牦牛冻精制作方法 【技术领域】
本发明涉及动物的冻精制作方法，特别是涉及牦牛冻精的制作方法。
背景技术
牦牛是我国优秀的牛类品种，而九龙牦牛又是我国最优秀的肉用型牦牛品种，它以体形硕大、产肉性能良好，遗传性能稳定而驰名中外。但九龙牦牛在混群放牧中容易产生近亲繁殖，使其优良基因流失，另外活牛引种成本高，野性带来的管理困难和利用年限短。近三十年来用冷冻精液进行人工授精已成为家畜繁殖和品种保护的一门先进技术，而牦牛精液的冷冻保存始终是一个空白。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题是提供一种牦牛冻精制作方法。
本发明的牦牛冻精制作方法的步骤如下：1)配制稀释液；2)稀释；3)平衡；4)滴冻。
本发明的有益效果是：采用本发明制作出来的牦牛冷冻精液，解冻后活率均在0.3-0.5之间，用此精液进行人工授精配怀率高，能有效提高牦牛特别是九龙牦牛质量，扩大九龙牦牛优秀个体数量，加快选育进程，防止九龙牦牛和其它地区牦牛的杂交，并克服活畜引种造成的生态和饲养管理方面的困难。
【具体实施方式】
采精制冻用公牛要求特级或一级以上种公牛，按常规方法采集种公牛的精液，并对精液进行常规检查。包括：
(一)一般直观检查
1、色泽：正常的精液为乳白色或略带黄色，凡是淡黄色、褐色或黄绿色均不能使用。
2、气味：正常的精液无味或略呈青草腥味。
3、外形：良好的精液用肉眼观察时，可看到精液有“云雾”或“旋风”式的活动状
(二)精子活力测定
1、取精液滴于载坡片上，加上盖坡片，置于显微镜下在37-38℃检查精子运动状况，并估计前进运动的精子占整个视野内精子的百分数。如全部精子呈直线运动为1级，如其中90％的精子呈直线运动，则评为0.9级，依此类推，如牦牛精子密度较大，可稀释后评定。
2、计算精子活率
1)计算一定方格内死精子和非前进运动的精子数。
将盖玻片推盖在计数板上，使其互相粘连呈密合状态，先用低倍镜找到计算室(方格)，用红血球稀释管吸取公牛精液到刻度0.5处，擦去管端附着的精液，而后吸至膨大部，再吸入0.9％NaCL溶液到刻度101处(即将原精液稀释成200倍)，以拇指和中指紧按两端，充分摆动混匀。弃掉稀释管内最初两滴，然后将管中已稀释好地精液滴1滴在盖玻与计算板之间的空隙边缘，使液体弥散至计算室中，放大200-400倍进行观察，计算一定方格内死亡、颤动、作圆圈运动的精子数，即死精子和非前进运动的精子数。
2)计算相同方格内精子总数
将上述盖玻片和计数板放于恒温干燥箱内于100℃加热2分钟，使精子全部死亡，计算精子总数。
3)计算精子活率
精子活率＝(总精子数-死精子和非前进运动精子数)/总精子数
(三)精子密度检查
1、目测
取原精液用点滴压片法检测精子密度，可粗略分为密、中、稀三级。如在多个视野中看不到精子，可评为“无”或“0”。
2、计算
将盖玻片推盖在计算室上，使其互相粘连呈密合，先用低倍镜找到计算室后，以血球稀释管准确吸取公牛精液至刻度0.5处，用纱布擦去管端附着的精液，然后将此精液吸至膨大部，再吸入3％NaCL溶液至刻度11处，充分摇动，混合均匀，弃掉管内最初几滴，然后滴1滴稀释的精液在计算器盖玻片边缘，待其自行进入计算室内(滴加精液不能过多或过少，不能使计算室内产生气泡)，放大200-400倍计数。计算5个中方格内的精子数，四角各查一个，中间再查一个，而后推算1毫升原精内的精子数。
计算公式：
1毫升精液中精子数＝(X/80)×400×10×1000×稀释倍数＝X×500000×稀释倍数
其中：X为五个中方格(80个小方格)的精子数。400为一个大方格，即1平方毫米内有400个小方格。10为盖玻片与计数的实际高度(1/10毫米)。1000为一立方毫米。稀释倍数：200倍(以取精液0.5处至101处为稀释200倍)。100倍(以取精液1.0处至101处为稀释100倍)。
(四)精子畸形率的测定
1、方法
以玻璃棒沾1滴精液于洁净载玻片的一端，另一载玻片以30°角从载玻片的另一端拖向精液，使其边缘与精液充分接触后向反方向推去，制成均匀的精液抹片。抹片不宜太厚，精液可预先在载坡片上滴上生理盐水稀释。当抹片自然干燥后，以0.5％龙胆紫酒精溶液滴数滴染色3分钟，也可用红(蓝)墨水染色。再用蒸馏水缓慢冲去染料，待干燥后即可镜检。
2、畸形率的计算
将抹片置于高倍镜下(400-600倍)检查500个精子以上，计算其中畸形精子所占比例。其中畸形精子是指：核厚帽、赤道板、顶体损害等不正常精子。
计算公式：畸形率＝畸形精子数/精子总数×100％
在35-38℃条件下镜检精子活力达0.7以上、每毫升精液精子数达8亿以上和畸形率为15％以下者可用于冷冻保存。畸形率过高会影响受胎率。
牦牛的冻精制作方法：
1、配制稀释液
1)稀释液的几种配方：
A、10％或12％蔗糖液75毫升，卵黄20毫升，甘油5毫升。
B、11％或12％乳糖液75毫升，卵黄20毫升，甘油5毫升。
C、2.9％柠檬酸钠液75毫升，卵黄20毫升，甘油5毫升。
D、7.5％或8.0％葡萄糖液75毫升，卵黄20毫升，甘油5毫升。
以上几种配方均可加入青毒素1000单位/毫升或(和)链毒素1000微克/毫升，加入后效果会更好。
2)配制方法
A、准确称取所需盐类物质(蔗糖、乳糖、柠檬酸钠或葡萄糖)。
B、将称取好的盐类物质放入量杯中，加入蒸馏水，搅拌促溶形成需要浓度的盐溶液。
C、将盐溶液用滤纸或棉球过滤，盛于玻璃瓶中，塞上瓶塞，在瓶塞中央插入一根注射针头，在瓶外对准液面做一标记，然后进行高压或蒸煮消毒30分钟，同时消毒适量蒸馏水备用。
D、将消毒好的溶液和蒸馏水取出，观察瓶外面的标记，如液面低于标记，将消毒好的蒸馏水加至标记处。
E、消毒好的盐溶液冷却至25-30℃时，加入卵黄，并用消毒过的玻棒充分搅拌均匀，然后加入青霉素或(和)链霉素和甘油，并充分搅拌。置于2-5℃的条件下保存备用。
其中卵黄的抽取方法是：选新鲜鸡蛋，用65-75℃的酒精消毒蛋壳，然后打一小孔，排出蛋清，将蛋破壳后把卵黄盛于消毒过的平皿中，最后用消过毒的注射器插入卵黄中心，吸取需要量的卵黄，注入盐溶液中，并反复抽吸溶液以使粘糊在注射器内的卵黄全部注入盐溶液中。
2、稀释
稀释过程应在25-30℃条件下进行，精液和稀释液必须基本恒温，然后将稀释液沿瓶壁缓慢加入，再用经消毒并用稀释液冲洗后的玻棒轻轻搅拌。稀释倍数可以是2倍也可以是3倍，以使解冻后前进运动的精子数在1500万个以上为宜。
3、平衡
将稀释好的精液塞上瓶塞，用少量棉花或3-4层纱布包裹，放入冰箱或广口瓶内，在0-5℃条件下放置1-5小时，如精液稀释后过多，可分装于5-10毫升小瓶内进行平衡。
4、滴冻
1)准备
所用的玻璃器材均需消毒，凡接触精液的器具，必须用稀释液冲洗2-3次，然后置于高温烘箱中烘干备用。室内其它器具需经紫外线照射消毒5分钟以上。工作人员应穿好工作服、戴上工作帽、手套、口罩和眼镜并在紫外线下消毒15分钟。
2)制作
A、将溶氮注入滴冻专用液氮罐中，放入泡沫浮架和铜筛，使其距液氮液面在1.5-2.0厘米为宜。
B、用镊子按压铜筛浸入液氮中L-2分钟。
C、用吸管吸取平衡后的精液均匀地滴在铜网上，每处滴一滴(基本上是每毫升稀释后的精液滴10滴，制成0.1毫升/滴的颗粒精液)。滴满之后，静置3-5分钟，用镊子捡起颗粒冻精，然后置于浸过液氮的纱布内，封好结口，迅速放入集精小提桶中浸入液氮罐中保存，或直接放入小提桶中保存。
在使用上述冻精时，如采用湿解冻法解冻颗粒冻精则应配制解冻液。解冻液可采用上述稀释液的配方及配制方法。其解冻步骤如下：
1)取已配制好的解冻液1毫升，置于消毒过并用解冻液冲洗2-3次的小瓶中或小试管中。
2)将试管放入40-42℃的温水中加温，使解冻温度为38-40℃。
3)用镊子取一粒冻精，迅速放入解冻液中，并轻轻晃动，使其迅速解冻。
上述方法可用于输精时的解冻和解冻检查。
实施例1：
在九龙县洪坝乡牧场选择了3头种公牛，并对其进行了父母系和后裔调查，体尺、外貌测定，详见表1。
表1：采精用九龙牦牛体尺、体重测定表编号 年龄 体高 体长 胸围 胸深 胸宽 管围 体重1 6 133.50 140.25 183.00 69.25 40.35 19 328.192 5 127.60 135.50 173.25 65.75 35.80 18 284.703 4 130.56 137.60 180.30 66.00 37.70 18 301.30
单位：cm、kg
技术人员经过30多天努力达到了采精目的，精液各项技术指标均达到要求，解冻后活力均在0.3-0.5之间，详见表2。其中畸形率测定用0.5％刚果红酒精溶液对精液抹片染色计算。
表2：九龙牦牛采精记录表 编号 年龄 射精量(毫升) 颜色气味PH值 密度 (亿个/ 毫升) 活率 畸形率 ％备注 一次 二次 三次 1 4.5 1.0 0.9 0.9 黄白腥味6.2 14.8 0.5 15.9活力不足 2 5 0.8 乳白无6.6 15.4 0.80 12.4鲜精平衡用 1 4.5 1.0 乳白无6.5 15.3 0.75 11.4 2 5 2.5 0.5 乳白无6.5 15.5 0.80 12.6 1 4.5 1.5 乳白无6.8 15.4 0.80 13.7 2 5 1.5 1.3 乳白无6.5 15.0 0.75 12.0 3 5 2.2 乳白无6.5 15.0 0.90 12.2 1 4.5 1.0 0.5 0.5 乳白无6.5 15.0 0.75 12.2 2 5 1.0 乳白无6.7 15.3 0.80 12.8 1 4.5 1.0 0.5 乳白无6.7 14.8 0.85 12.0 2 5 2.0 乳白无6.5 15.1 0.85 12.5 合计 20.6
将上面采集到的精液按照本发明的方法制作成了冷冻精液颗粒，祥见表3，其中稀释液采用葡萄糖-卵黄液。
表3：九龙牦牛冷冻精液(颗粒)品质检查编号 年 龄 原精 活率稀释倍数 平衡 后活 率 滴冻 颗粒 数 解冻 后活 率 密度(亿 个/毫升) 畸形 率％备注1 4.5 0.803 0.60 42 0.35 5.3 13.5活力不足
2 5 0.80鲜精平衡用1 4.5 0.90 3 642 5 0.75 3 0.60 1361 4.5 0.80 3 0.65 96 0.40 5.2 13.32 5 0.85 3 0.70 179 0.45 5.1 12.63 5 0.85 3 0.65 138 0.35 5.2 14.21 4.5 0.80 3 0.70 95 0.50 5.3 12.72 5 0.85 3 0.65 60 0.40 5.2 13.41 4.5 0.90 3 0.70 93 0.45 5.2 12.52 5 3 124合计 1027
结果表明：各项技术指标均达到要求，解冻后活率均在0.3-0.5之间。
实施例2：
在九龙县汤古乡牧场选取3头种公牛，采精15次，成功10次，符合制作冻精要求的8次，共制作颗粒冻精689粒，详见表4。其中畸形率的测定用0.5％龙胆紫酒精溶液对精液抹片染色计算。编号1的牦牛年龄为3.5岁，编号2的年龄为8岁，编号3的年龄为5岁。
表4：九龙牦牛采精记录表编号 射精量 (毫升)颜色气味PH值密度(亿个/毫升)活率 畸形率％备注 一次二次1 2.0淡红腥味有血尿液2 2.5乳白无0.80有污物3 3.0乳白无6.515.30.75 11.4不慎损失1 1.8乳白无6.515.50.80 12.62 2.0乳白无6.815.40.80 13.73 2.51.8乳白无6.515.00.90 12.2
11.5淡黄无6.5 15.00.75 12.0 有异物11.10.5乳白无6.5 15.00.75 12.222.5乳白无6.7 15.30.80 12.833.01.5乳白无6.7 14.80.85 12.022.0乳白无6.5 15.10.85 12.532.5乳白无6.5 15.00.80 11.821.8乳白无6.5 15.20.85 12.333.01.8乳白无6.5 14.50.90 11.512.0乳白无6.5 15.4 不慎导致 集精管破 损合计33.2 5.6
用上面采集到的精液按照本发明的共制作颗粒冻精689粒，但由于公路塌方，未能及时补充液氮，损失冻精300余粒，获得冻精292粒。详见表5。其中稀释液采用蔗糖一卵黄液。
表5九龙牦牛冷冻精液(颗粒)品质检查编号原精活率 稀释 倍数 平衡后 活率 滴冻颗粒数 解冻后活率 解冻后密度 (亿个/毫升) 畸形率％10.80 2 0.60 5L 0.35 5.3 13.520.80 2 0.65 65 0.40 5.3 14.230.90 2 精液平衡时，不慎进水。10.75 2 0.60 滴冻时被拌倒。20.80 2 0.65 83 0.40 5.2 13.330.85 2 0.70 130 0.45 5.1 12.620.85 2 0.65 70 0.35 5.2 14.230.80 2 0.70 80 0.50 5.3 12.720.85 2 0.65 50 0.40 5.2 13.430.90 2 0.70 160 0.45 5.2 12.5合计 689
实施例3：
选取康定县榆林乡雅嘉梗牧场的3头种公牛，共采精25头次，采精成功20次，符合制作冻精要求的17次，共制作颗粒冻精1027粒，其中42粒不符合配种要求，获得符合配种要求的冻精985粒。