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一种锝标记吡咯并喹啉醌二甲酯的制备方法
    【技术领域】
     一种锝标记吡咯并喹啉醌二甲酯的制备方法， 属于生物技术和医药领域。背景技术 吡咯并喹呤醌 （Pyrroloquinoline quinone， PQQ） 是上世纪 70 年代末发现的一种 新的氧化还原酶辅基， 它的分子具有平面共轭分子结构、 共轭二醌 （邻位醌） 以及多阴离子 （三个羧基） 。吡咯并喹呤醌对神经活性具有保护作用， 对淀粉斑块具有抑制作用， 对 N- 甲 基 -D- 天冬氨酸受体 （NMDAR） 介导的兴奋性神经毒同样具有调节作用， 并且作为很有潜力 的老年病治疗药物引起了脑神经科学工作者的兴趣。有文献 【Yanyan Kong， J Radioanal 99m Nucl Chem， 2010】 报道用 PQQ 作配体与 Tc 络合研究 N- 甲基 -D- 天冬氨酸 （NMDA） 受体的 变化， 但其水溶性较大， 影响其进脑量。
     发明内容 本发明的目的是提供一种锝标记吡咯并喹啉醌二甲酯的制备方法， 得以制备放化 纯较高、 脂水分配系数较高、 带电性从阴离子改变为电中性并且进脑量增加的吡咯并喹啉 醌二甲酯。
     本发明的技术方案 ： 一种锝标记吡咯并喹啉醌二甲酯 （99mTc-PQQ-Z） 的制备方法， 反应总方程式如下 ：
     步骤如下 ： （1） 5- 甲氧基 -1 氢 - 吡咯 [2,3-f] 喹啉 -2,7,9- 三羧酸 -2- 乙酯 -7,9- 二甲酯的制 备： 反应方程式如下 ：a、 加入原料 ： 在 1000mL 四口烧瓶中， 加入 34.6mmol 9- 羟基 -5- 甲氧基 -6,7,8,9- 四 氢 -1 氢 - 吡咯 [2,3-f] 喹啉 -2,7,9- 三羧酸 -2- 乙酯 -7,9- 二甲酯、 37.9mmol 一水合醋酸 铜和 600mL 二氯甲烷， 搅拌并冷却至 10℃ ； b、 通混合气体反应 ： 将步骤 a 中加入原料后的四口烧瓶升温至 20℃， 连续通入空气和 无水氯化氢气体， 流量均为 10-20L/h ； 6 小时后停止通无水氯化氢气体， 继续通空气过夜 ； 停止通空气， 在 30 分钟内缓慢加入 28.4g 碳酸氢钠和 300mL 水配成的溶液， 继续搅拌 2 小 时； c、 后处理 ： 将步骤 b 所得溶液过滤后用二氯甲烷萃取， 分离出水层和二氯甲烷层， 二氯 甲烷层待用 ； 所得水层继续用二氯甲烷萃取 2-3 次， 合并二氯甲烷层 ； 用 200mL 水洗 2-3 次 ； 水洗后的二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥后过滤 ； 旋蒸除去二氯甲烷得到粗产品 ； 在得到的 粗产品中加入 50mL 乙醚搅拌过夜， 冰浴冷却重结晶， 过滤， 所得结晶用 30mL 乙醚清洗， 50℃ 干燥得到产品 ； （2） 4,5- 二氧 -4,5- 二氢化 -1 氢 - 吡咯 [2,3-f] 喹啉 -2,7,9- 三羧酸 -2- 乙酯 -7,9- 二 甲酯 PQQ-Z 的制备 ： 反应方程式如下 ：a、 加入原料 ： 在 1000mL 三口烧瓶中， 加入 25.9mmol 步骤 （1） 所得产品和 500mL 乙腈， 搅拌， 于干冰浴中冷至 -5℃ ； b、 反应 ： 在三口烧瓶中加入 70 克硝酸铈铵和 100mL 水配成的溶液， 5 分钟内滴加完毕， 完毕后控温在 -5℃继续搅拌 1.5 小时 ； 将所得反应液强烈搅拌下倒入 1000mL 冷水中， 继续 搅拌 0.5 小时 ； c、 后处理 ： 将步骤 b 所得反应液过滤除去铈盐， 使用二氯甲烷萃取 2-3 次， 收集二氯甲 烷层 ； 二氯甲烷层用无水硫酸镁干燥过滤， 旋蒸去二氯甲烷 ； 收集残留物， 将残留物置于由 10mL 甲苯和 10mL 乙酸乙酯配成的溶剂中搅拌 1 小时， 过滤收集固体产物 ； 配置乙酸乙酯︰ 庚烷体积比为 3 ︰ 1 的溶剂， 所得固体产物用所配溶剂洗涤， 洗涤后溶于 300mL 二氯甲烷 中， 加入 4 克硅胶搅拌 1 小时 ； 将所得溶液用硅藻土进行过滤， 收集滤液， 蒸干二氯甲烷得到 粗产品 ； 粗产品用硅胶柱层析， 先用二氯甲烷洗出杂质， 再用二氯甲烷︰乙酸乙酯体积比为1 ︰ 1 的溶剂洗出产物 PQQ-Z ； 氢谱表征如图 1 所示， 1H-NMR （400MHz， DMSO） : δ12.48(br, 1H, NH), δ8.56(s, 1H, 喹啉环上氢 （H-8） )， δ7.27（s， 1H， 吡咯环上氢 （H-3） ） ， δ4.33-4.38（q， 2H， J=7.09Hz， CH2 上的 H） ， 4.05（s， 3H， CH3 上的 H） ， 3.97（s， 3H， CH3 上的 H） ， 1.34（t， 3H， J=7.07Hz， CH3 上 的 H） 。
     （3）锝 标 记 4,5- 二 氧 -4,5- 二 氢 化 -1 氢 - 吡 咯 [2,3-f] 喹 啉 -2,7,9- 三 羧 酸 -2- 乙酯 -7,9- 二甲酯 99mTc-PQQ-Z 的制备 ： 反应方程式如下 ：在容器中加入 0.05mL 1mg/mL 的乙二胺四乙酸二钠 EDTA-2Na 溶液、 0.05mL 1mg/mL 的 SnF2 盐酸溶液、 0.25mL 由步骤 （2） 产品吡咯并喹啉醌二甲酯配置的 10mg/mL 的二甲基亚砜 99m DMSO 溶液、 37MBq 的 Na Tc04 淋洗液 0.1mL， 再加入 pH8.5 的磷酸盐缓冲液至 1mL， 100℃水 99m 浴加热 30min 后室温下冷却， 得产品锝标记吡咯并喹啉醌二甲酯 Tc-PQQ-Z。
     锝标记吡咯并喹啉醌二甲酯 99mTc-PQQ-Z 标记率测定 ： 薄层层析 TLC 法 ： 以新华一号纸层析条 （0.8cm×10cm） 为支持物， 用毛细点样管将锝标 记吡咯并喹啉醌二甲酯反应液点样于聚酰胺薄膜层析条的下端 （离末端约 1.5cm） ， 以体积 比丙酮 : 正己烷 : 三乙胺 =3:1:1 的溶液为展开剂， 上行展开 8cm， 取出， 晾干， 分为 10 段， 分 99m 别测各段的放射性计数。对照组为不含 PQQ 酯的反应液及 Na Tc04 淋洗液。 锝标记吡咯并喹啉醌二甲酯 99mTc- PQQ-Z 的生物学特性研究 ： 99m 取 0.2mL（2.82MBq） Tc- PQQ-Z 注 射 到 体 积 比 为 1:1 的 正 辛 醇 / 磷 酸 盐 缓 冲 液 （pH=7.4） 的二相体系中， 涡旋振荡 5min， 静置 5min 分层， 2000r/min 离心分离 10min， 分别 取有机相和水相各 0.1mL 测 γ 计数。再取 0.5mL 水相， 往其中加入 0.5mL 正辛醇饱和的磷 酸盐缓冲液和 1mL 磷酸盐缓冲液饱和的正辛醇， 涡旋振荡 5min， 静置 5min 分层， 2000r/min 离心 10min， 取有机相和水相各 0.1mL 测 γ 计数， 如此重复至正辛醇相和水相的放射性比值 为一恒定值。
     电泳法测定 99mTc- PQQ-Z 的电荷 ： 采用体积比为 1 ︰ 1 的乙醇 /pH7.4 的磷酸盐缓冲液混合液作为电泳溶液， 长 19cm 宽 99m 1cm 新华 1 号纸为电泳条， 纸条悬空浸入缓冲槽中。将标记好的 Tc- PQQ-Z 点样于电泳
     条中部。通电， 电压调节在 150V。待电泳条湿润后开始通电电泳， 时间为 2 ～ 3h， 取出电泳 条， 干燥并剪成等长的小段， 测量每段的放射性计数， 从而判断配合物的电性。
     本发明的有益效果 ： 本发明对吡咯并喹呤醌的结构进行了改造， 并进行了 99mTc 标 记， 制备得到了放化纯较高的 99mTc-PQQ-Z， 与 99mTc-PQQ 相比脂水分配系数从 -1.49 提高到 0.67， 带电性从阴离子改变为电中性， 进脑量是 99mTc-PQQ 的 2 倍。 附图说明
     图1PQQ-Z 氢谱图。具体实施方式
     实施例 1 99mTc-PQQ-Z 的制备 （1） 5- 甲氧基 -1 氢 - 吡咯 ［2,3-f］ 喹啉 -2,7,9- 三羧酸 -2- 乙酯 -7,9- 二甲酯的制 备： a、加 入 原 料 ： 在 1000mL 四 口 烧 瓶 中， 加 入 14g（34.6mmol） 9- 羟 基 -5- 甲 氧 基 -6,7,8,9- 四氢 -1 氢 - 吡咯 [2,3-f] 喹啉 -2,7,9- 三羧酸 -2- 乙酯 -7,9- 二甲酯、 一水 合醋酸铜 7.56g（37.9mmol） 和 600mL 二氯甲烷， 搅拌并冷却至 10℃ ； b、 通混合气体反应 ： 将步骤 a 四口烧瓶中所配之原料升温至 20℃， 连续通入空气和无 水氯化氢气体， 流量均为 10-20L/h ； 6 小时后停止通无水氯化氢气体， 继续通空气过夜 ； 停 止通空气， 在 30 分钟内缓慢加入 28.4g 碳酸氢钠和 300mL 水配成的溶液， 继续搅拌 2 小时 ； c、 后处理 ： 将步骤 b 所得溶液过滤后用二氯甲烷萃取， 分离出水层和二氯甲烷层， 二氯 甲烷层待用 ； 所得水层继续用二氯甲烷萃取 2-3 次， 合并二氯甲烷层 ； 用 200mL 水洗 2-3 次 ； 水洗后的二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥后过滤 ； 旋蒸除去二氯甲烷得到粗产品 ； 在得到的 粗产品中加入 50mL 乙醚搅拌过夜， 冰浴冷却重结晶， 过滤， 所得结晶用 30mL 乙醚清洗， 50℃ 干燥得到产品 11.5g， 产率 ： 87％。 （2） 4,5- 二 氧 -4,5- 二 氢 化 -1 氢 - 吡 咯 [2,3-f] 喹 啉 -2,7,9- 三 羧 酸 -2- 乙 酯 -7,9- 二甲酯 PQQ-Z 的制备 ： a、 加入原料 ： 在 1000mL 三口烧瓶中， 加入 10g（25.9mmol） 步骤 （1） 所得产品和 500mL 乙腈， 搅拌， 于干冰浴中冷至 -5℃ ； b、 反应 ： 在步骤 a 的三口烧瓶中加入 70g（128mmol） 硝酸铈铵和 100mL 水配成的溶液， 5 分钟内滴加完毕， 滴加完毕后控温在 -5℃继续搅拌 1.5 小时 ； 将所得反应液强烈搅拌下倒 入 1000mL 冷水中， 继续搅拌 0.5 小时 ； c、 后处理 ： 将 步 骤 b 所 得 液 体 过 滤 除 去 铈 盐， 使 用 240mL 二 氯 甲 烷 分 三 次 萃 取 （3*80mL） ， 收集二氯甲烷层 ； 二氯甲烷层用无水硫酸镁干燥过滤， 旋蒸去二氯甲烷 ； 收集残 留物， 将残留物置于由 10mL 甲苯和 10mL 乙酸乙酯配成的溶剂中搅拌 1 小时， 过滤收集固体 产物 ； 所得固体产物用乙酸乙酯︰庚烷体积比为 3 ︰ 1 配置的溶剂洗涤， 洗涤后溶于 300mL 二氯甲烷中， 加入 4 克硅胶搅拌 1 小时 ； 将所得溶液用硅藻土进行过滤， 收集滤液， 蒸干二氯 甲烷得到粗产品 ； 粗产品用硅胶柱层析， 先用二氯甲烷洗出杂质， 再用二氯甲烷︰乙酸乙酯 体积比为 1 ︰ 1 的溶剂洗出产物 PQQ-Z ； 产率 85%。
     （3）锝 标 记 4,5- 二 氧 -4,5- 二 氢 化 -1 氢 - 吡 咯 [2,3-f] 喹 啉 -2,7,9- 三 羧
     酸 -2- 乙酯 -7,9- 二甲酯 99mTc-PQQ-Z 的制备 ： 在容器中加入 0.05mL 1mg/mL 的乙二胺四乙酸二钠 EDTA-2Na 溶液、 0.05mL 1mg/mL 的 SnF2 盐酸溶液、 0.25mL 由步骤 （2）产品 PQQ-Z 配置的 10mg/mL 的二甲基亚砜 DMSO 溶液、 99m 37MBq 的 Na Tc04 淋洗液 0.1mL， 再加入 pH=8.5 的磷酸盐缓冲液至 1mL， 100 ℃水浴加热 99m 30min 后室温下冷却即得产品锝标记吡咯并喹啉醌二甲酯 Tc-PQQ-Z。
     应用实施例 1 99mTc-PQQ-Z 标记率测定 薄层层析 TLC 法 ： 以新华一号纸层析条 （0.8cm×10cm） 为支持物， 用毛细点样管将锝标 记吡咯喹啉醌二甲酯反应液点样于聚酰胺薄膜层析条的下端 （离末端约 1.5cm） ， 以体积比 丙酮 : 正己烷 : 三乙胺 =3:1:1 的溶液为展开剂， 上行展开 8cm， 取出， 晾干， 分为 10 段， 分别 99m 测各段的放射性计数。对照组为不含 PQQ 酯的反应液及 Na Tc04 淋洗液。
     TLC 测定结果见表 1。游离的 99mTcO4– 位于最前沿， 对照组 99mTc- 胶体位于层析条 的原点部位， 而标记配体 99mTc- PQQ-Z 层析后位于层析条的中上端， 且 99mTc-PQQ-Z 放化纯大 于 95%。
     表 1 TLC 法标记反应不同组分的 Rf 值组分 99mTc-PQQ-Z Rf 0.6 ～ 1.099m99mTc 胶体99mTcO4-01应用实施例 2 Tc- PQQ-Z 的生物学特性研究 99m 取 0.2mL（2.82MBq） Tc- PQQ-Z 注 射 到 体 积 比 为 1:1 的 正 辛 醇 / 磷 酸 盐 缓 冲 液 （pH=7.4） 的二相体系中， 涡旋振荡 5min， 静置 5min 分层， 2000r/min 离心分离 10min， 分别 取有机相和水相各 0.1mL 测 γ 计数。再取 0.5ml 水相， 往其中加入 0.5mL 正辛醇饱和的磷 酸盐缓冲液和 1mL 磷酸盐缓冲液饱和的正辛醇， 涡旋振荡 5min， 静置 5min 分层， 2000r/min 离心 10min， 取有机相和水相各 0.1ml 测 γ 计数， 如此重复至正辛醇相和水相的放射性比值 为一恒定值。
     测得 99mTc- PQQ-Z 的脂水分配系数 （lgP） 为 0.67。 99m
     应用实施例 3 电泳法测定 Tc- PQQ-Z 的电荷 ： 采用体积比为 1 ︰ 1 的乙醇 /pH7.4 的磷酸盐缓冲液混合液作为电泳溶液， 长 19cm 宽 99m 1cm 新华 1 号纸为电泳条， 纸条悬空浸入缓冲槽中。将标记好的 Tc- PQQ-Z 点样于电泳 条中部。通电， 电压调节在 150V。待电泳条湿润后开始通电电泳， 时间为 2 ～ 3h， 取出电泳 条， 干燥并剪成等长的小段， 测量每段的放射性计数， 从而判断配合物的电性。 99m
     实验结果有 99.61% 的 Tc- PQQ-Z 在通电情况下没有发生移动， 显示标记配体 99m Tc- PQQ-Z 为电中性。 99m
     应用实施例 4 Tc- PQQ-Z 的小鼠体内分布及初步药代动力学实验 体内分布实验 ： ICR 小鼠 （18 ～ 22g， n=40， 4 周龄） 随机分成 8 组， 尾静脉注射 0.2mL 99m Tc-PQQ-Z（6.66MBq / 只） ， 分别于注射后不同时间 （5, 15, 30, 60, 120, 180, 240 和 360 min） 颈部放血处死小鼠， 分别取血 （200μL） 、 心、 肝、 脾、 肺、 肾、 胃、 肠、 性腺、 肌肉、 骨 骼、 脑等称重， 计数 cpm ； 分别计算每克组织百分注射剂量率 （% ID/g） 。计算式如下 ： -1 %ID·g =[( 组织器官 (cpm)/ 标准源 (cpm) )/ 组织器官重量 (g)]×100% 99m Tc- PQQ-Z 在小鼠体内的生物分布 （X ±SD， n=5， ）Region 5min 心 3.20±0.53 15min 30min 2.68±0.13 2.65±0.71 60min 0.65±0.13 120min 0.58±0.23 180min 0.45±0.06 240min 0.36±0.06 360min 0.25±0.087102093351 A CN 102093357肝 脾 肺 肾 肠 性腺 肌肉 骨骼 血 脑 6.04±0.60 3.76±0.47 8.95±0.46 5.58±0.78 2.49±0.58 1.62±0.39 1.16±0.29 1.54±0.27 12.64±0.26 0.40±0.01 9.94±0.66 3.66±0.57 6.11±0.81 5.39±0.10 3.33±0.77 2.03±0.16 1.15±0.11 2.28±0.62 7.70±0.79 0.34±0.01 28.29±0.71 3.30±0.34 5.00±0.42 5.22±0.95 4.22±0.60 2.17±0.59 0.97±0.09 2.12±0.28 6.33±0.62 0.25±0.02说明书58.70±2.32 2.48±0.39 1.88±0.47 3.14±0.55 2.04±0.84 0.85±0.75 0.23±0.11 0.60±0.22 1.29±0.36 0.08±0.01 38.58±6.22 2.17±0.26 1.46±0.23 3.59±0.54 1.73±0.15 0.47±0.29 0.25±0.11 0.76±0.33 0.93±0.10 0.08±0.01 38.34±4.15 1.52±0.08 1.62±0.63 3.66±0.22 1.47±0.15 0.32±0.18 0.13±0.06 0.56±0.22 0.64±0.23 0.06±0.016/6 页27.26±0.82 1.42±0.28 0.65±0.19 3.75±0.96 0.88±0.26 0.13±0.01 0.09±0.03 0.32±0.10 0.46±0.30 0.04±0.0041.54±6.61 2.67±0.14 2.26±0.92 3.30±0.34 2.48±0.65 0.83±0.28 0.27±0.10 0.62±0.10 2.20±0.89 0.12±0.0299m 实验结果显示 ： Tc- PQQ-Z 在肝脏放射性摄取较高， 6h 的 %ID/g 为 27.3， 在心、 肺、 脾 99m 等组织放射性摄取均较低， 说明主要通过肝胆代谢 ； 在脑内摄取量较低， 是 Tc- PQQ 的 2 倍， 而在海马和额叶摄取量相对较高。