分子表面印迹聚合物的制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种分子表面印迹聚合物的制备方法，具体是一种能够识别模板分子的表面印迹聚合物的制备方法。用于分子识别、检测和分离纯化领域。
背景技术
分子印迹是指将特定分子的形状及在分子表面上分布的电荷、疏水性、氢键受体和供体的性质互补地印到聚合物中的过程，这种聚合物能够保留被印分子的形状和分子表面性质的印迹。聚合物中的印迹与被印迹的分子具有特异的对应关系，具有记忆模板分子形状的效应，从而使印迹聚合物材料具有识别特定分子的性能。
近年来，有关分子印迹的报道很多，但有关生物大分子印迹制备的报道文献比较少，比较满意的试验结果更少。主要原因是聚合反应常常在有机溶剂环境进行，一方面有机溶剂破坏生物大分子识别的氢键，容易使生物大分子物质发生变性，另一方面生物大分子的体积比较大，即使不变性能够顺利制备成印迹聚合物，生物大分子不容易从聚合物内部洗出，生物大分子也不容易扩散进入小孔径印迹聚合物地内部，无法进一步开发利用。针对蛋白质分子脆弱的特点，一些研究者开展了制备识别生物大分子的印迹聚合物的研究。同时针对蛋白质分子体积大的特点，一些研究者采用表面印迹的策略来制备聚合物。
经对现有技术文献的检索发现，Buddy D.Ratner等在《自然》上发表的《识别蛋白的模板印迹纳米结构表面》(Template-imprinted nanostructured surfacesfor protein recognition Nature Vol.398 1999 593-597)。该论文中的方法是先将模板蛋白吸附在云母上脱水，再用射频辉光放电等离子沉积方法将二糖分子沉积在蛋白分子表面，然后再沉积六氟乙烯聚合物将蛋白分子表面二糖固定。去除蛋白后，固定在六氟乙烯聚合物中的二糖形成的印迹在一定程度上可以识别模板蛋白。该方法中由于蛋白质分子表面基团的灵活性在脱水后基本丧失，不能将互补的功能基团沉积在蛋白表面的电荷、疏水性、氢键受体和供体的功能基团附近，一方面难于通过引入功能基团改进分子识别材料的性能，另一方面也难于大规模制备印迹材料。因此，从根本上改进印迹聚合物的性能是科学和技术上的一项挑战。
【发明内容】
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供了一种分子表面印迹聚合物的制备方法，尤其是蛋白质类大分子的表面印迹聚合物的制备方法，使得模板分子的洗脱和重新识别更有效和快速。聚合物中整合的功能单体改进了与模板分子的相互作用，提高了模板分子重新识别的效率，和印迹聚合物的性能。
本发明是通过以下技术方案实现的，包括下列步骤：
(1)固定模板蛋白分子
将模板分子通过物理或化学的方法固定于载体表面，载体包括(但不局限于)酶标板微孔、云母、玻璃等。用缓冲液漂洗掉未结合的模板分子，晾干载体。
(2)功能单体与固定化蛋白孵育形成复合物
聚合单体、交连剂和功能单体与固定于载体表面的模板分子进行孵育，模板蛋白分子与功能单体结合形成复合物，使功能单体分布在模板蛋白分子表面。
(3)引发共聚合固定功能单体
加入引发剂引发聚合反应，将模板分子和功能单体形成的复合物固定于聚合物表面。
(4)漂洗印迹聚合物表面的模板分子
用洗脱溶液漂洗印迹聚合物3-6次，除去印迹聚合物中的模板分子，即得到表面带有与模板分子形状互补的空穴的聚合物材料。空穴中分布着能与模板分子结合的化学功能基团。
本发明所得的印迹聚合物的性能评价：通过检测模板蛋白分子在聚合物上的残留、对模板分子的重新吸附以及其它蛋白分子对模板分子的竞争和选择性吸附情况，测定本发明方法制备的印迹聚合物的性能。
本发明的理论基础是聚合物表面的纳米尺度的孔穴与模板分子在形状上互补，识别时起到在空间上筛选模板分子的作用，纳米孔穴中在特定位置固定的功能单体与模板分子表面的功能团从电荷、氢键、疏水作用和范德华力等几个方面进行非共价键相互作用，进一步对模板分子识别进行筛选，增强对正确分子的亲和作用。模板分子残留测定、重新吸附试验和有其它分子存在时的竞争吸附试验证明，本发明制备的印迹聚合物对模板残留量低，能够重新识别和结合模板分子，对混合物中的模板分子有比较高的选择识别能力。通过原子力显微镜扫描发现，印迹聚合物表面存在模板分子留下的纳米尺度的孔穴。
本发明制备的印迹聚合物将模板分子印迹在聚合物表面，不仅克服了模板分子嵌留在聚合物内部难以洗脱的缺点，也克服了模板分子需要扩散进聚合物材料内部才能再结合的限制，本发明还克服了蛋白质分子的脆弱性质，在水溶性聚合物系统中制备出了蛋白质印迹聚合材料。本发明所制备的印迹聚合物能够重新吸附模板蛋白分子，并且在有其它蛋白分子存在时对模板蛋白分子有选择性识别和结合能力。制备印迹聚合物时使用功能单体能够提高模板蛋白分子的吸附容量和选择性能。这些特点使制备的印迹聚合物在物质的分离纯化和生物传感器领域具有很大的潜在的应用价值。
【具体实施方式】
下面结合具体实例做进一步的阐述：
实施例1：以乙肝e抗原为模板分子的表面印迹聚丙烯酰胺
本发明中以HBe抗原为模板制备的印迹聚合物以MIPe表示，没有任何模板分子存在时制备的印迹聚合物以MIPc表示。步骤和结果如下：
一模板蛋白分子固定
将浓度为104mg/ml的乙肝e抗原(HBe)加在96孔酶标板微孔内，4℃过夜。用0.5％的TWEEN-生理盐水漂洗掉未结合的模板分子，甩干酶标板待用。
二功能单体与固定化蛋白孵育形成复合物
10ml丙烯酰胺(50％)、N，N’-亚甲双丙烯酰胺储液(8％)、甲基丙烯酸(6％)混合均匀，加入400ul过硫酸铵和200ul N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)，混合均匀，加0.4ml到包被有HBe分子的酶标板微孔中与固定于载体表面的模板分子进行孵育20-30分钟，模板蛋白分子与功能单体结合形成复合物，使功能单体分布在模板蛋白分子表面。
三引发共聚合固定功能单体
孵育20-30分钟后，加入的引发剂引发聚合反应，将模板分子和功能单体形成的复合物固定于聚合物表面。聚合反应完成后得到HBe的印迹材料MIPe。
四印迹材料的漂洗
将印迹材料MIPe放在1.5ml的离心管中，加3ml 0.1M NaOH漂洗2次，加3ml 0.1M HAC漂洗2次，再加3ml用磷酸盐缓冲液PBS(10mM，pH7.4含0.5％TWEEN20，137mM NaCl，2.7mM KCl)漂洗2遍。最后加3ml PBS(10mM，pH7.4)漂洗1遍。漂洗时加入漂洗后在摇床上以200rpm转速，在30℃温度下振荡时间10分钟后， 吸除漂洗液。印迹材料的浸泡在PBS(10mM，pH7.4)备用。
五印迹聚合物的性能评价
采用酶联免疫(ELISA)的方法检测模板蛋白分子在聚合物上的残留、模板分子的重新吸附以及其它蛋白分子对模板分子的竞争和选择性吸附。以参照聚合物(没有模板蛋白)的底物反应溶液做对照，测定450nm的光吸收值。根据吸光度与HBe标准浓度曲线，制备的印迹材料MIPe残留HBe 14ng/cm2，吸附HBe的量为193ng/cm2，使MIPe吸附HBe的量减少一半所需要的HBs分子的浓度为2倍，BSA的浓度2倍，RNase A的浓度8倍。
实施例2：以乙肝e抗原为模板分子的表面印迹聚丙烯醇
步骤和结果如下：
一模板蛋白分子固定
同实施例1
二功能单体与固定化蛋白孵育形成复合物
10ml丙烯醇(20％)，苯乙烯(12％)中加入300ul过硫酸铵和100ul N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)，混合均匀，加0.4ml到包被有HBe分子的酶标板微孔中，与固定于载体表面的模板分子进行孵育30分钟，模板蛋白分子与功能单体苯乙烯结合形成复合物，使功能单体分布在模板蛋白分子表面。
三引发共聚合固定功能单体
孵育30分钟后，发生聚合反应，得到HBe的印迹材料MIPe。
四印迹材料的漂洗
同实施例1
五印迹聚合物的性能评价
同实施例1
印迹材料MIPe残留HBe的量为16.7ng/cm2，MIPe特异吸附HBe的量为88.48ng/cm2，使MIPe吸附HBe的量减少一半所需要的HBs分子的浓度为1倍，BSA的浓度2倍，RNase A的浓度4倍。
实施例3：以乙肝c抗原为模板分子的表面印迹聚苯乙烯
步骤和结果如下：
一模板蛋白分子固定
同实施例1
二功能单体与固定化蛋白孵育形成复合物
10ml苯乙烯、甲基丙烯酸(5％)中加入300ul过硫酸铵120ul N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)，混合均匀，加0.4ml到包被有HBe分子的酶标板微孔中，与固定于载体表面的模板分子进行孵育30分钟，模板蛋白分子与功能单体结合形成复合物，使功能单体分布在模板蛋白分子表面。
三引发共聚合固定功能单体
孵育30分钟后，发生聚合反应，得到HBe的印迹材料MIPe。
四印迹材料的漂洗
同实施例1
五印迹聚合物的性能评价
同实施例1
印迹材料MIPe残留HBe的量为26.7ng/cm2，MIPe特异吸附HBe的量为81.4ng/cm2，使MIPe吸附HBe的量减少一半所需要的HBs分子的浓度为2倍，BSA的浓度2倍，RNase A的浓度4倍。
实施例4：以乙肝表面抗原(HBs)为模板的表面印迹聚二甲基硅氧烷
以抗原HBs为模板制备的印迹聚合物以MIPs表示，没有任何模板分子存在时制备的印迹聚合物以MIPc表示。步骤和结果如下：
一模板蛋白分子固定
将浓度为10-6mg/ml的HBs滴加在云母新剥开的表面，4℃过夜。用0.5％的TWEEN-生理盐水漂洗掉未结合的模板分子。
二功能单体与固定化蛋白孵育形成复合物
10ml二甲基硅氧烷(主剂与辅剂10∶1)、丙烯酸酯(8％)混合均匀，加到包被有HBs的云母新表面，与固定于载体表面的模板分子进行孵育，模板蛋白分子与功能单体结合形成复合物，使功能单体分布在模板蛋白分子表面。
三引发共聚合固定功能单体
模板蛋白分子与功能单体孵育的同时，对聚合物体系进行脱气处理，发生聚合反应，得到HBs的印迹材料MIPs。
四印迹材料的漂洗
3ml 0.1M NaOH漂洗4次，3ml用磷酸盐缓冲液PBS(10mM，pH7.4含0.5％TWEEN20，137mM NaCl，2.7mM KCl)漂洗2遍。最后加3ml PBS(10mM，pH7.4)漂洗1遍。
五印迹聚合物的性能评价
同实施例1
印迹材料MIPs残留HBs的量为13.9ng/cm2，MIPe特异吸附HBe的量为61.8ng/cm2，使MIPe吸附HBe的量减少一半所需要的HBs分子的浓度为2倍，BSA的浓度1倍，RNase A的浓度2倍。
实施例5：以乙肝表面抗原(HBs)为模板分子的表面印迹聚丙烯酰胺
步骤和结果如下：
一模板蛋白分子固定
将浓度为10-5mg/ml的HBs加在96孔酶标板微孔内，4℃过夜。用0.5％的TWEEN-生理盐水漂洗掉未结合的模板分子，甩干酶标板待用。
二功能单体与固定化蛋白孵育形成复合物
10ml丙烯酰胺(30％)、N，N’-亚甲双丙烯酰胺储液(20％)、4-乙烯基吡啶(8％)混合均匀，加入200ul过硫酸铵和100ul N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)，混合均匀，加0.4ml到包被有HBs分子的酶标板微孔中与固定于载体表面的模板分子进行孵育20-30分钟，模板蛋白分子与功能单体结合形成复合物，使功能单体分布在模板蛋白分子表面。
三引发共聚合固定功能单体
同实施例1
四印迹材料的漂洗
同实施例1
五印迹聚合物的性能评价
同实施例1
印迹材料MIPs残留HBs的量为13ng/cm2，MIPs特异吸附HBs的量为230ng/cm2，使MIPe吸附HBe的量减少一半所需要的HBe的浓度为4倍，BSA的浓度2倍，RNase A的浓度4倍。