作为自分泌运动因子抑制剂的杂环化合物 发明背景 本发明的目的是发现具有有价值的性质、 特别是可用于制备药物的那些性质的新化合物。 本发明涉及化合物以及其用于治疗伴有溶血磷脂酸水平升高的疾病的应用， 此 外， 本发明还涉及包含这些化合物的药物组合物。
详细地讲， 本发明涉及优选地抑制一种或多种可调节和 / 或调控溶血磷脂酸 ( 或 简称 LPA) 水平的式 I 的化合物、 包含这些化合物的组合物以及其用于治疗诸如血管生成、 癌症、 肿瘤形成、 生长和扩散、 动脉粥样硬化、 眼部疾病、 脉络膜新血管形成和糖尿病性视网 膜病、 炎性疾病、 关节炎、 神经变性、 再狭窄、 伤口愈合或移植排斥之类的疾病和并发症的应 用。本发明的化合物特别适于治疗或预防癌症疾病。
自分泌运动因子 (Autotaxin， ATX) 是能够导致腹水和血浆中溶血磷脂酸水平 升 高 的 酶 (Xu 等， Clinical Cancer Research 1995， 1： 1223 ； Xu 等， Biochem.J.1995， 309 ： 933)。ATX 能够将溶血磷脂酰胆碱 (LPC) 转化为溶血磷脂酸 (Tokumura 等， J.Biol. Chem.2002， 277 ： 39436 ； Umezu-Gozo 等， J.Biol.Chem.2002， 158 ： 227)。LPA 为细胞内脂质 调节剂， 它能够影响多种生物学和生物化学过程， 例如平滑肌收缩、 血小板聚集和细胞凋亡 (Tigyi 等， Prog.Lipid Res.2003， 42 ： 498 ； Mills 等， Nat.Rev.Cancer 2003， 3： 582 ； Lynch 等， Prost.Lipid Med.2001， 64 ： 33)。另外， 发现 LPA 在早期和晚期卵巢癌患者的血浆和腹 水液中浓度升高。 LPA 在肿瘤细胞增殖以及向周边组织的侵入中起作用， 其可导致转移的发 生 (Xu 等， Clinical Cancer Research 1995， 1： 1223 ； Xu 等， Biochem.J.1995， 309 ： 933)。 这些生物学和病理生物学过程可以通过 LPA 对 G- 蛋白偶联受体的激活而引发 (Contos 等， Mol.Pharm.2000， 58 ： 1188)。
因为该原因， 在肿瘤患者的治疗过程中， 需要降低 LPA 的水平。这可以通过抑制 与 LPA 生物合成有关的酶例如自分泌运动因子 (ATX) 来完成 (Sano 等， J.Biol.Chem.2002， 277 ： 21197 ； Aoki 等， J.Biol.Chem.2003， 277 ： 48737)。自分泌运动因子属于核苷焦磷酸 酶和磷酸二酯酶家族 (Goding 等， 1998， Immunol.Rev.Vol.161， 第 11 页 ) 并且代表了抗肿 瘤治疗的重要起点 (Mills 等， 2003， Nat.Rev.Cancer Vol.3 ： 第 582 页和 Goto 等， 2004， J.Cell.Biochem.Vol.92， 第 1115 页 )， 因为它在肿瘤中的表达增加并引起肿瘤细胞的增殖 和向周边组织的侵入， 这能够导致转移瘤的形成 (Nam 等， 2000， Oncogene， Vol.19， 第 241 页 )。另外， 在血管生成过程中， 自分泌运动因子与其它血管生成因子一起引起血管生成 (Nam 等， 2001， Cancer Res.Vol 61， 第 6938 页 )。血管生成是肿瘤生长期间的重要过程， 因 为它保证了肿瘤的营养供给。 因此， 抑制血管生成是癌症和肿瘤治疗的重要起点， 其可以在 一定程度上使肿瘤缺乏营养 (Folkman， 2007， Nature Reviews Drug Discovery Vol.6， 第 273-286 页 )。
此外， 自分泌运动因子还控制 T 细胞通过 LPC 转化成 LPA 迁移进入次级淋巴器官。 初生 T 细胞在健康生物体内通常在血液和次级淋巴器官、 淋巴结之间移动。为了从血流中 迁移进入淋巴结， T 细胞必须克服专门的血管， 所谓的高内皮小静脉 (HEV)。自分泌运动因
子参与该过程。HEV 细胞分泌自分泌运动因子进入血流。其结合到 T 细胞上并在其表面上 将 LPC 转化成 LPA。LPA 再在 T 细胞的表面上结合到特定的受体上并增加其迁移进入淋巴 结的能力。将 T 细胞用不具有酶活性的自分泌运动因子突变体处理降低了其迁移进入淋巴 结的能力 [1]。将 T 细胞用我们所研发的抑制剂处理同样可阻滞其迁移进入淋巴结。
在炎症过程中， T 细胞还可迁移进入其它的体组织并且在其中推动炎症反应向前 发展， 这可导致器官的损害。在动物模型中已证实发炎组织内的血管开始表达自分泌运动 因子 [2]。 因此可以假定在发炎过程中自分泌运动因子还能够控制 T 细胞迁移进入体组织。 在人体内在慢性炎性肠疾病患者的发炎的肠组织内 [3] 以及在关节炎患者的患病的关节 [4] 和滑液成纤维细胞内 [5] 也确实发现了明显增加的自分泌运动因子的产生。由于 T 细 胞迁移进入组织在炎症疾病中起作用， 自分泌运动因子的抑制可抑制该过程， 因此对该疾 病的过程具有正面影响。
1.Kanda， H. 等人， 自分泌运动因子， 一种产生溶血磷脂酸、 促进淋巴细胞进入二 级淋巴器官的细胞外酶 (Autotaxin， an ectoenzyme th at produces lysophosphatidic acid， promotes the entry of lymphocytes into secondary lymphoid organs)。Nat Immunol， 2008.9(4) ： p.415-23。
2.Nakasaki， T. 等人， 产生溶血磷脂酸的酶自分泌运动因子在淋巴细胞 - 内 皮细胞相互作用中的参与 (Involvement of the lysophosphatidic acid-generating enzyme autotaxin in lymphocyte-endothelial cell interactions)。Am J Pathol， 2008.173(5) ： p.1566-76。
3.Wu， F. 等人， 根据内窥镜活检发现的克罗恩病和溃疡性结肠炎的全基因表达差 异： 对不同发病机理的洞察 (Genome-wide gene expression differences in Crohn′ s disease and ulcerative colitis from endoscopic pinch biopsies ： insights into distinctive pathogenesis)。Inflamm Bowel Dis， 2007.13(7) ： p.807-21。
4.Nochi， H. 等人， 在成纤维样滑膜细胞中溶血磷脂酸对于类风湿性关节炎患者 的滑液诱导环氧合酶 -2 的刺激作用 (Stimulatory role of lysophosphatidic acid in cyclooxygenase-2 in du ction by synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis in fibroblast-like synovial cells)。J Immunol， 2008.181(7) ： p.5111-9。
5.Kehlen， A. 等 人， 在 类 风 湿 性 关 节 炎 (RA) 患 者 的 成 纤 维 样 滑 膜 细 胞 中 IL-1β- 和 IL-4 诱 导 的 自 分 泌 运 动 因 子 mRNA 和 PC-1 的 向 下 调 节 (IL-1 beta-and IL-4-induced down-regulation of autotaxin mRNA and PC-1 in fibroblast-like synoviocytes of patients with rheumatoid arth ritis(RA))。Clin Exp Immunol， 2001.123(1) ： p.147-54。
已经令人吃惊地发现， 本发明的化合物特异性地抑制核苷酸焦磷酸酶和磷酸二酯 酶的酶家族， 特别是自分泌运动因子。 本发明的化合物优选地表现出有利的生物学活性， 例 如可以在本文所述的试验中容易地检测该类活性。在该试验中， 本发明的化合物优选表现 出和引起抑制作用， 其通常通过位于适宜范围内的 IC50 值表示， 其优选位于微摩尔范围内 并且更优选位于毫微摩尔范围内。
一般而言， 所有的实体瘤和非实体瘤都可以用式 I 的化合物来进行治疗， 例如， 单 核细胞白血病、 脑癌、 泌尿生殖器癌、 淋巴系统癌、 胃癌、 喉癌、 卵巢癌和肺癌， 包括肺腺癌和小细胞肺癌。进一步的实例包括前列腺癌、 胰腺癌和乳癌。
如本文所讨论的那样， 本发明化合物的作用与许多疾病相关。 因此， 本发明化合物 可用于预防和 / 或治疗可以通过抑制一种或多种核苷酸焦磷酸酶和 / 或磷酸二酯酶， 特别 是自分泌运动因子来对其产生影响的疾病。
因此， 本发明涉及在所述疾病的治疗和 / 或预防中作为药物和 / 或药物活性成分 的本发明化合物以及本发明的化合物用于制备治疗和 / 或预防所述疾病的药物的应用， 并 且本发明还涉及治疗所述疾病的方法， 其包括给需要该类给药的患者施用一种或多种本发 明的化合物。
可以在异种移植物肿瘤模型中证实本发明的化合物具有有利作用。
所述主体或患者可属于任何哺乳动物种属， 例如灵长目动物， 特别是人 ； 啮齿类动 物， 包括小鼠、 大鼠和仓鼠 ； 兔子 ； 马、 牛、 狗、 猫等。动物模型对实验研究是很有用的， 它们 为人类疾病的治疗提供了一种模型。
可以用体外试验来测定某些细胞对于用本发明化合物处理的敏感性。通常， 将细 胞培养物与各种浓度的本发明化合物混合一段时间， 该时间足以确保所述活性成分诱导细 胞死亡或抑制其迁移或阻断细胞分泌促进血管生成的物质， 通常为大约 1 小时至 1 周。对 于体外实验而言， 可以使用得自活组织检查样品的培养细胞。 然后， 对处理后仍然有活力的 细胞进行计数。
剂量根据所用具体化合物、 具体疾病和患者状态等而变化。治疗剂量通常足以大 大降低靶组织中不希望的细胞群体， 同时维持患者的活力。该治疗通常持续至细胞负荷显 著降低， 例如使细胞负荷降低至少约 50％， 并且可持续至在体内基本检测不到不希望的细 胞。 现有技术
能够抑制自分泌运动因子的化合物记载于 Peng 等， Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters(17， 2007， 第 1634-1640 页 )。 其中所述的化合物是脂类类似物， 其不具 有任何与本发明化合物共同的结构特征。
发明概述
本发明涉及式 I 化合物
其中
R 表示 Hal、 Ar 或 Het1，
R1 表示 SO2A、 COOA、 COOH、 Cyc、 Het、 Ar、 COHet、 CONHHet、 CONHAr、 CHO、 CONH2、 CONHA、 CONA2、 (CH2)n2OH、 (CH2)n2OA、 OAr、 NHAr、 A、 Hal、 (CH2)n2NH2、 (CH2)n2NHA、 (CH2)n2NA2 或 NHCOA， 2
R 表 示 H、 (CH2)n3NH2、 (CH2)n3NHA、 (CH2)n3NA2、 (CH2)n3OH、 (CH2)n3OA、 (CH2)n3Het2、
CH2COHet2、 CH2CONH2、 CH2CONHA、 CH2CONA2 或 A，
X、 X1 彼此独立地表示 CO、 CH(OH)、 CH(OA)、 CH(NH2)、 CH2 或 CF2，
Y、 Y1 彼此独立地表示 CH 或 N，
Q 表示 C ＝ O、 COO、 C ＝ S、 C ＝ NH、 CH(OH)、 CH(NH2)、 SO、 SO2 或 CF2，
E 表 示 CO、 CH(OH)、 CA(OH)、 CH(OA)、 CA(OA)、 CH(NH2)、 Alk、或Alk 表示具有 1-8 个 C 原子的直链或支链亚烷基， 其中一个或两个 CH2 基团可被 O 和 / 或 NH 代替，
n1 表示 0、 1 或 2，
n2 表示 0、 1、 2、 3 或 4，
n3 表示 1、 2、 3 或 4，
Ar 表示苯基、 萘基或联苯， 它们均是未取代的或被 Hal、 A、 OH、 OA、 NH2、 NHA、 NA2、 NO2、 CN、 COOH、 COOA、 CONH2、 CONHA、 CONA2、 NHCOA、 NHSO2A、 SO2NH2 和 / 或 SO2A 单 -、 二 - 或三 取代，
Het 表示具有 1 至 4 个 N、 O 和 / 或 S 原子的单 -、 二 - 或三环的饱和、 不饱和或 2 芳族杂环， 它们均是未取代的或被 Hal、 Het 、 A、 OH、 OA、 NH2、 NHA、 NA2、 NO2、 CN、 COOH、 COOA、 CONH2、 CONHA、 CONA2、 NHCOA、 NHSO2A、 SO2NH2、 SO2A、 NHCONH2、 CHO、 COA、 ＝ S、 ＝ NH、 ＝ NA 和 / 或＝ O( 羰基氧 ) 单 -、 二 - 或三取代， 1
Het 表示具有 1 至 4 个 N、 O 和 / 或 S 原子的单 -、 二 - 或三环芳族杂环， 它们均是 未取代的或被 Hal、 A、 OH、 OA、 NH2、 NHA、 NA2、 NO2、 CN、 COOH、 COOA、 CONH2、 CONHA、 CONA2、 NHCOA、 NHSO2A、 SO2NH2、 SO2A、 NHCONH2、 CHO 和 / 或 COA 单 -、 二 - 或三取代，
Het2 表示吡咯烷基、 哌啶基、 噻唑烷基、 吗啉基、 唑烷基、 四氢喹唑啉基、 四氢吡 唑基、 异噻唑喃基、 哌嗪基、 噻唑基、 呋喃基、 噻吩基、 吡咯基、 咪唑基、 吡唑基、 唑基、 异 代，
基、 吡啶基、 嘧啶基、 三唑基、 四唑基、 二唑基或噻二唑基、 它们均是未取代的或被 A 单取 Cyc 表示具有 3-7 个 C 原子的环状烷基， A 表示具有 1-10 个 C 原子的直链或支链烷基， 其中 1-7 个 H 原子可被 F、 Cl 和 / 或 Br 取代， 和 / 或其中一个或两个 CH2 基团可被 O 和 / 或 NH 代替， 或 具有 3-7 个 C 原子的环状烷基， Hal 表示 F、 Cl、 Br 或 I， 及其可药用盐和立体异构体， 包括其所有比例的混合物， 其中排除化合物″ B1″ -″ B27″
本发明还涉及式 I 化合物在制备用于治疗其中磷酸二酯酶或溶血磷脂酶自分泌 运动因子的抑制、 调节和 / 或调控起作用的疾病的药物中的应用。
本发明还涉及包含至少一种权利要求 1 所述的化合物或化合物″ B1″ -″ B27″ 和 / 或其可药用的盐和立体异构体、 包括其所有比例的混合物和任选的赋形剂和 / 或辅助 剂的药物。
本发明还涉及用于治疗和 / 或预防肿瘤、 肿瘤疾病和癌症疾病的式 I 化合物和化 合物″ B1″ -″ B27″及其可药用的盐和立体异构体， 包括其所有比例的混合物。
本发明还涉及选自下列的化合物 ：
将以下所示的化合物在文献中以其 CAS 序号描述。
式 I 化合物还指其可药用衍生物、 这些化合物的光学活性形式 ( 立体异构体 )、 互 变异构体、 多晶型、 对映体、 外消旋体、 非对映异构体和水合物以及溶剂化物。 术语该化合物
的溶剂化物是指惰性溶剂分子被加合到化合物上形成的加合物， 其是由二者相互的吸引力 形成的。溶剂化物有例如单 - 或二水合物或醇化物。
可药用的衍生物是指例如本发明化合物的盐以及所谓的前体药物化合物。
前体药物衍生物是指被例如烷基或酰基、 糖或寡肽修饰并且在生物体内迅速裂解 形成有效的本发明化合物的式 I 化合物。
这些化合物还包括本发明化合物的生物可降解的聚合物衍生物， 例如如 Int. J.Pharm.115， 61-67(1995) 中所述。
术语 “有效量” 是指能够使得组织、 系统、 动物或人类产生例如研究者或临床医师 所寻求或期望的生物学或医学响应的药物或药学活性成分的量。
另外， 术语 “治疗有效量” 是指与没有接受此量的相应的个体相比， 能够改进疾病、 症状、 状况、 并发症、 病症或副作用的治疗、 康复、 预防或缓解或者能够降低疾病、 并发症或 病症进展的量。
术语 “治疗有效量” 也包括能够有效地提高正常生理学功能的量。
本发明还涉及式 I 化合物的混合物例如两种非对映异构体的混合物， 例如比例为 1 ∶ 1、 1 ∶ 2、 1 ∶ 3、 1 ∶ 4、 1 ∶ 5、 1 ∶ 10、 1 ∶ 100 或 1 ∶ 1000 的混合物的应用。
这些混合物特别优选地是立体异构化合物的混合物。
A 表示烷基并且优选直链或支链， 并且具有 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个 C 原子。 烷基优选表示甲基， 以及乙基、 丙基、 异丙基、 丁基、 异丁基、 仲丁基或叔丁基， 以及戊基、 1-、 2- 或 3- 甲基丁基、 1， 1-、 1， 2- 或 2， 2- 二甲基丙基、 1- 乙基丙基、 己基、 1-、 2-、 3- 或 4- 甲基 戊基、 1， 1-、 1， 2-、 1， 3-、 2， 2-、 2， 3- 或 3， 3- 二甲基丁基、 1- 或 2- 乙基丁基、 1- 乙基 -1- 甲基 丙基、 1- 乙基 -2- 甲基丙基、 1， 1， 2- 或 1， 2， 2- 三甲基丙基， 进一步优选例如三氟甲基。
烷基尤其优选表示具有 1、 2、 3、 4、 5 或 6 个 C 原子的烷基， 优选甲基、 乙基、 丙基、 异 丙基、 丁基、 异丁基、 仲丁基、 叔丁基、 戊基、 己基、 三氟甲基、 五氟乙基或 1， 1， 1- 三氟乙基。 烷基中的一个或两个 CH2 基团还可以被 O 和 / 或 NH 所代替。
烷基由此还表示例如 CH2OCH3 或 NHCH3。
烷基还表示环烷基。
环烷基优选表示环丙基、 环丁基、 环戊基、 环己基或环庚基。
Cyc 表示环丙基、 环丁基、 环戊基、 环己基或环庚基。
Alk 表示具有 1-8 个 C 原子的直链或支链亚烷基， 其中一个或两个 CH2 基团可被 O 和 / 或 NH 代替， 优选直链或支链亚甲基、 亚乙基、 亚丙基、 亚丁基、 亚戊基、 亚己基、 2， 2- 二甲 基亚丙基、 CH2OCH2、 CH2NHCH2 或 CH2NH-。 2
R 优选表示 H、 (CH2)n3NH2、 (CH2)n3NHA、 (CH2)n3NA2、 (CH2)n3OH、 (CH2)n3OA、 (CH2)n3Het2、 CH2COHet2、 CH2CONH2、 CH2CONHA、 CH2CONA2 或甲基。 2
R 尤 其 优 选 表 示 H、 (CH2)2NMe2、 (CH2)2OH、 (CH2)2OMe、 (CH2)n3Het2、 CH2COHet2、 CH2CONH2 或 Me( 甲基 )。
X、 X1 优选在所有情况下均彼此独立地表示 CO 或 CH2。
Y、 Y1 优选表示 CH。
Q 优选表示 CO、 SO2 或 COO。
n1 优选表示 0 或 1。n2 优选表示 0 或 1。
n3 优选表示 1 或 2。
Hal 优选表示 F、 Cl 或 Br 以及 I， 尤其优选 Br 或 Cl。
Ar 表示例如苯基、 邻 -、 间 - 或对 - 甲苯基、 邻 -、 间 - 或对 - 乙基苯基、 邻 -、 间-或 对 - 丙基苯基、 邻 -、 间 - 或对 - 异丙基苯基、 邻 -、 间 - 或对 - 叔丁基苯基、 邻 -、 间-或 对 - 羟基苯基、 邻 -、 间 - 或对 - 硝基苯基、 邻 -、 间 - 或对 - 氨基苯基、 邻 -、 间 - 或对 -(N- 甲 基氨基 ) 苯基、 邻 -、 间 - 或对 -(N- 甲基氨基羰基 ) 苯基、 邻 -、 间 - 或对 - 乙酰氨基苯基、 邻 -、 间 - 或对 - 甲氧基苯基、 邻 -、 间 - 或对 - 乙氧基苯基、 邻 -、 间 - 或对 - 乙氧基羰基苯 基、 邻 -、 间 - 或对 -(N， N- 二甲基氨基 ) 苯基、 邻 -、 间 - 或对 -(N， N- 二甲基氨基羰基 ) 苯 基、 邻 -、 间 - 或对 -(N- 乙基氨基 ) 苯基、 邻 -、 间 - 或对 -(N， N- 二乙基氨基 ) 苯基、 邻 -、 间 - 或对 - 氟苯基、 邻 -、 间 - 或对 - 溴苯基、 邻 -、 间 - 或对 - 氯苯基、 邻 -、 间 - 或对 -( 甲基 亚磺酰氨基 ) 苯基、 邻 -、 间 - 或对 -( 甲基磺酰基 ) 苯基、 邻 -、 间 - 或对 - 氰基苯基、 邻 -、 间 - 或对 - 羧基苯基、 邻 -、 间 - 或对 - 甲氧基羰基苯基、 邻 -、 间 - 或对 - 氨基磺酰基苯基， 进一步优选 2， 3-、 2， 4-、 2， 5-、 2， 6-、 3， 4- 或 3， 5- 二氟苯基、 2， 3-、 2， 4-、 2， 5-、 2， 6-、 3， 4- 或 3， 5- 二氯苯基、 2， 3-、 2， 4-、 2， 5-、 2， 6-、 3， 4- 或 3， 5- 二溴苯基、 2， 4- 或 2， 5- 二硝基苯基、 2， 5- 或 3， 4- 二甲氧基苯基、 3- 硝基 -4- 氯苯基、 3- 氨基 -4- 氯 -、 2- 氨基 -3- 氯 -、 2- 氨 基 -4- 氯 -、 2- 氨基 -5- 氯 - 或 2- 氨基 -6- 氯苯基、 2- 硝基 -4-N， N- 二甲基氨基 - 或 3- 硝 基 -4-N， N- 二 甲 基 氨 基 苯 基、 2， 3- 二 氨 基 苯 基、 2， 3， 4-、 2， 3， 5-、 2， 3， 6-、 2， 4， 6- 或 3， 4， 5- 三氯苯基、 2， 4， 6- 三甲氧基苯基、 2- 羟基 -3， 5- 二氯苯基、 对 - 碘苯基、 3， 6- 二氯 -4- 氨 基苯基、 4- 氟 -3- 氯苯基、 2- 氟 -4- 溴苯基、 2， 5- 二氟 -4- 溴苯基、 3- 溴 -6- 甲氧基苯基、 3- 氯 -6- 甲氧基苯基、 3- 氯 -4- 乙酰氨基苯基、 3- 氟 -4- 甲氧基苯基、 3- 氨基 -6- 甲基苯 基、 3- 氯 -4- 乙酰氨基苯基或 2， 5- 二甲基 -4- 氯苯基。
Ar 尤其优选表示未取代的或被 Hal、 A、 OH、 OA、 NH2、 NHA 和 / 或 NA2 单 -、 二 - 或三 取代的苯基。
与其它的取代基无关， Het 表示例如 2- 或 3- 呋喃基、 2- 或 3- 噻吩基、 1-、 2- 或 3- 吡咯基、 1-、 2、 4- 或 5- 咪唑基、 1-、 3-、 4- 或 5- 吡唑基、 2-、 4- 或 5唑基、 3-、 4- 或 5- 异 唑基、 2-、 4- 或 5- 噻唑基、 3-、 4- 或 5- 异噻唑基、 2-、 3- 或 4- 吡啶基、 2-、 4-、 5- 或 6- 嘧啶 基， 此外还优选 1， 2， 3- 三唑 -1-、 -4- 或 -5- 基、 1， 2， 4- 三唑 -1-、 -3- 或 -5- 基、 1- 或 5- 四唑 基、 1， 2， 3二唑 -4- 或 -5- 基、 1， 2， 4二唑 -3- 或 -5- 基、 1， 3， 4- 噻二唑 -2- 或 -5- 基、 1， 2， 4- 噻二唑 -3- 或 -5- 基、 1， 2， 3- 噻二唑 -4- 或 -5- 基、 3- 或 4- 哒嗪基、 吡嗪基、 1-、 2-、 3-、 4-、 5-、 6- 或 7- 吲哚基、 4- 或 5- 异吲哚基、 吲唑基、 1-、 2-、 4- 或 5- 苯并咪唑基、 1-、 3-、 4-、 5-、 6- 或 7- 苯并吡唑基、 2-、 4-、 5-、 6- 或 7- 苯并 并 -2， 1， 3唑基、 3-、 4-、 5-、 6- 或 7- 苯并异 唑基、 2-、 4-、 5-、 6- 或 7- 苯并噻唑基、 2-、 4-、 5-、 6- 或 7- 苯并异噻唑基、 4-、 5-、 6- 或 7- 苯 二唑基、 2-、 3-、 4-、 5-、 6-、 7- 或 8- 喹啉基、 1-、 3-、 4-、 5-、 6-、 7- 或 8- 异喹啉 嗪基、 苯并三唑基， 进一步优选 1， 3- 苯并间二氧杂环 二 基、 3-、 4-、 5-、 6-、 7- 或 8- 噌啉基、 2-、 4-、 5-、 6-、 7- 或 8- 喹唑啉基、 5- 或 6- 喹喔啉基、 2-、 3-、 5-、 6-、 7- 或 8-2H- 苯并 -1， 4戊烯 -5- 基、 1， 4- 苯并二 唑 -5- 基或二苯并呋喃基。78烷 -6- 基、 2， 1， 3- 苯并噻二唑 -4-、 -5- 基或 2， 1， 3- 苯并CN 102471343 A
说明书23/121 页杂环基团还可以是部分或完全氢化的。
与其它的取代基无关， Het 由此还可以表示例如 2， 3- 二氢 -2-、 -3-、 -4- 或 -5- 呋 喃 基、 2， 5- 二 氢 -2-、 -3-、 -4- 或 5- 呋 喃 基、 四 氢 -2- 或 -3- 呋 喃 基、 1， 3- 二 氧 戊 环 -4- 基、 四氢 -2- 或 -3- 噻吩基、 2， 3- 二氢 -1-、 -2-、 -3-、 -4- 或 -5- 吡咯基、 2， 5- 二 氢 -1-、 -2-、 -3-、 -4- 或 -5- 吡 咯 基、 1-、 2- 或 3- 吡 咯 烷 基、 四 氢 -1-、 -2- 或 -4- 咪 唑 基、 2， 3- 二 氢 -1-、 -2-、 -3-、 -4- 或 -5- 吡 唑 基、 四 氢 -1-、 -3- 或 -4- 吡 唑 基、 1， 4- 二 氢 -1-、 -2-、 -3- 或 -4- 吡啶基、 1， 2， 3， 4- 四氢 -1-、 -2-、 -3-、 -4-、 -5- 或 -6- 吡啶基、 1-、 2-、 3- 或 4- 哌啶基、 2-、 3- 或 4- 吗啉基、 四氢 -2-、 -3- 或 -4- 吡喃基、 1， 4- 二 3- 二 烷基、 1， 烷 -2-、 -4- 或 -5- 基、 六氢 -1-、 -3- 或 -4- 哒嗪基、 六氢 -1-、 -2-、 -4- 或 -5- 嘧啶基、 1-、 2- 或 3- 哌嗪基、 1， 2， 3， 4- 四氢 -1-、 -2-、 -3-、 -4-、 -5-、 -6-、 -7- 或 -8- 喹啉基、 1， 2， 3， 4- 四氢 -1-、 -2-、 -3-、 -4-、 -5-、 -6-、 -7- 或 -8- 异喹啉基、 2-、 3-、 5-、 6-、 7- 或 8-3， 4- 二氢 -2H- 苯并 -1， 4嗪基、 此外还优选 2， 3- 亚甲基二氧基苯基、 3， 4- 亚甲基二氧基 苯基、 2， 3- 亚乙基二氧基苯基、 3， 4- 亚乙基二氧基苯基、 3， 4-( 二氟亚甲基二氧基 ) 苯基、 2， 3- 二氢苯并呋喃 -5- 或 6- 基、 2， 3-(2- 氧代亚甲基二氧基 ) 苯基或 3， 4- 二氢 -2H-1， 5- 苯 并二 庚英 -6- 或 -7- 基， 此外还优选 2， 3- 二氢苯并呋喃基、 2， 3- 二氢 -2- 氧代呋喃基、 唑基、 2- 氧代 -2， 3- 二氢苯并 唑基、 3， 4- 二氢 -2- 氧代 -1H- 喹唑啉基、 2， 3- 二氢苯并2， 3- 二氢苯并咪唑基、 1， 3- 二氢吲哚、 2- 氧代 -1， 3- 二氢吲哚或 2- 氧代 -2， 3- 二氢苯并咪 唑基。 Het 优选表示具有 1 至 4 个 N、 O 和 / 或 S 原子的单 -、 二 - 或三环的饱和、 不饱和 1 或芳族杂环， 它们均是未取代的或被 A、 Het 、 OH、 NH2、 NHA 和 / 或 NA2 单 -、 二 - 或三取代。
Het 尤其优选表示吡咯烷基、 哌啶基、 噻唑烷基、 吗啉基、 唑烷基、 四氢喹唑啉 唑基、 异噻唑基、 哌嗪基、 噻唑基、 呋喃基、 噻吩基、 吡咯基、 咪唑基、 吡唑基、 唑基、 异基、 吡啶基、 嘧啶基、 三唑基、 四唑基、 二唑基、 噻二唑基、 咪唑并吡啶基或苯并三唑基， 它 们均是未取代的或被 A、 Het1、 OH、 NH2、 NHA 和 / 或 NA2 单 -、 二 - 或三取代。 1
与其它取代基无关， Het 表示例如 2- 或 3- 呋喃基、 2- 或 3- 噻吩基、 1-、 2- 或 3- 吡 咯基、 1-、 2、 4- 或 5- 咪唑基、 1-、 3-、 4- 或 5- 吡唑基、 2-、 4- 或 5唑基、 3-、 4- 或 5- 异 唑 基、 2-、 4- 或 5- 噻唑基、 3-、 4- 或 5- 异噻唑基、 2-、 3- 或 4- 吡啶基、 2-、 4-、 5- 或 6- 嘧啶基， 此外还优选 1， 2， 3- 三唑 -1-、 -4- 或 -5- 基、 1， 2， 4- 三唑 -1-、 -3- 或 5- 基、 1- 或 5- 四唑基、 1， 2， 3二唑 -4- 或 -5- 基、 1， 2， 4二唑 -3- 或 -5- 基、 1， 3， 4- 噻二唑 -2- 或 -5- 基、 1， 2， 4- 噻二唑 -3- 或 -5- 基、 1， 2， 3- 噻二唑 -4- 或 -5- 基、 3- 或 4- 哒嗪基、 吡嗪基、 1-、 2-、 3-、 4-、 5-、 6- 或 7- 吲哚基、 4- 或 5- 异吲哚基、 吲唑基、 1-、 2-、 4- 或 5- 苯并咪唑基、 1-、 3-、 4-、 5-、 6- 或 7- 苯并吡唑基、 2-、 4-、 5-、 6- 或 7- 苯并 并 -2， 1， 3唑基、 3-、 4-、 5-、 6- 或 7- 苯并异 唑基、 2-、 4-、 5-、 6- 或 7- 苯并噻唑基、 2-、 4-、 5-、 6- 或 7- 苯并异噻唑基、 4-、 5-、 6- 或 7- 苯 二唑基、 2-、 3-、 4-、 5-、 6-、 7- 或 8- 喹啉基、 1-、 3-、 4-、 5-、 6-、 7- 或 8- 异喹啉 嗪基、 苯并三唑基， 进一步优选 1， 3- 苯并间二氧杂环 二 基、 3-、 4-、 5-、 6-、 7- 或 8- 噌啉基、 2-、 4-、 5-、 6-、 7- 或 8- 喹唑啉基、 5- 或 6- 喹喔啉基、 2-、 3-、 5-、 6-、 7- 或 8-2H- 苯并 -1， 4戊烯 -5- 基、 1， 4- 苯并二 唑 -5- 基或二苯并呋喃基。79烷 -6- 基、 2， 1， 3- 苯并噻二唑 -4-、 -5- 基或 2， 1， 3- 苯并CN 102471343 A
说明书24/121 页Het1 优选表示具有 1 至 4 个 N、 O 和 / 或 S 原子的单 -、 二 - 或三环芳族杂环， 它们 均是未取代的或被 A 和 / 或 Hal 单 -、 二 - 或三取代。 1
Het 尤其优选表示呋喃基、 噻吩基、 吡啶基、 吡咯基、 咪唑基、 嘧啶基或 1， 3- 苯并间 二氧杂环戊烯 -5- 基， 其中基团可以被 A 和 / 或 Hal 单 -、 二 - 或三取代。
哌啶基、 噻唑烷基、 吗啉基、 唑烷基、 四氢喹唑啉基、 四 Het2 优选表示吡咯烷基、 唑基、 异氢吡喃基、 哌嗪基、 噻唑基、 呋喃基、 噻吩基、 吡咯基、 咪唑基、 吡唑基、 唑基、 异它们均是未取代的或被 A 噻唑基、 吡啶基、 嘧啶基、 三唑基、 四唑基、 二唑基或噻二唑基、 单取代。
缩写词 ：
DIPEA 二异丙基乙基胺
DAPECI N-3- 二甲基氨基丙基 -N′ - 乙基碳二亚胺
DCCI N， N′ - 二环己基碳二亚胺
HOBt 1- 羟基苯并三唑
在本发明中， 所有出现一次以上的基团可以是相同的或不同的， 例如 R 可以是相 同或不同的， 即为各自独立的。
式 I 化合物可以具有一个或多个手性中心并且因此可以以各种立体异构形式存 在。式 I 包含所有这些形式。
因此， 本发明尤其涉及其中的至少一个所述基团具有以上所示的优选含义之一的 式 I 化合物的应用。
某些优选的化合物组可以通过下面的子式 Ia 至 Ih 进行表述， 它们与式 I 一致并 且其中未更详细地指定的基团具有关于式 I 所示的含义， 但是， 其中 2
在 Ia 中 R 表示 H、 (CH2)n3NH2、 (CH2)n3NHA、 (CH2)n3NA2、 (CH2)n3OH、 (CH2)n3OA、 (CH2) 2 2 CH2COHet 、 CH2CONH2、 CH2CONHA、 CH2CONA2 或甲基 ； n3Het 、
在 Ib 中 X、 X1 彼此独立地表示 CO 或 CH2 ；
在 Ic 中 Y、 Y1 表示 CH ；
在 Id 中 A 表示具有 1-10 个 C 原子的直链或支链烷基， 其中 1-7 个 H 原子被 F 和 / 或 Cl 代替，
或
具有 3-7 个 C 原子的环状烷基 ；
在 Ie 中 Ar 表示未取代的或被 Hal、 A、 OH、 OA、 NH2、 NHA 和 / 或 NA2 单 -、 二 - 或三 取代的苯基 ；
在 If 中 Het 表示具有 1 至 4 个 N、 O 和 / 或 S 原子的单 -、 二 - 或三环的饱和、 不 2 饱和或芳族杂环， 它们均是未取代的或被 A、 Het 、 OH、 NH2、 NHA 和 / 或 NA2 单 -、 二 - 或三取 代；
在 Ig 中 Het1 表示具有 1 至 4 个 N、 O 和 / 或 S 原子的单 -、 二 - 或三环芳族杂环， 它们均是未取代的或被 A 和 / 或 Hal 单 -、 二 - 或三取代 ； 1
在 Ih 中 R 表示 Hal、 Ar 或 Het 、 1
R 表示 SO2A、 COOA、 COOH、 Cyc、 Het、 Ar、 COHet、 CONHHet、 CONHAr、 CHO、 CONH2、 CONHA、 CONA2、 (CH2)n2OH、 (CH2)n2OA、 OAr、 NHAr、 (CH2)n2NH2、 (CH2)n2NHA、 (CH2)n2NA2 或 A，R2 表 示 H、 (CH2)n3NH2、 (CH2)n3NHA、 (CH2)n3NA2、 (CH2)n3OH、 (CH2)n3OA、 (CH2)n3Het2、 CH2COHet2、 CH2CONH2、 CH2CONHA、 CH2CONA2 或甲基，
X、 X1 彼此独立地表示 CO 或 CH2、
Y、 Y1 表示 CH，
Q 表示 CO、 SO2 或 COO，
E 表 示 CO、 CH(OH)、 CA(OH)、 CH(OA)、 CA(OA)、 CH(NH2)、 Alk、或Alk 表示具有 1-8 个 C 原子的直链或支链亚烷基， 其中一个或两个 CH2 基团可被 O 和 / 或 NH 代替，
n1 表示 0、 1 或 2，
n2 表示 0、 1、 2、 3 或 4，
n3 表示 1、 2、 3或4
Ar 表示未取代的或被 Hal、 A、 OH、 OA、 NH2、 NHA 和 / 或 NA2 单 -、 二 - 或三取代的 苯基，
Het 表示具有 1 至 4 个 N、 O 和 / 或 S 原子的单 -、 二 - 或三环的饱和、 不饱和或芳 2 族杂环， 它们均是未取代的或被 A、 Het 、 OH、 NH2、 NHA 和 / 或 NA2 单 -、 二 - 或三取代， 1
Het 表示具有 1 至 4 个 N、 O 和 / 或 S 原子的单 -、 二 - 或三环芳族杂环， 它们均是 未取代的或被 A 和 / 或 Hal 单 -、 二 - 或三取代，
Het2 表示吡咯烷基、 哌啶基、 噻唑烷基、 吗啉基、 唑烷基、 四氢喹唑啉基、 四氢吡 唑基、 异噻唑喃基、 哌嗪基、 噻唑基、 呋喃基、 噻吩基、 吡咯基、 咪唑基、 吡唑基、 唑基、 异 代，
基、 吡啶基、 嘧啶基、 三唑基、 四唑基、 二唑基或噻二唑基， 它们均是未取代的或被 A 单取 Cyc 表示具有 3-7 个 C 原子的环状烷基， A 表示具有 1-10 个 C 原子的直链或支链烷基， 其中 1-7 个 H 原子可被 F 和 / 或 Cl 取代， 或 具有 3-7 个 C 原子的环状烷基，Hal 表示 F、 Cl、 Br 或 I ；
及其可药用盐和立体异构体， 包括其所有比例的混合物。
式 I 化合物以及本发明化合物以及用于制备它们的起始材料可以采用如文献中 所述的本身已知的方法 ( 例如在标准专著中所述的方法， 如 Houben-Weyl， Methoden der organischen Chemie[ 有机化学方法 ]， Georg-Thieme-Verlag， Stuttgart)， 在已知并且适 于所述反应的反应条件下进行制备。 也可以采用此处并未更详细说明的本身已知的变通方 法进行制备。
式 I 化合物优选通过将式 II 化合物
其中 R、 Y、 Y1、 X、 X1 和 R2 具有权利要求 1 中所示的含义，
与式 III 化合物反应来得到
L-(Q)n1-(E)n2-R1 III 1
其中 Q、 E、 R、 n1 和 n2 具有权利要求 1 中所示的含义， 并且
L 表示 Cl、 Br、 I 或游离的或反应官能团修饰的 OH 基团。
在式 III 化合物中， L 优选表示 Cl、 Br、 I 或游离的或反应官能团修饰的 OH 基团， 例如活性酯、 酰基咪唑或具有 1-6 个 C 原子的烷基磺酰基氧基 ( 优选甲基磺酰基氧基或三 氟甲基磺酰基氧基 ) 或具有 6-10 个 C 原子的芳基磺酰基氧基 ( 优选苯基 - 或对甲苯基磺 酰基氧基 )。
如果在式 III 化合物中 L 表示 OH， 则反应尤其优选在加入 DAPECI 和 HOBT 水合物 的条件下在 DMF 中进行。
反应还可在酸结合剂、 优选有机碱例如 DIPEA、 三乙胺、 二甲基苯胺、 吡啶或喹啉的 存在下进行。加入碱金属或碱土金属氢氧化物、 碳酸盐或碳酸氢盐或另一种碱金属或碱土 金属优选钾、 钠、 钙或铯的弱酸盐也是有利的。
根据所用条件， 其反应时间为数分钟至 14 天， 反应温度为约 -30°至 140°， 通常 为 -10°至 90°， 特别优选地为约 0℃至约 70℃。
适宜的惰性溶剂的实例是烃类如己烷、 石油醚、 苯、 甲苯或二甲苯 ； 氯代烃类， 如三 氯乙烯、 1， 2- 二氯乙烷、 四氯化碳、 氯仿或二氯甲烷 ； 醇如甲醇、 乙醇、 异丙醇、 正丙醇、 正丁
醇或叔丁醇 ； 醚如二乙醚、 二异丙基醚、 四氢呋喃 (THF) 或二烷； 乙二醇醚如乙二醇单甲或单乙醚、 乙二醇二甲醚 ( 二甘醇二甲醚 ) ； 酮如丙酮或丁酮 ； 酰胺如乙酰胺、 二甲基乙酰胺 或二甲基甲酰胺 (DMF) ； 腈如乙腈 ； 亚砜如二甲基亚砜 (DMSO) ； 二硫化碳 ； 羧酸如甲酸或乙 酸； 硝基化合物如硝基甲烷或硝基苯 ； 酯如乙酸乙酯或所述溶剂的混合物。
特别优选乙腈、 二氯甲烷和 / 或 DMF。
式 I 化合物还优选通过将式 IV 化合物
其中 X、 X1、 Y、 Y1、 R1、 R2、 Q、 E、 n1 和 n2 具有权利要求 1 所示的含义， 且 L1 表示 Br、 Cl 或 I，
与式 V 化合物反应来得到
R-Y V 其中 R 具有权利要求 1 所示的含义， 并且 Y 表示硼酸或硼酸酯基团。 在式 V 化合物中， Y 优选表示反应在 Suzuki 偶联的标准条件下进行。
根据所用条件， 其反应时间为数分钟至 14 天， 反应温度为约 -30°至 140°， 通常 为 0°至 100°， 特别优选约 60℃至约 90℃。
溶剂特别优选乙醇、 甲苯或二甲氧基乙烷。
所述单独的本发明化合物可以以它们最终的非盐形式应用。另一方面， 本发明也 包括可药用盐形式的这些化合物的应用， 所述盐可以通过本领域已知的方法衍生自多种有 机和无机酸和碱。大部分式 I 化合物的可药用盐形式可以通过常规方法制备。如果式 I 化 合物包含羧基基团， 它的适当的盐之一可以通过将该化合物与适当的碱反应得到相应的碱 加成盐来形成。所述的碱为例如碱金属氢氧化物， 包括氢氧化钾、 氢氧化钠和氢氧化锂 ； 碱 土金属氢氧化物， 如氢氧化钡和氢氧化钙 ； 碱金属醇盐， 例如乙醇钾和丙醇钠 ； 以及各种有 机碱， 如哌啶、 二乙醇胺和 N- 甲基葡糖胺。 也包括式 I 化合物的铝盐。 在某些化合物的情况
中， 可以通过将这些化合物用可药用的有机和无机酸处理来形成酸加成盐， 例如氢卤酸， 如 盐酸、 氢溴酸或氢碘酸 ； 其它无机酸和它们相应的盐， 如硫酸盐、 硝酸盐或磷酸盐等 ； 以及 烷基 - 和单芳基磺酸盐， 如乙磺酸盐、 甲苯磺酸盐和苯磺酸盐 ； 以及其它有机酸和它们相应 的盐， 如乙酸盐、 三氟乙酸盐、 酒石酸盐、 马来酸盐、 琥珀酸盐、 柠檬酸盐、 苯甲酸盐、 水杨酸 盐、 抗坏血酸盐等。 因此， 化合物的可药用酸加成盐包括下列 ： 乙酸盐、 己二酸盐、 藻酸盐、 精 氨酸盐、 天冬氨酸盐、 苯甲酸盐、 苯磺酸盐、 硫酸氢盐、 亚硫酸氢盐、 溴化物、 丁酸盐、 樟脑酸 盐、 樟脑磺酸盐、 辛酸盐、 氯化物、 氯苯甲酸盐、 柠檬酸盐、 环戊烷丙酸盐、 二葡糖酸盐、 磷酸 二氢盐、 二硝基苯甲酸盐、 十二烷基硫酸盐、 乙磺酸盐、 富马酸盐、 半乳糖酸盐 ( 得自半乳糖 二酸 )、 半乳糖醛酸盐、 葡庚糖酸盐、 葡糖酸盐、 谷氨酸盐、 甘油磷酸盐、 半琥珀酸盐、 半硫酸 盐、 庚酸盐、 己酸盐、 马尿酸盐、 盐酸盐、 氢溴酸盐、 氢碘酸盐、 2- 羟基乙磺酸盐、 碘化物、 羟乙 基磺酸盐、 异丁酸盐、 乳酸盐、 乳糖酸盐、 苹果酸盐、 马来酸盐、 丙二酸盐、 扁桃酸盐、 偏磷酸 盐、 甲磺酸盐、 甲基苯甲酸盐、 磷酸一氢盐、 2- 萘磺酸盐、 烟酸盐、 硝酸盐、 草酸盐、 油酸盐、 棕 榈酸盐、 果胶酸盐、 过硫酸盐、 苯基乙酸盐、 3- 苯基丙酸盐、 磷酸盐、 膦酸盐、 邻苯二甲酸盐， 但本发明并不限于此。
另外， 本发明的化合物的碱盐包括铝、 铵、 钙、 铜、 铁 (III)、 亚铁 (II)、 锂、 镁、 锰 (III)、 锰 (II)、 钾、 钠和锌盐， 但本发明并不限于此。对于上文所述的盐， 优选为铵盐 ； 碱 金属钠和钾的盐， 以及碱土金属钙和镁的盐。衍生自可药用的有机无毒碱的化合物的盐包 括伯胺、 仲胺和叔胺的盐， 取代的胺的盐， 也包括天然存在的取代的胺、 环胺和碱性的离子 交换树脂的盐， 例如精氨酸、 甜菜碱、 咖啡因、 氯普鲁卡因、 胆碱、 N， N′ - 二苄基乙二胺 ( 苄 2- 二甲基氨基乙醇、 乙醇胺、 乙二 星 )、 二环己基胺、 二乙醇胺、 二乙胺、 2- 二乙基氨基乙醇、胺、 N- 乙基吗啉、 N- 乙基哌啶、 葡糖胺、 氨基葡糖、 组氨酸、 哈胺 (hydrabamine)、 异丙基胺、 利多卡因、 赖氨酸、 葡甲胺、 N- 甲基 -D- 葡糖胺、 吗啉、 哌嗪、 哌啶、 聚胺树脂、 普鲁卡因、 嘌呤 类、 可可碱、 三乙醇胺、 三乙胺、 三甲胺、 三丙胺和三 ( 羟甲基 ) 甲胺 ( 氨基丁三醇 ) 的盐， 但 本发明并不限于此。
可以用如下物质将包含碱性含氮基团的本发明化合物季铵化 ： (C1-C4) 烷基卤化 物， 例如甲基、 乙基、 异丙基和叔丁基氯化物、 溴化物和碘化物 ； 二 (C1-C4) 烷基硫酸酯， 例如 二甲基、 二乙基和二戊基硫酸酯 ； (C10-C18) 烷基卤化物， 例如癸基、 十二烷基、 月桂基、 肉豆 蔻基和十八烷基氯化物、 溴化物和碘化物 ； 以及芳基 (C1-C4) 烷基卤化物， 例如苄基氯化物 和苯乙基溴化物。水溶性和油溶性的本发明的化合物均可使用此类盐制备。
优选的上文所述的药用盐包括乙酸盐、 三氟乙酸盐、 苯磺酸盐、 柠檬酸盐、 富马酸 盐、 葡糖酸盐、 半琥珀酸盐、 马尿酸盐、 盐酸盐、 氢溴酸盐、 羟乙基磺酸盐、 扁桃酸盐、 葡甲胺、 硝酸盐、 油酸盐、 膦酸盐、 新戊酸盐、 磷酸钠、 硬脂酸盐、 硫酸盐、 磺基水杨酸盐、 酒石酸盐、 硫 代苹果酸盐、 甲苯磺酸盐和氨基丁三醇， 但本发明并不限于此。
碱性化合物的酸加成盐可以以常规方式， 通过将游离碱形式与足量的所需酸接触 成盐来进行制备。游离碱可以以常规方式， 通过将该盐形式与碱接触并将游离碱分离而再 生。游离碱形式在某些方面不同于它们相应的盐形式， 如某些物理性质 ( 例如在极性溶剂 中的溶解度 ) ； 然而， 就本发明的目的而言， 盐与它们各自的游离碱形式是相当的。
如前文所述， 化合物的可药用的碱加成盐可以由金属或胺形成， 例如碱金属和碱 土金属或有机胺。优选的金属为钠、 钾、 镁和钙。优选的有机胺为 N， N’ - 二苄基乙二胺、 氯 普鲁卡因、 胆碱、 二乙醇胺、 乙二胺、 N- 甲基 -D- 葡糖胺和普鲁卡因。
本发明的酸性化合物的碱加成盐可以以常规方式， 通过将游离酸形式与足量的所 需碱接触成盐来进行制备。游离酸可以以常规方式， 通过将该盐形式与酸接触并将游离酸 分离而再生。游离酸形式在某些方面不同于它们相应的盐形式， 如某些物理性质 ( 例如 在极性溶剂中的溶解度 ) ； 然而， 就本发明的目的而言， 盐与它们各自的游离酸形式是相当 的。
如果本发明的化合物包含一个以上能形成此类可药用盐的基团， 那么本发明也包 括多盐。典型的多盐形式包括例如二酒石酸盐、 二乙酸盐、 二富马酸盐、 二葡甲胺、 二磷酸 盐、 二钠盐和三盐酸盐， 但本发明并不限于此。
如上文所述， 可知本文中的术语 “可药用盐” 是指包含盐形式的化合物的活性成 分， 特别是如果这种盐形式使活性成分的药代动力学性质与之前使用的活性成分的游离形 式或活性成分的任何其它盐形式相比有所改善时。 活性成分的可药用盐形式还可以为该活 性成分首次提供之前没有的所需药代动力学性质， 并且甚至可以对该活性成分的药效学在 其体内治疗效果方面产生积极的作用。
另外， 本发明涉及包含至少一种本发明化合物和 / 或其可药用盐和立体异构体 ( 包括其所有比例的混合物 ) 以及任选的赋形剂和 / 或辅剂的药物。
药物制剂可以以剂量单位的形式给药， 每个剂量单位包含预定量的活性成分。该 剂量单位可以包含例如 0.5mg-1g、 优选 1mg-700mg、 特别优选 5mg-100mg 的本发明化合物， 具体剂量取决于所治疗的疾病、 给药方法和患者的年龄、 体重和状况， 或者药物制剂可以以 剂量单位的形式给药， 该剂量单位每剂量单位包含预定量的活性成分。优选的剂量单位制剂为包含上文所述日剂量或部分剂量或其相应比例的活性成分的那些制剂。另外， 此类药 物制剂可以应用药学领域所熟知的方法来制备。
药物制剂可以通过任何所需的适当方法给药， 例如通过口服 ( 包括口腔或舌下 )、 直肠、 鼻、 局部 ( 包括口腔、 舌下或经皮 )、 阴道或非胃肠 ( 包括皮下、 肌内、 静脉内或真皮 内 ) 方法给药。此类制剂可以应用药学领域已知的所有方法通过例如将活性成分与赋形剂 或辅剂混合来制备。
适用于口服给药的药物制剂可以以分开的独立单位形式给药， 如胶囊剂或片剂 ； 散剂或颗粒剂 ； 在水或非水液体中的溶液剂或混悬剂 ； 可食用的泡沫剂或泡沫食物 ； 或者 水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。
因此， 例如， 在以片剂或胶囊剂形式口服给药的情况中， 可以将活性成分与口服、 无毒并且可药用的惰性赋形剂如乙醇、 甘油、 水等混合。 散剂可以通过将化合物粉碎成适当 的细粉末并将其与以类似方法粉碎的药物赋形剂混合来制备， 所述赋形剂是例如可食用的 碳水化合物， 如淀粉或甘露醇。也可以应用矫味剂、 防腐剂、 分散剂和染料等。
胶囊剂可以通过制备如上所述的粉末混合物并且将其填入成形的明胶壳中来制 备。 可以在填充操作前向该粉末混合物中加入助流剂和润滑剂如高分散硅酸、 滑石粉、 硬脂 酸镁、 硬脂酸钙或固体形式的聚乙二醇。 同样可以加入崩解剂或增溶剂例如琼脂、 碳酸钙或 碳酸钠， 以便在服用胶囊剂后提高药物的利用度。
另外， 如果需要或必须， 也可以向混合物中掺入适当的粘合剂、 润滑剂和崩解剂以 及染料。适当的粘合剂包括淀粉、 明胶、 天然糖 ( 如葡萄糖或 β- 乳糖、 用玉米制备的甜味 剂 )、 天然的和合成的橡胶 ( 如阿拉伯胶、 黄蓍胶或海藻酸钠 )、 羧甲基纤维素、 聚乙二醇、 蜡 等。这些剂型中所用的润滑剂包括油酸钠、 硬脂酸钠、 硬脂酸镁、 苯甲酸钠、 乙酸钠、 氯化钠 等。崩解剂包括但不限于淀粉、 甲基纤维素、 琼脂、 膨润土、 黄原胶等。片剂通过例如制备粉 末混合物、 制粒或干法压制混合物、 加入润滑剂和崩解剂并压制全部混合物以得到片剂来 配制。粉末混合物可以通过如上文所述将以适当方式粉碎的化合物与稀释剂或基质混合， 并任选地与粘合剂 ( 例如羧甲基纤维素、 海藻酸盐、 明胶或聚乙烯吡咯烷酮 )、 溶解阻滞剂 ( 如石蜡 )、 吸收促进剂 ( 如季盐 ) 和 / 或吸附剂 ( 如膨润土、 高岭土或磷酸二钙 ) 混合来 制备。粉末混合物可以通过用粘合剂 ( 如糖浆、 淀粉糊、 阿拉伯胶浆或纤维素或聚合物材料 的溶液 ) 将其润湿并且挤压过筛来制粒。作为制粒的替代方案， 粉末混合物可以通过压片 机操作， 压制成形状不一的团块， 该团块粉碎后形成颗粒。颗粒可以通过加入硬脂酸、 硬脂 酸盐、 滑石粉或矿物油来润滑， 以避免其粘附于片剂冲模。 然后压制已润滑的混合物以得到 片剂。本发明的化合物也可以与自由流动的惰性赋形剂混合， 然后不经制粒或干法压制步 骤直接压制得到片剂。可以存在由紫胶密封层、 糖或聚合物材料层和蜡抛光层组成的透明 或不透明的保护层。可以向这些包衣剂中加入染料以便区分不同的剂量单位。
口服的液体例如溶液剂、 糖浆剂和酏剂可以以剂量单位形式制备， 以使给定的量 中包含预定量的化合物。糖浆剂可以通过将化合物溶于含有合适矫味剂的水溶液中来制 备， 而酏剂可以应用无毒醇介质制备。 混悬剂可以通过将化合物分散于无毒介质中来制备。 也可以加入增溶剂和乳化剂 ( 如乙氧基化的异十八烷醇和聚氧乙烯山梨醇醚 )、 防腐剂、 矫 味添加剂 ( 如薄荷油或天然的甜味剂或糖精 ) 或者其它的人工甜味剂等。
如果需要， 可以将口服给药的剂量单位制剂包封到微囊中。该制剂也可以以延长或延缓释放的方式制备， 例如通过包衣或将微粒材料包埋于聚合物、 蜡等中。
化合物及其盐、 溶剂化物以及有生理学功能的衍生物也可以以脂质体传递系统的 形式， 例如小单室脂质体、 大单室脂质体和多复层脂质体形式给药。 脂质体可以由各种磷脂 例如胆固醇、 硬脂胺或磷脂酰胆碱形成。
化合物及其盐、 溶剂化物和有生理学功能的衍生物也可以用与该化合物分子偶联 的单克隆抗体作为单一载体来传递。该化合物也可以与作为靶向药物载体的可溶性聚合 物偶联。此类聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、 吡喃共聚物、 聚羟丙基甲基丙烯酰氨基苯酚、 聚羟乙基天冬氨酰氨基苯酚或聚氧乙烯聚赖氨酸， 其可以被棕榈酰基取代。另外， 该化合 物还可以与一类适合获得药物控释的可生物降解的聚合物偶联， 该聚合物是例如聚乳酸、 聚 -ε- 己内酯、 聚羟基丁酸、 聚原酸酯、 聚缩醛、 聚二羟基吡喃、 聚氰基丙烯酸酯和水凝胶 的交联或两亲的嵌段共聚物。
适于经皮给药的药物制剂可以以用于长时间紧密接触受体表皮的独立硬膏剂的 形式给药。因此， 例如活性成分可以从硬膏剂通过如 Pharmaceutical Research， 3(6)， 318(1986) 中所述的离子电渗疗法传递。
适于局部给药的药用化合物可以配制为软膏剂、 乳膏剂、 混悬剂、 洗剂、 散剂、 溶液 剂、 糊剂、 凝胶剂、 喷雾剂、 气雾剂或油剂。
对于眼或其它外部组织例如口腔和皮肤的治疗而言， 制剂优选以局部软膏剂或乳 膏剂的形式来应用。在制剂为软膏剂的情况下， 活性成分可以与石蜡或易与水混溶的膏基 共同应用。或者， 活性成分可以用水包油型乳膏基或油包水型乳膏基配制成乳膏剂。
适于局部应用于眼部的药物制剂包括滴眼剂， 其中活性成分溶于或混悬于合适载 体中， 特别是水性溶剂中。
适于局部应用于口腔的药物制剂包括锭剂、 软锭剂和漱口剂。
适于直肠给药的药物制剂可以以栓剂或灌肠剂的形式给药。
其中的载体物质为固体的适于鼻腔给药的药物制剂包括具有例如 20-500 微米范 围内的粒径的粗粉剂， 其以鼻吸的方式给药， 即通过鼻道从接近鼻腔的装有粉末的容器内 快速吸入。 用液体作为载体物质的适于以鼻喷雾剂或滴鼻剂的形式给药的制剂包括活性成 分的水或油溶液。
适于吸入给药的药物制剂包括细颗粒的粉末或喷雾， 其可以通过多种类型的具有 气雾剂、 喷雾器或吹入器的加压分散器来产生。
适于阴道给药的药物制剂可以以阴道栓剂、 阴道塞、 乳膏剂、 凝胶剂、 糊剂、 泡沫剂 或喷雾制剂给药。
适于胃肠外给药的药物制剂包括含有抗氧化剂、 缓冲剂、 抑菌剂和溶质的水性和 非水无菌注射液， 通过所述溶质使该制剂与被治疗的患者的血液等张 ； 以及水性和非水无 菌混悬液， 其可以包含助悬介质和增稠剂。 这些制剂可以在单剂量或多剂量容器， 例如密封 的安瓿和小瓶中被给药， 并存贮于冷冻干燥 ( 冻干 ) 状态下， 从而仅需在临用之前加入无菌 液体载体， 例如注射用水。 依照处方制备的注射溶液和混悬液可以由无菌粉末、 颗粒和片剂 制备。
不言而喻， 除了上文所特别指出的组分外， 对于特定类型的制剂而言， 制剂中也可 以包含本领域常用的其它物质 ； 因此， 例如适于口服给药的制剂可以包含矫味剂。化合物的治疗有效量取决于多种因素， 包括例如动物的年龄和体重、 需要治疗的 具体病症及其严重性、 制剂的性质以及给药方法， 并且最终由主治医生或兽医确定。然而， 本发明的化合物用于治疗肿瘤生长 ( 例如结肠或乳腺癌 ) 的有效量通常为每日 0.1-100mg/ kg 受体 ( 哺乳动物 ) 体重， 特别是每日 1-10mg/kg 体重。因此， 对于体重为 70kg 的成年哺 乳动物而言， 每日的实际量通常为 70-700mg， 其中该剂量可以以单剂量形式每日给药， 或者 通常以一系列部分剂量形式 ( 如每天给药 2、 3、 4、 5 或 6 次 ) 每日给药， 以使总的日剂量不 变。 其盐或溶剂化物或有生理学功能的衍生物的有效量可以确定为本发明化合物本身的有 效量的分数。可以推断适于治疗上述其它病症的类似剂量。
本发明还涉及包含至少一种本发明化合物和 / 或其可药用的衍生物、 溶剂化物和 立体异构体 ( 包括其所有比例的混合物 ) 以及至少一种其他药物活性成分的药物。
本发明也涉及药盒， 该药盒由单独包装的
(a) 有效量的本发明化合物和 / 或其可药用的衍生物、 溶剂化物和立体异构体 ( 包 括其所有比例的混合物 )， 以及
(b) 有效量的其他药物活性成分所组成。
所述药盒包括适当的容器， 如盒、 单独的瓶、 袋或安瓿。该药盒可以包含例如单独 的安瓿， 各安瓿分别包含有效量的本发明化合物和 / 或其可药用的衍生物、 溶剂化物和立 体异构体 ( 包括其所有比例的混合物 )， 以及有效量的溶解或冻干形式的其他药物活性成 分。
优选将表 1 的药物与本发明化合物联合用药， 但并不排除其它药物。
优选将式 I 的化合物与已知的抗癌剂联合。
这些已知的抗炎剂包括下面的物质 ： 雌激素受体调节剂、 雄激素受体调节剂、 类维 生素 A 受体调节剂、 细胞毒性剂、 抗增殖剂、 异戊二烯基 - 蛋白转移酶抑制剂、 HMG-CoA 还原 酶抑制剂、 HIV 蛋白酶抑制剂、 逆转录酶抑制剂和其它血管生成抑制剂。本发明的化合物特 别适于与放疗同时使用。专家们已经描述了与放疗联合时对 VEGF 的协同抑制作用 ( 见 WO 00/61186)。
“雌激素受体调节剂” 指的是无论其机理如何， 可以干扰或抑制雌激素与受体 结合的化合物。雌激素受体调节剂的实例非限制性地包括他莫昔芬、 雷洛昔芬、 艾多昔 芬、 LY353381、 LY117081、 托瑞米芬、 氟维司群、 4-[7-(2， 2- 二甲基 -1- 氧代丙氧基 -4- 甲
基 -2-[4-[2-(1- 哌啶基 ) 乙氧基 ] 苯基 ]-2H-1- 苯并吡喃 -3- 基 ]- 苯基 -2， 2- 二甲基丙 酸酯、 4， 4’ - 二羟基二苯甲酮 -2， 4- 二硝基苯基 - 腙和 SH646。
“雄激素受体调节剂” 指的是无论其机理如何， 可以干扰或抑制雄激素与受体结合 的化合物。雄激素受体调节剂的实例包括非那雄胺和其它 5α- 还原酶抑制剂、 尼鲁米特、 氟他胺、 比卡鲁胺、 利阿唑和醋酸阿比特龙。
“类维生素 A 受体调节剂” 指的是无论其机理如何， 可以干扰或抑制类维生素 A 与 受体结合的化合物。 该类类维生素 A 受体调节剂的实例包括贝沙罗汀、 维甲酸、 13- 顺式 - 视 黄酸、 9- 顺式 - 视黄酸、 α- 二氟甲基鸟氨酸、 ILX23-7553、 反式 -N-(4’ - 羟基苯基 ) 视黄 酰胺和 N-4- 羧基苯基视黄酰胺。
“细胞毒性剂” 指的是主要通过直接作用于细胞功能或抑制或干扰细胞有丝分裂 而造成细胞死亡的化合物， 包括烷化剂、 肿瘤坏死因子、 嵌入剂、 微管抑制剂和拓扑异构酶 抑制剂。
细胞毒性剂的实例非限制性地包括替拉扎明、 Sertenef、 恶病质素、 异环磷酰胺、 他索纳明、 氯尼达明、 卡铂、 六甲密胺、 泊尼莫司汀、 二溴卫矛醇、 雷莫司汀、 福莫司汀、 奈达 铂、 奥沙利铂、 替莫唑胺、 庚铂、 雌莫司汀、 英丙舒凡甲苯磺酸盐、 曲磷胺、 尼莫司汀、 二溴螺 氯铵、 嘌嘧替派、 洛铂、 沙铂、 甲基丝裂霉素、 顺铂、 伊罗夫文、 右异环磷酰胺、 顺式 - 胺化二 氯 (2- 甲基 - 吡啶 ) 铂、 苄基鸟嘌呤、 葡磷酰胺、 GPX100、 ( 反式， 反式， 反式 )- 二 -mu-( 己 烷 -1， 6- 二胺 )-mu-[ 二胺 - 铂 (II)] 二 [ 二胺 ( 氯 ) 铂 (II)] 四氯化物、 二氮杂环丙烯基 精胺、 三氧化二砷、 1-(11- 十二烷基氨基 -10- 羟基十一烷基 )-3， 7- 二甲基黄嘌呤、 佐柔比 星、 伊达比星、 柔红霉素、 比生群、 米托蒽醌、 吡柔比星、 吡萘非特、 戊柔比星、 氨柔比星、 抗瘤 酮 (antineoplaston)、 3’ - 脱氨基 -3’ - 吗啉代 -13- 脱氧代 -10- 羟基洋红霉素、 Annamycin、 加柔比星、 依利奈法德、 MEN10755、 和 4- 脱甲氧基 -3- 脱氨基 -3- 环乙亚胺基 -4- 甲基磺酰 基 - 柔红霉素 ( 见 WO 00/50032)。
微管抑制剂的实例包括紫杉醇、 硫酸长春地辛、 3’ ， 4’ - 二脱氢 -4’ - 脱氧 -8’ -去 长春花碱、 多西紫杉醇、 根霉素、 多拉司他汀、 米伏布林羟乙基磺酸盐、 Auristatin、 西马多 丁、 RPR109881、 BMS184476、 长春氟宁、 自念珠藻环肽、 2， 3， 4， 5， 6- 五氟 -N-(3- 氟 -4- 甲氧基 苯基 ) 苯磺酰胺、 脱水长春碱 (anhydrovinblastine)、 N， N- 二甲基 -L- 缬氨酰基 -L- 缬氨 酰基 -N- 甲基 -L- 缬氨酰基 -L- 脯氨酰基 -L- 脯氨酸 - 叔 - 丁酰胺、 TDX258 和 BMS188797。
拓扑异构酶抑制剂的一些实例有托泊替康、 Hycaptamine、 伊立替康、 卢比替康、 6- 乙氧基丙酰基 -3’ ， 4’ -O- 外 - 亚苄基 - 教酒菌素、 9- 甲氧基 -N， N- 二甲基 -5- 硝基吡唑并 [3， 4， 5-kl] 吖啶 -2-(6H) 丙胺、 1- 氨基 -9- 乙基 -5- 氟 -2， 3- 二氢 -9- 羟基 -4- 甲基 -1H， 12H- 苯并 [de] 吡喃并 [3’ ， 4’ :b， 7]- 吲嗪并 [1， 2b] 喹啉 -10， 13(9H， 15H) 二酮、 勒托替康、 7-[2-(N- 异丙基氨基 ) 乙基 ]-(20S) 喜树碱、 BNP1350、 BNPI1100、 BN80915、 BN80942、 磷酸 依托泊苷、 替尼泊苷、 索布佐生、 2’ - 二甲基氨基 -2’ - 脱氧 - 依托泊苷、 GL331、 N-[2-( 二甲 基氨基 ) 乙基 ]-9- 羟基 -5， 6- 二甲基 -6H- 吡啶并 [4， 3-b] 咔唑 -1- 甲酰胺、 Asulacrine、 (5a， 5aB， 8aa， 9b)-9-[2-[N-[2-( 二甲基氨基 ) 乙基 ]-N- 甲基氨基 ] 乙基 ]-5-[4- 羟基 -3， 5- 二甲氧基苯基 ]-5， 5a， 6， 8， 8a， 9- 六氢呋喃并 (3’ ， 4’ :6， 7) 萘并 (2， 3-d)-1， 3- 间二氧 杂环戊烯 -6- 酮、 2， 3-( 亚甲二氧基 )-5- 甲基 -7- 羟基 -8- 甲氧基苯并 [c]- 啡啶 6， 9- 二 [(2- 氨基乙基 ) 氨基 ] 苯并 [g] 异喹啉 -5， 10- 二酮、 5-(3- 氨基丙基氨基 )-7， 10- 二羟基 -2-(2- 羟基乙基氨基甲基 )-6H- 吡唑并 [4， 5， 1-de] 吖啶 -6- 酮、 N-[1-[2( 二乙基氨 基 ) 乙基氨基 ]-7- 甲氧基 -9- 氧代 -9H- 噻吨 -4- 基甲基 ] 甲酰胺、 N-(2-( 二甲基氨基 ) 乙基 ) 吖啶 -4- 甲酰胺、 6-[[2-( 二甲基氨基 ) 乙基 ] 氨基 ]-3- 羟基 -7H- 茚并 [2， 1-c] 喹 啉 -7- 酮和地美司钠。
“抗增殖剂” 包括反义 RNA 和 DNA 寡核苷酸如 G3139、 ODN698、 RVASKRAS、 GEM231、 和 INX3001， 以及抗代谢物如依诺他滨、 卡莫氟、 替加氟、 喷司他丁、 去氧氟尿苷、 曲美沙特、 氟达拉滨、 卡培他滨、 加洛他滨、 阿糖胞苷十八烷基磷酸钠、 Fosteabine 钠水合物、 雷替 曲塞、 Paltitrexid、 乙嘧替氟、 噻唑呋林 (tiazofurin)、 地西他滨、 诺拉曲塞、 培美曲塞、 Nelzarabine、 2’ - 脱氧 -2’ - 亚甲基胞苷、 2’ - 氟亚甲基 -2’ - 脱氧胞苷、 N-[5-(2， 3- 二 氢 - 苯并呋喃基 ) 磺酰基 ]-N’ -(3， 4- 二氯苯基 ) 脲、 N6-[4- 脱氧 -4-[N2-[2(E)， 4(E)- 十四 碳 二 烯 酰 基 ] 甘 氨 酰 基 氨 基 ]-L- 甘 油 -B-L- 甘 露 - 吡 喃 庚 糖 基 ] 腺 嘌 呤、 Aplidine、 Ecteinascidin、 曲沙他滨、 4-[2- 氨基 -4- 氧代 -4， 6， 7， 8- 四氢 -3H- 嘧啶并 [5， 4-b][1， 4] 噻嗪 -6- 基 -(S)- 乙基 ]-2， 5- 噻吩酰基 -L- 谷氨酸、 氨基蝶呤、 5- 氟尿嘧啶、 阿拉诺新、 11- 乙酰基 -8-( 氨基甲酰氧基甲基 )-4- 甲酰基 -6- 甲氧基 -14- 氧杂 -1， 11- 二氮杂四环 (7.4.1.0.0)- 十四碳 -2， 4， 6- 三烯 -9- 基醋酸酯、 苦马豆碱、 洛美曲索、 右雷佐生、 蛋氨酸 酶、 2’ - 氰基 -2’ - 脱氧 -N4- 棕榈酰基 -1-B-D- 呋喃阿糖基胞嘧啶和 3- 氨基吡啶 -2- 醛缩 氨基硫脲。
“抗增殖剂” 还包括除 “血管生成抑制剂” 下列出的那些物质外的生长因子的单克 隆抗体， 如曲妥单抗和肿瘤抑制基因， 如 p53， 其可以通过重组的病毒介导的基因转移来进 行传递 ( 例如见 US 专利 6,069,134)。
特别优选用式 I 化合物来治疗和预防肿瘤和 / 或肿瘤疾病以及用于预防癌症疾 病。
所述肿瘤优选选自鳞状上皮、 膀胱、 胃、 肾、 头和颈、 食管、 宫颈、 甲状腺、 小肠、 肝、 脑、 前列腺、 泌尿生殖道、 淋巴系统、 胃、 喉和 / 或肺的肿瘤。
该肿瘤还优选选自肺腺癌、 小细胞肺癌、 胰腺癌、 卵巢癌、 成角质细胞瘤、 结肠癌和 乳癌。
还优选用其来治疗血液和免疫系统的肿瘤， 优选用其来治疗选自急性骨髓性白血 病、 慢性骨髓性白血病、 急性淋巴性白血病和 / 或慢性淋巴性白血病的肿瘤。
本发明另一方面包括一种通过与抗增殖剂联合给予式 (I) 化合物来对患有肿瘤 如癌的患者进行治疗的方法。适宜的抗增殖剂包括表 1 中提供的那些化合物。
上下文中所有的温度都是以℃为单位给出的。在下面的实施例中， “常规后处理” 是指 ： 如果需要的话， 加入水， 如果需要的话， 根据终产物的组成将 pH 调至 2 至 10， 用乙酸 乙酯或二氯甲烷对混合物进行萃取， 进行相分离， 将有机相用硫酸钠干燥并蒸发， 然后用硅 胶色谱和 / 或通过结晶对产物进行纯化。Rt 值通过 HPLC 利用所述的洗脱剂测定。
质谱 (MS) ： EI( 电子撞击电离 )M+
FAB( 快原子轰击 )(M+H)+
ESI( 电喷射电离 )(M+H)+
APCI-MS( 大气压化学电离 - 质谱 )(M+H)+
分析性 HPLC 和 LC/MS 方法A HPLC 方法 ： 1_100_2 Speed( 仪器 ： LaChrom)
柱： Chromolith Performance RP18e 100-3mm
流速 ： 2ml/min( 泵 ： L-7100)
溶剂 A ： 水 +0.01％ TFA
溶剂 B ： 乙腈 +0.01％ TFA
波长 ： 220nm( 检测器 ： L-7455)
梯 度： 0-0.2min.100 ％ A， 0.2-3.7min. 至 100 ％ B， 3.7-4.4min.00 ％ B， 4.5-5.0min.100％ A
B HPLC/MS 方法 ： SOP 2222( 仪器 ： Waters)
柱： Chromolith Flash RP18e 25-2mm
流速 ： 2.4ml/min( 泵 ： Waters 1525 Binary HPLC 泵 )
溶剂 A ： 水 +0.01％ TFA
溶剂 B ： 乙腈 +0.01％ TFA
波长 ： 254nm( 检测器 ： Waters 2488 Mux-UV 检测器 )
梯度 ： 0-8min 2％至 100％ B。
C LC-MS 方法 ： polar.M( 仪器 ： Agilent 1100 Series)
柱： Chromolith Speed Rod RP18e-50-4.6
流速 ： 2.4ml/min
溶剂 A ： 水 +0.05％ HCOOH
溶剂 B ： 乙腈 +0.04％ HCOOH
WL ： 220nm
梯度 ： 0-2.8min ： 4％ B 至 100％ B， 2.8-3.3min ： 100％ B
D HPLC 方法 ： 1_100_2( 仪器 ： LaChrom)
柱： Chromolith Performance RP18e 100-3mm
流速 ： 2ml/min( 泵 ： L-7100)
溶剂 A ： 水 +0.05％ CHOOH
溶剂 B ： 乙腈 +0.04％ CHOOH
波长 ： 220nm( 检测器 ： L-7455)
梯度 ： 0-0.2min ： 99％ A， 0.2-3.8min ： 99％ A-- ＞ 100％ B，
3.8-4.4min ： 100％ B， 4.4-4.5min ： 100％ B-- ＞ 99％ A，
4.5-5.1min ： 99％ A
E HPLC/MS 方法 (polar)( 仪器 ： Agilent 1100 Series)
溶剂 A ： 水 +0.05％甲酸
溶剂 B ： 乙腈 +0.04％甲酸
流速 ： 2.4ml/min， 波长 ： 220nm
梯度 ： 0.0min 4％ B
2.8min 100％ B
3.3min 100％ B
3.4min 4％ B柱： Chromolith Speed ROD RP-18e 50-4.6mm
F SFC 方法 (ChiracelOJ-H 20％ MOH)( 仪器 ： Berger 仪器 )
溶剂 ： 二氧化碳 +20％甲醇
流速 ： 5ml/min， 波长 ： 220nm
梯度 ： Isocratic
柱： ChiracelOJ-H
G HPLC/MS 方法 (DMSO)( 仪器 ： Agilent 1100 Series)
溶剂 A ： 水 +0.05％甲酸
溶剂 B ： 乙腈 +0.04％甲酸
流速 ： 2.4ml/min， 波长 ： 220nm
梯度 ： 0.0min 5％ B
0.5min 5％ B
2.8min 100％ B
3.5min 100％ B
在报告中仅从 0.8 分钟开始显示峰。
柱： Chromolith Speed ROD RP-18e 50-4.6mm
H HPLC/MS 方法 (DMSO)( 仪器 ： Waters Acquity UPLC 具有 PDA 和 ELSD 和 Waters SQD(ESI+/- 和 APCI+/-))
溶剂 A ： 99.9％乙腈 +0.1％ TFA
溶剂 B ： 99.9％水 +0.1％ TFA
流速 ： 2ml/min， 波长 ： 256nm
梯度 ： 0.0min 95％ B
8.0min 0％ B
8.1min 90％ B
8.5min 95％ B
11.0min 95％ B
柱： Waters XBridgeTM C8 3.5μm ； 4.6x 50mm 柱 ；
Part No.186003053
I HPLC/MS 方法 (DMSO)( 仪器 ： Waters 1525 Binary HPLC 泵， Waters In-Line Degasser AF， Waters 2777 Sample Manager， Waters 2488 Mux-UV 检测器， Waters 2420 ELS 检测器， Waters ZQ-MUX)
溶剂 A ： 99.9％乙腈 +0.1％甲酸
溶剂 B ： 99.9％水 +0.1％甲酸
流速 ： 0.8ml/min， 波长 ： 254nm
梯度 ： 0.0min 95％ B
1.7min 0％ B
3.0min 0％ B
3.01min 100％ B
6.25min 95％ B柱： Chromolith Flash RP-18e(25-2mm) 制备型 HPLC 方法 ： 1_10_10_50 ( 仪器 ： Agilent 1100 Series) 柱： Chromolith Prep Rod RP18e 流速 ： 50ml/min 溶剂 A ： 水 +0.1％ TFA 溶剂 B ： 乙腈 +0.1％ TFA WL ： 220nm 梯度 ： 在 10 分钟内从 1 至 10％乙腈， 从 2 至 11 分钟收集。 制备型 HPLC 方法 ： 25_50_10 ( 仪器 ： Agilent 1100 Series) 柱： Chromolith Prep Rod RP18e 流速 ： 50ml/min 溶剂 A ： 水 +0.1％ TFA 溶剂 B ： 乙腈 +0.1％ TFA WL ： 220nm 梯度 ： 在 2 分钟内从 1 至 25％乙腈， 从 2 至 10 分钟至 50％乙腈， 从 2 至 11 分钟收集。 制备型 HPLC 方法 ： 30_60_10
( 仪器 ： Agilent 1100 Series)
柱： Chromolith Prep Rod RP18e
流速 ： 50ml/min
溶剂 A ： 乙腈 +0.1％ TFA
溶剂 B ： 水 +0.1％ TFA
WL ： 220nm
梯度 ： 在 2 分钟内从 1-30％乙腈， 2 至 8 分钟至 60％乙腈， 从 2 至 11 分钟收集
制备型 HPLC 方法 20_40_10
( 仪器 ： Agilent 1100 Series)
柱： Chromolith Prep Rod RP18e
流速 ： 50ml/min
溶剂 A ： 乙腈 +0.1％ TFA
溶剂 B ： 水 +0.1％ TFA
WL ： 220nm
梯度 ： 在 2 分钟内从 1-20％乙腈， 在另外的 8 分钟内从 20-40％乙腈， 从 2 至 11 分 钟收集。
制备型 HPLC 方法 ： 方法 5_70_10
( 仪器 ： Agilent 1100 Series)
柱： Chromolith Prep Rod RP18e
流速 ： 50ml/min
溶剂 A ： 乙腈 +0.1％甲酸 溶剂 B ： 水 +0.1％甲酸 WL ： 220nm 梯度 ： 在 15 分钟内从 5-70％ ACN 制备型 HPLC 方法 ： 1_60_10 ( 仪器 ： Agilent 1100 Series) 柱： Chromolith Prep Rod RP18e 流速 ： 50ml/min 溶剂 A ： 乙腈 +0.1％甲酸 溶剂 B ： 水 +0.1％甲酸 WL ： 220nm 梯度 ： 在 16 分钟内从 1-60％ ACN 制备型 HPLC 方法 ： 25_50_10_50ml_empfind_o_equi.M ( 仪器 ： Agilent 1100 Series) 柱： Chromolith Prep Rod RP18e 流速 50ml/min 溶剂 A ： 乙腈 +0.1％ TFA 溶剂 B ： 水 +0.1％ TFA WL ： 220nm 梯度 ： 在 2 分钟内从 1-25％， 在 8 分钟内 25-50％溶剂 B， 从 2-11 分钟收集 制备型 HPLC 方法 ： 15_35_10_50ml_normal_o_equi.M ( 仪器 ： Agilent 1100 Series) 柱： Chromolith Prep Rod RP18e 流速 ： 50ml/min 溶剂 A ： 乙腈 +0.1％ TFA 溶剂 B ： 水 +0.1％ TFA WL ： 220nm 梯度 ： 在 2 分钟内从 1-15％ ACN， 在 8 分钟内从 15-35％ ACN， 从 2-11 分钟收集 对比方法 1 ： RediSep 柱 ： 40g 二氧化硅 检测波长 ： 254nm 流速 ： 40ml/min 调节 (Conditioning)- 体积 ： 120.0ml 运行时间 30.0min 洗脱剂 A ： A1 环己烷 洗脱剂 B ： B1 乙酸乙酯B％ 洗脱剂 B101CN 102471343 A 0.0 1.3 18.7 4.0 0.0 5.0 1.0
说0.0 0.0 50.0 50.0 50.0 50.0 50.0明书B1 乙酸乙酯 B1 乙酸乙酯 B1 乙酸乙酯 B1 乙酸乙酯 B1 乙酸乙酯 B1 乙酸乙酯 B1 乙酸乙酯46/121 页实施例 1
7-(4- 氯 -2- 氟苯基 )-2-(3， 3- 二甲基丁酰基 )-1， 3， 4， 11a- 四氢 -2H， 10H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -5， 11- 二酮 (″ 10″ ) 的制备
a.4′ - 氯 -2′ - 氟 -4- 硝基联苯 -3- 甲酸 (3) 的制备将 2.5g(10mmol) 原料 1、 1.8g(10mmol) 原料 2 和 2.9g(35mmol) 碳酸氢钠的 10ml 水溶液和 120ml 乙二醇二甲醚加入到 100ml 多颈烧瓶中并将烧瓶用氮气冲洗。然后加入 0.5g(0.4mmol) 四 ( 三苯基膦 ) 钯 (0) 并将反应混合物在 90℃下加热 14 小时。 将溶液酸化至 pH 4 并除去溶剂。向残余物中加入 60ml 水并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机相用水洗 涤， 用硫酸钠干燥并除去溶剂。将留下的固体残余物与乙腈一起搅拌， 抽吸过滤并干燥， 得 + 到白色结晶状产物 (900mg， 3mmol， 31％的收率 )( 质量 ： [M -(OH)] ＝ 278 ； RT2.96min， HPLC 方法 1_100_2_Speed)。
b.4′ - 氯 -2′ - 氟 -4- 硝基联苯 -3- 羰基氯 (4) 的制备
将 原 料 3(900mg， 3mmol) 加 入 到 30ml 二 氯 甲 烷 中。 然 后 在 搅 拌 下 加 入 1.4ml(16mmol) 草酰氯和 1 滴 DMF。将混合物搅拌 14 小时。蒸出溶剂， 结晶残余物 (900mg， 2.9mmol， 94％ ) 不经进一步纯化即可进一步反应。
c.4-(4 ′ - 氯 -2 ′ - 氟 -4- 硝基联苯 -3- 羰基 ) 哌嗪 -1， 3- 二甲酸 1- 叔丁酯 3- 甲酯 (6) 的制备
将原料 5(708mg， 2.9mmol) 的 20ml 二氯甲烷溶液加入到配有滴液漏斗、 温度计和 N2 入口管的 50ml 多颈烧瓶中并加入 1.7ml DIPEA。 将溶液冷却至 0℃并在 15 分钟内在搅拌 下加入 900mg(3mmol) 原料 4 的 10ml 二氯甲烷溶液。然后除去冰浴并将混合物继续搅拌 1 小时。将水加入到反应混合物中， 分出有机相， 用硫酸钠干燥并除去溶剂。将残余物用乙酸 乙酯通过硅胶柱吸附过滤并将滤液蒸发至干。得到固体状所需产物 6， 收率为 80％ (1.5g， + t 2.3mmol)( 质量 ： [M -( Bu)] ＝ 266 ； RT 3.44min， HPLC 方法 1_100_2_Speed)。
d.4-(4- 氨基 -4 ′ - 氯 -2 ′ - 氟联苯 -3- 羰基 ) 哌嗪 -1， 3- 二甲酸 1- 叔丁酯 3- 甲酯 (7) 的制备
将原料 6(1.5g， 2.3mmol) 在 200ml 甲醇中用 1g 5％ Pd/C(50.5％水 ) 氢化。滤出 催化剂并除去溶剂。产物 7(1.3g， 2.3mmol， 92％ ) 不经进一步纯化即可进一步反应。
e.7-(4- 氯 -2- 氟苯基 )-1， 3， 4， 11a- 四氢 -2H， 10H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -5， 11- 二酮 (8) 的制备
将原料 7(1.3g， 3mmol) 在 110℃下在 40ml 冰乙酸中搅拌 3 小时。随后在室温下加 入 50ml 4N HCl 的二 烷溶液并将反应混合物继续搅拌 3 小时。将混合物蒸发至干， 将残 余物溶于水， 将 pH 用 1N NaOH 调节至 9 并将混合物用二氯甲烷萃取。将合并的有机相用水 洗涤， 用硫酸钠干燥， 过滤并将滤液蒸发至干。 将残余物溶于 20ml 甲醇。 通过加入 150ml 二 乙醚得到无色结晶状所需产物 8(530mg， 1.5mmol， 77％ )。( 质量 [M+] ＝ 360 ； RT 2.48min， HPLC 方法 1_100_2_Speed)。
f.7-(4- 氯 -2- 氟苯基 )-2-(3， 3- 二甲基丁酰基 )-1， 3， 4， 11a- 四氢 -2H， 10H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -5， 11- 二酮 (10) 的制备 将原料 8(100mg， 0.3mmol) 和 3， 3- 二甲基丁酸 9(32.3mg， 0.3mmol) 溶于 1ml DMF。 加入 63.3mg(0.33mmol)DAPECI 和 50.5mg(0.33mmol)HOBT 水合物并将混合物在室温下搅拌 3 小时。除去溶剂并将残余物通过 HPLC 装置纯化 ( 方法 30-60-10 ； 50ml/min)， 由此得到无 定形固体状所需产物 10(28mg， 21％的收率， 94％的含量 )( 质量 ： [M+] ＝ 458 ； RT 3.35min， HPLC 方法 1_100_2_Speed) ； 1
H NMR(500MHz， DMSO-d6)δ[ppm]10.64(m， 1H)， 7.93(s， 1H)， 7.76-7.71(m， 1H)， 7.68-7.54(m， 2H)， 7.41(d， J ＝ 8.4， 1H)， 7.24(d， J ＝ 8.5， 1H)， 4.31(m， 1H)， 4.23-3.86(m， 2H)， 3.84-3.71 和 3.65(2x m， 2H)， 3.60-3.41(m， 2H)， 2.40-2.14(m， 2H)， 1.01(m， 9H)。
类似地得到以下化合物
实施例 2
7-(3- 氯苯基 )-2-(3， 3- 二甲基丁酰基 )-1， 3， 4， 11a- 四氢 -2H， 10H-2， 4a， 10- 三 氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -5， 11- 二酮 (″ 17″ ) 的制备
a.5- 溴 -2- 硝基苯甲酰氯 (11) 的制备
所 需 产 物 11 按 照 类 似 于 实 施 例 1.b. 的 方 法 从 3g 原 料 1(12.2mmol)、 5.5ml(65mmol) 草酰氯和 1ml DMF 的 30ml 二氯甲烷溶液以定量收率制备， 并且以无定形残 余物 (3.2g， 12.1mmol， 80％含量 ) 的形式不经进一步纯化直接用于下一步反应。
b.4-(5- 溴 -2- 硝基苯甲酰基 ) 哌嗪 -1， 3- 二甲酸 1- 叔丁酯 3- 甲酯 (12) 的制备
类似于实施例 1.c.， 用原料 5(2g， 8.2mmol)、 原料 11(3.2g， 12.1mmol) 和 7.2ml DIPEA(42.5mmol) 在 30ml 二氯甲烷中进行制备， 通过 Com-panion， 方法 1 纯化后得到所 需 产 物 12， 收 率 55 ％ (3.2g， 6.7mmol)， 为无色结晶固体 ( 质量 ： [M+-(tBu)] ＝ 416 ； RT 3.43min， HPLC 方法 1_100_2)。
c.4-(2- 氨基 -5- 溴苯甲酰基 ) 哌嗪 -1， 3- 二甲酸 1- 叔丁酯 3- 甲酯 (13) 的制备
将原料 12(3.1g， 6.6mmol) 在 30ml THF 中利用 442ml 氢气在 1.5g 多孔镍 (pH- 中 性， THF- 润湿 ) 上氢化， 过滤并真空浓缩后得到无定形固体状所需产物 13(2.6g， 5.9mmol， + t 90％ )( 质量 ： [M -( Bu)] ＝ 386 ； RT 3.29min， HPLC 方法 1_100_2)。将其不经进一步纯化 的用于进一步反应。
d.7- 溴 -1， 3， 4， 11a- 四氢 -2H， 10H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -5， 11- 二酮 (14) 的制备
类似于实施例 1.e.， 用原料 13(2.2g， 4.9mmol)、 50ml 冰乙酸和 50ml 4NHCl 的甲 醇溶液进行制备， 在制备型 HPLC( 方法 1_10_10_50) 上纯化后得到无定形固体状所需产物 14(200mg， 0.65mmol， 13％ )( 质量 [M+] ＝ 312 ； RT1.73min， HPLC 方法 1_100_2)。
e.7- 溴 -2-(3， 3- 二甲基丁酰基 )-1， 3， 4， 11a- 四氢 -2H， 10H-2， 4a， 10- 三氮杂二
苯并 [a， d] 环庚烯 -5， 11- 二酮 (15) 的制备
类 似 于 实 施 例 1.f.， 用 原 料 14(200mg， 0.6mmol)、 3， 3- 二 甲 基 丁 酸 9(0.1ml， 0.6mmol)、 106mg HOBT 水合物 (0.8mmol)、 148mg(0.8mmol)DAPECI 在 2ml DMF 中制得粉色无 定形固体状所需产物 15(230mg， 66％的收率， 75％含量 )， 其不经进一步纯化即可用于进一 步反应 ( 质量 ： [M+] ＝ 409 ； RT 2.87min， HPLC 方法 1_100_2)。
f.7-(3- 氯 苯 基 )-2-(3， 3- 二 甲 基 丁 酰 基 )-1， 3， 4， 11a- 四 氢 -2H， 10H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -5， 11- 二酮 (17) 的制备
类 似 于 实 施 例 1.a.， 用 230mg(0.6mmol) 原 料 15、 100mg(0.6mmol) 原 料 16、 166mg(2mmol) 碳酸氢钠的 10ml 水溶液和 10ml 乙二醇二甲醚及 0.5g(0.4mmol) 四 ( 三苯 基膦 ) 钯 (0) 进行制备， 在通过制备型 HPLC( 方法 25_50_10) 纯化后得到无色结晶固体 状所需产物 17(12.5mg， 0.3mmol， 5 ％的收率 ； 质量 ： [M+)] ＝ 440 ； RT 3.25min， HPLC 方法 1_100_2)。
实施例 3
1-[7-(2- 氟苯基 )-3， 4， 5， 10， 11， 11a- 六氢 -1H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环 庚烯 -2- 基 ]-3， 3- 二甲基丁烷 -1- 酮 (″ 25″ ) 和 2-(3， 3- 二甲基丁酰基 )-7-(2- 氟苯 基 )-1， 3， 4， 5， 10， 11a- 六氢 -2H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -11- 酮 (″ 26″ ) 的制备
a.7-(2- 氟苯基 )-1， 3， 4， 5， 10， 11a- 六氢 -2H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环 庚烯 -11- 酮 (23) 和 7-(2- 氟苯基 )-1， 2， 3， 4， 5， 10， 11， 11a- 八氢 -2， 4a， 10- 三氮杂二苯 并 [a， d] 环庚烯 (24) 的制备
将 450mg(1.2mmol)7-(2- 氟 苯 基 )-5， 11- 二 氧 代 -1， 2， 3， 4， 5， 10， 11， 11a- 八
氢 -4a， 10- 二氮杂 -2- 氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯盐酸盐 ( 化合物 21， 其可类似于实施例1 或 2 的方法制备 ) 溶于 30ml THF。在氮气氛下于 0℃下在搅拌下分批加入 190mg(5mmol) 氢化铝锂 (LAH， 化合物 9)。30 分钟后， 将混合物升温至 70℃。2 小时后， 将混合物重新冷却 至室温， 分批加入冰水， 将油脂性残余物通过硅藻土抽吸过滤并用乙酸乙酯洗涤。 将合并的 有机相用硫酸钠干燥， 过滤并蒸发至干得到 174mg 所需化合物 23 和 24 的混合物， 其不经进 一步纯化直接用于下一步反应 ( 质量 ： [M+] ＝ 298 和 312 ； RT 1.37min， HPLC-MS 方法 E)。
b.1-[7-(2- 氟苯基 )-3， 4， 5， 10， 11， 11a- 六氢 -1H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -2- 基 ]-3， 3- 二甲基丁烷 -1- 酮 (25) 和 2-(3， 3- 二甲基丁酰基 )-7-(2- 氟苯 基 )-1， 3， 4， 5， 10， 11a- 六氢 -2H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -11- 酮 (26) 的合 成
将 170mg( 约 0.6mmol) 化合物 23 和 24 的混合物和 67mg(0.6mmol) 二甲基丁酸 ( 化合物 9) 溶于 2ml DMF 并随后加入 134mg(0.7mmol)DAPECI 和 92mg(0.6mmol)HOBT。将 混合物在室温下搅拌 3 小时。将反应混合物蒸发， 将残余物通过制备型 HPLC 纯化 ( 方法 ： 204010)。
将相关级分合并然后真空蒸发得到所需产物 ：
77mg(0.181mmol， 31％的收率 ) 化合物 25( 质量 ： [M+] ＝ 396 ； RT 2.70min， HPLC 方法 1_100_2_Speed)。
9.5mg(0.022mmol， 4％的收率 ) 化合物 26( 质量 ： [M+] ＝ 410 ； RT 2.95min， HPLC 方法 1_100_2_Speed) ； 1
H NMR(500MHz， DMSO-d6)δ[ppm]10.47(m， 1H)， 7.66-7.50(m， 3H)， 7.43(m， 1H)， 7.36-7.27(m， 2H)， 7.19(d， J ＝ 8.5， 1H)， 4.40-1.93(m， 11H)， 0.95(d， J ＝ 6.6， 9H)[ 旋光异 构体混合物 ]。
实施例 4
7-(4- 氯 -2- 氟苯基 )-2-(3， 3- 二甲基丁基 )-1， 3， 4， 11a- 四氢 -2H， 10H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -5， 11- 二酮 (28) 的制备
将 100mg(0.3mmol) 化 合 物 8( 按 照 类 似 于 实 施 例 1， a.-e. 的 方 法 制 备 ) 和 28mg(0.3mmol)3， 3- 二 甲 基 丁 醛 (27) 加 入 到 2ml 二 氯 乙 烷 和 1ml THF 中 并 加 入 17mg(0.3mmol) 乙酸。然后将溶液在室温下搅拌 2 小时。然后加入 107mg(0.5mmol) 三乙 酰氧基硼氢化钠并将混合物继续搅拌 14 小时。加入饱和碳酸氢钠溶液， 然后用乙酸乙酯 萃取两次， 用硫酸钠干燥并过滤。将滤液蒸发至干并用乙酸乙酯通过硅胶过滤得到所需产
物 28， 收率为 35％ (46mg， 0.1mmol)， ( 质量 ： [M+] ＝ 444 ； RT 2.95min， HPLC 方法 1_100_2_ Speed)。
实施例 5
7-(4- 氯苯基 )-2-(3， 3- 二甲基丁酰基 )-10- 甲基 -1， 3， 4， 11a- 四氢 -2H， 10H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -5， 11- 二酮 (″ 31″ ) 的制备
将 100mg 化合物 29(0.2mmol， 按照类似于实施例 1， a.-f. 的方法制备 ) 溶于 10ml THF 并在氮气下搅拌几分钟。 然后将混合物冷却至 0℃并加入 6.5mg(0.3mmol) 氢化钠 (60％ 的石蜡油悬浮液 )。继续搅拌并将混合物升温至室温。30 分钟后形成澄清溶液。将其重新 冷却至 0℃并加入 28mg 甲基碘。将混合物再次升温至室温并继续搅拌 14 小时。
真空除去溶剂并将残余物用乙酸乙酯稀释。将混合物用水和饱和氯化钠溶液洗 涤。将混合物用硫酸钠干燥， 过滤并除去溶剂。将剩下的黄色固体残余物 (130mg) 通过制 备型 HPLC 纯化 ( 方法 25_50_10) 得到白色固体状所需产物 31(30mg， 0.06mmol， 28％的收 率； 质量 ： [M+] ＝ 454 ； RT 3.42min， HPLC 方法 1_100_2) ； 1
H NMR(500MHz ，DMSO-d 6 ) δ [ppm]7.99-7.92(m ， 2H) ， 7.79-7.73(m ， 2H) ， 7.57-7.51(m， 3H)， 4.32(m， 1H)， 4.23-4.08 和 3.98-3.89(2x m， 2H)， 3.78-3.66(m， 2H)， 3.61(m， 1H)， 3.45-3.33(m， 1H)， 3.37(s， 3H)， 2.49-2.16(m， 2H)， 1.04(m， 9H)。
实施例 6
7-(4- 氯苯基 )-10- 乙基 -2-((S)-2- 羟基 -3， 3- 二甲基丁酰基 )-1， 3， 4， 11a- 四 氢 -2H， 10H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -5， 11- 二酮 (37) 的制备
a.4-(4′ - 氯 -4- 乙基氨基联苯 -3- 羰基 ) 哌嗪 -1， 3- 二甲酸 1- 叔丁酯 3- 甲酯 (34) 的制备
将 200mg(0.4mmol) 化合物 32( 按照类似于实施例 1 a.-d. 的方法制备 ) 溶于 10ml 二氯乙烷并在氮气氛下搅拌。然后加入 18mg 乙醛 (33) 和 1 滴乙酸。5 分钟后将 148mg(0.7mmol) 三乙酰氧基硼氢化钠加入到黄色反应混合物中并将反应液在室温下进一 步搅拌过夜。
将反应混合物用水和饱和氯化钠溶液洗涤， 用硫酸钠干燥并过滤。将滤液真空 蒸发并将残余物通过制备型 HPLC 纯化 ( 方法 40_70_10)， 由此得到棕色固体状所需产 物 34(70mg， 0.13mmol， 31 ％ 的 收 率 ； 质量 ： [M+， 无 BOC] ＝ 402 ； RT 4.09min， HPLC 方 法 1_100_2)。
b.7-(4- 氯苯基 )-10- 乙基 -1， 3， 4， 11a- 四氢 -2H， 10H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -5， 11- 二酮 (35) 的制备
将 60mg 化合物 34(0.1mmol) 和 35ml 乙酸在装配有回流冷凝器的烧瓶中在 110℃ 下搅拌 3 小时， 然后冷却。然后在室温下加入 25ml HCl 的甲醇溶液并将反应液继续搅拌 1.25 小时。
加入水并将 pH 用 2N NaOH 调节至 9。将混合物用二氯甲烷萃取。将合并的有机 相用水和饱和氯化钠溶液洗涤， 用硫酸钠干燥， 过滤并蒸发。将形成的黄色固体 35(40mg， 0.094mmol， 79 ％的收率 ) 不经进一步纯化即用于进一步反应。( 质量 ： [M+] ＝ 470 ； RT 2.57min， HPLC 方法 1_100_2)。
c.7-(4- 氯苯基 )-10- 乙基 -2-((S)-2- 羟基 -3， 3- 二甲基丁酰基 )-1， 3， 4， 11a- 四 氢 -2H， 10H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -5， 11- 二酮 (37) 的制备
将 化 合 物 35(40mg， 0.09mmol)、 36(15mg， 0.09mmol) 和 4- 甲 基 吗 啉 (10mg， 0.1mmol) 在烧瓶内溶于 2ml DMF。然后加入 25mg(0.1mmol)EDCI 和 20mg(0.1mmol)HOBT 并将反应混合物在室温下搅拌 14 小时。将黄色反应混合物用乙酸乙酯稀释并加入水。分 出有机相， 用水和饱和氯化钠溶液洗涤， 用硫酸钠干燥， 过滤并蒸发。将形成的黄色残余物 (26mg) 通过制备型 HPLC 纯化 ( 方法 25_50_10) 得到所需产物 37(9mg， 0.02mmol， 17％的收 率； 质量 ： [M+] ＝ 484 ； RT 3.33-3.36min， HPLC 方法 1_100_2)。
类似地得到下列化合物 ：
7-(4- 氯苯基 )-10- 乙基 -2-((S)-2- 羟基 -3， 3- 二甲基丁酰基 )-1， 3， 4， 11a- 四 氢 -2H， 10H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -5， 11- 二酮 (″ A57″ )
HPLC 方法 D ； RT 3.33min ； 1 H NMR(500MHz ， DMSO-d 6) δ [ppm]10.53(s ， 1H) ， 7.95(s ， 1H) ， 7.85(dd ， J ＝8.4 ， 2.3 ， 1H) ， 7.72(s ， 2H) ， 7.53(d ， J ＝ 8.5 ， 2H) ， 7.26(m ， 1H) ， 4.57-2.73(m ， 13H) ， 1.58-1.32(m， 9H)。
实施例 7
对映体 (S)- 和 (R)-7-(4- 氯苯基 )-1， 3， 4， 11a- 四氢 -2H， 10H-2， 4a， 10- 三氮杂 二苯并 [a， d] 环庚烯 -5， 11- 二酮 (″ 19″和″ 20″ ) 的制备
将约 145mg 物质 18 在超声浴中溶于 25ml 甲醇 /2ml 二乙胺 /10ml 乙腈并在制备 型 SFC 上通过 3x25cm 5μm Chiralpak AS-H 柱用 80ml CO2/20mlMeOH+5％二乙胺分离。
将相同的级分合并并蒸发得到 (S)- 对映体 (19， 65mg， 0.19mmol， 45％ ) 和 (R)- 对 映体 (20， 86mg， 0.25mmol)， 其各自为对映体纯的形式。它们可类似于化合物 8 而进一步反 应。
实施例 8
(R)-7-(4- 氯 -2- 氟苯基 )-1， 3， 4， 11a- 四氢 -2H， 10H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -5， 11- 二酮 ((R)-8) 和 7-(4- 氯 -2- 氟苯基 )-1， 3， 4， 11a- 四氢 -2H， 10H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -5， 11- 二酮 ((S)-8) 的制备
a.(R)-7-(4- 氯 -2- 氟苯基 )-1， 3， 4， 11a- 四氢 -2H， 10H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -5， 11- 二酮 ((R)-8) 的合成
类似于实施例 1， a.-e.， 仅是将化合物 5 用对映体纯的 (R)-5 代替， 得到对映体纯 形式的所需化合物 (R)-8( 质量 ： [M+] ＝ 360 ； RT 2.45min， HPLC 方法 1_100_2 ＝方法 D)。
b.(S)-7-(4- 氯 -2- 氟苯基 )-1， 3， 4， 11a- 四氢 -2H， 10H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -5， 11- 二酮 ((S)-8) 的合成
类似于实施例 1， a.-e.， 仅是将化合物 5 用对映体纯的 (S)-5 代替， 得到对映体纯 形式的所需化合物化合物 (S)-8( 质量 ： [M+] ＝ 397 ； RT 2.44min， HPLC 方法 1_100_2 ＝方 法 D)。
实施例 9
7-(4- 氯苯基 )-5， 11- 二氧代 -3， 4， 5， 10， 11， 11a- 六氢 -1H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯 并 [a， d] 环庚烯 -2- 甲酸苄酯 (40) 的制备
将 0.1ml(0.5mmol) 苄醇 39 和 79mg(0.5mmol) 羰基二咪唑溶于 2ml 无水 DMF 并在 室温下搅拌 2 小时。然后加入 166mg(0.5mmol) 化合物 38 的 2ml 无水 DMF 溶液并将形成的 溶液在室温下搅拌 4 天。将黄色反应溶液用乙酸乙酯稀释并用水洗涤两次， 用饱和 NaCl 溶 液洗涤一次。将有机相随后用 Na2SO4 干燥， 过滤并真空蒸发， 得到黄色粉末。将其通过制 备型 HPLC 纯化 ( 方法 HPLC 25_50_10)， 由此得到黄色固体状所需产物 40(19mg， 0.04mmol， 8％的收率 ； 质量 ： [M+] ＝ 476 ； RT 3.46min， HPLC 方法 1_100_2 ＝方法 D)。
实施例 10
(R)-7-(4- 氯 -2- 氟苯基 )-2-( 咪唑 -1- 羰基 )-1， 3， 4， 11a- 四氢 -2H， 10H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -5， 11- 二酮 (41) 的制备
将 199mg(0.5mmol) 化合物 (R)-8 溶于 10ml 二氯甲烷并加入 81mg(0.5mmol) 羰基 二咪唑和 69μl(0.5mmol) 三乙胺。将混合物在室温下搅拌过夜。然后将溶液蒸发至干并 将残余物通过制备型 HPLC 纯化 ( 方法 25_50_10)， 由此得到黄色固体状所需产物 41(61mg， 收率 27％， 质量 ： [M+] ＝ 454 ； RT 2.86min， HPLC 方法 1_100_2 ＝方法 D)。
实施例 11
4 ′ - 氯 -4-({(R)-4-[(S)-3， 3- 二 甲 基 -2-( 哌 啶 -4- 基 氨 基 ) 丁 酰 基 ] 哌 嗪 -2- 羰基 } 氨基 )-2′ - 氟联苯 -3- 甲酸 (47) 和 (R)-7-(4- 氯 -2- 氟苯基 )-2-[(S)-3， 3- 二甲基 -2-( 哌啶 -4- 基氨基 ) 丁酰基 ]-1， 3， 4， 11a- 四氢 -2H， 10H-2， 4a， 10- 三氮杂二 苯并 [a， d] 环庚烯 -5， 11- 二酮 (48) 的制备
a.{(S)-1-[(R)-7-(4- 氯 -2- 氟 苯 基 )-5， 11- 二 氧 代 -3， 4， 5， 10， 11， 11a- 六 氢 -1H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -2- 羰基 ]-2， 2- 二甲基丙基 } 氨基甲酸叔丁 酯 (43) 的合成
将原料 (R)-8(198mg， 0.5mmol) 加入到 10ml 二氯甲烷中， 随后将 DIPEA(0.1ml， 0.5mmol)、 96mg(0.5mmol)DAPECI 和 76mg(0.5mmol)HOBT 水 合 物 以 及 原 料 42(116mg，
0.5mmol) 加入到所形成的溶液中并将反应混合物在室温下搅拌。8 小时后， 将有机反应混 合物用水洗涤两次， 用硫酸钠干燥， 过滤并将滤液蒸发至干 (R1)， 由此得到固体状所需产物 43(260mg， 0.45mmol， 91％的收率， 质量 ： [M+， 无 Boc] ＝ 473 ； HPLC 方法 D， RT ＝ 3.55min)， 其不经进一步纯化即可用于进一步反应。
b.(S)-1-[(R)-7-(4- 氯 -2- 氟 苯 基 )-5， 11- 二 氧 代 -3， 4， 5， 10， 11， 11a- 六 氢 -1H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -2- 羰基 ]-2， 2- 二甲基丙基铵 (44) 的合成
将 260mg(0.5mmol) 化合物 43 溶于 10ml 4N HCl 的二烷溶液并在室温下搅拌 2小时。随后将反应混合物蒸发至干， 将固体残余物用乙腈研制。将形成的结晶抽吸滤出并 用少量乙腈冲洗， 由此分离得到所需产物 44(105mg， 0.2mmol， 45％的收率， HPLC 方法 D， RT ＝ 2.57min)， 其不经进一步纯化即可用于下一步反应。
c.4-{(S)-1-[(R)-7-(4- 氯 -2- 氟 苯 基 )-5， 11- 二 氧 代 -3， 4， 5， 10， 11， 11a- 六 氢 -1H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -2- 羰基 ]-2， 2- 二甲基丙基氨基 } 哌啶 -1- 甲 酸叔丁酯 (46) 的合成
将 化 合 物 44(105mg， 0.2mmol) 和 1-Boc-4- 哌 啶 酮 45(50mg， 0.3mmol) 溶 于 10ml 1， 2- 二氯乙烷和 2ml 二 烷的混合物并在室温下搅拌 2 小时。然后分两批加入 108mg(0.5mmol) 三乙酰氧基硼氢化钠并将混合物在室温下搅拌 4 小时。将反应溶液蒸发 至干并将残余物通过制备型 HPLC 装置纯化 ( 方法 5_70_10)。将相应的级分合并并蒸发得 到无色固体状所需产物 46(73mg， 0.11mmol， 44％的收率， 质量 ： [M+] ＝ 656 ； HPLC 方法 D， RT ＝ 2.83min)。
d.4 ′ - 氯 -4-({(R)-4-[(S)-3， 3- 二 甲 基 -2-( 哌 啶 -4- 基 氨 基 ) 丁 酰 基 ] 哌 嗪 -2- 羰基 }- 氨基 )-2′ - 氟联苯 -3- 甲酸 (47) 和 (R)-7-(4- 氯 -2- 氟苯基 )-2-[(S)-3， 3- 二甲基 -2-( 哌啶 -4- 基氨基 ) 丁酰基 ]-1， 3， 4， 11a- 四氢 -2H， 10H-2， 4a， 10- 三氮杂二 苯并 [a， d] 环庚烯 -5， 11- 二酮 (48) 的合成
将 73mg(0.1mmol) 化合物 46 溶于 30ml 2N HCl 并在室温下搅拌 2 小时。随后将 反应混合物蒸发至干并将固体残余物用乙腈研制。 将形成的结晶抽吸滤出并用少量乙腈冲 洗。 将结晶再次通过制备型 HPLC 装置纯化 ( 方法 1_60_10)， 由此分离得到产物 47(10.5mg， 0.018mmol， 16 ％ 的 收 率， 质量 ： [M+] ＝ 574 ； HPLC 方 法 D， RT ＝ 2.55min) 和 48(24.8mg， 0.045mmol， 40％的收率， 质量 ： [M+] ＝ 556 ； HPLC 方法 D， RT ＝ 2.40min)。
实施例 12
(R)-7-(4- 氯 -2- 氟苯基 )-2- 苯基甲磺酰基 -1， 3， 4， 11a- 四氢 -2H， 10H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -5， 11- 二酮 (50) 的制备
将 100mg(0.3mmol)(R)-8 溶 于 5ml 二 氯 甲 烷。 随 后 加 入 81mg(0.4mmol) 苯 甲 磺酰氯和 80μl 三乙胺 (0.6mmol)。将混合物在室温下搅拌 2.5 小时。然后将反应溶 液用稀 HCl 和水洗涤， 用硫酸钠干燥并蒸发至干。将残余物通过制备型 HPLC 纯化 ( 方 法 25_50_10_50ml_empfind_o_equi.M)， 由此得到 8mg(0.016mmol， 6 ％的收率 ) 所需产物 50( 质量 ： [M+] ＝ 513 ； HPLC 方法 D， RT ＝ 3.46min) ； 1
H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ[ppm]10.71(s， 1H)， 7.98-7.88(m， 1H)， 7.78-7.71(m， 1H)， 7.62(t， J ＝ 8.6， 1H)， 7.57(dd， J ＝ 10.8， 2.1， 1H)， 7.42(dd， J ＝ 7.4， 1.8， 3H)， 7.36-7.30(m， 3H)， 7.25(d， J ＝ 8.5， 1H)， 4.53(q， J ＝ 13.7， 2H)， 4.32-4.19(m， 2H)， 3.96(dd， J ＝ 13.7， 5.0， 1H)， 3.51-3.22(m， 2H)， 3.22-3.11(m， 2H)。
实施例 13
7-(4- 氯 苯 基 )-2-((S)-2- 羟 基 -3， 3- 二 甲 基 丁 酰 基 )-1， 3， 4， 5， 10， 11a- 六 氢 -2H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -11- 酮 (57) 的制备
a.4-(5- 氯 -2- 硝基苄基 ) 哌嗪 -1， 3- 二甲酸 1- 叔丁酯 3- 甲酯 (52) 的制备
将 1.5g(8.2mmol) 醛 51 和 2.0g(8.2mmol) 胺 5 加 入 到 50ml 二 氯 乙 烷 和 50ml THF 的混合物中。然后加入 0.940ml 冰乙酸并将混合物在室温下搅拌约 3 小时。随后加入 5.5g(24.6mmol)NaB(OAc)3 和另外的 0.940ml 乙酸并将混合物在室温下搅拌过夜。 将混合物 与饱和 NaHCO3 溶液一起搅拌， 用二氯甲烷稀释并通过振荡萃取。将有机相再次通过振荡用 水洗涤， 将水相再次通过振荡用 DCM 萃取。将合并的有机相用 Na2SO4 干燥， 抽滤并真空蒸发
至干。 将 3.5g 所得到的粗产物溶于 THF， 吸附到 Isolute 上并在硅胶 60(Flashmaster) 上分 离。将有关的级分合并并在旋转蒸发器内蒸发至干， 由此得到黄色油状所需产物 52(1.6g， 21％的收率 )， 纯度为 45％ ( 质量 ： [M+] ＝ 414 ； HPLC 方法 D， RT ＝ 3.86min)， 其不经进一 步纯化即可用于进一步反应。
b.4-(4 ′ - 氯 -4- 硝基联苯 -3- 基甲基 ) 哌嗪 -1， 3- 二甲酸 1- 叔丁酯 3- 甲酯 (54) 的制备
将原料 52(1.6g， 3.9mmol)、 53(605mg， 3.9mmol)、 10ml 乙二醇二甲醚和 5ml 水加入 到微波小瓶 (10-20ml) 中 ( 澄清溶液 )， 然后在搅拌下分批加入 1.1g(13.5mmol) 碳酸氢钠 ( 悬浮液 )。 在搅拌下将氮气通过套管引入到悬浮液中。 在氮气逆流中加入 447mg(0.3mmol) 四三苯基膦钯并将 MW 容器密封。将反应混合物通过微波加热 (140℃， 30 分钟 )。将混合物 过滤并用 EA 洗涤。将滤液用 EA 和水稀释并通过振荡洗涤。将有机相再次用水洗涤。将有 机相用饱和 NaCl 溶液洗涤， 用 Na2SO4 干燥， 抽滤并真空蒸发至干。 将有机残余物 (2.3g， 根据 HPLC 为 19％， 黑色粘稠物质 ) 溶于 DCM， 吸附到 Isolute 吸附剂上并在硅胶 60(Companion) 上纯化。将相关的级分合并并真空蒸发至干， 由此得到黄色粘稠状所需产物 54， 纯度约 50％ (1.3g， 质量 ： [M+] ＝ 490 ； HPLC 方法 D， RT ＝ 4.27min)， 其不经进一步纯化即可用于进 一步反应。
c.4-(4- 氨基 -4 ′ - 氯联苯 -3- 基甲基 ) 哌嗪 -1， 3- 二甲酸 1- 叔丁酯 3- 甲酯 (55) 的制备
将 1.2g(1.2mmol) 原料 54 用氢气在多孔镍催化剂 (1g) 上在 20ml THF 中于室温 下氢化 22 小时。在该过程中摄取了 82ml 氢气。将反应溶液真空蒸发得到棕色粘稠状所需 产物 55(1.1g， 62％纯度， 质量 ： [M+] ＝ 460 ； HPLC 方法 D， RT ＝ 4.03min)。
d.7-(4- 氯苯基 )-1， 3， 4， 5， 10， 11a- 六氢 -2H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环 庚烯 -11- 酮 (56) 的制备
将原料 55(1.1g， 1.5mmol) 和 15ml 乙酸加入到 50ml 圆底烧瓶中并在 110℃下搅 拌 2 小时 ( 黄色溶液 )。然后加入 10ml HCl/ 异丙醇 (5-6N) 以裂解 BOC 基团。将混合物继 续搅拌 1 小时， 然后将黄色溶液蒸发至干。将该残余物与水和 EA 一起搅拌。然后加入饱和 NaHCO3 溶液至 pH 8。然后分相。将水相通过振荡用正丁醇萃取两次。将合并的有机相用 Na2SO4 干燥， 抽滤并真空蒸发至干， 得到棕色固体状所需产物 56(790mg， 25％的收率， 质量 ： [M+] ＝ 328 ； HPLC 方法 D， RT ＝ 2.45min)。
e.7-(4- 氯 苯 基 )-2-((S)-2- 羟 基 -3， 3- 二 甲 基 丁 酰 基 )-1， 3， 4， 5， 10， 11a- 六 氢 -2H-2， 4a， 10- 三氮杂二苯并 [a， d] 环庚烯 -11- 酮 (57) 的制备
将 250mg(0.8mmol) 原 料 56、 101mg(0.8mmol) 原 料 5、 219mg(1.1mmol)DIPEA、 152mg(1.0mmol)HOBt 水合物和 5ml DMF 与磁力搅拌棒一起依次加入到反应容器 (2-5ml) 中， 然后将其通过隔膜密封并通过微波加热 (120℃， 30 分钟 )。 将混合物用乙酸乙酯和水稀 释并通过振荡洗涤。将有机相再次用水和饱和 NaCl 溶液洗涤。将有机相用 Na2SO4 干燥， 抽 滤并真空蒸发至干。 将得到的残余物溶于 DMSO 并在制备型 HPLC 上在 RP 硅胶上纯化 ( 方法 15_35_10_50ml_normal_o_equi.M)。 将有关级分合并并真空蒸发至干。 蒸发后 (110mg)， 将 污染的级分再次在 RP 硅胶上纯化 ( 制备型 HPLC， 方法 15_35_10_50ml_normal_o_equi.M)。 将有关的级分合并， 将乙腈真空蒸出并将含水残余物冷冻干燥。分离得到无色固体状所需产物 57(39.5mg， 0.09mmol， 12％的收率， 质量 ： [M+] ＝ 442 ； HPLC 方法 D， RT ＝ 3.16min)。
实施例 14
类似于实施例 1 得到下列化合物
实施例 15 以下化合物类似于实施例 2 得到。
实施例 16 以下化合物类似于实施例 5 得到。
实施例 17 以下化合物类似于实施例 9 得到。
实施例 18 以下化合物类似于实施例 12 得到。
实施例 19 类似于实施例 13 得到下列化合物 ：
药理学数据 自分泌运动因子的抑制 ( 酶试验 )表1
IC50 ： ＜ 100nM ＝ A 100nM-1μM ＝ B ＞ 1μM ＝ C
实施例 A ： 自分泌运动因子试验 ( 酶试验 )
实验描述
自分泌运动因子活性通过 Amplex Red 试剂间接测定。其中， 作为生成的 H2O2 的 荧光指示剂， 对 Amplex Red 进行测定。详细地讲， 自分泌运动因子将底物溶血磷脂酰胆碱 (LPC) 转化为磷酸胆碱和溶血磷脂酸 (LPA)。转化完成后， 磷酸胆碱与碱性磷酸酶反应生成 无机磷酸盐和胆碱。在下一步骤中， 胆碱被胆碱氧化酶氧化生成甜菜碱， 同时产生 H2O2。在 过氧化物酶 ( 辣根过氧化物酶 ) 的存在下， H2O2 与 Amplex Red 试剂以 1 ∶ 1 的化学计量反 应， 产生高荧光性试卤灵 (resorufin)。 以反应 - 依赖性动力学模式测定荧光以排除与反应 无关的其它可能的荧光物质的荧光信号。
实验过程
将 3μl 标准溶液或以多个浓度溶于最多含有 11％ DMSO 的 20mM Hepes pH 7.2 中 的待测物质 ( 具有名称 A(n) 的物质 ) 与 20μl(19ng) 高度纯化的重组自分泌运动因子在
测试缓冲液中的溶液一起在黑色 384 孔微量板中于 22℃预先温育 30 分钟。然后， 通过加 入 10μl L-α- 溶血磷脂酰胆碱 (LPC) 启动反应， 其中 LPC 的终浓度为 75μM。将混合物于 37℃温育 90 分钟。温育结束后， 加入 Amplex Red 试剂、 过氧化物酶 ( 辣根过氧化物酶 ) 和 胆碱氧化酶， 并立即在 “Tecan Ultra multimode” 荧光读板仪中于 612nm 波长测定荧光， 激 发波长为 485nm。自分泌运动因子的活性通过测定产生的 H2O2 间接计算。
材料
微量板 ： PS-Microplate， 384- 孔， 小容量， 黑色 Corning， Cat#3677
蛋白质 ： 重组自分泌运动因子 ( 杆状病毒 Hi5 表达 )
底物 ： L-α- 溶血磷脂酰胆碱 ( 鸡蛋 ) ； Avanti Polar Lipids # 830071P
标准 ： C14 LPA， Avanti Polar Lipids， Cat#857120P
检测试剂 ： Amplex Red 试 剂 ； Invitrogen#A12222 ； 5mg， 溶 于 1.923mlDMSO 的 过 氧 化 物 酶 VI-A 型 ( 辣 根 )， Sigma#P6782 ； 5mg 溶 于 7.45ml 测 试 缓 冲 液 的 胆 碱 氧 化 酶 ； Sigma#C5896 ； 50U 溶于 2.47ml 测试缓冲液
检测试剂混合物 ： 在测试缓冲液中 1 ∶ 50 稀释的检测试剂
测 试 缓 冲 液： 10mM Tris-HCl， Merck， Cat#1.08219， pH 8， 1mM ； CaCl2x 2H2O， Merck#1.02382
下面的实施例涉及药物 ：
实施例 B ： 注射小瓶
用 2N 盐酸将 100g 式 I 的活性成分和 5g 磷酸氢二钠在 3L 双蒸水中的溶液调至 pH 6.5， 无菌过滤， 将其转移到注射小瓶中， 在无菌条件下冷冻干燥并在无菌条件下对其进 行密封。每个注射小瓶包含 5mg 活性成分。
实施例 C ： 栓剂
将 20g 式 I 的活性成分与 100g 大豆卵磷脂和 1400g 可可豆脂的混合物熔化， 倾倒 到模具中并使其冷却。每个栓剂包含 20mg 活性成分。
实施例 D ： 溶液剂
制备 1g 式 I 的活性成分、 9.38g NaH2PO4·2H2O、 28.48g Na2HPO4·12H2O 和 0.1g 苯 扎氯铵在 940ml 双蒸水中的溶液。将其 pH 调至 6.8， 将该溶液制备至 1L 并将其辐射灭菌。 该溶液可以以滴眼液的形式使用。
实施例 E ： 软膏剂
在无菌条件下将 500mg 式 I 的活性成分与 99.5g 凡士林混合。
实施例 F ： 片剂
将 1kg 式 I 的活性成分、 4kg 乳糖、 1.2kg 土豆淀粉、 0.2kg 滑石粉和 0.1kg 硬脂酸 镁的混合物按照常规方法压制获得片剂， 使每片包含 10mg 活性成分。
实施例 G ： 糖锭剂
按照类似于实施例 E 的方法压制片剂并随后按照常规方法用蔗糖、 土豆淀粉、 滑 石粉、 西黄蓍胶和染色剂的包衣剂进行包衣。
实施例 H ： 胶囊剂
将 2kg 式 I 的活性成分按照常规方法装入硬明胶胶囊中， 使每粒胶囊包含 20mg 活 性成分。实施例 I ： 安瓿剂
将 1kg 式 I 的活性成分在 60L 双蒸水中的溶液进行无菌过滤， 转移至安瓿中， 在无 菌条件下冷冻干燥并在无菌条件下密封。每个安瓿包含 10mg 活性成分。177