还原型吡咯并喹啉醌的制造方法 参照相关申请
本专利申请享受 2010 年 2 月 16 日提出的日本申请特愿 2010 － 31637 的优先权。 该在先申请中的全部公开内容通过引用作为本说明书的一部分。
技术领域 本发明涉及还原型吡咯并喹啉醌的制造方法以及由该制造方法得到的还原型吡 咯并喹啉醌。本发明还涉及还原型吡咯并喹啉醌的稳定化方法。
背景技术 吡咯并喹啉醌 （以下， 有时表述为 “PQQ” ） 被提出可能成为新的维生素而备受瞩目 （非专利文献 1） 。 而且， PQQ 不限于细菌， 也存在于真核生物的霉菌、 酵母， 作为辅酶发挥着重 要的作用。另外， 关于 PQQ， 近年来已知其细胞的增殖促进作用、 抗白内障作用、 肝脏疾病预 防治疗作用、 创伤治愈作用、 抗过敏作用、 逆转录酶抑制作用和乙二醛酶 I 抑制作用－抗癌 作用等多种生理活性。该 PQQ 类能够通过有机化学的合成法 （非专利文献 2） 和发酵法 （专 利文献 1） 等制造。
有报告指出还原型 PQQ 与现有的 PQQ 相比其抗氧化活性非常高 （非专利文献 3） ， 是能够有效用作营养功能食品、 特定保健用食品、 营养辅助剂、 营养剂、 饮料、 饲料、 动物药、 化妆品、 医药品、 治疗药、 预防药等的化合物。有报告指出还原型 PQQ 可以通过使用硼氢化 钠、 连二亚硫酸钠等一般的还原剂将氧化型 PQQ 还原而得到 ； 通过铂催化剂进行氢还原而 得到 ； 通过谷胱甘肽进行还原而得到 （非专利文献 3、 4、 5） 。但是， 一般的还原剂对生物体显 示毒性的可能性高， 需要将其除去的工序。另外， 在使用催化剂时， 由于使用容易泄露且容 易爆炸的氢， 所以需要特别的设备。利用谷胱甘肽的还原虽然安全性高、 易于使用， 但问题 在于谷胱甘肽的价格高。因此需求安全性高、 简便、 且低成本的方法。
此外， 作为具有将物质还原的作用的物质， 抗坏血酸广为人知。因此， 作为具有抗 氧化活性的组合物， 提出了 PQQ 与抗坏血酸的组合的方案， 但如非专利文献 3 中的记载， 由 于 PQQ 的还原体比抗坏血酸的抗氧化活性高， 可以认为利用抗坏血酸的还原困难。另外还 原型 PQQ 容易被分子氧氧化为氧化型 PQQ。因此， 保存方法也需要对策。
现有技术文献
专利文献
专利文献 1 ： 日本特开平 1 － 218597 号公报
非专利文献
非专利文献 1 ： nature,vol.422,24,April,3003,p832
非专利文献 2 ： JACS， 第 103 卷， 第 5599 ～ 5600 页 （1981）
非专利文献 3 ： J.Agric.Food Chem.2009,57,450-456
非专利文献 4 ： Bull.Chem.Soc.Jpn,59,1911-1914(1986)
非专利文献 5 ： Eur.J.Biochem.118,395-399(1981)
发明内容 发明所要解决的课题
本发明的发明人发现从将 pH4 以下的吡咯并喹啉醌溶液和抗坏血酸溶液混合得 到的 pH3.5 以下的溶液中， 能够以高收率得到还原型吡咯并喹啉醌。本发明是基于该见解 得到的。
本发明的目的在于提供安全性高、 简便、 低成本的还原型吡咯并喹啉醌的制造方 法、 以及通过该制造方法得到的还原型吡咯并喹啉醌。本发明的目的还在于提供还原型吡 咯并喹啉醌的稳定化方法。
用于解决课题的方法
根据本发明， 提供以下的发明。
（1） 一种还原型吡咯并喹啉醌的制造方法， 其包括 ： 将调节为 pH4 以下的吡咯并喹 啉醌或其盐的溶液与抗坏血酸类似物混合， 得到含有还原型吡咯并喹啉醌的 pH 3.5 以下 的溶液的工序。
（2） 根据 （1） 所记载的制造方法， 吡咯并喹啉醌或其盐的溶液为水溶液。
（3） 根据 （1） 或 （2） 所记载的制造方法， 吡咯并喹啉醌或其盐的溶液的 pH 为 2 ～ 3.5。
（4） 根据 （1） 所记载的制造方法， 吡咯并喹啉醌或其盐与抗坏血酸类似物的摩尔比 为 1:0.5 ～ 1000。
（5） 根据 （1） 所记载的制造方法， 抗坏血酸类似物选自抗坏血酸、 鼠李糖型抗坏血 酸、 阿拉伯糖型抗坏血酸、 葡萄糖型抗坏血酸、 岩藻糖型抗坏血酸、 葡庚糖型抗坏血酸、 木糖 型抗坏血酸、 半乳糖型抗坏血酸、 古洛糖型抗坏血酸、 异抗坏血酸、 红抗坏血酸、 6 －脱氧抗 坏血酸、 以及它们的酯体和盐。
（6） 根据 （1） 所记载的制造方法， 还包括从溶液中分离还原型吡咯并喹啉醌的工序。 （7） 通过 （1） ～ （6） 中记载的制造方法所制造的还原型吡咯并喹啉醌。
（8） 根据 （7） 所记载的还原型吡咯并喹啉醌， 作为含有抗坏血酸类似物的溶液提 供。
（9） 一种还原型吡咯并喹啉醌的稳定化方法， 包括 ： 使还原型吡咯并喹啉醌或其盐 与抗坏血酸类似物一同存在于溶剂中的步骤。
发明的效果
根据本发明， 能够安全性高、 简便、 且以低成本制造还原型吡咯并喹啉醌， 并且， 在 制造还原型吡咯并喹啉醌时不需要昂贵的设备方面有利。根据本发明， 在能够稳定保存还 原型吡咯并喹啉醌的方面也有利。
具体实施方式
根据本发明， 能够通过将 pH4 以下的吡咯并喹啉醌或其盐的溶液与抗坏血酸类似 物混合， 得到 pH3.5 以下的溶液， 从而制造还原型吡咯并喹啉醌。
在本申请说明书中， “还原型吡咯并喹啉醌” 是指下述式 （1） 所示的化合物。
在本发明中使用的吡咯并喹啉醌 （游离体） 是指式 （2） 所示的化合物。
根据本发明， 能够用抗坏血酸类似物将吡咯并喹啉醌还原而制造还原型 PQQ。本发明中所使用的吡咯并喹啉醌既可以使用吡咯并喹啉醌 （游离体） ， 也可以使用 吡咯并喹啉醌的盐。
作为本发明中所使用的 “吡咯并喹啉醌的盐” ， 可以列举吡咯并喹啉醌的碱金属 盐、 碱土金属盐、 铵盐， 但优选碱金属盐。
本发明中所使用的吡咯并喹啉醌只要是游离体、 碱金属盐就没有特别限定。特别 优选使用易于获得的游离体、 二钠体、 二钾体。
作为本发明中所使用的吡咯并喹啉醌的碱金属盐， 可以列举钠、 钾、 锂、 铯、 铷等的 盐。优选从易于获得的方面考虑， 优选钠盐和钾盐。吡咯并喹啉醌的碱金属盐中盐的取代 数为 1 ～ 3， 单碱金属盐、 二碱金属盐、 三碱金属盐均可， 优选为二碱金属盐。作为吡咯并喹 啉醌的碱金属盐， 特别优选二钠盐和二钾盐。
本发明中所使用的吡咯并喹啉醌或其盐既可以获得市售品， 也可以通过公知的方 法制造。
本发明中所使用的吡咯并喹啉醌或其盐， 可以作为吡咯并喹啉醌或其盐的溶液使 用。所使用的溶剂只要反应进行就没有特别限定， 可以将吡咯并喹啉醌或其盐溶解于水、 醇、 二甲基亚砜等的溶剂中使用， 但从即使在制品中残留也不会造成大的问题的方面考虑， 优选水 （水溶液） 。 吡咯并喹啉醌或其盐的溶液， 例如， 能够调制为 0.001 ～ 30g ／ l， 优选为 0.01 ～ 15g ／ l， 更优选为 0.1 ～ 5g ／ l。
为了有效地得到还原型 PQQ， 可以将吡咯并喹啉醌或其盐的溶液的 pH 调节为 4 以 下。另外， 为了提高吡咯并喹啉醌的溶解度， 可以调节为 1 以上。吡咯并喹啉醌或其盐的溶 液的 pH 优选为 1 ～ 4， 更优选为 1 ～ 3.5， 更加优选为 2 ～ 3.5， 进一步优选为 2 ～ 2.5。为 了调节 pH， 可以使用酸性物质 （例如盐酸等） 或碱性物质 （例如氢氧化钠等） 。
作为抗坏血酸类似物， 没有特别限制， 例如， 可以列举抗坏血酸、 鼠李糖型抗坏血 酸、 阿拉伯糖型抗坏血酸、 葡萄糖型抗坏血酸、 岩藻糖型抗坏血酸、 葡庚糖型抗坏血酸、 木糖
型抗坏血酸、 半乳糖型抗坏血酸、 古洛糖型抗坏血酸、 异抗坏血酸、 红抗坏血酸、 6 －脱氧抗 坏血酸等类似于抗坏血酸的物质。也可以是它们的酯体或盐 （例如棕榈酸酯、 硬脂酸酯、 钠 盐、 钙盐等） 。另外， 它们也可以是 L 体 （例如 L －抗坏血酸、 L －抗坏血酸钠等） 、 D体 （例如 D －阿拉伯糖型抗坏血酸、 D －阿拉伯糖型抗坏血酸钠等） 、 或者外消旋体。
进一步具体而言， 例如， 能够列举 L －抗坏血酸、 L －抗坏血酸棕榈酸酯、 L －抗坏 血酸硬脂酸酯、 D －阿拉伯糖型抗坏血酸等。
在还原型吡咯并喹啉醌的制造中， 上述抗坏血酸类似物的任意一种均使用， 但若 考虑与生成的还原型吡咯并喹啉醌的分离的容易程度等， 上述抗坏血酸类似物中， 特别优 选使用水溶性的物质。从获得容易性、 价格等的观点出发， 最优选 L －抗坏血酸、 D －阿拉 伯糖型抗坏血酸等的游离体。
本发明中所使用的抗坏血酸类似物， 既可以获得市售品， 也可以通过公知的方法 制造。
本发明中所使用的抗坏血酸类似物， 可以以抗坏血酸类似物的状态使用， 也可以 以抗坏血酸类似物的溶液的状态使用。在以溶液的状态使用抗坏血酸类似物时， 可以溶解 在水、 醇、 二甲基亚砜等溶剂中使用， 但优选以抗坏血酸类似物的水溶液的状态使用。
抗坏血酸类似物的溶液， 例如， 可以调制为 0.1 ～ 500g ／ l， 优选为 0.5 ～ 100g ／ l。
在本发明的制造方法中， “将吡咯并喹啉醌或其盐的溶液与抗坏血酸类似物混合， 得到含有还原型吡咯并喹啉醌的 pH3.5 以下的溶液” 的工序， 只要能够通过使吡咯并喹啉醌 或其盐与抗坏血酸类似物在溶剂中反应、 将吡咯并喹啉醌还原、 从而得到还原型吡咯并喹 啉醌即可， 例如， 既可以将吡咯并喹啉醌或其盐的溶液与抗坏血酸类似物的溶液混合而进 行， 也可以在吡咯并喹啉醌或其盐的溶液中添加抗坏血酸类似物而进行。
上述工序还包括如下方式 ： 给哺乳类等口服给予含有吡咯并喹啉醌或其盐和抗坏 血酸类似物的溶液， 使其在生物体内 （例如口腔、 胃、 肠） 反应。
在本说明书中， 关于 “混合” ， 既可以在一个混合对象物中添加另一个混合对象物 而进行， 也可以将混合对象物添加到其他容器中进行。
在本申请说明书， 关于 “添加” ， 既可以将添加物一下子添加到添加对象中， 也可以 缓慢添加。
在反应中， 抗坏血酸类似物与吡咯并喹啉醌或其盐的摩尔比， 考虑到吡咯并喹啉 醌或其盐与抗坏血酸类似物以等摩尔反应， 可以根据所需要的还原体的含量决定。实际上 优选使用相对于 PQQ 为 0.5 到 1000 倍摩尔的抗坏血酸类似物。在分离还原型 PQQ 时优选 为 0.9 到 10 倍。当低于该范围时， 由于还原体的含量低， 所以得不到预期的效果。虽然即 使过量添加也没有问题， 但若过多则成本增高。
在本发明的制造方法中， 吡咯并喹啉醌或其盐与抗坏血酸类似物的摩尔比， 在 溶剂中可以为 1:0.5 ～ 1000， 优选为 1:1.5 ～ 1000， 更优选为 1:1.5 ～ 100， 更加优选为 1:1.5 ～ 10。
在本发明的制造方法中， 反应温度没有特别限制， 例如， 可以为 -10℃到 180℃， 优 选为 0℃到 100℃。即使在室温下反应也充分进行。在希望进一步提高反应速度时， 优选提 高温度， 在溶解度的方面， 由于高的温度易于溶解， 所以为了提高生产率， 优选为 50℃以上。在本发明的制造方法中， 反应时间没有特别限制， 例如可以为 0.2 到 48 小时， 优选 为 0.5 ～ 24 小时。
只要反应进行则使用何种溶剂都没有关系， 但优选即使在制品中残留也不会造成 大的问题的水溶液。由于在碱性条件下反应难以进行， 因此特别优选为 pH5 以下的水溶液， 更优选为 4 以下。为了调节 pH 而加入酸或碱来调节没有特别问题， 根据需要使用即可。
在本发明的制造方法中， 反应没有特别限制， 但优选在氧的存在少的环境中进行。 为了防止还原型 PQQ 由于空气中的氧而变为氧化型， 可以按照常规方法， 在氮、 氩等的不活 泼气体中进行上述操作。 可以通过利用不活泼气体的置换、 减压、 沸腾或组合这些操作来降 低氧化反应。至少适合使用利用不活泼气体的置换、 即、 使用不活泼气体氛围。作为上述不 活泼气体， 例如可以列举氮气、 氦气、 氩气、 氢气、 二氧化碳等， 优选为氮气。
在本发明的制造方法中， 使吡咯并喹啉醌或其盐的溶液与抗坏血酸类似物反应得 到的溶液 （反应液） 的 pH， 既可以通过调节吡咯并喹啉醌或其盐的溶液的 pH 或抗坏血酸类 似物的量以达到 pH3.5 以下， 也可以经过使用酸性物质 （例如盐酸等） 或碱性物质 （例如氢氧 化钠等） 调节 pH 的工序以达到 pH3.5 以下。
得到的溶液的 pH 可以为 3.5 以下， 优选为 3 以下， 更优选为 2.8 以下， 更加优选为 2.6 以下。 本发明的制造方法具体可以如下所述实施。
以 0.01g/L 到 15g/L 的水溶液浓度准备吡咯并喹啉醌。该浓度作为进行溶解的浓 度记载， 但高于此时容易变为悬浊状态的反应。通过将抗坏血酸类以粉末或溶液在其中混 合的简单的操作反应结束。 反应温度通常为 0℃到 100℃， 反应时间依赖于温度， 可以为 0.2 到 48 小时左右。
此时， 要调节 pH 的话可以添加酸或碱。
在经过反应得到的溶液中， 最终析出还原体。得到的析出物为还原型吡咯并喹啉 醌。
本说明书中 “析出物” 是指从液相 （溶液） 中出现的固相 （固体） 。
析出物能够从溶液中分离。析出物 （析出的还原体） 可以通过过滤、 离心分离、 倾析 得到。还可以利用水或醇对其进行清洗。然后可以通过减压干燥进行干燥得到固体。或者 也可以不进行这样的分离操作而直接提供。
此外， 在要求更纯的物质时可以通过进行重结晶以提高纯度。可以通过使其溶解 于二甲基亚砜等良溶剂、 降低溶解度的操作， 具体而言通过降低温度、 添加贫溶剂、 进行浓 缩的操作进行重结晶。还可以利用柱色谱进行精制。
本发明的还原型吡咯并喹啉醌的制造方法， 由于反应在室温附近充分地进行， 所 以通过以相对于吡咯并喹啉醌或其盐含有 0.5 到 1000 倍摩尔的抗坏血酸类似物的组合物 提供， 可以在即将食用前， 在杯子等容器内使其反应， 也可以在生物体的口腔、 胃、 肠中使其 反应。
为了即使在室温下反应也能够进行， 制作相对于吡咯并喹啉醌或其盐含有 0.5 到 1000 倍摩尔的抗坏血酸类似物的组合物， 用于上述的目的与本发明的目的一致。该组合物 即使是固体、 溶液任何形态， 在口服给药后， 也成为溶液状态进行反应。
根据本发明的制造方法的优选方式， 提供一种还原型吡咯并喹啉醌的制造方法，
其包括 ： 将 pH 为 2 ～ 3.5 的吡咯并喹啉醌或其盐的溶液与抗坏血酸类似物或其溶液混合， 得到含有还原型吡咯并喹啉醌的 pH3 以下的溶液的工序。
根据本发明的制造方法的更优选的方式， 提供一种还原型吡咯并喹啉醌的制造方 法， 其包括 ： 将 pH 为 2 ～ 2.5 的吡咯并喹啉醌或其盐的溶液与抗坏血酸类似物或其溶液混 合， 得到含有还原型吡咯并喹啉醌的 pH2.6 以下的溶液的工序。
根据本发明， 提供通过本发明的制造方法所制造的还原型吡咯并喹啉醌。
由于还原型吡咯并喹啉醌容易被氧化， 所以在分离精制后的保存时， 为了防止氧 化， 需要严格的管理。 虽然为了抑制氧化只要放置在还原气氛中即可， 但通常的还原剂大多 有毒而不能使用。在本发明中， 通过制成相对于还原型吡咯并喹啉醌含有抗坏血酸 0.5 到 1000 倍摩尔的组合物， 能够抑制氧化， 即使不进行精制也能够稳定地保存， 能够直接提供。 这是本发明的制造方法的优点之一。
根据本发明， 为了稳定地保存还原型吡咯并喹啉醌， 可以将还原型吡咯并喹啉醌 以含有抗坏血酸类似物的溶液的形态提供。
在进行分离操作之后， 通过添加抗坏血酸类似物也能够生成组合物。该组合物能 够以固体、 或悬浊液、 溶液的状态提供， 从反应条件出发能够容易提供的是在水中悬浊状态 的组合物。 根据本发明， 提供一种还原型吡咯并喹啉醌的稳定化方法。本发明的稳定化方法 的特征在于， 防止还原型吡咯并喹啉醌被分子氧所氧化。 本发明的稳定化方法， 通过使还原 型吡咯并喹啉醌或其盐与抗坏血酸类似物一同存在于溶剂中， 能够使还原型吡咯并喹啉醌 稳定化。
在本发明的稳定化方法中， 还原型吡咯并喹啉醌与抗坏血酸类似物的摩尔比， 在 溶剂中为 1:0.5 ～ 1000， 优选为 1:1 ～ 500。
本发明中得到的还原型吡咯并喹啉醌的给药剂形没有特别限制， 可以根据使用用 途适当选择。 本发明的口服摄取用组合物， 作为人用或动物用， 能够以食品、 功能性食品、 医 药品或医药部外品 （Quasi drug） 使用。这里所说的功能性食品是指健康食品、 营养辅助食 品、 营养功能食品、 营养保健食品等以维持健康或者代替用餐以补给营养为目的进行摄取 的食品。作为具体的形态， 可以列举胶囊剂、 药片、 咀嚼片、 锭剂、 饮料剂等， 但不限定于这 些。
在制成功能性食品而制品化时， 可以使用食品中所使用的添加剂， 例如甜味剂、 着 色料、 防腐剂、 增粘稳定剂、 抗氧化剂、 发色剂、 漂白剂、 防菌防霉剂、 胶基、 苦味料、 酶、 光泽 剂、 酸味料、 调味料、 乳化剂、 强化剂、 制造用剂、 香料、 香辛料提取物等。一般而言也能够加 入通常的食品中， 例如味噌、 酱油、 即食酱汤、 汤面、 炒面、 咖喱、 玉米汤、 麻婆豆腐、 麻婆茄 子、 意大利面酱、 布丁、 蛋糕、 面包等。
根据本发明， 提供用于制造还原型 PQQ 的组合物。
根据本发明， 提供用于制造对于氧化的耐受性强、 能够稳定保存的还原型 PQQ 的 组合物。
根据本发明， 还提供以下的发明。
（1） 一种还原型吡咯并喹啉醌的制造方法， 在溶剂中混合吡咯并喹啉醌和抗坏血 酸。
（2） 根据 （1） 所记载的制造方法， 溶剂为水。
（3） 根据 （1） 或 （2） 所记载的制造方法， 混合液的 pH 为 5 以下。
（4） 根据 （1） ～ （3） 中任一项所记载的制造方法， 相对于吡咯并喹啉醌， 使用 0.5 到 1000 倍摩尔的抗坏血酸。
（5） 相对于吡咯并喹啉醌， 含有 0.5 到 1000 倍摩尔的抗坏血酸的组合物。
（6） 根据 （5） 所记载的组合物， 吡咯并喹啉醌为还原型。
实施例
通过实施例和比较例进一步具体地说明本发明， 但本发明不仅仅限定于这些例 子。另外， 只要没有特别说明， 本文中的％表示重量％。
在本实施例和比较例中， NMR 测定使用 JEOL 制 500MHz NMR、 JNM-ECA500 谱仪， 在 13 室温测定 C － NMR。
在本实施例和比较例中， UV 测定使用 HITACHI U － 2000Spectrophotometer 进行 测定。
还原反应确认实验
实施例 1 原料吡咯并喹啉醌二钠使用三菱瓦斯化学株式会社生产的试剂 （商品名 ： Bio PQQ） 。L- 抗坏血酸使用和光纯药生产的试剂。
将 1.53g 吡咯并喹啉醌二钠溶解在 500g 水中， 得到 0.01mol ／ l 的浓度。 将 3.51g L －抗坏血酸溶解在 100g 水中， 得到 0.2mol ／ l 的浓度。
将 0.01mol ／ l 浓度的吡咯并喹啉醌二钠溶液 （pH3.5） 20g 与 0.2mol ／ l 浓度的 L －抗坏血酸溶液 20g 混合 （pH2.5） 。相对于吡咯并喹啉醌 1， L －抗坏血酸为 20 倍的摩尔 量。在室温混合这两种溶液， 使其在 70℃反应 2 小时 （pH2.5） 。反应后， 固体析出。在该溶 液中加入盐酸， 使 pH 为 1 以下。将其以 1000rpm 离心分离 10 分钟， 弃去上清， 得到固体。将 所得到的固体用脱气的盐酸水溶液清洗， 利用氮气流进行干燥。 在其中加入重二甲基亚砜， 13 在氮气流下装入 NMR 管中， 在室温测定 C － NMR。
其结果， 为 105.7,111.0,119.4,122.9,123.6,128.1,131.3,134.2,137.8,140.9, 142.6,162.2,165.5,170.1ppm(DMSO-d6:39.5ppm 基准 )。
该值与非专利文献 5 （Eur.J.Biochem.118,395-399(1981)） 中记载的还原体一致， 确认了还原体的生成。另外， 该测定数据中不存在来自醌结构的 173.3、 178.0ppm 的峰。
比较例 1
在吡咯并喹啉醌二钠的饱和水溶液中加入盐酸， 使 pH 为 1 以下。利用过滤器过滤 析出的红色固体， 得到吡咯并喹啉醌的游离体。在其中加入重二甲基亚砜， 装入 NMR 管中， 13 在室温测定 C － NMR。
其结果， 为 113.5,124.5,126.4,127.6,129.2,134.3.136.3,146.8,148.7,160.9, 164.9,168.7,173.3,178.0ppm(DMSO-d6:39.5ppm 基准 )。与实施例 1 的峰不同， 被还原的 PQQ 应该存在的峰没有测到。
实施例 2
将 0.01mol ／ l 浓度的吡咯并喹啉醌二钠溶液 （pH3.5） 20g 和 0.2mol ／ l 浓度的 L －抗坏血酸溶液 10g 混合 （pH3） 。 相对于吡咯并喹啉醌 1， L －抗坏血酸为 10 倍的摩尔量。
将这两种溶液在室温混合搅拌。颜色立刻改变， 固体析出。在室温放置过夜后， 用 pH 试纸 测定 pH 为 3。通过离心分离 （1000rpm、 10 分钟） 取出固体， 进行减压干燥， 得到 0.073g 的 不存在氧化体的还原体含水固体。UV 谱的分析显示为还原状态。
实施例 3
将 0.01mol ／ l 浓度的吡咯并喹啉醌二钠溶液 （pH3.5） 20g 和 0.2mol ／ l 浓度的 L －抗坏血酸溶液 5g 混合 （pH3） 。相对于吡咯并喹啉醌 1， L －抗坏血酸为 5 倍的摩尔量。 将这两种溶液在室温混合搅拌。颜色立刻改变， 固体析出。在室温放置过夜后， 用 pH 试纸 测定 pH 为 3。通过离心分离 （1000rpm、 10 分钟） 取出固体， 进行减压干燥， 得到 0.044g 的 还原体固体。分离粗收率为 66％。
实施例 4
将 0.001mol ／ l 浓度的吡咯并喹啉醌二钠溶液 （pH3.5） 20g 和 0.2mol ／ l 浓度 的 L- 抗坏血酸溶液 10g 混合 （pH2） 。相对于吡咯并喹啉醌 1， L －抗坏血酸为 100 倍的摩尔 量。将这两种溶液在室温混合搅拌。颜色立刻改变， 固体析出。在室温放置过夜后， 用 pH 试纸测定 pH 为 2。通过离心分离 （1000rpm、 10 分钟） 取出固体， 进行减压干燥， 得到 0.006g 的还原体固体。
实施例 5
将 0.01mol ／ l 浓度的吡咯并喹啉醌二钠溶液 （pH3.5） 0.5g 和 0.5mol ／ l 浓度 的 L －抗坏血酸钠溶液 0.5g 混合。此时的 pH 为 6 － 7。相对于吡咯并喹啉醌 1， L －抗坏 血酸为 50 倍的摩尔量。将这两种溶液在室温混合， 将该混合溶液添加在人工胃液 10ml 中 （pH1.2） 。 在室温放置过夜， 还原体的固体析出。 通过制成酸性条件， 反应变得易于进行。 另 外， 可以认为即使在生物体内也可以被还原。
实施例 6
将 0.01mol ／ l 浓度的吡咯并喹啉醌二钠溶液 （pH3.5） 1g 和 0.011mol ／ l 浓 度的 L －抗坏血酸溶液 1g 混合 （pH2.5） 。此时的摩尔比为 1:1.1。通过在 30℃反应 8 天 （pH2.5） ， 82％的 PQQ 发生反应， 能够得到还原体含有物。
比较例 2
将 0.01mol ／ l 浓度的吡咯并喹啉醌二钠溶液 0.5g 和 0.5mol ／ l 浓度的 L －抗 坏血酸钠溶液 0.5g 在室温混合。此时的 pH 为 6 － 7。相对于吡咯并喹啉醌 1， L －抗坏血 酸为 50 倍的摩尔量。将混合液在室温放置 3 天， 在溶液中没有变化 （pH7） ， 未得到还原体。
保存试验
实施例 7
将 1.53g 吡咯并喹啉醌二钠溶解在 500g 水中， 得到 0.01mol ／ l 的浓度。 将 3.51g L －抗坏血酸溶解在 100g 水中， 得到 0.2mol ／ l 的浓度。
将上述的 0.01mol ／ l 浓度的吡咯并喹啉醌二钠溶液 （pH3.5） 20g 和 0.2mol ／ l 浓度的 L －抗坏血酸溶液 20g 在室温混合。相对于吡咯并喹啉醌 1， L －抗坏血酸为 20 倍 的摩尔量。用 pH 试纸测定， 结果 pH 为 2。使该混合溶液在室温反应一晩 （pH2） 。反应后， 还原体固体析出。在该状态下， 考虑到还原反应中所使用的量和被空气氧化的量， L- 抗坏 血酸存在 15 倍摩尔。然后， 在室温保存 1 周， 维持还原状态。
比较例 3将在实施例 6 中得到的还原体固体通过离心分离取出， 弃去上清， 用水清洗。通过 该处理， 除去了 L －抗坏血酸。在其中加入氢氧化钠水溶液达到 pH7。30 分钟后全部变化 为氧化体。
实施例 8
将 0.01mol ／ l 浓度的吡咯并喹啉醌二钠溶液 （pH3.5） 1g 和 0.014mol ／ l 浓度 的 L －抗坏血酸溶液 1g 混合。将该混合液 1g 加入 15ml 的容器中， 使其与空气接触， 结果 含有 14％的氧化型 PQQ （pH3） 。将该含有氧化型的还原型 PQQ 在 30℃放置 1 周， 含有 18％ 的氧化型 PQQ。
pH 条件确认试验
实施例 9
将吡咯并喹啉醌二钠溶解在水中， 调节为 2g ／ l。使用盐酸和 NaOH， 将水溶液的 pH 调节为 pH1 以下。另外， 将 L －抗坏血酸溶解在水中， 调节为 4g ／ l。
将上述 2 种水溶液各 0.5ml 在 1.5m 容器中混合， 在室温使其反应 24 小时。反应 后的 pH 为 1。然后， 对于得到的混合液进行离心分离 （1000rpm、 10 分钟） ， 弃去上清， 得到固 体。将得到的固体用约 9％的盐酸清洗， 溶解在二甲基亚砜中， 通过 UV 测定算出还原体收 率， 结果为 68％。 实施例 10
将吡咯并喹啉醌二钠溶解在水中， 调节为 2g ／ l。使用盐酸和 NaOH， 将水溶液的 pH 调节为 pH2.2。另外， 将 L －抗坏血酸溶解在水中， 调节为 4g ／ l。
将上述 2 种水溶液各 0.5ml 在 1.5m 容器中混合， 在室温使其反应 24 小时。反应 后的 pH 为 2.6。然后， 对于得到的混合液进行离心分离 （1000rpm、 10 分钟） ， 弃去上清， 得到 固体。 将得到的固体用约 9％的盐酸清洗， 溶解在二甲基亚砜中， 通过 UV 测定算出还原体收 率， 结果为 100％。
实施例 11
将吡咯并喹啉醌二钠溶解在水中， 调节为 2g ／ l。使用盐酸和 NaOH， 将水溶液的 pH 调节为 pH2.6。另外， 将 L- 抗坏血酸溶解在水中， 调节为 4g ／ l。
将上述 2 种水溶液各 0.5ml 在 1.5m 容器中混合， 在室温使其反应 24 小时。反应 后的 pH 为 3。然后， 对于得到的混合液进行离心分离 （1000rpm、 10 分钟） ， 弃去上清， 得到固 体。将得到的固体用约 9％的盐酸清洗， 溶解在二甲基亚砜中， 通过 UV 测定算出还原体收 率， 结果为 66％。
实施例 12
将吡咯并喹啉醌二钠溶解在水中， 调节为 2g ／ l。使用盐酸和 NaOH， 将水溶液的 pH 调节为 pH3.5。另外， 将 L －抗坏血酸溶解在水中， 调节为 4g ／ l。
将上述 2 种水溶液各 0.5ml 在 1.5m 容器中混合， 在室温使其反应 24 小时。反应 后的 pH 为 3.5。再加入 100μl 浓盐酸使 pH 为 1。然后， 对于得到的混合液进行离心分离 （1000rpm、 10 分钟） ， 弃去上清， 得到固体。将得到的固体用约 9％的盐酸清洗， 溶解在二甲 基亚砜中， 通过 UV 测定算出还原体收率， 结果为 54％。
比较例 4
将吡咯并喹啉醌二钠溶解在水中， 调节为 2g ／ l。使用盐酸和 NaOH， 将水溶液的
pH 调节为 pH4.3。另外， 将 L －抗坏血酸溶解在水中， 调节为 4g ／ l。
将上述 2 种水溶液各 0.5ml 在 1.5m 容器中混合， 在室温使其反应 24 小时。反应 后的 pH 为 3.5。然后， 对于得到的混合液进行离心分离 （1000rpm、 10 分钟） ， 弃去上清， 得到 固体。 将得到的固体用约 9％的盐酸清洗， 溶解在二甲基亚砜中， 通过 UV 测定算出还原体收 率， 结果为 1％。
比较例 5
将吡咯并喹啉醌二钠溶解在水中， 调节为 2g ／ l。使用盐酸和 NaOH， 将水溶液的 pH 调节为 pH7.6。另外， 将 L －抗坏血酸溶解在水中， 调节为 4g ／ l。
将上述 2 种水溶液各 0.5ml 在 1.5m 容器中混合， 在室温使其反应 24 小时。反应 后的 pH 为 3.5。然后， 对于得到的混合液进行离心分离 （1000rpm、 10 分钟） ， 弃去上清， 得到 固体。 将得到的固体用约 9％的盐酸清洗， 溶解在二甲基亚砜中， 通过 UV 测定算出还原体收 率， 结果为 9％。12