抗血小板聚集、低免疫原性重组葡激酶突变体 【技术领域】
本发明属生物技术领域，具体涉及一种抗血小板聚集、低免疫原性重组葡激酶突变体及其制备方法和应用。
背景技术
天然葡激酶(Staphylokinase，Sak)是金黄色葡萄球菌溶原性噬菌体合成的一种蛋白水解酶，由136个氨基酸组成。Sak本身不是酶，在人血浆中与纤溶酶原(plasminogen，plg)形成1∶1的复合物，该复合物被血块表面痕量的纤溶酶(plasmin，plm)激活为Sak·plm，Sak·plm能高效激活血浆中的plg形成plm，plm催化血栓主要基质纤维蛋白的降解，从而溶解血栓。在血浆中，Sak·plm很快被α2-抗纤溶酶抑制，而当plg通过赖氨酸结合位点与纤维蛋白结合后，α2-抗纤溶酶对Sak·plm的抑制速度会下降100倍，因此Sak是一种高效特异的溶栓剂(Collen D et al.Nature Medicine.4.279-284(1998))。但是，Sak是细菌蛋白，用于人体有较强的免疫原性。大多数病人给药两周后出现高滴度的中和抗体，并且抗体水平可以维持数月之久，从而阻碍了Sak的反复使用(Declerck PJ et al.Thromb Haemost.71.129-133(1994))。此外，与其他溶栓剂一样，Sak的使用也会导致再梗阻和出血等副作用。
研究发现，Sak含有三个互不重叠的抗原决定簇，其中两个抗原决定簇的具体位置已经阐明。将这两个抗原决定簇的关键氨基酸突变后，突变体的免疫原性显著降低，但其纤溶活性和特异性也随之下降(Collen D et al.Circulation.94.197-206.(1996)；Collen D et al.Circulation.94.207-216.(1996))。为降低免疫原性，Collen D等定点突变了Sak中的13个氨基酸，并用分子量为5kD的PEG对Sak的N端进行交联修饰，得到了一个Sak重组突变体SY161。SY161在人血浆中能保持纤溶活性和特异性，免疫原性显著降低，循环半衰期延长(Collen D etal.Circulation.102.1766-1772.(2000))。目前，SY161作为治疗急性心肌梗死的药物正处于II期临床试验阶段。
为提高溶栓效果，防止梗阻，近年来，靶向溶栓剂的研究引人注目。Arg-Gly-Asp(RGD)三肽序列可竞争结合血小板表面糖蛋白膜受体GPIIb/IIIa，阻止纤维蛋白原与GPIIb/IIIa受体的结合，从而抑制血小板的聚集，阻断血栓形成(Frishman WH et al.Am Heart J.130.877-892.(1995)；Nichols AJ et al.TrendsPharmacol Sci.13.413-417.(1992))。Saudek等人的研究发现，功能性RGD序列通常是位于连接两个β折叠的柔性环状区，暴露并突出于分子表面(Saudek V et al.Biochemistry.30(30).7369-7372.(1991)；Leaphy DJ et al.Science.258(5084).987-991.(1992))。在一定构象限制下，将RGD序列导入溶栓药物，如尿激酶、组织型纤溶酶原激活物的一定部位，所得地突变体具有溶栓、防栓的双重功能(Smith J.et al.J Biol Chem.270.30486-30490.(1995)；Yamada T et al.BiochemBiophys Res Commun.228(2).306-3 11.(1996))。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种具有防栓溶栓双功能低免疫原性的新型葡激酶突变体的蛋白质结构及其制备方法。本发明的另一目的是提供所述突变体在制备防止血栓形成药物中应用。
本发明采用结构生物学设计新型Sak突变体的分子结构，改变野生型Sak环状区1的34-37位氨基酸，将野生型Sak肽链的Asp33-Gly34-Lys35-Gly36替换为Asp33-Gly34-Arg35-Gly36(DGR)或Asp33-Gly34-Arg35-Gly36-Asp(RL1)。并利用基因工程手段生产，所得产品除了具有高效、特异的溶栓功能外，还具有抗血小板聚集和低免疫原性等新特性，能防治血栓形成，并且制备过程简便、安全，产品得率、纯度、活性均与野生型Sak基本相同。
本发明技术方案通过下述方法和步骤进行，
1)野生型Sak是一椭球状分子，从第21个氨基酸起，分别由5条、2条β折叠股构成的β折叠片层包裹在一个由12个氨基酸残基构成的α螺旋上。本发明根据Sak三维结构模型，在Sak的环状区1引入了RGD序列，并通过计算机分子对接手段，预测了突变体的三维结构。突变体与野生型Sak结构相似，突变氨基酸不影响活性中心的构象。
2)根据步骤1)设计了突变体DGR/RL1的分子结构，并利用PCR定点突变技术改变野生型Sak基因碱基序列，使其含有DGR/RGD编码序列。即以质粒pST-Sak为模板，上游引物、突变引物、下游引物进行三轮PCR扩增，获得DGR/RL1基因，然后与质粒pUC19重组，酶解筛选阳性克隆，核苷酸序列分析验证是否发生预计位置的突变。
3)突变体DGR/RL1基因与原核表达载体pLY-4重组，形成表达质粒，转化大肠杆菌，温度诱导DGR/RL1基因表达。表达产物以胞内可溶性蛋白的形式存在于工程菌内。
4)发酵技术：用低营养培养基M9CA培养工程菌，温度诱导前后用LB、葡萄糖、稀有元素溶液等进行补料，发酵参数为温度30-42℃，氧容量为50％一80％，pH＝6-8，搅拌速度随DO升高而降低。
5)工程菌发酵后用高压破碎，离心，收集细菌裂解液，超滤浓缩后用凝胶过滤和离子交换二步法纯化产品。
6)与野生型Sak性质比较表明，突变体DGR/RL1纤溶活性与野生型相当，能抑制ADP诱导的血小板聚集，免疫原性显著降低，具有溶栓，防栓双重功能。
【具体实施方式】
实施例1
1，理设计突变体
Sak的环状区1(D33G34K35G36)连接β折叠1(G21-D32)和β折叠2(N37-I49)，暴露于Sak的分子表面。在此环状区内构建RGD序列，期望能与血小板表面膜受体GPIIb/IIIa结合，阻止血小板的聚集。同时，该区远离Sak的活性中心，其构象的改变对纤溶活性影响极小。再者，该区是Sak抗原表位3所在区域，突变可能会导致该区构象改变，从而降低其免疫原性。因此，本发明设计了突变分子RL1，将环状区1突变成D33G34R35G36D。基于血小板表面膜受体GPIIb/IIIa对RGD的识别依赖于空间构象而非一级结构的假设，本发明设计了突变分子DGR，将环状区1突变为D33G34R35G36，在Sak分子中嵌入了RGD的反向序列DGR，期望对Sak分子改动最小，最大限度保持其纤溶活性。
本发明利用美国Rockfeller大学Vakser IA开发的GRAMM V1.03，以野生型Sak的晶体结构为基础，在SGI02图形工作站上进行了突变分子DGR/RL1的模建工作，模建的突变分子空间结构显示，构建的DGR/RGD均突出于分子表面，突变分子活性中心的构象与野生型一致。表明突变分子的设计是合理的。
2，克隆GR/RL1基因及构建原核表达质粒
质粒pST-SAK为模板，以上游引物、突变引物进行第一轮扩增，145bp扩增片段经琼脂糖凝胶电泳回收、纯化后，与下游引物再次以质粒pST-SAK为模板进行第二轮扩增。纯化后，所得432bp片段为模板，以上游引物，下游引物进行第三轮扩增，EcoRI、BamHI酶解后与pUC19重组，酶解筛选阳性克隆，核苷酸序列分析证实已发生设计的突变，由联合基因生物技术公司完成序列分析。然后用EcoRI、BamHI将DGR/RL1基因切出，连入表达载体pLY-4的相应位点。
所述寡核苷酸由上海生物工程公司制备。
所述上游引物、突变引物和下游引物的序列如下：
上游引物：5’-GCGGAATTCATGTCAAGTTCATTCGACAAAGG-3’
突变引物(DGR)：
5’-CATAATGAGGGGATAGCAATTCATTTCCGCGGCCATCAACTCCAGTC
ACATTTAC-3’
突变引物(RL)：
5’-CATAATGAGGGGATAGCAATTCATTGTCTCCGCGGCCATCAACTCCA
GTCACATTTAC-3’
下游引物：5’-GCGGGATCCTTATTTCTTTTC-3’
目的基因与pLY-4重组，转化大肠杆菌JF1125，提取质粒，以相应的内切酶酶解鉴定，获得特征性片段，证实获得阳性克隆。
质粒pLY-4-DGR/RL1转化大肠杆菌JF1125，经温度诱导表达，SDS-PAGE分析表达产物。电泳结束后，一半进行考马斯亮兰染色，可见诱导后细菌裂解液在分子量约15.5kD处有一浓集条带，经凝胶扫描，重组蛋白约占全菌总蛋白的50％；另一半洗去SDS后，贴在酪蛋白凝胶板上，37℃孵育数小时，于15.5kD处有一明显的透亮区。即此部位的酪蛋白已溶解，表明DGR/RL1具有纤溶活性。菌体经压榨破胞后，DGR的15.5kD条带主要位于上清中，说明表达产物DGR以胞内可溶形式存在；RL1的15.5kD条带既存在于上清中，也存在于沉淀中。说明RL1以胞内可溶和包涵体两种形式存在于胞内。
3，诱导表达工程菌
筛选高表达菌株作为工程菌，然后以30L发酵罐于低营养培养基(Na2HPO4，KH2PO4，NaCl，MgSO4，葡萄糖，酪蛋白水解物)中进行低密度发酵，30℃菌体培养，用LB、葡萄糖、稀有元素溶液(CuSO4，MnSO4，H3BO4，ZnCl2，KI，Na2MoO4，CoCl2，FeSO4，H2SO4，CaSO4，biotin)进行补料，42℃温度诱导后，离心收集菌体，PBS洗涤后，-70℃保存待用。24L发酵液得湿菌200g。湿菌用PBS重悬，以高压均质机压榨，离心后，SDS-PAGE结果显示，DGR在上清中15.5kD处有浓集条带，沉淀中相应位置无浓集条带，表明DGR主要以胞内可溶形式存在；而RL1在上清和沉淀中15.5kD处均有浓集条带，表明RL1以胞内可溶和包涵体两种形式存在于胞内。
4，细菌裂解液上清的超滤浓缩
压榨后收集DGR/RL1的破胞上清，先用截留分子量为50kD的膜包负超滤，滤出液再用截留分子量为3kD的膜包正超滤，浓缩液离心后收集上清。
5，Sephadex G-50柱层析
以2倍柱体积NaAc-HAc缓冲液平衡色谱柱，浓缩液上清上柱，Waters色谱仪控制流速和检测蛋白峰。上样结束后，以NaAc-HAc缓冲液洗脱，收集洗脱组分，SDS-PAGE分析目的蛋白分布，合并含目的蛋白组分。
6，SP-Sepharose FF柱层析
以10倍柱体积NaAc-HAc缓冲液平衡色谱柱，Sephadex G-50层析收集的组分上柱，Waters色谱仪控制流速和检测蛋白峰。上样结束后，以NaAc-HAc缓冲液洗至基线，0-1M NaCl梯度洗脱，收集洗脱组分，SDS-PAGE分析目的蛋白分布，并测定蛋白浓度。
7，纯度鉴定及分子量测定
样品进行15％SDS-PAGE，考马斯亮兰R-250染色后，Pharmacia ImagemasterVDS扫描测定纯度，纯度＞95％。样品经HPLC检测，纯度＞95％。样品经MassSpectrum检测，分子量约为15.5kD。
8，生物活性测定
分别以酪蛋白凝胶板溶圈法、发色底物法测定。DGR的比活性10-12万HU/mg；RL1比活性7-9万HU/mg。
9，Sak·纤溶酶复合物、DGR·纤溶酶复合物和RL1·纤溶酶复合物的Km和Kcat值测定
分别将2μM纤溶酶原与2μM Sak、DGR或RL1在pH7.4，0.1M PB，37℃的条件下，混合反应1h，形成与纤溶酶的复合物。取催化量复合物，在pH7.4，0.1M PB，25℃的条件下，在以下体系反应10min，每隔15记录405nm OD值，每个不同的纤溶酶原浓度重复三次，取平均值。
反应体系
终浓度
Sak·纤溶酶/DGR·纤溶酶/RL1·纤溶酶 5nM
发色底物S-2390 1mM
纤溶酶原 0.25-10μM
DGR·纤溶酶和RL1·纤溶酶复合物激活纤溶酶原的反应符合米氏方程。
表1是Sak·纤溶酶、DGR·纤溶酶和RL1·纤溶酶激活纤溶酶原的酶促动力学常数比较。
10，血小板聚集抑制试验
将用0.1体积，110mM枸橼酸三钠抗凝的新鲜血液低速离心(150g，10min)，得富含血小板血浆(PRP)。在连续搅拌的条件下，DGR/RL1与PRP 37℃孵育15min后，向PRP中加入ADP(终浓度20μM)作为诱导剂，以双通道血小板聚集仪测定5min内血小板的聚集率。分别以2μM野生型Sak、生理盐水为对照。
结果显示，DGR组和RL1组的血小板聚集率分别为44％±4％，45％±6％，低于野生型Sak组(51％±4％)和生理盐水组(52％±6％)(n＝3)，其抑制率分别为17％和14％，表明DGR/RL1能抑制ADP诱导的血小板聚集的能力。
11，豚鼠免疫试验
分别以灭菌生理盐水溶解重组野生型Sak或突变体DGR/RL1，配成0.25万单位/ml供致敏用。每次给药，均重新开瓶配制新鲜溶液。取健康雄性豚鼠18只，分3组，6只/组，分别间日腹腔注射r-Sak/DGR/RL1致敏豚鼠3次(0.125万单位/只)，14日后行第一次iv攻击，21日行第二次iv攻击(0.25万单位/只)。每次攻击后采血，ELISA测定抗体滴度。攻击时取健康雄性豚鼠2只，静脉注射上述样品(剂量0.25万单位/只)，观察有无同类反应，以排除供试品药理、毒理作用的干扰。
结果显示，豚鼠致敏后攻击，野生型r-Sak组5只呈IV级阳性反应，1只呈II级反应，而DGR/RL1组6只均无明显反应。ELISA测定致敏豚鼠抗体滴度，第一周r-Sak/DGR/RL1组均检测不到抗体产生，第二周r-Sak组抗体滴度为1：6400，DGR/RL1组无可检测到抗体产生。第三周r-Sak组抗体滴度升至1∶51200，DGR/RL1组分别为1∶200和1∶400。
以上结果表明，与野生型r-Sak相比，DGR/RL1的免疫原性显著下降。
12.兔动脉血栓防治试验
家兔20只，4只/组，设空白组(生理盐水)，对照组为r-Sak(40000HU/mg)，实验组DGR/RL1设大剂量(40000HU/mg)、中剂量(8000U/mg)、小剂量(4000HU/mg)三组。制备兔颈动脉血栓模型，耳缘静脉给药，电磁血流计监测栓塞血管血流量。颈静脉采血检测血小板聚集率及凝血指标。
结果显示，对照组及试验组均有明显溶栓效果。大剂量组再通率与对照组相当(100％)，但再灌注时间显著缩短(25min±0.96min vs35min±1.5min，p＜0。05)。中剂量组再通率为67％，再灌注时间与对照组无显著差异(32min±1.3minvs35min±1.5min)。低剂量组再通率为36％，再灌注时间延长(57min±0.89minvs35min±1.5min，p＜0.05)。对照组、实验组低剂量、中剂量和大剂量组再栓2例，0例，0例，1例。实验组大中低剂量组血小板聚集率分别为67％±5％，45％±3％，26％±6％，与对照组(12％±4％)有显著差异(p＜0.05)。实验组凝血指标与对照组无显著差异。
结果表明，DGR/RL1的溶栓效果较野生型Sak有显著提高，并能抑制血栓再次形成。本发明抗血小板聚集、低免疫原性重组葡激酶突变体可制备成药物，用于防止血栓形成。
表1
Km(μM) Kcat(s-1) Kcat/Km(μM-1s-1)
wt-Sak·plasmin 0.38 0.011 0.030
DGR·plasmin 0.74 0.025 0.035
RL1·plasmin 0.38 0.009 0.025
【序列表】
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