乙酰水杨酰基葛根素衍生物及其制备方法与应用 【技术领域】
本发明属医药技术领域，主要涉及葛根素的衍生物及其制备方法与应用，尤其涉及乙酰水杨酰基葛根素衍生物及其制备与应用。
背景技术
葛根素是一种天然的低毒有效的心脑血管系统疾病治疗药物，药理作用广泛，临床上已用于治疗冠心病、心绞痛、脑梗塞、缺血性脑血管病，改善血小板功能、减少糖尿病微量清蛋白、预防糖尿病肾病等(欧明洪葛根素的药理作用及临床应用 药学建设2000，9(12)：59-60)。但是葛根素口服吸收生物利用度较差，使口服剂型的应用受到限制，临床主要使用葛根素的注射液剂型，为方便应用，需要改善葛根素溶解性和生物利用度。目前相关文献报道主要在于进行结构修饰或采用特殊剂型。杨若林等曾对葛根素进行了一系列甲基化、甲氧基、异丙基、苯甲酰基、三苯甲基等的衍生化改造，进行兔眼血流量试验表明所得结构修饰后的化合物中三苯甲基化和乙酰化者显示可增加血流量。(杨若林，李娜等 葛根素衍生物的制备及其活性 中国药科大学学报1999，30(2)：81-85)。另外也有报导对其它黄酮类化合物的结构修饰，王晓莉尝试将7-羟基黄酮分别与阿魏酸、烟酸、对氯苯氧异丁酸合成酯(王晓莉，徐鸣夏，谢益农 7-羟基黄酮衍生物的合成 华西药学杂志1999，14(5-6)：309-314)。闫炳双等尝试以B环带不同取代基的7-羟基黄酮为母体，与对血栓素A2合成酶具有较强抑制作用的咪唑和乙酰水杨酸成酯(闫炳双，孙铁民，武振卿 7-乙酰水杨酰氧基黄酮衍生物的合成 中国药物化学杂志1994，4(1)：36-40；闫炳双，孙铁民，武振卿 7-(1-咪唑)-烷氧基黄酮衍生物的合成 中国药物化学杂志1995，5(1)：44-46)。
尽管在现有技术中有诸多对葛根素进行了一系列衍生化改造，但是，经检索，目前尚未见将葛根素用阿司匹林进行结构修饰，制备乙酰水杨酰基葛根素及其衍生物的报导。
【发明内容】
针对现有技术存在的不足，本发明要解决的问题之一是针对葛根素口服吸收生物利用度较差，临床仅有注射剂应用的现状，提供一种葛根素结构修饰衍生物——乙酰水杨酰基葛根素及其衍生物和其制备方法；本发明要解决的问题之二是提供乙酰水杨酰基葛根素衍生物在制备抗血小板聚集的药物中的应用。
本发明所述的乙酰水杨酰基葛根素衍生物用下述通式(I)表示：
其中：
R1，R2，R3，R4，R5或R6是指：氢、乙酰基或乙酰水杨酰基，且R1、R2、R3、R4、R5、R6中至少一个为乙酰水杨酰基。
其中R1，R2或R3是指：氢、乙酰基或乙酰水杨酰基；R4，R5或R6是指氢。
其中R1，R2或R3是指：乙酰基或乙酰水杨酰基；R4，R5或R6是指氢。
其中R1或R2是指：乙酰基或乙酰水杨酰基；R3，R4，R5或R6是指氢。
其中R1或R3是指：乙酰基或乙酰水杨酰基；R2，R4，R5或R6是指氢。
其中R1是指乙酰水杨酰基；R2，R3，R4，R5或R6是指氢。
上述化合物优选7-乙酰水杨酰基葛根素，7-乙酰水杨酰基-4′-乙酰基葛根素或7-乙酰水杨酰基-6”-乙酰基葛根素。
本发明所述的化合物的制备方法，该方法步骤如下：
(1)乙酰水杨酰氯地制备：将阿司匹林与二氯亚砜按1∶1～2的摩尔比混合，以吡啶为溶剂，在60℃～80℃油浴中反应2～3小时，减压蒸除溶剂，得乙酰水杨酰氯，置于无水四氢呋喃中备用；
(2)制备葛根素衍生物：将葛根素溶解于碱性无水溶剂中，在冰浴条件下，将上述乙酰水杨酰氯按与葛根素1～5∶1的摩尔比缓慢加入到葛根素的碱性无水溶液中，20℃～35℃反应1～2小时、回流2～3小时，常规过滤、浓缩、蒸干，得到乙酰水杨酰基葛根素衍生物；
(3)葛根素衍生物的分离纯化：采用常规硅胶柱层析手段，将上述反应得到乙酰水杨酰基葛根素衍生物进行分离纯化。
其中，步骤(2)所述的碱性无水溶剂优选为饱和碳酸钾的无水四氢呋喃溶剂。
其中，步骤(2)所述乙酰水杨酰氯与葛根素的摩尔比优选是2～3∶1。
本发明的化合物乙酰水杨酰基葛根素衍生物及其制剂在制备抗血小板聚集的药物中的应用。
用本发明的乙酰水杨酰基葛根素衍生物可制成任何一种药剂学上所述的剂型的药物；在所述的剂型中优选口服制剂或注射剂。
利用本发明的化合物乙酰水杨酰基葛根素衍生物的7-乙酰水杨酰基葛根素进行抑制血小板聚集活性实验表明：对人体外血小板聚集反应具有非常显著的剂量依赖性的抑制作用，在心脑血管疾病治疗方面具有良好应用前景。
利用本发明的乙酰水杨酰基葛根素衍生物，优选7-乙酰水杨酰基葛根素，选择临床常规检验血小板功能的比浊实验方法，观察其对二磷酸腺苷(ADP)诱导的人体外血小板聚集作用的影响情况。并将葛根素衍生物的抗血小板聚集作用与传统的抗血栓药物阿司匹林和反应物葛根素的作用情况进行比较，以确证葛根素的结构修饰与药效作用的相关性。结果在药效实验浓度范围内，7-乙酰水杨酰基葛根素对人体外血小板聚集反应具有非常显著的剂量依赖性的抑制作用。在相同浓度条件下，7-乙酰水杨酰基葛根素抑制血小板聚集作用显著地强于单用临床抗血栓药物阿司匹林和葛根素。7-乙酰水杨酰基葛根素、阿司匹林及葛根素对体外人血小板聚集反应的半数抑制聚集浓度IC50分别是0.91mmol.L-1、3.99mmol.L-1和3.18mmol.L-1。与相同摩尔浓度的葛根素和阿司匹林混合溶液的抗血小板聚集作用比较，衍生物的抗聚集作用强于物理混合溶液，两者存在着显著性差异。
阿司匹林本身作为抗血栓药物，主要作用机理在于对血小板的抑制，阿司匹林与葛根素的结合有望产生协同效果。本发明的化合物是根据药物设计的拼合原理，使阿司匹林与葛根素通过酰化结合成酯反应制成的药物组合物。利用本发明的制备方法，所得组合物包括在葛根素不同位置、不同数目上的羟基发生乙酰水杨酰化的一系列衍生物，通过常规柱层析手段可分别获得单一化合物。本发明的化合物改变了葛根素本身的极性和空间结构，以影响化合物的水溶性、改善药物的细胞膜通透功能，增强在胃肠道中的吸收，提高葛根素的口服生物利用度，降低阿司匹林的刺激性，达到协同作用的结果。
利用本发明的乙酰水杨酰基葛根素衍生物进行抑制血小板聚集活性实验表明：对人体外血小板聚集反应具有非常显著的剂量依赖性的抑制作用，且抑制作用显著地强于单用相当量的临床抗血栓药物阿司匹林和葛根素，及二者的物理混合物，并存在着显著性差异。该类化合物可克服目前临床上葛根素口服吸收生物利用度较差、阿司匹林刺激性较大等缺点，且表现更强的生物效应，在制备心脑血管疾病治疗药物方面应具有良好应用前景。
【附图说明】
图1 7-乙酰水杨酰基葛根素的1HNMR谱图
图2 7-乙酰水杨酰基葛根素的13CNMR谱图
图3 7-乙酰水杨酰基葛根素的1H-1HCOSY谱图
图4 7-乙酰水杨酰基葛根素的HMQC谱图
图5 7-乙酰水杨酰基葛根素的HMBC图谱
图6 7-乙酰水杨酰基葛根素的MS谱图
图7 7-乙酰水杨酰基葛根素的IR谱图
图8 7-乙酰水杨酰基-4′-乙酰基葛根素的1HNMR谱图
图9 7-乙酰水杨酰基-4′-乙酰基葛根素的13CNMR谱图
图10 7-乙酰水杨酰基-4′-乙酰基葛根素的1H-1HCOSY谱图
图11 7-乙酰水杨酰基-4′-乙酰基葛根素的HMQC谱图
图12 7-乙酰水杨酰基-4′-乙酰基葛根素的HMBC图谱
图13 7-乙酰水杨酰基-4′-乙酰基葛根素的MS谱图
图14 7-乙酰水杨酰基-6”-乙酰基葛根素的1HNMR谱图
图15 7-乙酰水杨酰基-6”-乙酰基葛根素的13CNMR谱图
图16 7-乙酰水杨酰基-6”-乙酰基葛根素的MS谱图
【具体实施方式】
1.乙酰水杨酰基葛根素衍生物的制备
实施例1：
将9.0g(约0.05mol)的阿司匹林与7ml(约0.084mol)的氯化亚砜混合，加入吡啶4滴，将油浴在50min内缓慢升温至75℃，恒温反应2h，减压蒸除液体，加入6ml无水四氢呋喃，密闭保存待用。将4.2g葛根素(约0.01mol)用适量无水四氢呋喃溶解，加入5g无水碳酸钠，室温搅拌10min。在冰浴搅拌条件下缓慢滴加乙酰水杨酰氯5.5g(约0.026mol)，室温反应1h后，回流2h，过滤后减压蒸除溶剂。固体经常规硅胶柱层析，氯仿-甲醇系统梯度洗脱，硅胶薄层层析(CHCl3∶MeOH＝8∶2，1％FeCl3-K3[Fe(CN)6](1∶1)溶液显色)检测，收集合并Rf＝0.4～0.5流份，常规浓缩，析晶得7-乙酰水杨酰基葛根素1.36g。
7-乙酰水杨酰基葛根素(结构式见下式结构A)为白色粉末，分子式：C30H26O12，分子量：578。mp：195.6～196.8℃。IR vKBrmax(cm-1)3425(v-OH)，1746(vC＝O)，1633，1608(vC＝C)，1515，1229，1197，1110(vC-O-C)，1485，1435，1371(δ-CH3)，MS m/z(％)(579.4)：579.3(100)，537.3(10)，459.4(8)，417.3(16)，399.3(4)，321.3(6)，279.3(4)，163.4(2)，121.2(2)。1HNMR、13CNMR、1H-1HCOSY、HMQC、HMBC、MS、IR谱图见附图1-7。1HNMR和13CNMR谱数据分别见表1和2。
实施例2：
将9.0g(约0.05mol)的阿司匹林与5ml的氯化亚砜混合，加入吡啶4滴，将油浴在50min内缓慢升温至60℃，恒温反应2h，减压蒸除液体，加入6ml无水四氢呋喃，密闭保存待用。将10.0g葛根素(约0.025mol)用适量无水四氢呋喃溶解，加入5g无水碳酸钠，室温搅拌10min。在冰浴搅拌条件下缓慢滴加乙酰水杨酰氯5.5g(约0.026mol)，室温反应2h后，回流2h，过滤后减压蒸除溶剂。固体经常规硅胶柱层析，氯仿-甲醇系统梯度洗脱，硅胶薄层层析(CHCl3∶MeOH＝8∶2，1％FeCl3-K3[Fe(CN)6](1∶1)溶液显色)检测，收集合并Rf＝0.65～0.85流份，常规浓缩，析晶得7-乙酰水杨酰基-4′-乙酰基葛根素1.21g。
7-乙酰水杨酰基-4′-乙酰基葛根素(结构式见下式结构B)为白色块状晶体，分子式：C32H28O13，分子量：620，mp：141.0～143.5℃。MS m/z(％)：621.6(100)，515.5(10)，339.5(25)，330.6(30)，163.3(15)，131.1(17)，121.4(10)。1HNMR、13CNMR、1H-1HCOSY、HMQC、HMBC、MS谱图见附图8-13，1HNMR和13CNMR谱谱数据分别见表1和2。
实施例3：
将9g(约0.05mol)的阿司匹林与8ml的氯化亚砜混合，加入吡啶4滴，将油浴在50min内缓慢升温至80℃，恒温反应2h，减压蒸除液体，加入6ml无水四氢呋喃，密闭保存待用。将6.2g葛根素(约0.015mol)用适量无水四氢呋喃溶解，加入5g无水碳酸钠，室温搅拌10min。在冰浴搅拌条件下缓慢滴加乙酰水杨酰氯5.5g(约0.026mol)，室温反应1h后，回流3h，过滤后减压蒸除溶剂。固体经常规硅胶柱层析，氯仿-甲醇系统梯度洗脱，硅胶薄层层析(CHCl3∶MeOH＝8∶2，1％FeCl3-K3[Fe(CN)6](1∶1)溶液显色)检测，收集合并Rf＝0.5～0.6流份，常规浓缩，析晶得7-乙酰水杨酰基-6″-乙酰基葛根素0.83g。
7-乙酰水杨酰基-6”-乙酰基葛根素(结构式见下式结构C)为白色块状晶体，分子式：C32H28O13，分子量：620。mp.152.0～154.1℃。MS m/z：621.6[M+1]+，643[M+23]+，659[M+39]+，459.6[458+1]+。1HNMR、13CNMR、MS谱图见附图14-16。1HNMR和13CNMR谱数据分别见表1和2。
表1 化合物(A、B、C)的1HNMR数据(ppm)
H A B* C
H-2 8.32s 8.45s 8.32s
H-5 8.26s 8.32d 8.29
H-6 7.33 7.37d 7.32
H-2’，6’ 7.52d 7.72 7.53d
H-3’，5’ 6.92d 7.31d 6.85d
H-1” 5.14d 5.13d 5.16d
H-2” 4.09 4.04 4.26
H-3” 3.56 3.51 3.67
H-4” 3.16 3.02 3.59
H-5” 3.41 3.38 3.16
H2-6” 3.63，3.27 3.66，3.22 4.14，3.52
H-3 7.31 7.26 7.32
H-4” 7.78 7.78 7.79
H-5” 7.52 7.48 7.52
H-6” 8.32 8.23 8.27
-CH3 2.27s 2.33，2.31 2.25，1.79
注：化合物A、C溶剂为(CD3)2CO，化合物B溶剂为CD3OD
表2 化合物(A、B、C)的13CNMR数据(ppm)
No. A B* C
2 152.9 153.1 153.0
3 123.9 125.3 123.6
4 174.7 177.5 174.7
5 125.8 127.7 125.9
6 122.5 123.5 122.6
7 152.6 156.0 152.5
8 121.4 125.5 121.4
9 154.7 156.0 154.7
10 121.1 122.7 120.9
1’ 123.6 125.1 123.9
2’，6’ 129.7 131.5 129.8
3’，5’ 114.7 122.9 114.6
4’ 157.0 130.9 157.0
-CH3 19.7 21.0，21.0 19.7，19.3
1” 73.2 75.0 73.2
2” 72.6 74.2 72.5
3” 78.7 80.0 78.0
4” 71.0 72.4 70.9
5” 80.9 83.1 78.3
6” 62.1 63.6 63.9
1 121.4 124.0 121.8
2 151.2 152.5 151.2
3 123.9 125.1 124.0
4 134.7 136.0 134.5
5 125.8 127.4 125.8
6 131.1 133.0 131.5
C＝O 174.3，168.9 171.6，171.3 169.6，169.6
164.5 168.6
注：化合物A、C溶剂为(CD3)2CO，化合物B溶剂为CD3OD
2.药效试验：
仪器：RYXN-96B多功能智能血液凝集仪，上海通用机电技术研究所产品；
材料：受试血浆由健康男性青年志愿者提供；二磷酸腺苷(ADP)，自制7-乙酰水杨酰基葛根素，其它所用试剂均为分析纯。
2.1受试药物溶液的配制
分别精密称取阿司匹林(ASP)、葛根素(Pur)和7-乙酰水杨酰基葛根素，以0.9％NaCl溶液做溶剂分别配制成高浓度受试溶液(C高≈36mmol.L-1)、中浓度受试溶液(C中≈10mmol.L-1)和低浓度受试溶液(C低≈3mmol.L-1)。
将阿司匹林和葛根素按等摩尔比例计算的结果精确称量，物理混合后配制与上述试液浓度相同的高、中、低三个浓度的混合溶液。
以葛根素衍生物溶液为实验组，阿司匹林、葛根素及其等摩尔混合溶液为对照组，测定含一定量药物血浆血小板的聚集率，以血小板聚集抑制率评价药物的药效作用。
2.2血浆的准备
同年龄组健康男性青年空腹肘静脉取血10ml，置入3.8％枸橼酸钠抗凝管(血液与抗凝剂体积比为9∶1)。以500r/min转速离心5min，取上清液为富血小板血浆(PRP)；然后以3000r/min转速离心10min，分离血浆获得贫血小板血浆(PPP)。以贫血小板血浆作空白调试仪器。
2.3药物抗血小板聚集实验
精确移取富血小板血浆200μl于血液凝集仪的测试管中，加入受试药物溶液20μl(使其在血浆中的终浓度分别约为C高3mmol.L-1、C中0.9mmol.L-1和C低0.29mmol.L-1)。电动搅拌1min，37℃恒温孵化6min后，加入ADP血小板聚集诱导剂20μl(使终浓度为4μmol.L-1)。按比浊法测定加入血小板聚集诱导剂ADP后，血浆在8min内的最大聚集率。所有血浆试样必须在2h内完成聚集率的测定。
将所测得实验数据均以血小板聚集抑制率(x±s)表示，相同浓度不同实验组的血小板聚集抑制率分别与7-乙酰水杨酰基葛根素对应浓度的血小板聚集抑制率数据进行统计学的t检验。
2.4试验结果：
2.4.1 7-乙酰水杨酰基葛根素对人体外血小板聚集作用的影响
7-乙酰水杨酰基葛根素的血小板聚集率实验数据与空白实验的血小板聚集率数据进行统计学处理，以考察药物是否具有抗血小板聚集的作用。实验数据处理结果见表1。
2.4.2 7-乙酰水杨酰基葛根素抗血小板聚集作用的评价
7-乙酰水杨酰基葛根素对血小板聚集的抑制作用与相同实验条件下阿司匹林、葛根素及阿司匹林与葛根素混合溶液的抗血小板聚集作用的实验数据进行统计学意义的考察。以确定葛根素结构修饰对其药效变化的意义，初步了解和推测葛根素衍生物可能的抗血小板聚集的机理。实验数据处理结果列于表2。
表1 7-乙酰水杨酰基葛根素对人体外血小板聚集作用的影响(n＝5，x±s)
组别 血浆终浓度 样本数 血小板聚集率 抑制率
(mmol.L-1) n (％) (％)
对照组 5 31.88±7.55
高浓度组 3.00 5 6.65±4.63* 79.17±13.88
中浓度组 0.90 5 13.79±3.56* 51.76±11.05
低浓度组 0.27 5 20.70± 35.07±7.48
7.32**
*与对照组(加入0.9％NaCl)血小板聚集率比较的t检验P＜0.001
**与对照组(加入0.9％NaCl)血小板聚集率比较的t检验P＜0.05
表2 7-乙酰水杨酰基葛根素、阿司匹林和葛根素
对人体外血小板聚集作用的影响(n＝5，x±s)
药物在血浆 7-乙酰水杨
中的终浓度 酰基葛根素 阿司匹林 葛根素 混合液
(mmol.L-1) (ASP+Pur)
3.00 79.17±13.88 38.40± 47.46± 67.41±17.18
8.12*** 9.4***
0.90 56.86±1.26 24.94± 17.01± 26.50±
10.35*** 1.89*** 7.92***
0.27 35.07±7.48 6.81± 9.36± 15.10±
2.01*** 1.90*** 3.97**
IC50 0.91 3.99 3.18
***与相同浓度的葛根素衍生物的血小板聚集抑制率比较的t检验：P＜0.001
**与相同浓度的葛根素衍生物的血小板聚集抑制率比较的t检验：P＜0.01