联苄类化合物13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D及其提取分离方法与应用 【技术领域】
本发明涉及一种联苄类化合物及其提取分离方法与应用，尤其涉及一种联苄类化合物13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D(13，13’-O-isoproylidenericcardin)及其由苔纲地钱属植物地钱中提取分离的方法与其在制备抗真菌药物中的应用。
背景技术
联苄类化合物多见于苔藓植物中，在结构上以C6-C2-C6母核及其二聚体存在，以苯环之间连接方式不同而分为不同结构类型，通常根据植物来源命名；因苯环取代基的不同而产生众多化合物，根据所属的结构类型依次命名，如地钱素B-H，J-L，片叶苔素C，异片叶苔素C等(Susanne F.，Ulrich HM.，Brigirle DN.，et al Biosynthesis ofCyclic Bisbibenzyls in Marchantia polymorpha.Phytochemistry，2001，50(4)：589-598.)。到目前为至，已从苔类植物中获得联苄类化合物80多个，但是，未见有关在联苄结构上有异丙叉基取代的报道。
目前，由于天然来源的抗真菌化合物较少，人们在开发新药以及利用天然原料提取新药方面作了许多的工作，试图找到具有较强的抗真菌作用，克服合成抗菌药物耐药性的、结构新颖的新型化合物，然而，在检索的诸多报道中，还未见有关13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D(13，13’-O-isoproylidenericcardin)的报道。
【发明内容】
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种联苄类化合物13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D(13，13’-O-isoproylidenericcardin)及其由苔纲地钱属植物地钱中提取分离的方法与其在制备抗真菌药物中的应用。
本发明的化合物用下述通式(I)表示：
本发明的化合物命名为13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D(13，13’-O-isoproylidenericcardin)，分子式为C31H28O4，分子量为464；熔点为235～237℃；呈无色针状结晶；硅胶薄层层析显示Rf＝0.65～0.85，喷三氯化铁-铁氰化钾显色剂显蓝色；HREI-MS：[M]+464.1985，计算值464.1687；EI-MS(Rel.Int)：464(100)，449(5)，421(2)，265(2)，251(37)，239(3)，213(40)，211(26)，195(7)，181(3)，165(6)，152(2)，107(13)，105(5)，91(7)，77(4)；1HNMR高场区存在两个呈单峰的甲基信号，与110～115ppm的一季碳信号存在HMBC相关，为异丙叉基的特征。其余28个碳原子在碳谱上的信号分布为δ110-δ160区24个，δ36-δ39区4个，呈现双联苄类化合物的典型特征。
本发明的化合物羽苔素E地制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)制备乙醚总提物：将干地钱(Marchantia polymorpa L.)粉碎，加入5～10倍地钱体积的乙醚，于20℃～35℃条件下浸泡4～7天，常压过滤，收集乙醚提取液I，重复3～6次，合并提取液I；将提取后的药渣用其2～4倍量的甲醇于20℃～35℃条件下，浸泡3～5次，每次2～3天，常压过滤，收集甲醇提取液，合并，旋转蒸发仪50℃～70℃，真空度0.09Mpa条件下，减压浓缩得甲醇浸膏，用相当于浸膏2～5倍量的乙醚萃取浸膏2～4次，收集、合并乙醚萃取液II；将上述I、II两部分乙醚液合并，于50℃～70℃条件蒸馏至流浸膏，自然挥干，得乙醚总提物；
(2)分离：将上述乙醚总提物用其1～3倍量的200～300目的硅胶拌样，进行硅胶柱层析(200～300目，6×15cm)，以石油醚-丙酮系统按常规比例梯度洗脱(100％石油醚～50％石油醚)，在石油醚∶丙酮为90～98∶2～10洗脱部分用硅胶薄层层析检测，其中展开剂为石油醚∶丙酮＝6∶4；显色剂为三氯化铁-铁氰化钾溶液，合并收集Rf＝0.65～0.85相同流份，以常规方法浓缩至成浸膏；
(3)纯化。将上述浸膏进行Sephadex LH-20(3×50cm)层析，以氯仿∶甲醇＝1∶1的溶液洗脱，洗脱液用硅胶薄层层析检测，其中展开剂为石油醚∶丙酮＝6∶4；显色剂为三氯化铁-铁氰化钾溶液，合并收集Rf＝0.65～0.85相同流份，以常规方法浓缩析出结晶，干燥得13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D。
其中，上述三氯化铁-铁氰化钾溶液是1％三氯化铁与2％铁氰化钾溶液等体积混合溶液。
其中，步骤(2)所述石油醚∶丙酮优选为95∶5。
本发明的化合物13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D在制备抗菌药物中的应用，尤其是涉及在制备抗真菌药物中的应用。
采用本发明的化合物13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D进行抗菌活性实验表明：该化合物具有较强的抗真菌作用，且由于其结构新颖，在天然新药开发中具有良好应用前景。
利用本发明涉及的13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D采用TLC(薄层层析)生物自显影法进行抗菌活性测试：无菌条件下，用取菌环将白色念珠菌(Candida allbicans)接种于常规肉汤琼脂培养基(蛋白胨，氯化钠，牛肉膏，营养琼脂)，恒温培养至测试浓度(约107CFU/mL)。样品TLC法展开，待薄层板上的溶剂完全挥干后，紫外灭菌，将菌培养液均匀的涂抹在薄板上，恒温培养，观测其抑菌斑。用MTT(四唑盐)溶液显色5分钟后，观测其抑菌斑。结果表明13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D显示较强抗菌活性。
本发明的化合物为新的少见的联苄类接异丙叉基的化合物，利用本发明的从地钱植物中提取分离化合物13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D的方法，提取产率较高，所获得化合物纯度达98％以上，抗菌活性实验表明该化合物具有较强的抗真菌作用，虽然活性不及合成抗菌药硝酸咪康唑，但天然来源的抗真菌化合物比较少见，引起耐药的可能性较小，在目前合成抗菌药物耐药严重的环境下，采用本发明的化合物13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D具有良好的开发、利用和发展前景，同时也为研究开发新的抗菌药物提供先导化合物开辟了一个新的途径。
【附图说明】
图1 13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D的1HNMR谱图
图2 13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D的13CNMR谱图
图3 13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D的1H-1HCOSY谱图
图4 13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D的HMBC谱图
图5 13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D的HMQC图谱
图6 13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D的EI-MS谱图
图7 TLC生物自显影法进行抗菌活性测试最小抑菌浓度(MID)试验结果：
其中：A图为硝酸咪康唑，从第三个点开始出现抑菌斑，表明MID为0.01μg；
B图为13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D，从第三个点开始出现抑菌斑，表明MID为0.4μg。
【具体实施方式】
实施例1：
将采自四川省峨嵋山海拔1000-1500米地区的地钱(Marchantia polymorpa L.)自然阴干粉碎得8.95Kg，用8倍地钱体积的乙醚28℃浸泡5天，常压过滤，收集乙醚提取液I，重复4次，合并提取液I。将最后一次提取后的药渣用3倍量甲醇28℃浸泡4次，每次3天，常压过滤，收集甲醇提取液，合并，旋转蒸发仪60℃，减压(真空度0.09Mpa)浓缩得甲醇浸膏，用相当于浸膏3倍量的乙醚萃取浸膏3次，收集、合并乙醚萃取液II，将I、II两部分乙醚液合并后于60℃条件蒸馏至流浸膏，自然挥干，得乙醚总提物。将上述乙醚总提物用其2倍量的200～300目的硅胶拌样，进行硅胶柱层析(青岛海洋化工生产200～300目，6×15cm)，石油醚-丙酮系统常规比例梯度洗脱(100％石油醚～50％石油醚)，在石油醚-丙酮(95∶5)洗脱部分用硅胶薄层层析(展开剂，石油醚∶丙酮＝6∶4；显色剂，三氯化铁-铁氰化钾溶液)检测，合并收集Rf＝0.65～0.85相同流份，以常规方法浓缩至成浸膏。将所得浸膏进行Sephadex LH-20(3×50cm)层析，以氯仿∶甲醇＝1∶1的溶液洗脱，洗脱液用硅胶薄层层析检测，其中展开剂为石油醚∶丙酮＝6∶4；显色剂为三氯化铁-铁氰化钾溶液(所述三氯化铁-铁氰化钾溶液是1％三氯化铁与2％铁氰化钾溶液等体积混合溶液)，合并收集Rf＝0.65～0.85相同流份，以常规方法浓缩析出结晶，干燥得13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D 5.9mg。
该化合物为无色针状结晶，mp：235.8-236.3℃，TLC(石油醚∶丙酮＝6∶4)Rf＝0.77，三氯化铁-铁氰化钾溶液显蓝色。
HREI-MS：[M]+464.1985，计算值464.1987，分子式为C31H28O4。1HNMR高场区存在两个呈单峰的甲基信号，与110～115ppm的一季碳信号存在HMBC相关，为异丙叉基的特征。其余28个碳原子在碳谱上的信号分布为δ110-δ160区24个，δ36-δ39区4个，呈现双联苄类化合物的典型特征。
1HNMR显示出13个芳氢信号具备四种不同取代苯环上芳氢的裂分特征(见下式A～D结构片断)，饱和区质子信号的耦合关系显示两组相邻亚甲基特征(见下式E-F)。
HMBC中δ33.76与δ7.31远程耦合，δ37.49与δ6.72和δ5.14有耦合，δ37.96与δ6.88和δ6.11远程耦合。从而可将下式中的A与D，B与C分别通过相连的亚甲基连接。
33.76 39.04 37.49 37.96
E F
HMBC中δ7.10与δ113存在远程耦合，δ1.58和δ1.55分别与δ151.1和δ151.4有远程耦合，最终而得出下式整体结构G。
EI-MS(Rel.Int)：464(100)，449(5)，421(2)，265(2)，251(37)，239(3)，213(40)，211(26)，195(7)，181(3)，165(6)，152(2)，107(13)，105(5)，91(7)，77(4)都能得到合理的解释，其可能的裂解途径如下式所示。
经查阅文献，此化合物的母核为片页苔素D，检索CA等相关文献，没有发现该化合物，确定该化合物为新化合物，命名为13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D(13，13′-O-isoproylidenericcardin D)。
本发明化合物13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D鉴定中涉及的MS、1HNMR、13CNMR、1H-1HCOSY、HMBC、HMQC图谱见附图1-6。
1H-NMR数据见表1，13C-NMR数据见表2。
表1 13，13’-O-异丙叉基片页苔素D的1H(CDCl3，600MHz)
序号 1H(ppm) 序号 1H(ppm)
2 6.78(m) 2′
3 6.96(m) 3′ 5.14(d，J＝1.80Hz)
5 6.54(m) 5′ 6.71(dd，J＝8.0，1.8Hz)
6 6.56(m) 6′ 6.90(d，J＝8.0Hz)
7 2.72(m)，2.97(m)， 7′ 2.92(m)，2.49(m)
8 3.18(m) 8′ 3.01(m)，2.41(m)
10 7.31(dd，J＝7.8，1.5Hz) 10′ 6.88(dd，J＝7.9，1.8Hz)
11 7.34(d，J＝7.8Hz) 11′ 7.10(d，J＝7.9Hz)
12 6.96(dd，J＝7.8，1.5Hz)
14′ 6.11(d，J＝7.80Hz)
R-CH3 1.45(3H，s)
R-CH3 1.58(3H，s)
表2 13，13’-O-异丙叉基片页苔素D的13C-NMR数据(CDCl3，150MHz)
序号 13C(ppm) 序号 13C(ppm)
1 152.42 1′ 143.41
2 122.35 2′ 146.40
3 130.27 3′ 115.95
4 139.17 4′ 132.64
5 128.85 5′ 121.90
6 122.13 6′ 114.88
7 39.04 7′ 37.49
8 33.79 8′ 37.96
9 142.06 9′ 141.31
10 128.04 10′ 123.97
11 128.32 11′ 130.71
12 121.09 12′ 130.27
13 151.45 13′ 151.12
14 133.11 14′ 125.88
R-CH3 24.89 113.93
R-CH3 24.89
实施例2：
将采自四川省峨嵋山海拔1000-1500米地区的地钱(Marchantia polymorpa L.)自然阴干粉碎得9.50Kg，用5倍地钱体积的乙醚23℃浸泡4天，常压过滤，收集乙醚提取液I，重复6次，合并提取液I；将最后一次提取后的药渣用2倍量甲醇35℃浸泡5次，每次2天，常压过滤，收集甲醇提取液，合并，旋转蒸发仪70℃，减压(真空度0.09Mpa)浓缩得甲醇浸膏，用相当于浸膏2倍量的乙醚萃取浸膏4次，收集、合并乙醚萃取液II，将I、II两部分乙醚液合并后于70℃条件蒸馏至流浸膏，自然挥干，得乙醚总提物。将上述乙醚总提物用其1倍量的200目的硅胶拌样，用硅胶柱层析(200目，6×15cm)石油醚-丙酮系统常规比例梯度洗脱(100％石油醚～50％石油醚)，在石油醚-丙酮(98∶2)洗脱部分用硅胶薄层层析(展开剂，石油醚∶丙酮＝6∶4；显色剂，三氯化铁-铁氰化钾溶液)检测，合并收集Rf＝0.65～0.85相同流份，以常规方法浓缩至成浸膏。将所得浸膏进行Sephadex LH-20(3×50cm)层析，氯仿-甲醇(1∶1)洗脱，洗脱液用硅胶薄层层析检测，其中展开剂为石油醚∶丙酮＝6∶4；显色剂为三氯化铁-铁氰化钾溶液(所述三氯化铁-铁氰化钾溶液是1％三氯化铁与2％铁氰化钾溶液等体积混合溶液)，合并收集Rf＝0.65～0.85相同流份，以常规方法浓缩析出结晶，干燥得13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D 6.2mg。
实施例3：
将采的地钱(Marchantia polymorpa L.)自然阴干粉碎得8.25Kg，用10倍地钱体积的乙醚35℃浸泡7天，常压过滤，收集乙醚提取液I，重复3次，合并提取液I。将最后一次提取后的药渣用4倍量甲醇室温浸泡3次，每次2天，常压过滤，收集甲醇提取液，合并，旋转蒸发仪50℃，减压(真空度0.09Mpa)浓缩得甲醇浸膏，用相当于浸膏5倍量的乙醚萃取浸膏2次，收集、合并乙醚萃取液II，将I、II两部分乙醚液合并后于50℃条件蒸馏至流浸膏，自然挥干，得乙醚总提物。将上述乙醚总提物用其3倍量的300目的硅胶拌样，用硅胶柱层析(300目，6×15cm)石油醚-丙酮系统常规比例梯度洗脱(100％石油醚～50％石油醚)，在石油醚-丙酮(90∶10)洗脱部分用硅胶薄层层析(展开剂，石油醚∶丙酮＝6∶4；显色剂，三氯化铁-铁氰化钾溶液)检测，合并收集Rf＝0.65～0.85相同流份，以常规方法浓缩至成浸膏。将所得浸膏进行Sephadex LH-20(3×50cm)层析，氯仿-甲醇(1∶1)洗脱，洗脱液用硅胶薄层层析检测，其中展开剂为石油醚∶丙酮＝6∶4；显色剂为三氯化铁-铁氰化钾溶液(所述三氯化铁-铁氰化钾溶液是1％三氯化铁与2％铁氰化钾溶液等体积混合溶液)，合并收集Rf＝0.65～0.85相同流份，以常规方法浓缩析出结晶，干燥得13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D 5.4mg。
实施例4：
无菌条件下，用取菌环将白色念珠菌(Candida allbicans)接种于肉汤琼脂培养基(蛋白胨，氯化钠，牛肉膏，营养琼脂)，30℃恒温培养1周，菌浓度达到107CFU/mL。将13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D配制如表3的系列梯度浓度，以硝酸咪康唑(表4)作为对照品，样品经TLC展开(石油醚∶丙酮＝6∶4)，待薄板上的溶剂完全挥干后，紫外灭菌30分钟，将菌培养液均匀的涂抹在薄板上，30℃恒温培养36小时，用2.5mg/mL的MTT溶液显色，5分钟后，观测其抑菌斑。
实验结果：13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D抗白色念珠菌的MID为0.4μg，阳性对照硝酸咪康唑的MID为0.01μg(见附图7)。
表3 13，13’-O-异丙叉基片叶苔素D点样量
F1 F2 F3 F4 F5 F6
C(μg/μl) 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
点样量(μg) 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1
表4 硝酸咪康唑点样量
A1 A2 A3 A4 A5 A6
C(μg/μl) 0.0025 0.00375 0.005 0.00625 0.0125 0.025
点样量(μg) 0.005 0.0075 0.01 0.0125 0.025 0.05