚酮类化合物及其应用。背景技术 目前从微生物的代谢产物中分离到 30000 种以上的天然产物， 其中很大一部分都 具有生物活性， 它们有望被开发成药物。已经面世的微生物相关药物已过百种。人们正做 出巨大的努力去探寻和发现更有价值的代谢产物。 而耐药性病原体、 新病原体、 癌症和心脑 血管等疾病快速发展， 因此寻找活性更好、 毒性更低的药物成了当务之急， 由于从传统的陆 生微生物中发现新的活性化合物的速度逐年减缓， 故海洋微生物资源的开发与利用成为当 务之急。
     发明内容 ： 本发明的目的是提供一种聚酮类化合物及其应用。
     本发明涉及从海洋来源微生物的发酵液中提取得到新的聚酮类化合物及其应 用， 具体的说是从采集自南海潮间带红树植物木果楝 Xylocarpus Granatum 的一株真菌 Nigrospora sphaerica 的发酵液中分离得到两个具有一定细胞毒活性及免疫佐剂功能的 新的聚酮类化合物 Rousselianone A'（compound 1） 、 Dimeric sculezonone A（compound 2） 及其应用。
     本发明的目的在于利用中国海洋药物资源 , 寻找新的活性化合物 , 为研究开发药 物提供先导化合物。
     本发明是以采集自南海潮间带红树植物木果楝Xylocarpus Granatum 的一株真菌 Nigrospora sphaerica 的发酵液为原料 , 经溶剂萃取和多种色谱方法分离 , 得到两个新的 聚酮类化合物。采用了质谱、 核磁共振等光谱技术 , 确定了该化合物的结构。
     该化合物的结构如下 :
     其制备方法可通过以下技术方案予以实施 ： 将分离自南海潮间带红树植物 Xylocarpus Granatum 的真菌 Nigrospora sphaerica 大 量 发 酵。16 层 纱 布 过 滤， 将 菌 丝 体 和 发 酵 液 分 离， 发 酵 液 减 压 浓 缩 至 10L， 将浓缩 液分别用乙酸乙酯和正丁醇萃取， 各萃三次， 合并萃取物， 经中低压柱色谱， 硅胶柱色 谱 ,sephadexLH-20 凝胶柱色谱， 高效液相色谱纯化 , 得单体化合物。本发明的化合物具有较好的抗肿瘤活性及免疫抑制作用。具体实施方式
     实施例 1 ： 分离培养基采用马铃薯浸汁 200ml+ 玉米浸汁 8ml+ 蛋白胨 1g+ 葡萄糖 9g+ 陈海水 600ml+ 水 300 ml， 在 23℃条件下， 培养 12 天。发酵培养基采用马铃薯浸汁 200ml+ 玉米 浸汁 5ml+ 蛋白胨 1g + 酵母粉 1g+ 葡萄糖 17g+ NaCl 18 g+ MgCl2 1.3g+ KCl 0.2g+ FePO40.01g+ 水 1000ml， 在 23℃条件下， 以 150rpm 振荡培养 17 天， 发酵量为 70L。
     菌落与菌株生物学特性 ： 发育完全的菌落呈现为灰色毛茸状， 菌丝体具荚膜显褐 色。菌丝体分裂时， 前期为灰色， 后期为深棕色。菌株分生的孢子为黑色球状， 由单细胞构 成， 分生于透明腔状菌丝体的顶端， 粒径一般在 15.3-20.5μm 之间。
     将 Y9-19 菌株的 18S rRNA 序列与 GenBank 中的序列比对， 发现核酸序列与真菌 Nigrospora sp. 相似率达到 95% 以上， 再结合之前观测到的生物学特性及孢子结构分析， 最终将该真菌鉴定为 Nigrospora sphaerica。 海洋来源真菌 Nigrospora sphaerica 的发酵液 70L， 减压浓缩至 10L， 等量乙酸乙酯， 正丁醇萃取三次， 回收溶剂的到浸膏 66.5g， 经中低压液相色谱， 30% 甲醇 / 水洗脱部分过硅 胶柱色谱， 氯仿甲醇梯度洗脱， 得到 10 个流分， 其中氯仿甲醇 100:3 洗脱部分使用 Sephedex LH-20 凝胶柱色谱 （氯仿 ： 甲醇 =1:1 系统） ， 减压硅胶柱色谱 （石油醚 ： 乙酸乙酯 =2:1） ， 最后 使用制备型高效液相色谱 （45% 甲醇水） 得到化合物 1 和 2。 物理常数光谱数据如下 : 化合物 1 Rousselianone A' 黄色针晶 ( 甲醇 ), mp 149-150℃。UV (MeOH) λ max 592, 334, 259nm; IR (KBr) ν max 3246, 2922, 1710, 1603, 1555, 1462, 1384, 1211, 1115, 1048, 976 cm-1。 1 HR-TOF-MS m/z 421.12564 [M+Na]+ (calcd for C22H22O7Na, 421.12577)。 H-NMR (600MHz, DMSO-d 6) δ : 13.24 (1H, s, 1-OH), 12.67 (1H, s, 6-OH), 6.78 (1H, s, H-5), 6.38 (1H, s, H-2), 5.55 (1H, t, J = 6.0Hz, H-19), 4.69 (1H, d, J =6.0Hz, H-18), 3.79 (H, s, 12-OH), 3.25 (1H, s, H-14), 2.79 (1H, s, H-17), 2.20 (1H, s, H-16), 1.84 (1H, s, H-21), 1.79 (1H, s, H-22)。13C-NMR (150MHz, DMSO-d 6) δ 205.6 (C-15), 199.2 (C-11), 197.1 (C-13), 168.8 (C-1), 166.5 (C-3), 165.6 (C-6), 150.1 (C-4), 139.8 (C-20), 137.1 (C-9), 119.1 (C-5), 117.1 (C-19), 113.1 (C-10), 105.5 (C-7), 101.8 (C-8), 97.1 (C-2), 77.5 (C-12), 66.3 (C-18), 51.9 (C-14), 31.1 (C-16), 26.6 (C-17), 25.7 (C-21), 18.3 (C-22). 化合物 2: Dimeric sculezonone A 黄色无定形粉末。UV (MeOH) λ max 593, 343, 260 nm; IR (KBr) ν max 3426, 2923, 1710, 1605, 1458, 1383, 1201, 1146, 1061, 1032 cm-1。HR-TOF-MS m/z 819.2624 [M+Na]+ (calcd for C44H44O14Na, 819.2625). 1H-NMR (600MHz, DMSO-d 6) δ : 13.32 (1H, s, 1-OH), 13.27 (1H, s, 1-OH'), 12.79 (1H, s, 6-OH), 12.76 (1H, s, 6-OH'), 6.75 (1H, s, H-5), 6.75 (1H, s, H-5'), 4.64 (1H, q, J = 6.0Hz, H-18), 4.65 (1H, q, J = 6.0Hz, H-18'), 3.72 (H, s, 12-OH), 3.67 (H, s, 12-OH'), 3.30
     (1H, s, H-14), 3.26 (1H, s, H-14'), 2.77 (1H, s, H-17), 2.77 (1H, s, H-17'), 2.20 (1H, s, H-16), 2.20 (1H, s, H-16'), 1.53 (1H, s, H-22), 1.51 (1H, s, H-22'), 1.47 (1H, d, J = 6.0Hz, H-20), 1.46 (1H, d, J = 6.0Hz, H-20'), 1.28 (1H, s, H-21), 1.31 (1H, s, H-21')。13C-NMR (150MHz, DMSO-d 6) δ ： 205.8 (C-15), 205.6 (C-15'), 199.2 (C-11), 199.2 (C-11'), 197.0 (C-13), 196.9 (C-13'), 166.2 (C-6), 166.1 (C-6'), 166.0 (C-1), 166.0 (C-1'), 165.3 (C-3), 165.3 (C-3'), 149.2 (C-4), 149.2 (C-4'), 137.5 (C-9), 137.5 (C-9'), 118.5 (C-2), 118.5 (C-2'), 117.9 (C-5), 117.9 (C-5'), 109.7 (C-10), 109.7 (C-10'), 105.4 (C-7), 105.4 (C-7'), 102.6 (C-8), 102.6 (C-8'), 91.6 (C-18), 91.5 (C-18'), 77.5 (C-12), 77.5 (C-12'), 52.1 (C-14), 51.7 (C-14'), 43.3 (C-19), 43.2 (C-19'), 31.0 (C-16), 30.9 (C-16'), 25.8 (C-22), 25.4 (C-22'), 24.2 (C-17), 24.2 (C-17'), 20.6 (C-21), 20.5 (C-21'), 14.6 (C-20), 14.4 (C-20'). 实施例 2 ： 细胞毒活性测试 化合物 1 和 2 的细胞毒活性测试结果1 2 HL-60cellsIC50(μ M) 33.6 58.2 PC-3cellsIC50(μ M) 54.8 62.3实验方法 采用 MTT 法， 将密度为 4.5×104 个 /mL 的细胞液 （HL-60, PC -3） 以 2 ml/ 孔剂量接种 于 24 孔板， 向其中加入不同浓度的化合物 1 和 2 ， 共同孵育 72 小时后于显微镜下计数， 生 长抑制率 = 细胞总数 / 孔 ÷ 对照细胞总数 / 孔 ×100%， 并求 IC50 （细胞生长抑制率达 50％ 时的药物浓度 )。
     实施例 3 ： 免疫调节活性测试 ： 化合物 1 对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响　 注 : 与 ConA 组比较﹡ P<0.05 ； ﹡﹡ P<0.01。
     化合物 2 对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响注 : 与 ConA 组比较﹡ P<0.05 ； ﹡﹡ P<0.01。
     对于两个化合物来说， 空白组 OD 值分别为 0.162±0.008/0.135±0.011, 而 ConA 组 OD 值明显增加 , 分别为 0.335±0.011/0.305±0.010, ConA+ 药组 OD 值与 ConA 组比较 具统计学意义 （P<0.05） , 另外高浓度组 OD 值 （化合物 1 的 50μg· ml–1 给药加 ConA 组， 化 –1 合物 2 的 50μg · ml–1 给药加 ConA 组和未加 ConA 组， 以及化合物 2 的 100μg·ml 给 药加 ConA 组） 均明显高于对照组 （P<0.01） , 且具有浓度依赖性。说明化合物 1 和 2 具有 免疫佐剂样作用， 2 的作用强于 1。 1 和 2 的高浓度组效果减弱， 说明它们的量效关系曲线成 抛物线状， 过大剂量无益于免疫调节。 实验方法 无菌条件下制备小鼠脾细胞， 然后用 1640 不完全培养液洗涤 2 次， 每次 1000r/min， 离 心 10 min， 再用 1640 完全培养液配成终浓度为 5×106 个 /ml， 取 100 μl 加入 96 孔板每 孔， 再加入终浓度为 5μg/ml 的 ConA， 置 37℃， 5% CO2 条件下培养 48 小时后， MTT 染色， 再 继续培养 12 小时， 然后加入 DMSO， 充分震荡后静置， 酶标仪 560 nm 波长检测 OD 值。
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