雷帕霉素或其衍生物的制备色谱纯化方法.pdf

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1、10申请公布号CN102464668A43申请公布日20120523CN102464668ACN102464668A21申请号201010546460622申请日20101117C07D498/18200601B01D15/3220060171申请人浙江海正药业股份有限公司地址318000浙江省台州市椒江区外沙路46号申请人上海医药工业研究院72发明人吴忠伟刘自兵郭红军赵小仁张福利吴泰志刘军54发明名称雷帕霉素或其衍生物的制备色谱纯化方法57摘要本发明通过一次制备色谱纯化得到高纯度雷帕霉素或其衍生物，其中制备色谱纯化是指通过正相制备色谱纯化或反相制备色谱纯化。51INTCL权利要求书2页说明书。

2、7页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书7页1/2页21一种式I雷帕霉素或其衍生物的纯化方法，其特征在于单独使用正相制备色谱，将式I的雷帕霉素或其衍生物吸附于所述制备色谱的固定相，经一步色谱纯化得到纯度99以上的产物式I其中R是指氢、烷基、烷基硅氧烷基、芳基烷基、羟烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、烷氧羰基氨基烷基、酰基氨基烷基、芳基、四氢吡喃2基氧基乙酰基、羟基乙酰基、2，2二甲基3四氢吡喃2基氧基丙酰基、3羟基2，2二甲基丙酰基、2，2二甲基1，3二氧杂环戊烷4酰基、2，3二羟基丙酰基、3羟基2羟甲基丙酰基、2，2双羟甲基丙酰基。2根据权利要求1所述的方法，其中所。

3、述的烷基或烷氧基是指C1C6的烷基或烷氧基；其中所述的芳基是苯基或取代苯基，苯基上的取代基选自C1C5烷基、羟基、硝基、磺酸基或卤素。3根据权利要求1所述的方法，其中所述的式I是雷帕霉素、依维莫司或泰姆西罗莫司。4根据权利要求1所述的方法，该方法包括下述步骤A将溶于流动相的样品吸附在固定相中，B用制备泵将流动相吸入制备柱洗脱样品，C收集雷帕霉素或其衍生物。5根据权利要求4所述的方法，其中所述的固定相为非键合硅胶，粒径为3100M，孔径为60形状为无定型或球型。6根据权利要求5所述的方法，其中所述的固定相粒径为520M，孔径为60形状为球型。7根据权利要求4所述的方法，其中所述的流动相是指低极性。

4、有机溶剂与高极性有机溶剂的混合溶剂，其中低极性有机溶剂占的体积百分比大于60。8根据权利要求7所述的方法，其中所述的低极性有机溶剂选自C5C12的烷烃或环烷烃、C1C8的卤代烷烃或其混合物。9根据权利要求8所述的方法，其中所述的C5C12的烷烃或环烷烃选自正己烷、正庚烷、环己烷，C1C8的卤代烷烃选自二氯甲烷、氯仿。10根据权利要求7所述的方法，其中所述的高极性有机溶剂选自C1C5的醇、C2权利要求书CN102464668A2/2页3C10的酯、C3C6的酮、C3C6的环醚、乙腈或其混合物。11根据权利要求10所述的方法，其中所述的C1C5的醇选自甲醇、乙醇、异丙醇，C2C10的酯选自乙酸乙酯。

5、、乙酸异丙酯，C3C6的酮选自丙酮、丁酮，C3C6的环醚选自四氢呋喃、二氧六环。12根据权利要求7所述的方法，其所述的低极性有机溶剂占流动相的体积百分比为70999。13一种制备权利要求1所述式I雷帕霉素或其衍生物的方法，其特征在于单独使用反相制备色谱，将式I的雷帕霉素或其衍生物吸附于所述制备色谱的固定相，经一步色谱纯化得到纯度99以上的产物，包括步骤A将样品溶解并吸附在固定相中，B用制备泵将流动相吸入制备柱洗脱样品，C收集雷帕霉素或其衍生物，14根据权利要求13所述的方法，其中所述的固定相选自键合硅胶，粒径为5100M，孔径为6015根据权利要求14所述的方法，其中所述的固定相的键合基团选自。

6、烷基、苯基、烷基甲硅烷基中的至少一种。16根据权利要求15所述的方法，其中所述的烷基选自丁基、辛基、十八烷基、二十三烷基中的至少一种。17根据权利要求14所述的方法，其中所述的固定相的粒径为520M，孔径为6018根据权利要求13所述的方法，其中所述的流动相为包含至少一种有机溶剂的水溶液。19根据权利要求18所述的方法，其中所述的有机溶剂为C1C5的醇、乙腈、C3C6的环醚、C1C5的酸。20根据权利要求19所述的方法，其中所述的C1C5的醇选自甲醇、乙醇、异丙醇，C3C6的环醚选自四氢呋喃、二氧六环，C1C5的酸选自乙酸、甲酸、三氟乙酸。21根据权利要求18所述的方法，其中所述的流动相中，水。

7、占的体积百分比为560。权利要求书CN102464668A1/7页4雷帕霉素或其衍生物的制备色谱纯化方法技术领域0001本发明涉及应用高压制备系统分离纯化雷帕霉素或其衍生物的方法背景技术0002雷帕霉素是由吸水链霉菌产生的大环三烯抗生素，发现它具有体外和体内抗真菌活性，特别是抗白色念珠菌CVEZINA等人，JANTIBIOT28，7211975；SNSEHGAL等人，JANTIBIOT28，7271975；HABAKER等人，JANTIBIOT31，5391978；美国专利3,929,992和美国专利3,993,749。0003雷帕霉素具有抗肿瘤美国专利4,885,171和4,401,653和。

8、免疫抑制作用FASEB3，34111989，其用途包括预防或治疗系统性红斑疮美国专利5,078,999，肺炎美国专利5,080,899，胰岛素依赖型糖尿病炎性疾病研究协会第五次国际会议FIFTHINTCONFINFLAMMRESASSOC121摘要，1990，平滑肌细胞增生及血管损伤引起的内膜变厚MORRIS，RJ心肺移植HEARTLUNGTRANSPLANT11PT2；1971992，成年人T细胞白血病/淋巴瘤EP525，960A1和眼炎EP532，862A1。雷帕霉素结构式II和雷帕霉素衍生物包括依维莫司结构式III、泰姆西罗莫司结构式一直被研究用于治疗这些以及其它疾病。00040005结。

9、构式II0006说明书CN102464668A2/7页50007结构式III00080009结构式IV0010依维莫司又名40O2羟基乙基雷帕霉素，英文名EVEROLIMUS，其合成描述于美国专利NO5,665,772和国际专利公开NOWO94/09010中。其精制纯化专利描述于美国专利NO6,605,613B2，用乙酸乙酯和正己烷精制得到晶型固体。0011泰姆西罗莫司又名CCI779、2，2二羟甲基丙酸雷帕霉素42酯，其合成描述于CN1059905C和WO95/28406。其精制纯化专利描述于US2006178392A1用甲基叔丁基醚精制或甲基叔丁基醚与正己烷精制得到晶型固体；US20071。

10、29395A1用乙醚精制得到晶型固体。0012雷帕霉素及其衍生物一般纯化都是采用精制方法，而用精制方法并不能保证一次精制就能得到高纯度样品。WO2008065887公开了雷帕霉素衍生物制备色谱纯化方法，该发明需要通过先正相制备再反相制备才能达到提纯目的。【现有技术中关于雷帕霉素的提纯方法有哪些如何提纯雷帕霉素】发明内容0013因此，本发明的目的是提供了一种利用正相制备色谱分离纯化雷帕霉素或其衍生物的方法；0014本发明的另一发明目的是提供了一种利用反相制备色谱分离纯化雷帕霉素或其衍生物的方法；0015本发明的目的在于单独使用正相或反相制备色谱纯化技术，提纯高纯度雷帕霉素说明书CN1024646。

11、68A3/7页6或其衍生物，而不需进一步精制纯化，从而提高了效率，降低产品成本。0016本发明涉及的一种式I雷帕霉素或其衍生物的制备色谱纯化方法，其特征在于，将式I的雷帕霉素或其衍生物吸附于制备色谱固定相，经一步色谱纯化得到纯度99以上的产物。00170018式I0019其中R是指氢、烷基、烷基硅氧烷基、芳基烷基、羟烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、烷氧羰基氨基烷基、酰基氨基烷基、芳基、四氢吡喃2基氧基乙酰基、羟基乙酰基、2，2二甲基3四氢吡喃2基氧基丙酰基、3羟基2，2二甲基丙酰基、2，2二甲基1，3二氧杂环戊烷4酰基、2，3二羟基丙酰基、3羟基2羟甲基丙酰基、2，2双羟甲基丙酰基。。

12、其中所述的烷基或烷氧基是指C1C6的烷基或烷氧基；其中所述的芳基是苯基或取代苯基，苯基上的取代基选自C1C5烷基、羟基、硝基、磺酸基或卤素。其中所述的式I具体是指雷帕霉素、依维莫司、泰姆西罗莫司。0020本发明涉及制备色谱纯化技术一般分为正相制备色谱纯化与反相制备色谱纯化。所谓正相制备色谱是指用的固定相通常为非键合硅胶或键合其他具有极性官能团，如胺基团和氰基团的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基或其他团的极性较强，因此，分离的次序是依据样品中的各组份的极性大小，即极性强弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，反相色谱填料常是以硅胶为基础，表面键合有极性相对较弱的官能团。

13、的键合相。反相色色谱所使用的流动相极性较强，通常为水，缓冲液与甲醇，己腈等混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。常用的反相填料有C18、C8、C4、C6H5等。0021在本发明的一方面，本发明涉及的制备高纯度的雷帕霉素或其衍生物的方法的特征在于，将雷帕霉素或其衍生物的粗品用正相制备色谱纯化，得到纯度大于99的产物，其中所述正相制备色谱纯化方法是指0022A将溶于流动相的样品吸附在固定相中，0023B用制备泵将流动相吸入制备柱洗脱样品，0024C弱极性杂质先被分离，然后雷帕霉素或其衍生物产物被分离，再强极性杂质被分离，收集合有雷帕霉素或其衍。

14、生物产物峰的流份，蒸除溶剂得纯度大于99的样品。0025在进一步的实施方案中，其制备柱所需的固定相为非键合硅胶，优选固定相粒径为3100M，更优选为520M，进一步更优选510M，最优选10M。实验发现粒说明书CN102464668A4/7页7径较小则分离效果较好、收率相对较高。优选固定相孔径为60更优选为60实验发现孔径较小则分离效果较好。优选固定相的性状为无定型或球型，更优选为球型，实验发现球型的分离时的峰型比无定型的好，也就是说球型的分离效果比无定型的好。0026在进一步的实施方案中，所述流动相是指低极性有机溶剂与高极性有机溶剂的混合溶剂，其中低极性有机溶剂占的体积百分比大于60，优选为。

15、70999。其中所述的低极性有机溶剂选自例如烷烃、卤代烷烃等常规的低极性有机溶剂。优选其中所述的低极性有机溶剂选自C5C12的饱和烃、C1C8的卤代烷烃或其混合物。C5C12的饱和烃优选正己烷、正庚烷、环己烷，C1C8的卤代烷烃选自二氯甲烷、氯仿；其中所述的高极性有机溶剂选自例如醇、酮等常规的高极性有机溶剂。优选所述的高极性有机溶剂选自C1C5的醇、C2C10的酯、C3C6的酮、C3C6的环醚、乙腈或其混合物。C1C5的醇选自甲醇、乙醇、异丙醇，C2C10的酯选自乙酸乙酯、乙酸异丙酯，C3C6的酮选自丙酮、丁酮，C3C6的环醚选自四氢呋喃、二氧六环。0027在本发明涉及的制备高纯度的雷帕霉素或。

16、其衍生物的正相制备色谱纯化方法中，其所述的流动相的流速根据制备柱的大小、制备泵所承受的流量大小，以及流动相对杂质的分离度决定的；其中所述的产物的收集，由于样品的上样量比较大，会在图谱中形成平顶峰，可根据分离效果来决定收集的起止时间，如果杂质的分离效果特别好，可以从产物刚出来就可以收集，如果杂质的分离效果比较差，也可以收集平顶峰中间的某一段。含有产物的流份收集后，可以直接蒸除溶剂，得到产物。样品的纯度用HPLC检测大于99。0028在本发明的另一方面，本发明涉及的制备高纯度的雷帕霉素或其衍生物的方法的特征还在于将雷帕霉素或其衍生物的粗品用反相制备色谱纯化，得到纯度大于99的产物，其中所述反相制备。

17、色谱纯化方法是指0029A将样品溶解并吸附在固定相中，0030B用制备泵将流动相吸入制备柱洗脱样品，0031C强极性杂质先被分离，然后雷帕霉素或其衍生物产物被分离，再弱极性杂质被分离，收集含有雷帕霉素或其衍生物产物峰的流份，用二氯甲烷提取、浓缩、干燥得纯度大于99的样品。0032在进一步的实施方案中，其制备柱所需固定相选自键合硅胶，固定相的键合基团选自烷基、苯基、烷基甲硅烷基中的至少一种，其中烷基为选自丁基、辛基、十八烷基、二十三烷基中的至少一种。优选固定相的粒径为5100M，粒径更优选为520M，进一步更优选510M，最优选10M。实验发现粒径较小则分离效果较好、收率相对较高。优选固定相的孔。

18、径为60更优选600033在进一步的实施方案中，流动相为包含至少一种有机溶剂的水溶液，其所述的有机溶剂为C1C5的醇、乙腈、C3C6的环醚、C1C5的酸。优选其中所述的C1C5的醇选自例如甲醇、乙醇、异丙醇，C3C6的环醚选自例如四氢呋喃、二氧六环，C1C5的酸选自例如乙酸、甲酸、三氟乙酸，水占的体积百分比为560。0034在本发明涉及的制备高纯度的雷帕霉素或其衍生物的反相制备色谱纯化方法中，流动相的流速根据制备柱的大小、制备泵所承受的流量大小，以及流动相对杂质的分离度决定的；其所述的产物的收集，由于样品的上样量比较大，会在图谱中形成平顶峰，如果杂质的分离效果特别好，可以从产物刚出来就可以收集。

19、，如果杂质的分离效果比较差，也可以说明书CN102464668A5/7页8收集平顶峰中间的某一段。含有产物的流份收集后，用二氯甲烷提取、干燥、浓缩得到产物，样品的纯度用HPLC检测大于99。0035本发明涉及的制备高纯度的雷帕霉素或其衍生物的方法其特征还在于，其所述的衍生物是指依维莫司、泰姆西罗莫司等，用上述制备方法基本都可以分离得到高纯度的雷帕霉素或其衍生物。0036雷帕霉素是由吸水链霉菌发酵而成的JANTIBIOT28，7271975经提取、分离、结晶得较高纯度雷帕霉素。0037依维莫司合成描述于美国专利NO5,665,772和国际专利公开NOWO94/09010，以雷帕霉素为起始原料，在。

20、二氯甲烷中在DIPEA存在下与三氟甲磺酸叔丁基二甲基硅氧基乙基酯反应，经柱层析、水解得依维莫司纯度较高的粗品。0038泰姆西罗莫司的合成方法描述于中国专利CN1059905，先将2，2双羟甲基丙酸异亚丙基缩酮与2，4，6三氯苯甲酰氯反应形成酸酐再与雷帕霉素在DMAP存在下反应经柱层析、水解得纯度较高的泰姆西罗莫司的粗品0039本发明与现有技术相比的优点在于，经过合成得到纯度较高的雷帕霉素或其衍生物的粗品，通过一次制备色谱纯化方法，可以直接得到高纯度的雷帕霉素或其衍生物，而不需进一步精制纯化。本发明方法的收率较高，从而提高了效率，降低产品成本。本发明的制备色谱纯化方法还可以很方便的放大到工业级，。

21、无需对方法进行大的更改，只需根据制备柱的大小成比例的调节流速的大小。本发明制备后的高纯度产品的稳定性比较好，能在28保存较长时间。0040下面通过实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是本发明实施例所述制备方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。具体实施方式0041下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述制备方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。0042实施例一依维莫司的正相制备色谱纯化0043仪器制备色。

22、谱系统。0044填料80G非键合球型硅胶，粒径10M，孔径0045洗脱剂正己烷乙酸乙酯甲醇801010体积比。0046流速20ML/MIN。0047检测波长278NM。004802G依维莫司粗品合成参考WO94/09010用4ML洗脱剂溶解，用5ML/MIN流速将样品溶解液吸入柱子吸附在填料中，20ML/MIN流速洗脱，弱极性杂质先被分离，然后依维莫司产物被分离，再强极性杂质被分离，产物峰由于浓度高将在制备图谱上显现出平顶峰，收集平顶峰这一段的产物，浓缩干得依维莫司，收率70，产品纯度大于99。0049实施例二依维莫司的正相制备色谱纯化0050根据实施例一相同的方法将洗脱剂换成二氯甲烷甲醇50。

23、1体积比收集说明书CN102464668A6/7页9产物浓缩干得依维莫司，收率72，产品纯度大于99。0051实施例三依维莫司的正相制备色谱纯化0052根据实施例一相同的方法将洗脱剂换成正己烷二氯甲烷甲醇13501体积比收集产物浓缩干得依维莫司，收率75产品纯度大于99。0053实施例四依维莫司的正相制备色谱纯化0054根据实施例一相同的方法将洗脱剂换成二氯甲烷乙酸乙酯甲醇5031体积比收集产物浓缩干得依维莫司，收率76产品纯度大于99。0055实施例五依维莫司的正相制备色谱纯化0056根据实施例一相同的方法将填料换成80G粒径5M，孔径的非键合球型硅胶，用二氯甲烷乙酸乙酯甲醇5031体积比的。

24、洗脱剂洗脱，收集产物浓缩干得依维莫司，收率77，产品纯度大于99。0057实施例六依维莫司的正相制备色谱纯化0058根据实施例一相同的方法将填料换成80G粒径20M，孔径的正相球型硅胶，用二氯甲烷乙酸乙酯甲醇5031体积比的洗脱剂洗脱，收集产物浓缩干得依维莫司，收率65产品纯度大于99。0059实施例七雷帕霉素的正相制备色谱纯化0060根据实施例一、二、三、四相同的方法将粗品依维莫司替换成雷帕霉素，制备得到的雷帕霉素纯度大于99。0061实施例八泰姆西罗莫司的正相制备色谱纯化0062根据实施例一、二、三、四相同的方法将粗品依维莫司替换成泰姆西罗莫司，制备得到的泰姆西罗莫司纯度大于99。0063。

25、实施例九依维莫司的反相制备色谱纯化0064仪器制备色谱系统。0065填料350G粒径10M，孔径的反相C18硅胶。0066洗脱剂甲醇四氢呋喃水205030体积比0067流速50ML/MIN。0068检测波长278NM。006905G依维莫司粗品用10ML乙腈溶解，用10ML/MIN流速将样品溶解液吸入柱子吸附在填料中，50ML/MIN流速洗脱，强极性杂质先被分离，然后依维莫司产物被分离，再弱极性杂质被分离，产物峰由于浓度高将在制备图谱上显现出平顶峰，收集平顶峰这一段的产物，二氯甲烷提取、干燥、浓缩干得依维莫司，收率70，产品纯度大于99。0070实施例十依维莫司的反相制备色谱纯化0071根据实。

26、施例九相同的方法将洗脱剂换成四氢呋喃水5050体积比收集产物二氯甲烷提取、干燥、浓缩干得依维莫司，收率68，产品纯度大于99。0072实施例十一依维莫司的反相制备色谱纯化0073根据实施例九相同的方法将洗脱剂换成乙腈四氢呋喃水103555体积比收集产物二氯甲烷提取、干燥、浓缩干得依维莫司，收率70，产品纯度大于99。0074实施例十二依维莫司的反相制备色谱纯化0075根据实施例九相同的方法将洗脱剂换成乙腈异丙醇水60535体积说明书CN102464668A7/7页10比收集产物二氯甲烷提取、干燥、浓缩干得依维莫司，收率72，产品纯度大于99。0076实施例十三依维莫司的反相制备色谱纯化0077。

27、根据实施例九相同的方法将洗脱剂换成乙腈四氢呋喃水乙酸17354805体积比收集产物二氯甲烷提取、干燥、浓缩干得依维莫司，收率68，产品纯度大于99。0078实施例十四依维莫司的反相制备色谱纯化0079根据实施例九相同的方法将洗脱剂换成乙腈水乙酸604005体积比收集产物二氯甲烷提取、干燥、浓缩干得依维莫司，收率74，产品纯度大于99。0080实施例十五依维莫司的反相制备色谱纯化0081根据实施例九相同的方法将洗脱剂换成乙腈水6040体积比收集产物二氯甲烷提取、干燥、浓缩干得依维莫司，收率75，产品纯度大于99。0082实施例十六依维莫司的反相制备色谱纯化0083根据实施例九相同的方法将洗脱剂换。

28、成乙腈四氢呋喃水501040体积比收集产物二氯甲烷提取、干燥、浓缩干得依维莫司，收率73，产品纯度大于99。0084实施例十七依维莫司的反相制备色谱纯化0085根据实施例九相同的方法将填料换成350G粒径10M，孔径的反相C8硅胶，用乙腈水6040的混合溶剂洗脱，收集产物浓缩干得依维莫司，收率70，产品纯度大于99。0086实施例十八依维莫司的反相制备色谱纯化0087根据实施例九相同的方法将填料换成250G粒径20M，孔径的反相C18填料，用乙腈水6040的混合溶剂洗脱，收集产物浓缩干得依维莫司，收率68，产品纯度大于99。0088实施例十九依维莫司的反相制备色谱纯化0089根据实施例十一相同的方法将填料换成250G粒径20M，孔径的反相C8硅胶填料，用乙腈水6040的混合溶剂洗脱，收集产物浓缩干得依维莫司，收率65，产品纯度大于99。0090实施例二十雷帕霉素的反相制备色谱纯化0091根据实施例九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九相同的方法将粗品依维莫司替换成雷帕霉素，制备得到的雷帕霉素纯度大于99。0092实施例二十一泰姆西罗莫司的反相制备色谱纯化0093根据实施例九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九相同的方法将粗品依维莫司替换成泰姆西罗莫司，制备得到的泰姆西罗莫司纯度大于99。说明书CN102464668A10。